CN116397034B - 一种与鸡鹿角冠性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与鸡鹿角冠性状相关的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与鸡鹿角冠性状相关的分子标记及其应用，属于动物遗传育种技术及分子生物学领域。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。根据所述分子标记设计核苷酸序列如SEQ ID NO:2‑3所示的引物组，以及核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的Taqman探针，通过实时荧光定量核酸扩增即可完成对鸡鹿角冠的分离鉴定，利用本发明的方法还可筛选杂合鹿角冠基因型，对鹿角冠性状辅助选择育种具有重要价值。

Description

一种与鸡鹿角冠性状相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及动物遗传育种技术及分子生物学领域，特别是涉及一种与鸡鹿角冠性状相关的分子标记及其应用。
背景技术
传统的通过鸡毛色黄度、羽毛花色及长度来主观判断产品品质和来源的手段已无法实现，现急需一种新的标志来作为判断优质江村黄鸡与其它鸡种冰鲜产品的手段。
鸡冠在大部分整鸡冰鲜产品中都会保留，鹿角冠作为江村黄鸡特有的性状，是判断其整鸡冰鲜产品的有效标志，鹿角冠的性状和单冠有着截然不同的外观，其呈现出鸡冠后缘三分之一分叉的外观。这种分叉发生在鸡冠冠底区域，在分叉出来的冠齿上又会出现第二次分叉，整体形态如“树杈”又像“鹿角”，故命名为鹿角冠。但鸡冠后缘分叉的现象在三叉冠的性状中也相似出现，相较于鹿角冠，三叉冠的分叉的程度较弱，分叉冠齿较少（通常只有1~2个额外分叉冠齿），但也时常混入鹿角冠个体中，仅凭表型难以区分，影响选育工作。此外，鹿角冠是单基因控制的性状，其对野生型的单冠性状为显性。因此，如何使用客观的方法正确选择鹿角冠性状，并剔除具有单冠等位基因的杂合子，是保证其鹿角冠稳定遗传的重要问题。
实时荧光定量核酸扩增（qPCR）是一种在PCR进行的同时，对反应过程和产物进行实时监测的方法。TaqMan实时荧光定量PCR则依据荧光共振能量转移原理，即在PCR扩增中加入一个特异性的荧光探针引物，该探针引物两端分别标记一个报告基团和一个淬灭基团，通过检测PCR反应体系中的荧光强度可以达到监测PCR产物扩增量的目的。该方法具有特异性强、灵敏度高等特点，目前在国内的临床诊断中应用最为广泛。在TaqMan实时荧光定量PCR流程中，若目标核酸序列的起始拷贝数越高，则会越快观察到荧光的显著增加。于是在相同DNA浓度情况下，该方法可以用于检测某段核酸序列是否发生拷贝数变异（CNV）。因此基于TaqMan实时荧光定量PCR鉴定“鹿角冠”的分子标记，用于筛选杂合“鹿角冠”基因型，对“鹿角冠”性状的辅助选择育种具有重要价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种与鸡鹿角冠性状相关的分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，根据本发明的分子标记，采用实时荧光定量核酸扩增即可完成对鸡鹿角冠的分离鉴定，还可筛选杂合鹿角冠基因型，对鹿角冠性状辅助选择育种具有重要价值。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种与鸡鹿角冠性状相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供一种检测所述分子标记的Taqman探针引物组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的Taqman探针。
本发明还提供一种鸡鹿角冠性状的检测试剂盒，包括所述的Taqman探针引物组。
本发明还提供一种鸡冠型性状基因型的检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待测鸡基因组DNA；
（2）以稀释的待测鸡基因组DNA为模板，利用所述的Taqman探针引物组进行实时荧光定量核酸扩增，获得CT值；
（3）根据CT值计算RQ值，以单冠性状鸡种为对照组，通过鉴定待测鸡鹿角冠性状的基因型，若/>≥2，则判断待测个体的基因型为AA；若1.2≤＜2，则判断待测个体的基因型为Aa；若/>＜1.2，则判断待测个体的基因型为aa。
