CN116411033A - 一种来源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶突变体及其应用 - Google Patents
一种来源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的氨基转移酶突变体及其应用。具体地,本发明公开了一种反式氨基环己基类化合物的制备方法,其包括以下步骤:在氨基转移酶的存在下,将如式I所示的环己基酮类化合物和氨基供体进行如下所示的胺化反应,即得如式II所示的反式氨基环己基类化合物;其中,R为‑COOR1或‑CN;R1为氢或C1~C6烷基;所述的氨基转移酶为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的来源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶的突变体。本发明利用氨基转移酶突变体催化环己酮类化合物合成为反式氨基环己基类化合物,且收率大于80%、纯度大于98.0%,反式氨基环己基类化合物在产物中的占比大于90%,具有较高的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域,具体涉及一种来源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶突变体及其应用。
背景技术
反式氨基环己基类化合物是一种重要的药物合成前体,是多种处于临床阶段的创新化学药的重要砌块。此前的合成方法是,从对环己酮类化合物出发,经过化学催化形成顺式/反式混合的氨基环己基类化合物,再经过一次或多次重结晶,除去不需要的顺式构型。该法生产的步骤较多、收率较低(通常低于50%),反应是以钯、铂、铑、钌等不可回收的贵金属作为催化剂,成本较高,或者以镍等重金属作为催化剂,会对环境造成污染,且过程中需要在密闭反应装置中使用高压氢气,安全风险较高。
与化学法相比,酶催化法具备特异性好、纯度高、反应温和、成本低等特点,是一种替代上述化学方法的绿色新工艺。目前研究和应用较多的天然氨基转移酶为UniProt IDF7J696(Biotechnol Lett,2003,25:1843-1846)、UniProt:F2XBU9(Biotechnol Bioeng,1999, 65,206-211)、UniProt ID:Q0C8G1(Nat Chem Biol,2010,6:807-813.)、GenBankAccession No.KJ496414.1(Appl Microbiol Biotechnol,2014,98(17):7399-7408)、以及UniProt ID: Q7NWG4(Enzyme Microb Tech,2007,41:628-637),但对上述反应的立体特异性仍不够高。其中来源于(Arthrobater Sp.Knk168,UniProt ID:F7J696)的氨基转移酶对该反应的立体选择性是66%左右。来源于河流弧菌(Vibro fluvialis JS17,UniProt:F2XBU9)的氨基转移酶对该反应的立体选择性仅有1%左右。申请人在之前研究得到了氨基转移酶突变体,得到反式氨基环己基化合物的立体选择性大于98%,专利号为CN2020115235024。
发明内容
本发明提供了一种反式氨基环己基类化合物的制备方法,其包括以下步骤:在氨基转移酶的存在下,将如式I所示的环己基酮类化合物和氨基供体进行如下所示的胺化反应,即得如式II所示的反式氨基环己基类化合物;
其中,R为-COOR1或-CN;R1为氢或C1~C6烷基;所述的酶为氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的氨基转移酶的突变体;
所述的突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第3位、第4位、第5位、第7位、第8位、第9位、第15位、第19位、第21位、第25位、第28位、第29位、第32位、第33位、第37位、第47位、第48位、第51位、第56位、第58 位、第61位、第67位、第69位、第76位、第77位、第80位、第84位、第86位、第88位、第94位、第108位、第110位、第113位、第119位、第120位、第121位、第122位、第123位、第124位、第125位、第126位、第131位、第135位、第136 位、第140位、第145位、第147位、第148位、第150位、第151位、第152位、第 155位、第156位、第159位、第167位、第172位、第173位、第175位、第179位、第185位、第186位、第193位、第198位、第199位、第201位、第202位、第206 位、第208位、第209位、第210位、第214位、第225位、第229位、第230位、第 231位、第235位、第236位、第238位、第239位、第241位、第242位、第243位、第245位、第249位、第251位、第257位、第260位、第261位、第262位、第270 位、第272位、第273位、第274位、第277位、第287位、第292位、第295位、第 296位、第297位、第299位、第306位、第307位、第308位、第314位、第315位、第318位、第319位、第322位、第326位、第328位、第329位、第332位、第333 位、第337位、第350位、第356位、第358位、第360位、第374位、第376位、第 379位、第386位第396位、第398位、第403位、第411位、第417位、第418位、第424位、第428位、第434位、第435位、第439位、第446位、第448位、第450位、第451位、第469位、第472位、和第474位中的一个或多个。
在某优选一方案中,所述的氨基转移酶突变体的突变位点还包括选自如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第 169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第331位、第373 位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的一个或多个。
在某一方案中,所述的制备方法中的某些条件的定义可如下任一方案所述(以下简称“在某一方案中”):当所述的R1为C1~C6烷基时,所述的C1~C6烷基可为C1~C4烷基,例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基,还例如甲基或乙基。
在某一方案中,R为-COOH、-COOMe、-COOEt或-CN。
在某一方案中,所述的氨基供体为本领域常规的氨基供体,较佳地,所述氨基供体为异丙胺、L-丙氨酸、DL-丙氨酸、L-赖氨酸、DL-赖氨酸、(S)-1-苯乙胺、(R)-1-苯乙胺、(RS)-1-苯乙胺、戊二胺、邻苯二甲胺、邻苯二甲胺盐酸盐、2-(4-硝基苯)乙胺、2-(4-硝基苯)乙胺盐酸盐中的一种或多种;更佳地,所述氨基供体为异丙胺。
在某一方案中,所述的氨基供体与所述的如式I所示的环己基酮类化合物的摩尔比为本领域常规的摩尔比;优选为(1~4):1,例如1:1、2:1、3:1或4:1。
在某一方案中,所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液,或缓冲液和本领域常规的有机溶剂的混合物;所述的有机溶剂为甲基叔丁基醚、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙酸乙酯、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇;较佳地,所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液。
在某一方案中,所述的缓冲液为本领域常规的缓冲液,优选为磷酸盐缓冲液(PBS)、三羟甲基甲胺盐缓冲液(TRIS)和三乙醇胺盐缓冲液(TEOA)中的一种或多种;更优选为磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺盐缓冲液或三乙醇胺盐缓冲液。
在某一方案中,所述的缓冲液与所述的如式I所示的环己基酮类化合物的体积质量比为本领域常规的体积质量比;优选为5~100mL/g,例如10mL/g或9mL/g。
在某一方案中,所述的胺化反应的pH值为本领域常规的pH值,优选为6.0~9.0;更优选为7.0~9.0;例如7.5、8.0、8.5或9.0。
在某一方案中,所述的胺化反应的反应温度为本领域常规的反应温度,优选为 25℃~50℃;例如27℃或37℃或47℃。
在某一方案中,所述的胺化反应的反应时间为本领域常规的反应时间,反应时间同通常与反应规模相关,优选为16~20h;例如16h、18h或20h。
在某一方案中,所述的反式氨基环己基类化合物的制备方法,其包括以下步骤:向所述的缓冲液和氨基供体的混合液中,加入所述的如式I所示的环己基酮类化合物和所述的氨基转移酶,混合均匀后在25℃~50℃下反应即可。
在某一方案中,所述的胺化反应结束后还包括以下后处理步骤:加入醚类溶剂进行萃取分液、水相加入醚类溶剂并利用碱调节pH调至13,有机相干燥并除去醚类溶剂即可。
在某一方案中,所述的醚类溶剂为本领域常规醚类溶剂,优选为甲基叔丁基醚。
在某一方案中,所述的干燥采用本领域常规的干燥方式,优选为干燥剂干燥;所述的干燥剂为本领域常规干燥剂,优选为无水硫酸钠。
在某一方案中,所述的碱为本领域常规碱,优选为氢氧化钠或氢氧化钾,例如氢氧化钾。
在某一方案中,所述的除去醚类溶剂的方式为本领域常规方式,优选为减压蒸馏,例如在压力为-0.09Mpa下减压蒸馏。
在某一方案中,所述的突变体的为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的:
第3位替换为:D、G、H、K、N、R、S、W或Y;
和/或,第4位替换为:D、E、F、I、L、P、R、V或W;
和/或,第5位替换为:H、K、L、N或R;
和/或,第7位替换为:A、E、K、L、M、N、P、Q或T;
