CN114645027A - 一种来源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶突变体及其应用 - Google Patents

一种来源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的氨基转移酶突变体及其应用。其中，氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的一个或多个。本发明的氨基转移酶突变体能将环己酮类化合物催化合成为反式氨基环己基类化合物，且收率大于80％、纯度大于98.0％，反式氨基环己基类化合物在产物中的占比大于90％，具有较高的工业应用价值。

Description

一种来源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种来源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶突变体及其应用。
背景技术
反式氨基环己基类化合物是一种重要的药物合成前体，是多种处于临床阶段的创新化学药的重要砌块。此前的合成方法是，从对环己酮类化合物出发，经过化学催化形成顺式/反式混合的氨基环己基类化合物，再经过一次或多次重结晶，除去不需要的顺式构型。该法生产的步骤较多、收率较低(通常低于50％)，反应是以钯、铂、铑、钌等不可回收的贵金属作为催化剂，成本较高，或者以镍等重金属作为催化剂，会对环境造成污染，且过程中需要在密闭反应装置中使用高压氢气，安全风险较高。
与化学法相比，酶催化法具备特异性好、纯度高、反应温和、成本低等特点，是一种替代上述化学方法的绿色新工艺。目前研究和应用较多的天然氨基转移酶为UniProt IDF7J696(Biotechnol Lett,2003,25:1843-1846)、UniProt:F2XBU9(Biotechnol Bioeng,1999,65,206-211)、UniProt ID:Q0C8G1(Nat Chem Biol,2010,6:807-813.)、GenBankAccession No.KJ496414.1(Appl Microbiol Biotechnol,2014,98(17):7399-7408)、以及UniProt ID:Q7NWG4(Enzyme Microb Tech,2007,41:628-637)，但对上述反应的立体特异性仍不够高。其中来源于(Arthrobater Sp.Knk168，UniProt ID:F7J696)的氨基转移酶对该反应的立体选择性是66％左右。来源于河流弧菌(Vibro fluvialis JS17，UniProt:F2XBU9)的氨基转移酶对该反应的立体选择性仅有1％左右。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了解决现有技术中催化环己酮类化合物合成反式氨基环己类化化合物的酶催化活性不高的缺陷，故而，本发明从目前已知的天然氨基转移酶中筛选出对环己基酮类化合物氨基活性立体选择性好的一种来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的氨基转移酶，并经过定向转化得到若干立体选择性更高、催化活性更好的突变体。并在此基础上建立了酶催化反应制备反式氨基环己烷类化合物的合成工艺。
本发明提供了一种来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的氨基转移酶突变体，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的一个或多个。
本发明中，较佳地，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第60位、第144位、第164位、第169位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的一个或多个。
本发明中，所述的氨基转移酶的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1所示或巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的氨基转移酶(GI号为1048348995)。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位或第442位；较佳地，所述的氨基转移酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第60位、第387位、第436位或第442位。
本发明中，当所述的氨基转移酶突变体在如为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的多个位点发生突变时，所述的多个为2、3、4、5、6、7、8、9、10或12个；较佳地，所述的多个为2、3或5个。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的2个；例如，在第59位和第164位、第59位和第174位、第59位和第164位、第60位和436位、第60位和442位、第144位和437位、第161位和第327位、第161位和第330位、第164位和第169位、第164位和第240位、第164位和第437位、第169位和第240位、第169位和第436位、第169位和第437位、第174位和第244、第174位和第331位、第174位和第410位、第240位和第410位、第240位和第437位、第244位和436位、第244位和第437位、第327位和第373位、第327位和436位、第327位和第437位、第330位和第373位第330位和第437位、第387位和436位、第387位和第437位、第410位和第436位或第437位和第442位发生突变；较佳地，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第60位、第164位、第169位、第410位、第437位和第442位中的2个。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的3个。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的4个。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的5个；较佳地，所述的氨基转移酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第60位、第144位、第164位、第169位和第442位。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的6个。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位或第442位中的7个。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第331位、第373位、第387位、第410位、第437位和第442位中的8个。
本发明中，当所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第60位、第161位、第164位、第174位、第240位、第244位、第327位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位和第437位中的9个。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第60位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的10个；例如为“第60位、第240位、第244位、第327位、第331位、第373位、第387位、第410位、第437位和第442位”或“第60位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第373位、第387位、第410位、第436位和第442位”。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第373位、第387位、第410位、第436位和第442位中的11个；例如为“第59位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第373位、第387位、第410位和第442位”或“第59位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第373位、第387位、第410位和第436位。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第147位、第161位、第164位、第174位、第240位、第244位、第327位、第331位、第373位、第387位、第410位和第436位。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位的氨基酸残基由L突变为V、P、Q、R、C、F、S、D、M、K或T；较佳地，所述的第59位的氨基酸残基由L突变为V。