进一步地，在步骤（2）中，所述实时荧光定量核酸扩增的反应体系包括：模板DNA 1μL，10μM浓度正向引物0.4μL，10μM浓度反向引物0.4μL，10μM浓度Taqman探针引物0.1μL，Probe qPCR Master mix 5μL，ddH2O 3.1μL。
进一步地，在步骤（2）中，所述实时荧光定量核酸扩增的反应程序包括：去污染50℃ 2min；预变性95℃ 10min；变性95℃ 15s，退火并延伸60℃ 60s，40个循环。
进一步地，在步骤（2）中，所述模板中DNA的浓度为100ng/μL。
本发明还提供一种所述的分子标记、所述的Taqman探针引物组或所述的检测试剂盒在检测鸡冠性状中的应用，所述鸡冠性状包括鹿角冠、单冠和三叉冠。
本发明还提供一种所述的分子标记、所述的Taqman探针引物组或所述的检测试剂盒在鉴定鸡鹿角冠基因型中的应用。
本发明还提供一种所述的分子标记、所述的Taqman探针引物组或所述的检测试剂盒在鸡鹿角冠性状选育中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明发现鹿角冠鸡基因组19号染色体上一段15kb左右的拷贝数变异（CNV），在该段序列上设计引物及Taqman探针，通过对引物与Taqman探针组合出现的错配、发夹结构、引物二聚体等情况进行筛选，最终获得的引物组具有良好的特异性，通过DNA提取、DNA稀释、实时荧光定量核酸扩增即可完成对鸡鹿角冠的分离鉴定，利用本发明的方法还可筛选杂合鹿角冠基因型，对鹿角冠性状辅助选择育种具有重要价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同鸡种群体RQ值之间差异的显著性分析，其中，**为差异极其显著（P<0.001）；*为差异显著（P<0.05）；ns为差异不显著；
图2为不同基因型个体值之间差异的显著性分析，其中，**为差异极其显著（P<0.001）；*为差异显著（P<0.05）；ns为差异不显著。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明发现鹿角冠基因座涉及鸡19号染色体上一段15kb左右的拷贝数变异（CNV），针对这一特点，本发明使用Taqman探针的方法，对鸡DNA进行实时荧光定量核酸扩增（qPCR）便可以有效的检测该基因座。在相同的DNA浓度下，拥有鹿角冠性状的个体相较于表型为野生型的单冠个体，qPCR结果会显示出显著差异的RQ值（P<0.001），杂合和纯合鹿角冠个体的RQ值的差异则会通过反应出来。三叉冠与鹿角冠是外形相似但基因座完全不同的两种性状，通过DNA提取、DNA稀释、实时荧光定量核酸扩增同样可以完成对鹿角冠与三叉冠性状的分离鉴定。
实施例1 TaqMan实时荧光定量PCR检测鹿角冠性状分子标记在不同群体中的使用
本实施例中一共使用4个群体去验证TaqMan实时荧光定量PCR的方法是否可以用于鹿角冠性状基因座的检测。总样本数为99只，这四个群体分别是：混有单冠、三叉冠和鹿角冠的江村黄鸡群体（由广州市江丰实业股份有限公司提供）；混有单冠和鹿角冠的河田鸡群体（由河田鸡保种场提供）；玫瑰冠的丝羽乌骨鸡群体（由华南农业大学增城基地提供）；混有三叉冠和单冠的麻黄鸡群体（由温氏食品集团股份有限公司提供）。
1.待测鸡总DNA的提取
对待测鸡进行DNA的提取。具体步骤如下：
(1)取新鲜血样50μL，放入1.5mL的离心管，加入200μL裂解液，2μL的10mg/mL的蛋白酶K后37℃摇床12h。
(2)加入RNaseA至终浓度20μg/mL，水浴30min。
(3)加入700μL的苯酚：氯仿：异戊醇(体积比25:24:1)，轻轻颠倒混匀，室温条件下14000rpm离心5min。
(4)吸取上清液，加入等体积氯仿：异戊醇(体积比24:1)14000rpm离心5min。
(5)吸取上清液，加入两倍体积无水乙醇，颠倒混匀后14000rpm离心5min。
(6)体积分数75%的乙醇溶液洗涤沉淀两次，放于通风处室温晾干。
(7)加入50μL ddH2O，涡旋混匀后于-20℃冰箱中保存备用。
2.待测鸡总DNA的稀释
在TaqMan实时荧光定量PCR流程中，若目标核酸序列的起始数目越高，则会越快观察到荧光的显著增加，从而获得更小的CT值。所以在检测目标序列基因组拷贝数变异时，我们需要保证使用模板DNA的初始浓度相同。这里本发明使用TE Buffer对待测鸡总DNA进行稀释，步骤如下：
(1)通过分光光度计检测总DNA的浓度。
(2)根据总DNA的浓度计算将浓度稀释到100ng/μL所需添加TE Buffer的用量。
(3)添加对应体积的TE Buffer，并使用涡旋振荡器振荡混匀，获得浓度为100ng/μL的稀释DNA。
3.引物的合成及实时荧光定量核酸扩增