和/或,第8位替换为:A、G、H、M、P、S、V或W;
和/或,第9位替换为:A、C、D、E、H、N、P或Q;
和/或,第15位替换为:D、E、F、K、L、M、Q、S、T、V、W或Y;
和/或,第19位替换为:A、D、E、G、H、I、M、N、P、R、T、W或Y;
和/或,第21位替换为:A、C、D、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S或V;
和/或,第25位替换为:E、F、H、I、K、L、M、T、V或W;
和/或,第28位替换为:A、D、F、G、K、L、M、R、S、T或V;
和/或,第29位替换为:C、D、I、K、Q或S;
和/或,第32位替换为:C、D、F、G、K、P或Y;
和/或,第33位替换为:A、G、L、M、N、R或Y;
和/或,第37位替换为:D、H、K、P、Q、S、T、V、W或Y;
和/或,第47位替换为:A、C、F、G、I、R、S、T、V或W;
和/或,第48位替换为:A、E、F、G、H、I、P、Q、R、T、V或Y;
和/或,第51位替换为:C、D、E、F、G、M、N、P、R、W或Y;
和/或,第56位替换为:C、G、H、I、K、N、R、S或W;
和/或,第58位替换为:A、C、F、G、I、L、M、N、P、T或Y;
和/或,第61位替换为:A、C、L、R、V或W;
和/或,第67位替换为:E、F、H、K、M、N、P或Y;
和/或,第69位替换为:A、G、H、I、L、N、R、S或V;
和/或,第76位替换为:A、D、G、L、M、N、P、R、S、T或W;
和/或,第77位替换为:A、C、D、H、I、K、N、Q、R或T;
和/或,第80位替换为:A、F、H、K、P、Q、W或Y;
和/或,第84位替换为:C、F、H、K、L、M、P、Q、T、V、W或Y;
和/或,第86位替换为:A、D、E、G、I、K、N、P、S、T、V、W或Y;
和/或,第88位替换为:A、E、F、G、K、L、M、N、S、T或Y;
和/或,第94位替换为:C、D、F、G、I、K、N、P、Q、R、S或W;
和/或,第108位替换为:A、D、G、H、I、M、Q或T;
和/或,第110位替换为:C、E、F、Q、R或V;
和/或,第113位替换为:A、C、D、F、H、I、L、N、R或S;
和/或,第119位替换为:C、D、F、G、H、I、K、M、N、P、S或V;
和/或,第120位替换为:A、C、F、H、I、K、M、N、P或Q;
和/或,第121位替换为:F、H、I、Q、S、V、Y、F或I;
和/或,第122位替换为:L、N、V或Y;
和/或,第123位替换为:F、G、H、K、S或T;
和/或,第124位替换为:C、D、F、N、P或W;
和/或,第125位替换为:D、E、G、K、N、P、R、S或T;
和/或,第126位替换为:A、C、F、G、L、N、P、Q或W;
和/或,第131位替换为:C、G、H、I、M、R、T、V或W;
和/或,第135位替换为:A、D、G、H、K、L、Q、R、T或Y;
和/或,第136位替换为:E、F、G、K、M、N、P、S、V或W;
和/或,第140位替换为:C、G、K、M、N、P、R或S;
和/或,第145位替换为:D、E、F、G、I、K、L、M、Q、V、W或Y;
和/或,第147位替换为:D、F、G、H、K、M、Q、R、T、V、W或Y;
和/或,第148位替换为:A、E、F、K、L、M、N、Q、R、S、T或V;
和/或,第150位替换为:A、C、G、H、I、K、L、R、S、T或V;
和/或,第151位替换为:C、E、G、K、L、M、Q、R、S或W、
和/或,第152位替换为:D、I、K、M、N、P、Q、R、V或Y、
和/或,第155位替换为:E、F、K、M、N、P、R、S、T、W或Y、
和/或,第156位替换为:C、D、E、G、I、L、M、N、P、Q、R或W、
和/或,第159位替换为:D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、V或Y、
和/或,第167位替换为:E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T或W;
和/或,第172位替换为:A、C、D、E、G、H、M、N、P、Q、R、S、T、V或W;
和/或,第173位替换为:C、F、P、Q、R或V;
和/或,第175位替换为:D、E、G、H、I、K、S、V、W或Y;
和/或,第179位替换为:A、C、F、G、I、L、M、N、Q、R或V;
和/或,第185位替换为:A、D、E、F、H、I、K、M、N、P、T、V或W;
和/或,第186位替换为:A、D、E、F、H、K、L、M、N、P、Q或T;
和/或,第193位替换为:A、C、F、H、K、L、N、Q、R、S、T或Y;
和/或,第198位替换为:A、F、G、I、L、M、N、P、R、T、V或Y;
和/或,第199位替换为:C、D、H、I、K、M、N、P、Q、R或W;
和/或,第201位替换为:A、C、D、F、I、L、M、N、P、R、S或T;
和/或,第202位替换为:A、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S或Y;
和/或,第206位替换为:A、C、D、F、M、N、P、R、S、W或Y;
和/或,第208位替换为:C、H、I、K、M、Q、R或V;
和/或,第209位替换为:D、E、G、I、L、P、T、V、W或Y;
和/或,第210位替换为:A、G、H、I、K、L、Q、S或T;
和/或,第214位替换为:A、E、F、L、M、N、P、S、T或W;
和/或,第225位替换为:D、I、L、M、Q、R、V或W;
和/或,第229位替换为:A、C、F、G、H、K、M、P或R;
和/或,第230位替换为:A、C、F、G、H、K、M、Q、T、V或W;
和/或,第231位替换为:A、D、E、F、I、K、L、P、R或T;
和/或,第235位替换为:A、C、D、E、I、K、M、P、S或T;
和/或,第236位替换为:C、E、G、H、I、M、N、P、S、W或Y;
和/或,第238位替换为:C、D、E、F、H、K或P;
和/或,第239位替换为:A、C、F、G、H、I、K、Q、S、T、W或Y;
和/或,第241位替换为:A、D、K、P、Q、T或V;
和/或,第242位替换为:A、C、D、G、H、K、M、P、Q、R、W或Y;
和/或,第243位替换为:A、D、F、K、R、V、W或Y;
和/或,第245位替换为:A、D、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T或W;
和/或,第249位替换为:A、C、F、K、L、Q、S、V或W;
和/或,第251位替换为:F、G、I、L、N、P、Q、S、T、W或Y;
和/或,第257位替换为:G、P、Q或T;
和/或,第260位替换为:A、E、G、H、L、M、Q、R、S、T、V或W;
和/或,第261位替换为:A、D、F、G、K、M、N、R、T、W或Y;
和/或,第262位替换为:A、E、F、G、K、Q、V或W;
和/或,第270位替换为:C、D、E、F、G、H、I、L、P、Q、R、S或W;
和/或,第272位替换为:C、E、F、G、L、P、R、S、T或V;
和/或,第273位替换为:F、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y;
和/或,第274位替换为:A、C、F、G、I、K、L、M、N、R、T或Y;
和/或,第277位替换为:C、D、H、I、L、M、N、P、Q或Y;
和/或,第287位替换为:D、E、G、K、L、M、N、P、Q或Y;
和/或,第292位替换为:E、H、I、K、L、T、V、W或Y;
和/或,第295位替换为:A、F、R、S、V或Y;
和/或,第296位替换为:A、D、E、F、G、I、L、M、P、Q、R或T;
和/或,第297位替换为:A、F、I、K、L、M、P、R、S或W;
和/或,第299位替换为:C、D、E、F、G、H、L、M、P、R或V;
和/或,第306位替换为:A、C、I、N、S或Y;
和/或,第307位替换为:C、E、G、K、P、R、T或Y;
和/或,第308位替换为:E、F、G、H、L、M、N、R、S或Y;
和/或,第314位替换为:C、D、F、H、N、P、R、S、V或Y;
和/或,第315位替换为:A、C、D、E、F、H、I、L、M、P、Q、R或S、W或Y;
和/或,第318位替换为:D、E、F、I、K、L、M、N、Q、S、T或W;
和/或,第319位替换为:C、H、I、K、L、P、Q、R或V;
和/或,第322位替换为:A、E、F、G、I、L、N、S或W;
和/或,第326位替换为:D、G、H、I、N、R、S、T或Y;
和/或,第327位替换为:E、F、G、H、M、Q、T或Y;
和/或,第328位替换为:A、C、E、H、L、M、P、R或S;
和/或,第329位替换为:A、C、D、E、K、M、Q、T或W;
和/或,第332位替换为:C、D、E、M、Q、S、T、V或Y;
和/或,第333位替换为:H、L、T或Y;
和/或,第337位替换为:E、F、G、K、P、Q、R、S、V或Y;
和/或,第350位替换为:D、E、F、H、P、Q、T、V或W;
和/或,第356位替换为:A、D、E、F、H、L、M、N、P、R、S或T;
和/或,第358位替换为:C、G、I、K、N、P、Q、S、T或W;
和/或,第360位替换为:C、E、F、L、P、Q、R、S或Y;
和/或,第373位替换为:A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、Q、R、S、W或Y;
和/或,第374位替换为:C、D、G、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;
和/或,第376位替换为:A、C、E、G、H、I、L、M、Q、S、T、V或Y;
和/或,第379位替换为:D、E、H、K、M、N、P、R、W或Y;
和/或,第386位替换为:A、D、E、F、H、R、V或W;
和/或,第396位替换为:A、D、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S或Y;