发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第60位的氨基酸残基由Y突变为C、T、H、D、A、F、W、L、V、I、P、S、N、M或K；较佳地，所述的第60位的氨基酸残基由Y突变为F、V或N。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第144位的氨基酸残基由R突变为A、K、G、D、E、W、F或T；较佳地，所述的第144位的氨基酸残基由R突变为G。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第161位的氨基酸残基由L突变为C、G、K、Q、D、A或F。
本发明中，所述氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第164位的氨基酸残基由Y突变为A、C、G、I、R、F、S、P或D；较佳地，所述的第164位的氨基酸残基由Y突变为C或G。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第169位的氨基酸残基由V突变为L、F、A、P、H、D、S、R或G；较佳地，所述的第169位的氨基酸残基由V突变为L或H。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第174位的氨基酸残基由E突变为C、H、S、T、A、W、R、F、G或Y；较佳地，所述的第174位的氨基酸残基由E突变为G。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第240位的氨基酸残基由Q突变为I、D、R、G、H、K、W、C、T、F、A或P；较佳地，所述的第240位的氨基酸残基由Q突变为F。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第244位的氨基酸残基由S突变为Q、L、F、K、A、P、W、R、Y、G、I、H、T或D。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第327位的氨基酸残基由S突变为H、K、G、D、A、T、Y、V、R、F、P或I；较佳地，所述的第327位的氨基酸残基由S突变为H。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第330位的氨基酸残基由T突变为K、P、I、W、S、P、A、H、F或G。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第331位的氨基酸残基由Y突变为D、S、W、Q、R、P、I或H；较佳地，所述的第331位的氨基酸残基由Y突变为H。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第373位的氨基酸残基由E突变为Q、C、D、W、P、G、T、Y或I；较佳地，所述的第373位的氨基酸残基由E突变为R。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第387位的氨基酸残基由L突变为T、R、A、S、D、F、Q、P或H；较佳地，所述的第387位的氨基酸残基由L突变为A、D或Q。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第410位的氨基酸残基由H突变为L、G、Q、R、W、P、D、T、S、F、Y或I；较佳地，所述的第410位的氨基酸残基由H突变为L、R或Y。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第436位的氨基酸残基由V突变为P、F、C、Q、S、W、G、Y或A；较佳地，所述的第436位的氨基酸残基由V突变为P或C。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第437位的氨基酸残基由M突变为F、D、A、P、K、G、L、H、R、T、V、Q、F或C；较佳地，所述的第437位的氨基酸残基由M突变为A。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第442位的氨基酸残基由R突变为G、I、D、W、K、S、A、Q、V、T、N、L、H或Y；较佳地，所述的第436位的氨基酸残基由R突变为K或I。
本发明中，所述的氨基转移酶突变体的突变位置和种类如下表所示：(如表1所示)；
表1
Figure BDA0002850021330000061
Figure BDA0002850021330000071
Figure BDA0002850021330000081
Figure BDA0002850021330000091
Figure BDA0002850021330000101
Figure BDA0002850021330000111
Figure BDA0002850021330000121
较佳地，所述的氨基转移酶突变体为突变体48、突变体28、突变体29、突变体46、突变体83、突变体183、突变体110、突变体64、突变体144、突变体171、突变体33、突变体29或突变体5。
本发明还提供了一种上述氨基转移酶突变体在制备反式氨基环己基类化合物的用途。
本发明还提供了一种反式氨基环己基类化合物的制备方法包括以下步骤：在氨基转移酶的存在下，将如式I所示的环己基酮类化合物和氨基供体进行如下所示的胺化反应，即得如式II所示的反式氨基环己基类化合物；
Figure BDA0002850021330000131
其中，R为-COOR1或-CN；R1为氢或C1～C6烷基；所述的酶为氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的氨基转移酶和/或如前所述的氨基转移酶突变体。
在某一方案中，所述的制备方法中的某些条件的定义可如下所述，其他条件的定义可如上任一方案所述(以下简称“在某一方案中”)：当所述的R1为C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基可为C1～C4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基，还例如甲基或乙基。
在某一方案中，R为-COOH、-COOMe、-COOEt或-CN。
在某一方案中，所述的氨基供体为本领域常规的氨基供体，较佳地，所述氨基供体为异丙胺、L-丙氨酸、DL-丙氨酸、L-赖氨酸、DL-赖氨酸、(S)-1-苯乙胺、(R)-1-苯乙胺、(RS)-1-苯乙胺、戊二胺、邻苯二甲胺、邻苯二甲胺盐酸盐、2-(4-硝基苯)乙胺、2-(4-硝基苯)乙胺盐酸盐中的一种或多种；更佳地，所述氨基供体为异丙胺。
在某一方案中，所述的氨基供体与所述的如式I所示的环己基酮类化合物的摩尔比为本领域常规的摩尔比；优选为(1～4)：1，例如1：1、2：1、3：1或4：1。
在某一方案中，所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液，或缓冲液和本领域常规的有机溶剂的混合物；所述的有机溶剂为甲基叔丁基醚、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙酸乙酯、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇；较佳地，所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液。
在某一方案中，当所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液和本领域常规的有机溶剂时，所述的有机溶剂占反应总体积的比例为0～250mL/L。