以β-actin作为内参基因，扩增目的变异序列，引物组包括核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示的Taqman探针引物：
SEQ ID NO:2：5’-CTCAGGGAAGTGTTTGGTGC-3’；
SEQ ID NO:3：5’-ACACTTTCACTGCTGTGTGTC-3’；
SEQ ID NO:4：5’-(6-FAM)-ATCCTCCACACTGCCCTCCCTGTGCT-(MGB NFQ)-3’；
Taqman探针引物5’端和3’端分别采用6-FAM和MGB-NFQ标签修饰。
通过生物公司合成Taqman探针引物组，包括如SEQ ID NO:2所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的修饰探针。
利用“2.待测鸡总DNA的稀释”中获得的稀释DNA为模板，使用溶解后的Taqman探针引物组对DNA模板进行实时荧光定量核酸扩增：
实时荧光定量核酸扩增的反应体系包括：模板DNA 1μL，10μM浓度正向引物0.4μL，10μM浓度反向引物0.4μL，10μM浓度Taqman探针0.1μL，Probe qPCR Master mix 5μL，ddH2O3.1μL。
实时荧光定量核酸扩增的反应程序为：去污染50℃ 2min；预变性95℃ 10min；变性95℃ 15s，退火并延伸60℃ 60s，40个循环。
实时荧光定量核酸扩增的目的序列为15kb左右拷贝数变异上的一段标记序列，其具体核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
CTCAGGGAAGTGTTTGGTGCATCCTCCACACTGCCCTCCCTGTGCTCTTTTCCAGCTCTCTTATTTTCTTATTGAGATGGAGAGTCCAAAAAGACACACAGCAGTGAAAGTGT。
4.通过软件导出CT值并计算RQ值
通过qPCR配套软件导出每个待测样本的CT值。以β-actin作为内参基因，并通过以下公示计算RQ值：
ΔΔCt =ΔCt (test)－ΔCt（reference）
RQ=2-ΔΔCt
其中，test：待测样本；reference：对照样本（阴性样本，这里是指已知单冠的野生型）。
所有待测样本的RQ值见表1。根据表1结果使用GraphPad作图，对不同鸡种群体RQ值之间的差异进行显著性分析，结果如图1所示，图1中，不同鸡品种（配套系）与冠型分别用不同的柱状标识，以已知单冠的麻黄鸡作为对照样本。可以看到所有鹿角冠群体的RQ值与单冠、三叉冠群体RQ值差异极其显著（**为差异极其显著（P<0.001）；*为差异显著（P<0.05）；ns为差异不显著）。
表1 不同鸡种（配套系）冠型与RQ值
以上结果表明，以SEQ ID NO:1所示序列的基因片段作为分子标记，采用上述检测方法对四个鸡品种（配套系）一共99份样本进行实时荧光定量核酸扩增，结果显示，鹿角冠性状群体的RQ值与单冠和三叉冠性状群体的RQ值差异极其显著，说明利用该分子标记序列对待测样本进行Taqman实时荧光定量扩增实验，能够有效从单冠、三叉冠和鹿角冠的混合群体中分离鹿角冠性状个体，可用于鹿角冠性状的鉴定与辅助育种。
实施例2 TaqMan实时荧光定量PCR检测鹿角冠性状分子标记在鹿角冠等位基因纯化中的作用
本实施例中首先进行了一个交配实验，通过表1中的鹿角冠个体（基因型为AA或Aa）与表1中单冠的个体（基因型为aa）交配（鹿角冠与单冠个体均为江村黄鸡），获得一个后代出现性状分离的全同胞群体，那么在该全同胞群体中具有鹿角冠性状的个体基因型都为杂合的Aa，野生型单冠性状个体的基因型为aa。后代没有出现性状分离的亲本，鹿角冠基因型判断为AA。
本实施例从出现性状分离的全同胞中选择了5只杂合鹿角冠（基因型为Aa），5只野生型单冠（基因型为aa）；选择了5只后代没有出现性状分离的亲本鹿角冠（基因型为AA）一共15只鸡。
1.待测鸡总DNA的提取
对待测鸡进行DNA的提取。具体步骤如下：
(1)取新鲜血样50μL，放入1.5mL的离心管，加入200μL裂解液，2μL的10mg/mL的蛋白酶K后37℃摇床12h。
(2)加入RNaseA至终浓度20μg/mL，水浴30min。
(3)加入700μL的苯酚：氯仿：异戊醇(体积比25:24:1)，轻轻颠倒混匀，室温条件下14000rpm离心5min。
(4)吸取上清液，加入等体积氯仿：异戊醇(体积比24:1)14000rpm离心5min。
(5)吸取上清液，加入两倍体积无水乙醇，颠倒混匀后14000rpm离心5min。
(6)体积分数75%的乙醇溶液洗涤沉淀两次，放于通风处室温晾干。
(7)加入20μL ddH2O，涡旋混匀后于-20℃冰箱中保存备用。