和/或,第398位替换为:A、F、G、H、K、L、N、P、Q或T;
和/或,第403位替换为:F、G、K、P、Q、R、S、T、V、W或Y;
和/或,第410位替换为:D、E、F、M、N、P、R或S;
和/或,第411位替换为:A、C、D、E、G、I、L、S、T或Y;
和/或,第417位替换为:C、D、E、G、H、I、L、M、P或V;
和/或,第418位替换为:E、F、G、H、L、N、R、S、V、W或Y;
和/或,第424位替换为:A、H、I、K、L、M、N、P、R或W;
和/或,第428位替换为:C、D、E、L、N、P、S、V、W或Y;
和/或,第434位替换为:A、C、D、H、I、L、M、N、S或T;
和/或,第435位替换为:A、D、E、F、H、L、N、P、Q、S、T、W或Y;
和/或,第439位替换为:C、D、F、I、K、S、W或Y;
和/或,第446位替换为:A、E、G、K、L、M、N、P、R或T;
和/或,第448位替换为:A、D、E、F、K、R、W或Y;
和/或,第450位替换为:C、E、F、H、I、N、R、S或T;
和/或,第451位替换为:D、E、G、I、L或Q;
和/或,第469位替换为:A、E、F、G、H、I、L、M或N;
和/或,第472位替换为:A、F、L、P、R、S、T或Y;
和/或,第474位替换为:A、D、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、V或W。
在某优选一方案中,所述的突变体的还包括为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的:
和/或,第59位替换为:E、F、I、K、L、M、P、R、T、V或Y;
和/或,第60位替换为:C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W 或Y;
和/或,第144位替换为:A、E、G、I、M、P、Q、R、W或Y;
和/或,第161位替换为:C、D、M或S;
和/或,第164位替换为:A、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、V或W;
和/或,第169位替换为:L;
和/或,第174位替换为:C、F、G、H、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y;
和/或,第240位替换为:A、D、F、I、K、M、P、S、T或W;
和/或,第244位替换为:C、D、H、L、Q、R、S、T、W或Y;
和/或,第330位替换为:A、D、E、I、V或Y;
和/或,第331位替换为:A、I、M、N、P、Q、S、T或W;
和/或,第387位替换为:A、C、D、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;
和/或,第422位替换为:N;
和/或,第436位替换为:A、F、G、H、K、M、N、P、Q、R、S或Y;
和/或,第437位替换为:E、F、H、I、L、N、Q、R、T、W或Y;
和/或,第442位替换为:D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、T、V或Y。
在某一方案中,所述的突变体的突变位置和种类如表1所示:
表1
本发明还提供了一种源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶突变体,其中所述的突变体为如上所述的突变体。
本发明还提供了一种分离的核酸,其中所述核酸编码如上所述的源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶突变体。
本发明还提供了一种重组表达载体,其中所述重组表达载体包含如上所述的核酸。
本发明还提供了一种转化体,其中所述转化体包含如上所述的重组表达载体。
本发明还提供了一种制备如上所述转化体的方法,其培养如上所述的转化体并获得含氨基转移酶突变体的培养物,即得。
本发明还提供了一种如上所述的源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶突变体在制备反式氨基环己基类化合物中的应用。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规,具体简写符号对应的氨基酸如表2所示。
表2
本发明的积极进步效果在于:本发明通过基因工程对一株氨基转移酶进行定向进化,得到若干具有更高活性、立体特异性以及热稳定性的突变体。本发明基于上述氨基转移酶突变体,开发了从环己酮类化合物出发一步合成反式氨基环己基类化合物的反应工艺,能在比较高的温度下反应(47℃),收率大于80%,纯度大于98.0%,且反式氨基环己基类化合物在产物中的占比大于90%。
附图说明
图1为产物反式对氨基环己基羧酸乙酯的核磁图;
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
制备实施例:酶突变体的制备
在如SEQ ID NO:1的氨基酸序列所示野生型氨基转移酶上进行如下表1的突变,获得本发明的酶突变体。
表1氨基转移酶的突变位置和替换的氨基酸
实施例1
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体84的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0988g,收率为98.8%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例2
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出2.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体84的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0993g,收率为99.3%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例3
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出0.5mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体84的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0936g,收率为93.6%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例4
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体95的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于37℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0965g,收率为96.5%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例5
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出2.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体95的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于37℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0972g,收率为97.2%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例6
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出0.5mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体95的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于37℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0921g,收率为92.1%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例7
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体103的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0963g,收率为96.3%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例8
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出2.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体103的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0978g,收率为97.8%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例9
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出0.5mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体103的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0926g,收率为92.6%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例10