在某一方案中，所述的缓冲液为本领域常规的缓冲液，优选为磷酸盐缓冲液(PBS)、三羟甲基甲胺盐缓冲液(TRIS)和三乙醇胺盐缓冲液(TOEA)中的一种或多种；更优选为磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺盐缓冲液或三乙醇胺盐缓冲液。
在某一方案中，所述的缓冲液与所述的如式I所示的环己基酮类化合物的体积质量比为本领域常规的体积质量比；优选为5～100mL/g。
在某一方案中，所述的胺化反应的pH值为本领域常规的pH值，优选为6.0～9.0；更优选为7.0～9.0；例如7.0、7.5或9.0。
在某一方案中，所述的胺化反应的反应温度为本领域常规的反应温度，优选为25℃～40℃；更优选为30℃。
在某一方案中，所述的胺化反应的反应时间为本领域常规的反应时间，反应时间同通常与反应规模相关，优选为16～20h；例如16h、18h或20h。
在某一方案中，所述的反式氨基环己基类化合物的制备方法，其包括以下步骤：向所述的缓冲液和氨基供体的混合液中，加入所述的如式I所示的环己基酮类化合物和所述的氨基转移酶，混合均匀后在25℃～40℃下反应即可。
在某一方案中，所述的胺化反应结束后还包括以下后处理步骤：用酸将反应液pH调至4，加入醚类溶剂进行萃取分液、水相加入醚类溶剂并利用碱调节pH调至13，有机相干燥并除去醚类溶剂即可。
在某一方案中，所述的酸为本领域常规酸，优选为盐酸。
在某一方案中，所述的醚类溶剂为本领域常规醚类溶剂，优选为叔丁基甲醚。
在某一方案中，所述的干燥采用本领域常规的干燥方式，优选为干燥剂干燥；所述的干燥剂为本领域常规干燥剂，优选为无水硫酸钠。
在某一方案中，所述的碱为本领域常规碱，优选为氢氧化钠或氢氧化钾，例如氢氧化钾。
在某一方案中，所述的除去醚类溶剂的方式为本领域常规方式，优选为减压蒸馏，例如在压力为-0.09Mpa下减压蒸馏。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表2所示。
表2
Figure BDA0002850021330000141
Figure BDA0002850021330000151
本发明的积极进步效果在于：
本发明通过基因工程对一株氨基转移酶进行定向进化，得到若干具有更高活性、立体特异性的突变体。本发明基于上述氨基转移酶突变体，开发了从环己酮类化合物出发一步合成反式氨基环己基类化合物的反应工艺，收率大于80％，纯度大于98.0％，且反式氨基环己基类化合物在产物中的占比大于90％。
附图说明
图1为实施例6的反应液气相色谱图；
图2为环己酮羧酸乙酯标准品的气相色谱图；
图3为反式对氨基环己基羧酸乙酯标准品的气相色谱图；
图4为实施例6的产物反式对氨基环己基羧酸乙酯超临界流体色谱检测图；
图5为反式、顺式氨基环己基羧酸乙酯标准品超临界流体色谱检测图；
图6为实施例6的产物反式对氨基环己基羧酸乙酯的核磁图；
图7为实施例14的反应液气相色谱图；
图8为实施例15的反应液气相色谱图；
图9为实施例16的反应液气相色谱图；
图10为对环己酮羧酸甲酯标准品的气相色谱图；
图11为实施例16的产物反式对氨基环己基羧酸甲酯超临界流体色谱检测图；
图12为反式对氨基环己基羧酸甲酯标准品超临界流体色谱检测图；
图13为实施例17的反应液气相色谱图；
图14为实施例21的反应液气相色谱图；
图15为实施例21的产物反式对氨基环己基羧酸乙酯的液相色谱图；
图16为实施例22的反应液气相色谱图；
图17为实施例22的产物反式对氨基环己基羧酸乙酯的液相色谱图；
图18为实施例23的反应液气相色谱图；
图19为实施例23的产物反式对氨基环己基羧酸乙酯的液相色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)，搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体48的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应16h。结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，经柱层析纯化，最终得到产物0.0980g，收率为98.0％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例2
在TOEA缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的TOEA缓冲液，搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体28的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应16h。结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，加入4.0mL甲基叔丁基醚进行萃取，萃取之后取出水相在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，经柱层析纯化，最终得到产物0.0819g，收率为81.9％，产物经核磁检测，结果显示，对反式氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例3
在Tris缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的Tris缓冲液,搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到2.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体183的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应18h。结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，加入4.0mL甲基叔丁基醚进行萃取，萃取之后取出水相在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，经柱层析纯化，最终得到产物0.0842g，收率为84.2％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例4
在氨基供体异丙胺与化合物1的比例为2.0mol/mol的条件下氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和200mmol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为1.0mol/mol)的PBS缓冲液，搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体110的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应18h。结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0962g，收率为96.2％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例5
在pH＝7.0条件下氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.0的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液，搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体64的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应16h。结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0975g，得率为97.5％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例6