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体173的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0997g,收率为99.7%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例11
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为3.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体173的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0982g,收率为98.2%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例12
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为1.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体173的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0964g,收率为96.4%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例13
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=8.0的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体209的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0986g,收率为98.6%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例14
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=8.0的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体209的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0973g,收率为97.3%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例15
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=8.0的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为1.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体209的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0913g,收率为91.3%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例16
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=8.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体215的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0983g,收率为98.3%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例17
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=8.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体215的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0969g,收率为96.9%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例18
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=8.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为1.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体215的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0909g,收率为90.9%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例19
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=9.0的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体317的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0976g,收率为97.6%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例20
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=9.0的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体317的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0959g,收率为95.9%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例21
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=9.0的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为1.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1 g的化合物1和0.1g具有突变体317的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0908g,收率为90.8%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例22
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向500mL的烧杯中加入0.09g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、300mL pH=9.0的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出100mL的溶液加入到400mL的反应瓶中,并向溶液中添加10 g的化合物1和10g具有突变体216的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09 MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物9.78g,收率为97.8%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例23
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向2000mL的烧杯中加入0.36g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、1200mL pH=7.5的含异丙胺的PBS 缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出900mL的溶液加入到2000mL的反应瓶中,并向溶液中添加100g的化合物1和100g具有突变体326的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2000mL的甲基叔丁基醚进行萃取 (用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物99.5g,收率为99.5%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例24
在TRIS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的TRIS 缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加 0.1g的化合物1和0.1g具有突变体238的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于 47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在 -0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0972g,收率为97.2%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例25
在TRIS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的TRIS 缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加 0.1g的化合物1和0.1g具有突变体238的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于 47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在 -0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0963g,收率为96.3%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例26
在TRIS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的TRIS 缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为1.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加 0.1g的化合物1和0.1g具有突变体238的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于 47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在 -0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0923g,收率为92.3%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例27
在TRIS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=9.0的含异丙胺的TRIS 缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加 0.1g的化合物1和0.1g具有突变体258的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于 47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在 -0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0989g,收率为98.9%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例28
在TRIS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=9.0的含异丙胺的TRIS 缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加 0.1g的化合物1和0.1g具有突变体48的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于 47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0976g,收率为97.6%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例29
在TRIS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=9.0的含异丙胺的TRIS 缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为1.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加 0.1g的化合物1和0.1g具有突变体48的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于 47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在 -0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0931g,收率为93.1%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例30
在TEOA缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的TEOA 缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加 0.1g的化合物1和0.1g具有突变体284的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于 47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在 -0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0993g,收率为99.3%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例31
在TEOA缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的TEOA 缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体284的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于 47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在 -0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0986g,收率为98.6%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例32
在TEOA缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=7.5的含异丙胺的TEOA 缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为1.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加 0.1g的化合物1和0.1g具有突变体284的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于 47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在 -0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0942g,收率为94.2%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例33
在TEOA缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=9.0的含异丙胺的TEOA 缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加 0.1g的化合物1和0.1g具有突变体234的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于 47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在 -0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0973g,收率为97.3%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例34
在TEOA缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=9.0的含异丙胺的TEOA 缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为2.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加 0.1g的化合物1和0.1g具有突变体234的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于 47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在 -0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0959g,收率为95.9%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例35
在TEOA缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.009g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH=9.0的含异丙胺的TEOA 缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为1.0mol/mol),搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中,并向溶液中添加 0.1g的化合物1和0.1g具有突变体234的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于 47℃条件下反应16h。结束后取出反应液,并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH=13),萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠干燥,之后过滤得到滤液,在 -0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏,最终得到产物0.0914g,收率为91.4%,产物经核磁检测,结果显示,反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98%。