在200mL反应液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向500mL的夹套瓶中加入0.10g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、200mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液，并向溶液中添加20.0g的化合物1和20.0g具有突变体144的氨基转移酶，机械搅拌直至固体全部溶解形成均一溶液，并在30℃条件下反应18h。取出1.0mL的反应液并用1.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，甲基叔丁基醚的提取物经气相色谱显示，氨基转移酶对化合物1的转化率为99.65％(气相色谱如图1所示；对氨基环己基羧酸乙酯保留时间为10.230；对环己酮羧酸乙酯(保留时间10.70)和对氨基环己基羧酸乙酯(保留时间10.32)标准品的气相色谱图分别如图2和图3所示；图1中对氨基环己基羧酸乙酯的含量占总原料的99.65％)，将夹套瓶中的所有溶液于40℃条件下旋蒸4～6h以去除丙酮，之后加入200mL的水，并用400mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，最后经由过滤得到滤液并于35℃条件下旋蒸，最终得到的产物为19.64g，收率为98.2％；产物经超临界流体色谱检测，立体纯度：反式:顺式＝98.72:1.28(超临界流体色谱如图4；反式:顺式标准品的超临界流体色谱如图5；反式标准品保留时间约为2.119min；顺式标准品保留时间约为2.689min)；产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％(核磁图谱如图6所示)。
实施例7
在pH＝9.0条件下氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和200mmol/L、30mL pH＝9.0的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液,搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1mg的化合物1和0.1g具有突变体37的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应20h，结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，加入4.0mL甲基叔丁基醚进行萃取，萃取之后取出水相在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0975g，收率为97.5％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例8
在缓冲液与化合物1的比例为5mL/g的条件下氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和200mmol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液,搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出0.5mL的溶液加入到2.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体156的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应18h，结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，加入4.0mL甲基叔丁基醚进行萃取，萃取之后取出水相在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，经柱层析纯化，最终得到产物0.0886g，收率为88.6％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例9
在缓冲液与化合物1的比例为20mL/g的条件下氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液,搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体171的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应18h，结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0980g，收率为98.0％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例10
在20℃条件下氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液，搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体33的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于20℃条件下反应18h，结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0973g，收率为97.3％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例11
在40℃条件下氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液，搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体29的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于40℃条件下反应20h，结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，加入4.0mL甲基叔丁基醚进行萃取，萃取之后取出水相在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，经柱层析纯化，最终得到产物0.0826g，经柱层析纯化，收率为82.6％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例12
在氨基转移酶的加酶量与缓冲液比例为1：50的条件下催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液，搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.02g具有突变体5的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应18h，结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，加入4.0mL甲基叔丁基醚进行萃取，萃取之后取出水相在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，经柱层析纯化，经柱层析纯化，最终得到产物0.0834g，得率为83.4％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例13
在氨基供体与化合物1的比例为0.8:1的条件下催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为0.8mol/mol)的PBS缓冲液,搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体64的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应16h。结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，甲基叔丁基醚的提取物经气相色谱显示，氨基转移酶对化合物1的转化率为48.8％；萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，经柱层析纯化，最终得到产物0.0453g，收率为45.3％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例14