实施例36氨基转移酶突变体文库的构建
针对SEQ ID NO:1的第3位、第4位、第5位、第7位、第8位、第9位、第15 位、第19位、第21位、第25位、第28位、第29位、第32位、第33位、第37位、第47位、第48位、第51位、第56位、第58位、第61位、第67位、第69位、第76 位、第77位、第80位、第84位、第86位、第88位、第94位、第108位、第110位、第113位、第119位、第120位、第121位、第122位、第123位、第124位、第125 位、第126位、第131位、第135位、第136位、第140位、第145位、第147位、第 148位、第150位、第151位、第152位、第155位、第156位、第159位、第167位、第172位、第173位、第175位、第179位、第185位、第186位、第193位、第198 位、第199位、第201位、第202位、第206位、第208位、第209位、第210位、第 214位、第225位、第229位、第230位、第231位、第235位、第236位、第238位、第239位、第241位、第242位、第243位、第245位、第249位、第251位、第257 位、第260位、第261位、第262位、第270位、第272位、第273位、第274位、第 277位、第287位、第292位、第295位、第296位、第297位、第299位、第306位、第307位、第308位、第314位、第315位、第318位、第319位、第322位、第326 位、第328位、第329位、第332位、第333位、第337位、第350位、第356位、第 358位、第360位、第374位、第376位、第379位、第386位、第396位、第398位、第403位、第411位、第417位、第418位、第424位、第428位、第434位、第435 位、第439位、第446位、第448位、第450位、第451位、第469位、第472位、和第474位中的一个或多个。并筛选出催化活性较高的突变体1-突变体436,具体突变位点和种类如表3所示,反应条件与实施例1相同,不同之处为反应的催化酶的突变体替换为表3中突变体,反应效果如表3所示:
表3
上述实施例含本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
本申请中SEQ ID NO:1的序列如下所示
MSLTVQKINWEQVKEWDRKYLMRTFSTQNEYQPVPIESTEGDYLIMPDGTRLLD FFNQLYCVNLGQKNQKVNAAIKEALDRYGFVWDTYATDYKAKAAKIIIEDILGDEDW PGKVRFVSTGSEAVETALNIARLYTNRPLVVTREHDYHGWTGGAATVTRLRSYRSGL VGENSESFSAQIPGSSYNSAVLMAPSPNMFQDSDGNLLKDENGELLSVKYTRRMIENY GPEQVAAVITEVSQGAGSAMPPYEYIPQIRKMTKELGVLWINDEVLTGFGRTGKWFG YQHYGVQPDIITMGKGLSSSSLPAGAVLVSKEIAAFMDKHRWESVSTYAGHPVAMAA VCANLEVMMEENFVEQAKDSGEYIRSKLELLQEKHKSIGNFDGYGLLWIVDIVNAKT KTPYVKLDRNFTHGMNPNQIPTQIIMKKALEKGVLIGGVMPNTMRIGASLNVSRGDID KAMDALDYALDYLESGEWQ。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海合全药业股份有限公司
上海合全药物研发有限公司
<120> 一种来源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶突变体及其应用
<130> P21019878C
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 474
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 氨基转移酶
<400> 1
Met Ser Leu Thr Val Gln Lys Ile Asn Trp Glu Gln Val Lys Glu Trp
1 5 10 15
Asp Arg Lys Tyr Leu Met Arg Thr Phe Ser Thr Gln Asn Glu Tyr Gln
20 25 30
Pro Val Pro Ile Glu Ser Thr Glu Gly Asp Tyr Leu Ile Met Pro Asp
35 40 45
Gly Thr Arg Leu Leu Asp Phe Phe Asn Gln Leu Tyr Cys Val Asn Leu
50 55 60
Gly Gln Lys Asn Gln Lys Val Asn Ala Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asp
65 70 75 80
Arg Tyr Gly Phe Val Trp Asp Thr Tyr Ala Thr Asp Tyr Lys Ala Lys
85 90 95
Ala Ala Lys Ile Ile Ile Glu Asp Ile Leu Gly Asp Glu Asp Trp Pro
100 105 110
Gly Lys Val Arg Phe Val Ser Thr Gly Ser Glu Ala Val Glu Thr Ala
115 120 125
Leu Asn Ile Ala Arg Leu Tyr Thr Asn Arg Pro Leu Val Val Thr Arg
130 135 140
Glu His Asp Tyr His Gly Trp Thr Gly Gly Ala Ala Thr Val Thr Arg
145 150 155 160
Leu Arg Ser Tyr Arg Ser Gly Leu Val Gly Glu Asn Ser Glu Ser Phe
165 170 175
Ser Ala Gln Ile Pro Gly Ser Ser Tyr Asn Ser Ala Val Leu Met Ala
180 185 190
Pro Ser Pro Asn Met Phe Gln Asp Ser Asp Gly Asn Leu Leu Lys Asp
195 200 205
Glu Asn Gly Glu Leu Leu Ser Val Lys Tyr Thr Arg Arg Met Ile Glu
210 215 220
Asn Tyr Gly Pro Glu Gln Val Ala Ala Val Ile Thr Glu Val Ser Gln
225 230 235 240
Gly Ala Gly Ser Ala Met Pro Pro Tyr Glu Tyr Ile Pro Gln Ile Arg
245 250 255
Lys Met Thr Lys Glu Leu Gly Val Leu Trp Ile Asn Asp Glu Val Leu
260 265 270
Thr Gly Phe Gly Arg Thr Gly Lys Trp Phe Gly Tyr Gln His Tyr Gly
275 280 285
Val Gln Pro Asp Ile Ile Thr Met Gly Lys Gly Leu Ser Ser Ser Ser
290 295 300
Leu Pro Ala Gly Ala Val Leu Val Ser Lys Glu Ile Ala Ala Phe Met
305 310 315 320
Asp Lys His Arg Trp Glu Ser Val Ser Thr Tyr Ala Gly His Pro Val
325 330 335
Ala Met Ala Ala Val Cys Ala Asn Leu Glu Val Met Met Glu Glu Asn
340 345 350
Phe Val Glu Gln Ala Lys Asp Ser Gly Glu Tyr Ile Arg Ser Lys Leu
355 360 365
Glu Leu Leu Gln Glu Lys His Lys Ser Ile Gly Asn Phe Asp Gly Tyr
370 375 380
Gly Leu Leu Trp Ile Val Asp Ile Val Asn Ala Lys Thr Lys Thr Pro
385 390 395 400
Tyr Val Lys Leu Asp Arg Asn Phe Thr His Gly Met Asn Pro Asn Gln
405 410 415
Ile Pro Thr Gln Ile Ile Met Lys Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val Leu
420 425 430
Ile Gly Gly Val Met Pro Asn Thr Met Arg Ile Gly Ala Ser Leu Asn
435 440 445
Val Ser Arg Gly Asp Ile Asp Lys Ala Met Asp Ala Leu Asp Tyr Ala
450 455 460
Leu Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Glu Trp Gln
465 470
Claims (11)
1.一种反式氨基环己基类化合物的制备方法,其包括以下步骤:在氨基转移酶的存在下,将如式I所示的环己基酮类化合物和氨基供体进行如下所示的胺化反应,即得如式II所示的反式氨基环己基类化合物;
其中,R为-COOR1或-CN;R1为氢或C1~C6烷基;所述的氨基转移酶为氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的来源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶的突变体;
所述的突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第3位、第4位、第5位、第7位、第8位、第9位、第15位、第19位、第21位、第25位、第28位、第29位、第32位、第33位、第37位、第47位、第48位、第51位、第56位、第58位、第61位、第67位、第69位、第76位、第77位、第80位、第84位、第86位、第88位、第94位、第108位、第110位、第113位、第119位、第120位、第121位、第122位、第123位、第124位、第125位、第126位、第131位、第135位、第136位、第140位、第145位、第147位、第148位、第150位、第151位、第152位、第155位、第156位、第159位、第167位、第172位、第173位、第175位、第179位、第185位、第186位、第193位、第198位、第199位、第201位、第202位、第206位、第208位、第209位、第210位、第214位、第225位、第229位、第230位、第231位、第235位、第236位、第238位、第239位、第241位、第242位、第243位、第245位、第249位、第251位、第257位、第260位、第261位、第262位、第270位、第272位、第273位、第274位、第277位、第287位、第292位、第295位、第296位、第297位、第299位、第306位、第307位、第308位、第314位、第315位、第318位、第319位、第322位、第326位、第328位、第329位、第332位、第333位、第337位、第350位、第356位、第358位、第360位、第374位、第376位、第379位、第386位第396位、第398位、第403位、第411位、第417位、第418位、第424位、第428位、第434位、第435位、第439位、第446位、第448位、第450位、第451位、第469位、第472位、和第474位中的一个或多个。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,其满足下述条件的一种或多种:
(1)当所述的R1为C1~C6烷基时,所述的C1~C6烷基可为C1~C4烷基,例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基,还例如甲基或乙基;R优选为-COOH、-COOMe、-COOEt或-CN;
(2)所述的氨基供体为异丙胺、L-丙氨酸、DL-丙氨酸、L-赖氨酸、DL-赖氨酸、(S)-1-苯乙胺、(R)-1-苯乙胺、(RS)-1-苯乙胺、戊二胺、邻苯二甲胺、邻苯二甲胺盐酸盐、2-(4-硝基苯)乙胺、2-(4-硝基苯)乙胺盐酸盐中的一种或多种;较佳地,所述氨基供体为异丙胺;
(3)所述的氨基供体与所述的如式I所示的环己基酮类化合物的摩尔比为(1~4)∶1,例如1∶1、2∶1、3∶1或4∶1;
(4)所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液,或缓冲液和有机溶剂的混合物;所述的有机溶剂为甲基叔丁基醚、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙酸乙酯、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇;较佳地,所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液;
(5)所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺盐缓冲液和三乙醇胺盐缓冲液中的一种或多种;更优选为磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺盐缓冲液或三乙醇胺盐缓冲液;
(6)所述的缓冲液与所述的如式I所示的环己基酮类化合物的体积质量比为5~100mL/g,例如10mL/g或9mL/g;
(7)所述的胺化反应的pH值为6.0~9.0;更优选为7.0~9.0;例如7.5、8.0、8.5或9.0;
(8)所述的胺化反应的反应温度为25℃~50℃;例如27℃或37℃或47℃;
(9)所述的胺化反应的反应时间为16~20h;例如16h、18h或20h;
(10)所述的反式氨基环己基类化合物的制备方法,其包括以下步骤:向所述的缓冲液和氨基供体的混合液中,加入所述的如式I所示的环己基酮类化合物和所述的氨基转移酶,混合均匀后在25℃~50℃下反应即可;
(11)所述的胺化反应结束后包括以下后处理步骤:加入醚类溶剂进行萃取分液、水相加入醚类溶剂并利用碱调节pH调至13,有机相干燥并除去醚类溶剂即可;所述的醚类溶剂优选为甲基叔丁基醚;所述的干燥优选为干燥剂干燥;所述的干燥剂优选为无水硫酸钠;
(12)所述的碱为氢氧化钠或氢氧化钾,例如氢氧化钾;
(13)所述的除去醚类溶剂的方式为减压蒸馏,例如在压力为-0.09Mpa下减压蒸馏。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的突变体的为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的:
第3位替换为:D、G、H、K、N、R、S、W或Y;
和/或,第4位替换为:D、E、F、I、L、P、R、V或W;
和/或,第5位替换为:H、K、L、N或R;
和/或,第7位替换为:A、E、K、L、M、N、P、Q或T;
和/或,第8位替换为:A、G、H、M、P、S、V或W;
和/或,第9位替换为:A、C、D、E、H、N、P或Q;
和/或,第15位替换为:D、E、F、K、L、M、Q、S、T、V、W或Y;
和/或,第19位替换为:A、D、E、G、H、I、M、N、P、R、T、W或Y;
和/或,第21位替换为:A、C、D、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S或V;
和/或,第25位替换为:E、F、H、I、K、L、M、T、V或W;
和/或,第28位替换为:A、D、F、G、K、L、M、R、S、T或V;
和/或,第29位替换为:C、D、I、K、Q或S;
和/或,第32位替换为:C、D、F、G、K、P或Y;
和/或,第33位替换为:A、G、L、M、N、R或Y;
和/或,第37位替换为:D、H、K、P、Q、S、T、V、W或Y;
和/或,第47位替换为:A、C、F、G、I、R、S、T、V或W;
和/或,第48位替换为:A、E、F、G、H、I、P、Q、R、T、V或Y;
和/或,第51位替换为:C、D、E、F、G、M、N、P、R、W或Y;
和/或,第56位替换为:C、G、H、I、K、N、R、S或W;
和/或,第58位替换为:A、C、F、G、I、L、M、N、P、T或Y;
和/或,第61位替换为:A、C、L、R、V或W;
和/或,第67位替换为:E、F、H、K、M、N、P或Y;
和/或,第69位替换为:A、G、H、I、L、N、R、S或V;
和/或,第76位替换为:A、D、G、L、M、N、P、R、S、T或W;
和/或,第77位替换为:A、C、D、H、I、K、N、Q、R或T;
和/或,第80位替换为:A、F、H、K、P、Q、W或Y;
和/或,第84位替换为:C、F、H、K、L、M、P、Q、T、V、W或Y;
和/或,第86位替换为:A、D、E、G、I、K、N、P、S、T、V、W或Y;
和/或,第88位替换为:A、E、F、G、K、L、M、N、S、T或Y;
和/或,第94位替换为:C、D、F、G、I、K、N、P、Q、R、S或W;
和/或,第108位替换为:A、D、G、H、I、M、Q或T;
和/或,第110位替换为:C、E、F、Q、R或V;
和/或,第113位替换为:A、C、D、F、H、I、L、N、R或S;
和/或,第119位替换为:C、D、F、G、H、I、K、M、N、P、S或V;
和/或,第120位替换为:A、C、F、H、I、K、M、N、P或Q;
和/或,第121位替换为:F、H、I、Q、S、V、Y、F或I;
和/或,第122位替换为:L、N、V或Y;
和/或,第123位替换为:F、G、H、K、S或T;
和/或,第124位替换为:C、D、F、N、P或W;
和/或,第125位替换为:D、E、G、K、N、P、R、S或T;
和/或,第126位替换为:A、C、F、G、L、N、P、Q或W;
和/或,第131位替换为:C、G、H、I、M、R、T、V或W;
和/或,第135位替换为:A、D、G、H、K、L、Q、R、T或Y;
和/或,第136位替换为:E、F、G、K、M、N、P、S、V或W;
和/或,第140位替换为:C、G、K、M、N、P、R或S;
和/或,第145位替换为:D、E、F、G、I、K、L、M、Q、V、W或Y;
和/或,第147位替换为:D、F、G、H、K、M、Q、R、T、V、W或Y;
和/或,第148位替换为:A、E、F、K、L、M、N、Q、R、S、T或V;
和/或,第150位替换为:A、C、G、H、I、K、L、R、S、T或V;
和/或,第151位替换为:C、E、G、K、L、M、Q、R、S或W、
和/或,第152位替换为:D、I、K、M、N、P、Q、R、V或Y、
和/或,第155位替换为:E、F、K、M、N、P、R、S、T、W或Y、
和/或,第156位替换为:C、D、E、G、I、L、M、N、P、Q、R或W、
和/或,第159位替换为:D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、V或Y、
和/或,第167位替换为:E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T或W;
和/或,第172位替换为:A、C、D、E、G、H、M、N、P、Q、R、S、T、V或W;
和/或,第173位替换为:C、F、P、Q、R或V;
和/或,第175位替换为:D、E、G、H、I、K、S、V、W或Y;
和/或,第179位替换为:A、C、F、G、I、L、M、N、Q、R或V;