在缓冲液与化合物1的比例为3mL/g的条件下氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液,搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出0.3mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体144的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应16h。结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，甲基叔丁基醚的提取物经气相色谱显示，氨基转移酶对化合物1的转化率为49.1％(气相色谱如图7所示，其中对氨基环己基羧酸乙酯的保留时间为10.23，原料的保留时间为10.58，两个物质的峰面积比为49.1:50.9)；萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，经柱层析纯化，最终得到产物0.0446g，收率为44.6％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例15
pH＝10条件下氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝10的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液，搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体33的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于20℃条件下反应18h，结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，甲基叔丁基醚的提取物经气相色谱显示，氨基转移酶对化合物1的转化率为81.8％(气相色谱如图8所示，其中氨基环己基羧酸乙酯的保留时间为10.21，原料的保留时间为10.57，两个物质的峰面积比为81.8:18.2)萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，经柱层析纯化，最终得到产物0.0783g，收率为78.3％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例16
在pH＝7.5条件下氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸甲酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液,搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出20.0mL的溶液加入到40.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加2g的化合物1和2g具有突变体83的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应16h。结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入20.0mL的水，并用40.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，甲基叔丁基醚的提取物经气相色谱显示，氨基转移酶对化合物1的转化率为99.6％(气相色谱如图9所示；对环己酮羧酸甲酯标准品的气相色谱如图10所示，保留时间11.38min)；萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0953g，收率为95.3％，产物经超临界流体色谱检测，立体纯度：反式:顺式＝96.96:3.04(超临界流体色谱如图11所示；反式标准品的超临界流体色谱如图12所示)；产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸甲酯的纯度大于98％。
实施例17
在pH＝10条件下氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸甲酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝10的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液,搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出20.0mL的溶液加入到40.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加2g的化合物1和2g具有突变体83的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应16h。结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入20.0mL的水，并用40.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，甲基叔丁基醚的提取物经气相色谱显示，氨基转移酶对化合物1的转化率为52.83％(气相色谱如图13所示，其中氨基环己基羧酸甲酯的保留时间10.20，原料的保留时间为10.57，两个物质的峰面积比为52.83:41.17)；萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，经柱层析纯化，最终得到产物0.0469g，收率为46.9％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸甲酯的纯度大于98％。
实施例18
在pH＝7.5条件下氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基氰基。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液，搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体10的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于20℃条件下反应18h，结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，经柱层析纯化，最终得到产物0.0912g，收率为91.2％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸氰基的纯度大于98％。
实施例19
在pH＝7.5条件下氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液，搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体46的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于20℃条件下反应18h，结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，经柱层析纯化，最终得到产物0.0956g，收率为95.6％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸的纯度大于98％。
实施例20
在缓冲液与化合物1的比例为3mL/g的条件下氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。
向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)的PBS缓冲液，搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出0.3mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g具有突变体46的氨基转移酶。漩涡震荡混匀所得的溶液后于20℃条件下反应18h，结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，经柱层析纯化，最终得到产物0.0786g，收率为78.6％，产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸的纯度大于98％。
本发明中，实施例1-5，实施例7-20检测最终产物反式对氨基环己基类化合物立体选择性的方法与实施例6相同，且都能达到98％的反式立体选择性。
实施例21