和/或,第185位替换为:A、D、E、F、H、I、K、M、N、P、T、V或W;
和/或,第186位替换为:A、D、E、F、H、K、L、M、N、P、Q或T;
和/或,第193位替换为:A、C、F、H、K、L、N、Q、R、S、T或Y;
和/或,第198位替换为:A、F、G、I、L、M、N、P、R、T、V或Y;
和/或,第199位替换为:C、D、H、I、K、M、N、P、Q、R或W;
和/或,第201位替换为:A、C、D、F、I、L、M、N、P、R、S或T;
和/或,第202位替换为:A、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S或Y;
和/或,第206位替换为:A、C、D、F、M、N、P、R、S、W或Y;
和/或,第208位替换为:C、H、I、K、M、Q、R或V;
和/或,第209位替换为:D、E、G、I、L、P、T、V、W或Y;
和/或,第210位替换为:A、G、H、I、K、L、Q、S或T;
和/或,第214位替换为:A、E、F、L、M、N、P、S、T或W;
和/或,第225位替换为:D、I、L、M、Q、R、V或W;
和/或,第229位替换为:A、C、F、G、H、K、M、P或R;
和/或,第230位替换为:A、C、F、G、H、K、M、Q、T、V或W;
和/或,第231位替换为:A、D、E、F、I、K、L、P、R或T;
和/或,第235位替换为:A、C、D、E、I、K、M、P、S或T;
和/或,第236位替换为:C、E、G、H、I、M、N、P、S、W或Y;
和/或,第238位替换为:C、D、E、F、H、K或P;
和/或,第239位替换为:A、C、F、G、H、I、K、Q、S、T、W或Y;
和/或,第241位替换为:A、D、K、P、Q、T或V;
和/或,第242位替换为:A、C、D、G、H、K、M、P、Q、R、W或Y;
和/或,第243位替换为:A、D、F、K、R、V、W或Y;
和/或,第245位替换为:A、D、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T或W;
和/或,第249位替换为:A、C、F、K、L、Q、S、V或W;
和/或,第251位替换为:F、G、I、L、N、P、Q、S、T、W或Y;
和/或,第257位替换为:G、P、Q或T;
和/或,第260位替换为:A、E、G、H、L、M、Q、R、S、T、V或W;
和/或,第261位替换为:A、D、F、G、K、M、N、R、T、W或Y;
和/或,第262位替换为:A、E、F、G、K、Q、V或W;
和/或,第270位替换为:C、D、E、F、G、H、I、L、P、Q、R、S或W;
和/或,第272位替换为:C、E、F、G、L、P、R、S、T或V;
和/或,第273位替换为:F、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y;
和/或,第274位替换为:A、C、F、G、I、K、L、M、N、R、T或Y;
和/或,第277位替换为:C、D、H、I、L、M、N、P、Q或Y;
和/或,第287位替换为:D、E、G、K、L、M、N、P、Q或Y;
和/或,第292位替换为:E、H、I、K、L、T、V、W或Y;
和/或,第295位替换为:A、F、R、S、V或Y;
和/或,第296位替换为:A、D、E、F、G、I、L、M、P、Q、R或T;
和/或,第297位替换为:A、F、I、K、L、M、P、R、S或W;
和/或,第299位替换为:C、D、E、F、G、H、L、M、P、R或V;
和/或,第306位替换为:A、C、I、N、S或Y;
和/或,第307位替换为:C、E、G、K、P、R、T或Y;
和/或,第308位替换为:E、F、G、H、L、M、N、R、S或Y;
和/或,第314位替换为:C、D、F、H、N、P、R、S、V或Y;
和/或,第315位替换为:A、C、D、E、F、H、I、L、M、P、Q、R或S、W或Y;
和/或,第318位替换为:D、E、F、I、K、L、M、N、Q、S、T或W;
和/或,第319位替换为:C、H、I、K、L、P、Q、R或V;
和/或,第322位替换为:A、E、F、G、I、L、N、S或W;
和/或,第326位替换为:D、G、H、I、N、R、S、T或Y;
和/或,第327位替换为:E、F、G、H、M、Q、T或Y;
和/或,第328位替换为:A、C、E、H、L、M、P、R或S;
和/或,第329位替换为:A、C、D、E、K、M、Q、T或W;
和/或,第332位替换为:C、D、E、M、Q、S、T、V或Y;
和/或,第333位替换为:H、L、T或Y;
和/或,第337位替换为:E、F、G、K、P、Q、R、S、V或Y;
和/或,第350位替换为:D、E、F、H、P、Q、T、V或W;
和/或,第356位替换为:A、D、E、F、H、L、M、N、P、R、S或T;
和/或,第358位替换为:C、G、I、K、N、P、Q、S、T或W;
和/或,第360位替换为:C、E、F、L、P、Q、R、S或Y;
和/或,第373位替换为:A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、Q、R、S、W或Y;
和/或,第374位替换为:C、D、G、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;
和/或,第376位替换为:A、C、E、G、H、I、L、M、Q、S、T、V或Y;
和/或,第379位替换为:D、E、H、K、M、N、P、R、W或Y;
和/或,第386位替换为:A、D、E、F、H、R、V或W;
和/或,第396位替换为:A、D、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S或Y;
和/或,第398位替换为:A、F、G、H、K、L、N、P、Q或T;
和/或,第403位替换为:F、G、K、P、Q、R、S、T、V、W或Y;
和/或,第410位替换为:D、E、F、M、N、P、R或S;
和/或,第411位替换为:A、C、D、E、G、I、L、S、T或Y;
和/或,第417位替换为:C、D、E、G、H、I、L、M、P或V;
和/或,第418位替换为:E、F、G、H、L、N、R、S、V、W或Y;
和/或,第424位替换为:A、H、I、K、L、M、N、P、R或W;
和/或,第428位替换为:C、D、E、L、N、P、S、V、W或Y;
和/或,第434位替换为:A、C、D、H、I、L、M、N、S或T;
和/或,第435位替换为:A、D、E、F、H、L、N、P、Q、S、T、W或Y;
和/或,第439位替换为:C、D、F、I、K、S、W或Y;
和/或,第446位替换为:A、E、G、K、L、M、N、P、R或T;
和/或,第448位替换为:A、D、E、F、K、R、W或Y;
和/或,第450位替换为:C、E、F、H、I、N、R、S或T;
和/或,第451位替换为:D、E、G、I、L或Q;
和/或,第469位替换为:A、E、F、G、H、I、L、M或N;
和/或,第472位替换为:A、F、L、P、R、S、T或Y;
和/或,第474位替换为:A、D、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、V或W。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述的氨基转移酶突变体的突变位点还包括选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的一个或多个;
优选地,所述的突变体还包括为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的:第59位替换为:E、F、I、K、L、M、P、R、T、V或Y;
和/或,第60位替换为:C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y;
和/或,第144位替换为:A、E、G、I、M、P、Q、R、W或Y;
和/或,第161位替换为:C、D、M或S;
和/或,第164位替换为:A、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、V或W;
和/或,第169位替换为:L;
和/或,第174位替换为:C、F、G、H、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y;
和/或,第240位替换为:A、D、F、I、K、M、P、S、T或W;
和/或,第244位替换为:C、D、H、L、Q、R、S、T、W或Y;
和/或,第330位替换为:A、D、E、I、V或Y;
和/或,第331位替换为:A、I、M、N、P、Q、S、T或W;
和/或,第387位替换为:A、C、D、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;
和/或,第422位替换为:N;
和/或,第436位替换为:A、F、G、H、K、M、N、P、Q、R、S或Y;
和/或,第437位替换为:E、F、H、I、L、N、Q、R、T、W或Y;
和/或,第442位替换为:D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、T、V或Y。
6.一种源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶突变体,其中所述的氨基转移酶突变体为如权利要求1~5任一项所述的氨基转移酶突变体。
7.一种分离的核酸,其中所述核酸编码如权利要求6所述的氨基转移酶突变体。
8.一种重组表达载体,其中所述重组表达载体包含如权利要求7所述的核酸。
9.一种转化体,其中所述转化体包含如权利要求8所述的重组表达载体。
10.一种制备如权利要求9所述转化体方法,其培养如权利要求9所述的转化体并获得含氨基转移酶突变体的培养物,即得。
11.一种如权利要求6所述的源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶突变体在制备反式氨基环己基类化合物中的应用。
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