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)，搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的氨基转移酶(SEQ ID NO:1，GI号：1048348995)。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应16h。结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，甲基叔丁基醚的提取物经气相色谱显示，氨基转移酶对化合物1的转化率为98.1％(气相色谱如图14所示，其中氨基环己基羧酸乙酯的保留时间10.114，原料的保留时间为10.456，两个物质的峰面积比为98.1:1.9)；萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0960g，收率为96.0％，产物经核磁检测，结果显示，对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。产物经超临界流体色谱检测，立体纯度：反式:顺式＝78.38:21.62(超临界流体色谱如图15所示)；产物经核磁检测，结果显示，反式对氨基环己基羧酸乙酯的纯度大于98％。
实施例22
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成反式对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)，搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g来源于节杆菌(Arthrobater Sp.Knk168)的氨基转移酶(Uniport ID:F7J696)。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应16h。结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，甲基叔丁基醚的提取物经气相色谱显示，氨基转移酶对化合物1的转化率为99.8％(气相色谱如图16所示，其中氨基环己基羧酸乙酯的保留时间10.319，原料的保留时间为10.679，两个物质的峰面积比为99.78:0.22)；产物经液相色谱检测，立体纯度：反式:顺式＝66.17:33.83(液相色谱如图17所示)；
实施例23
在PBS缓冲液中氨基转移酶催化化合物1合成对氨基环己基羧酸乙酯。向100mL的烧杯中加入0.015g的磷酸吡哆醛和0.2mol/L、30mL pH＝7.5的含异丙胺的PBS缓冲液(氨基供体与化合物1的比例为4.0mol/mol)，搅拌直到磷酸吡哆醛全部溶解得到均匀的溶液。从烧杯中取出1.0mL的溶液加入到4.0mL的反应瓶中，并向溶液中添加0.1g的化合物1和0.1g来源于河流弧菌(Vibrio fluvialis JS17)的氨基转移酶(Uniport ID:F2XBU9)。漩涡震荡混匀所得的溶液后于30℃条件下反应16h。结束后取出反应液并用盐酸将反应液pH调至4，-0.09MPa(表压)的真空度下减压蒸馏0.5～1h以去除丙酮，之后加入1.0mL的水，并用2.0mL的甲基叔丁基醚进行萃取(用氢氧化钾调节pH＝13)，甲基叔丁基醚的提取物经气相色谱显示，氨基转移酶对化合物1的转化率为99.8％(气相色谱如图18所示，其中氨基环己基羧酸乙酯的保留时间10.528，原料的保留时间为10.945，两个物质的峰面积比为99.78:0.22)；产物经液相色谱检测，立体纯度：反式:顺式＝1.0:99.0(液相色谱如图19所示)；
实施例24氨基转移酶突变体文库的构建
针对SEQ ID NO:1的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中一个或多个位点进行突变，并筛选出催化活性较高的突变体2-突变体196，具体突变的位点和种类如表3所示，发应条件与实施例1相同，不同之处为反应的催化酶的突变体替换为表3中突变体，反应效果如表3所示：
表3
Figure BDA0002850021330000261
Figure BDA0002850021330000271
Figure BDA0002850021330000281
Figure BDA0002850021330000291
Figure BDA0002850021330000301
Figure BDA0002850021330000311
Figure BDA0002850021330000321
Figure BDA0002850021330000331
Figure BDA0002850021330000341
SEQUENCE LISTING
<110> 上海合全药物研发有限公司
上海合全药业股份有限公司
<120> 一种来源于巨大芽孢杆菌的氨基转移酶突变体及其应用
<130> P20016335C
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 483
<212> PRT
<213> Bacillus megaterium
<400> 1
Met Ser Leu Thr Val Gln Lys Ile Asn Trp Glu Gln Val Lys Glu Trp
1 5 10 15
Asp Arg Lys Tyr Leu Met Arg Thr Phe Ser Thr Gln Asn Glu Tyr Gln
20 25 30
Pro Val Pro Ile Glu Ser Thr Glu Gly Asp Tyr Leu Ile Met Pro Asp
35 40 45
Gly Thr Arg Leu Leu Asp Phe Phe Asn Gln Leu Tyr Cys Val Asn Leu
50 55 60
Gly Gln Lys Asn Gln Lys Val Asn Ala Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asp
65 70 75 80
Arg Tyr Gly Phe Val Trp Asp Thr Tyr Ala Thr Asp Tyr Lys Ala Lys
85 90 95
Ala Ala Lys Ile Ile Ile Glu Asp Ile Leu Gly Asp Glu Asp Trp Pro
100 105 110
Gly Lys Val Arg Phe Val Ser Thr Gly Ser Glu Ala Val Glu Thr Ala
115 120 125
Leu Asn Ile Ala Arg Leu Tyr Thr Asn Arg Pro Leu Val Val Thr Arg
130 135 140
Glu His Asp Tyr His Gly Trp Thr Gly Gly Ala Ala Thr Val Thr Arg
145 150 155 160
Leu Arg Ser Tyr Arg Ser Gly Leu Val Gly Glu Asn Ser Glu Ser Phe
165 170 175
Ser Ala Gln Ile Pro Gly Ser Ser Tyr Asn Ser Ala Val Leu Met Ala
180 185 190
Pro Ser Pro Asn Met Phe Gln Asp Ser Asp Gly Asn Leu Leu Lys Asp
195 200 205
Glu Asn Gly Glu Leu Leu Ser Val Lys Tyr Thr Arg Arg Met Ile Glu
210 215 220
Asn Tyr Gly Pro Glu Gln Val Ala Ala Val Ile Thr Glu Val Ser Gln
225 230 235 240
Gly Ala Gly Ser Ala Met Pro Pro Tyr Glu Tyr Ile Pro Gln Ile Arg
245 250 255
Lys Met Thr Lys Glu Leu Gly Val Leu Trp Ile Asn Asp Glu Val Leu
260 265 270
Thr Gly Phe Gly Arg Thr Gly Lys Trp Phe Gly Tyr Gln His Tyr Gly
275 280 285
Val Gln Pro Asp Ile Ile Thr Met Gly Lys Gly Leu Ser Ser Ser Ser
290 295 300
Leu Pro Ala Gly Ala Val Leu Val Ser Lys Glu Ile Ala Ala Phe Met
305 310 315 320
Asp Lys His Arg Trp Glu Ser Val Ser Thr Tyr Ala Gly His Pro Val
325 330 335
Ala Met Ala Ala Val Cys Ala Asn Leu Glu Val Met Met Glu Glu Asn
340 345 350
Phe Val Glu Gln Ala Lys Asp Ser Gly Glu Tyr Ile Arg Ser Lys Leu
355 360 365
Glu Leu Leu Gln Glu Lys His Lys Ser Ile Gly Asn Phe Asp Gly Tyr
370 375 380
Gly Leu Leu Trp Ile Val Asp Ile Val Asn Ala Lys Thr Lys Thr Pro
385 390 395 400
Tyr Val Lys Leu Asp Arg Asn Phe Thr His Gly Met Asn Pro Asn Gln
405 410 415
Ile Pro Thr Gln Ile Ile Met Lys Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val Leu
420 425 430
Ile Gly Gly Val Met Pro Asn Thr Met Arg Ile Gly Ala Ser Leu Asn
435 440 445
Val Ser Arg Gly Asp Ile Asp Lys Ala Met Asp Ala Leu Asp Tyr Ala
450 455 460
Leu Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Glu Trp Gln Ala Leu Glu His His His
465 470 475 480
His His His

Claims (10)

1.一种来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的氨基转移酶突变体，其特征在于，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的一个或多个。
2.如权利要求1所述的氨基转移酶突变体，其特征在于，所述的氨基转移酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位或第442位；较佳地，所述的氨基转移酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第60位、第387位、第436位或第442位；
和/或，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的2个；例如，在第59位和第164位、第59位和第174位、第59位和第164位、第60位和436位、第60位和442位、第144位和437位、第161位和第327位、第161位和第330位、第164位和第169位、第164位和第240位、第164位和第437位、第169位和第240位、第169位和第436位、第169位和第437位、第174位和第244、第174位和第331位、第174位和第410位、第240位和第410位、第240位和第437位、第244位和436位、第244位和第437位、第327位和第373位、第327位和436位、第327位和第437位、第330位和第373位第330位和第437位、第387位和436位、第387位和第437位、第410位和第436位或第437位和第442位发生突变；较佳地，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第60位、第164位、第169位、第410位、第437位和第442位中的2个；
和/或，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的3个；
和/或，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的4个；
和/或，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的5个；较佳地，所述的氨基转移酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第60位、第144位、第164位、第169位和第442位；
和/或，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的6个；
和/或，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第144位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位或第442位中的7个；
和/或，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第60位、第144位、第161位、第164位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第331位、第373位、第387位、第410位、第437位和第442位中的8个；
和/或，当所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第60位、第161位、第164位、第174位、第240位、第244位、第327位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位和第437位中的9个；
和/或，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第60位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第331位、第373位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的10个；例如为“第60位、第240位、第244位、第327位、第331位、第373位、第387位、第410位、第437位和第442位”或“第60位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第373位、第387位、第410位、第436位和第442位”；
和/或，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第373位、第387位、第410位、第436位和第442位中的11个；例如为“第59位、第161位、第164位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第373位、第387位、第410位和第442位”或“第59位、第169位、第174位、第240位、第244位、第327位、第330位、第373位、第387位、第410位和第436位；
和/或，所述的氨基转移酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位、第147位、第161位、第164位、第174位、第240位、第244位、第327位、第331位、第373位、第387位、第410位和第436位；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第59位的氨基酸残基由L突变为V、P、Q、R、C、F、S、D、M、K或T；较佳地，所述的第59位的氨基酸残基由L突变为V；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第60位的氨基酸残基由Y突变为C、T、H、D、A、F、W、L、V、I、P、S、N、M或K；较佳地，所述的第60位的氨基酸残基由Y突变为F、V或N；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第144位的氨基酸残基由R突变为A、K、G、D、E、W、F或T；较佳地，所述的第144位的氨基酸残基由R突变为G；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第161位的氨基酸残基由L突变为C、G、K、Q、D、A或F；
和/或，所述氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第164位的氨基酸残基由Y突变为A、C、G、I、R、F、S、P或D；较佳地，所述的第164位的氨基酸残基由Y突变为C或G；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第169位的氨基酸残基由V突变为L、F、A、P、H、D、S、R或G；较佳地，所述的第169位的氨基酸残基由V突变为L或H；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第174位的氨基酸残基由E突变为C、H、S、T、A、W、R、F、G或Y；较佳地，所述的第174位的氨基酸残基由E突变为G；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第240位的氨基酸残基由Q突变为I、D、R、G、H、K、W、C、T、F、A或P；较佳地，所述的第240位的氨基酸残基由Q突变为F；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第244位的氨基酸残基由S突变为Q、L、F、K、A、P、W、R、Y、G、I、H、T或D；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第327位的氨基酸残基由S突变为H、K、G、D、A、T、Y、V、R、F、P或I；较佳地，所述的第327位的氨基酸残基由S突变为H；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第330位的氨基酸残基由T突变为K、P、I、W、S、P、A、H、F或G；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第331位的氨基酸残基由Y突变为D、S、W、Q、R、P、I或H；较佳地，所述的第331位的氨基酸残基由Y突变为H；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第373位的氨基酸残基由E突变为Q、C、D、W、P、G、T、Y或I；较佳地，所述的第373位的氨基酸残基由E突变为R；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第387位的氨基酸残基由L突变为T、R、A、S、D、F、Q、P或H；较佳地，所述的第387位的氨基酸残基由L突变为A、D或Q；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第410位的氨基酸残基由H突变为L、G、Q、R、W、P、D、T、S、F、Y或I；较佳地，所述的第410位的氨基酸残基由H突变为L、R或Y；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第436位的氨基酸残基由V突变为P、F、C、Q、S、W、G、Y或A；较佳地，所述的第436位的氨基酸残基由V突变为P或C；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第437位的氨基酸残基由M突变为F、D、A、P、K、G、L、H、R、T、V、Q、F或C；较佳地，所述的第437位的氨基酸残基由M突变为A；
和/或，所述的氨基转移酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第442位的氨基酸残基由R突变为G、I、D、W、K、S、A、Q、V、T、N、L、H或Y；较佳地，所述的第436位的氨基酸残基由R突变为K或I。
3.如权利要求2所述的氨基转移酶突变体，其特征在于，所述的氨基转移酶突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第60位、第144位、第164位、第169位、第387位、第410位、第436位、第437位和第442位中的一个或多个；
较佳地，所述的多个为2、3、4、5、6、7、8、9、10或12个；更佳地，所述的多个为2、3或5个。
4.如权利要求1所述的氨基转移酶突变体，其特征在于，所述的氨基转移酶突变体的突变位置和种类如下表所示：
Figure FDA0002850021320000041
Figure FDA0002850021320000051
Figure FDA0002850021320000061
Figure FDA0002850021320000071
Figure FDA0002850021320000081
Figure FDA0002850021320000091
Figure FDA0002850021320000101
Figure FDA0002850021320000111
较佳地，所述的氨基转移酶突变体为突变体48、突变体28、突变体29、突变体46、突变体83、突变体183、突变体110、突变体64、突变体144、突变体171、突变体33、突变体29或突变体5。
5.一种如权利要求1-4中任一项所述的氨基转移酶突变体在制备反式氨基环己基类化合物的用途。
6.一种反式氨基环己基类化合物的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：在氨基转移酶的存在下，将如式I所示的环己基酮类化合物和氨基供体进行如下所示的胺化反应，即得如式II所示的反式氨基环己基类化合物；
Figure FDA0002850021320000121
其中，R为-COOR1或-CN；R1为氢或C1～C6烷基；所述的氨基转移酶为氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的氨基转移酶和/或如权利要求1-4中任一项所述的氨基转移酶突变体。
7.如权利要求6所述的反式氨基环己基类化合物的制备方法，其特征在于，当所述的R1为C1～C6烷基时，所述的C1～C6烷基为C1～C4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基，还例如甲基或乙基；
和/或，所述氨基供体为异丙胺、L-丙氨酸、DL-丙氨酸、L-赖氨酸、DL-赖氨酸、(S)-1-苯乙胺、(R)-1-苯乙胺、(RS)-1-苯乙胺、戊二胺、邻苯二甲胺、邻苯二甲胺盐酸盐、2-(4-硝基苯)乙胺、2-(4-硝基苯)乙胺盐酸盐中的一种或多种；较佳地，所述氨基供体为异丙胺；
和/或，所述的氨基供体与所述的如式I所示的环己基酮类化合物的摩尔比为(1～4)：1，例如1：1、2：1、3：1或4：1；
和/或，所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液，或缓冲液和有机溶剂的混合物；所述的有机溶剂为甲基叔丁基醚、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙酸乙酯、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇；较佳地，所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液；
和/或，所述的有机溶剂占反应总体积的比例为0～250mL/L；
和/或，所述的缓冲液与所述的如式I所示的环己基酮类化合物的体积质量比为5～100mL/g；
和/或，所述的胺化反应的反应温度为25℃～40℃；优选为30℃；
和/或，所述的胺化反应的反应时间为16～20h；例如16h、18h或20h。
8.如权利要求7所述的反式氨基环己基类化合物的制备方法，其特征在于，R为-COOH、-COOMe、-COOEt或-CN；
和/或，所述的胺化反应的pH值为6.0～9.0；优选为7.0～9.0；例如7.0、7.5或9.0；
和/或，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺盐缓冲液和三乙醇胺盐缓冲液中的一种或多种；优选为磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺盐缓冲液或三乙醇胺盐缓冲液；
和/或，所述的反式氨基环己基类化合物的制备方法包括以下步骤：向所述的缓冲液和氨基供体的混合液中，加入所述的如式I所示的环己基酮类化合物和所述的氨基转移酶，混合均匀后在25℃～40℃下反应即可。
9.如权利要求6-8中任一项所述的反式氨基环己基类化合物的制备方法，其特征在于，所述的胺化反应结束后还包括以下后处理步骤：用酸将反应液pH调至4，加入醚类溶剂进行萃取分液、水相加入醚类溶剂并利用碱调节pH调至13，有机相干燥并除去醚类溶剂即可。
10.如权利要求9所述的反式氨基环己基类化合物的制备方法，其特征在于，所述的酸为盐酸；
和/或，所述的干燥采用干燥剂干燥；优选地，所述的干燥剂为无水硫酸钠；
和/或，所述的碱为氢氧化钠或氢氧化钾；例如氢氧化钾；
和/或，所述的除去醚类溶剂的方式为减压蒸馏，例如在压力为-0.09Mpa下减压蒸馏。
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