2.待测鸡总DNA的稀释
在TaqMan实时荧光定量PCR流程中，若目标核酸序列的起始数目越高，则会越快观察到荧光的显著增加，从而获得更小的CT值。所以在检测目标序列基因组拷贝数变异时，我们需要保证使用模板DNA的初始浓度相同。这里使用TE Buffer 对待测鸡总DNA进行稀释，步骤如下：
(1)通过分光光度计检测总DNA的浓度。
(2)根据总DNA的浓度计算将浓度稀释到100ng/μL所需添加TE Buffer的用量。
(3)添加对应体积的TE Buffer，并使用涡旋振荡器振荡混匀，获得浓度为100ng/μL的稀释DNA。
3.引物的合成及实时荧光定量核酸扩增
以β-actin作为内参基因，扩增目的变异序列，引物组包括核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示的Taqman探针引物：
SEQ ID NO:2：5’-CTCAGGGAAGTGTTTGGTGC-3’；
SEQ ID NO:3：5’-ACACTTTCACTGCTGTGTGTC-3’；
SEQ ID NO:4：5’-(6-FAM)-ATCCTCCACACTGCCCTCCCTGTGCT-(MGB NFQ)-3’；
Taqman探针引物5’端和3’端分别采用6-FAM和MGB-NFQ标签修饰。
通过生物公司合成Taqman探针引物组，包括如SEQ ID NO:2所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的修饰探针。
利用“2.待测鸡总DNA的稀释”中获得的稀释DNA为模板，使用溶解后的Taqman探针引物组对DNA模板进行实时荧光定量核酸扩增：
实时荧光定量核酸扩增的反应体系包括：模板DNA 1μL，10μM浓度正向引物0.4μL，10μM浓度反向引物0.4μL，10μM浓度Taqman探针0.1μL，Probe qPCR Master mix 5μL，ddH2O3.1μL。
实时荧光定量核酸扩增的反应程序为：去污染50℃ 2min；预变性95℃ 10min；变性95℃ 15s，退火并延伸60℃ 60s，40个循环。
实时荧光定量核酸扩增的目的序列为15kb左右拷贝数变异上的一段标记序列，其具体核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
CTCAGGGAAGTGTTTGGTGCATCCTCCACACTGCCCTCCCTGTGCTCTTTTCCAGCTCTCTTATTTTCTTATTGAGATGGAGAGTCCAAAAAGACACACAGCAGTGAAAGTGT。
4.通过软件导出CT值并计算RQ值
通过qPCR配套软件导出每个待测样本的CT值。以β-actin作为内参基因，并通过以下公示计算RQ值：
ΔΔCt =ΔCt (test)－ΔCt（reference）
RQ=2-ΔΔCt
其中，test：待测样本；reference：对照样本（阴性样本，这里是指已知单冠的野生型）。
以已知单冠的麻黄鸡作为对照样本，通过进行归一化，结果见表2。根据表2结果使用GraphPad作图，结果如图2所示。图2中，不同鸡冠性状基因型分别用不同的柱状标识，可以看到单冠（aa）、杂合鹿角冠（Aa）和纯合鹿角冠（AA）的/>两两间都差异极其显著（**为差异极其显著（P<0.001）；*为差异显著（P<0.05）；ns为差异不显著）。
本发明发现若≥2，则判断待测鹿角冠个体的基因型为AA；若1.2≤＜2，则判断待测鹿角冠个体的基因型为Aa；若/>＜1.2，则判断待测鹿角冠个体的基因型为aa。具体的15个基因型分型结果见表2：
表2
以上结果显示，Taqman实时荧光定量扩增实验结果与杂交实验结果判断的实际鸡冠基因型相同，说明以SEQ ID NO:1所示序列的基因片段作为分子标记对待测样本进行Taqman实时荧光定量扩增实验，能够有效分辨鹿角冠的纯合或杂合基因型，可用于鹿角冠基因型的纯化与辅助育种，对建立新的具有鹿角冠表型的鸡品种或配套系具有重要价值。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种鸡冠型性状基因型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测鸡基因组DNA；
(2)以稀释的待测鸡基因组DNA为模板，利用Taqman探针引物组进行实时荧光定量核酸扩增，获得CT值；所述Taqman探针引物组由核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的Taqman探针构成；
(3)根据CT值计算RQ值，以单冠性状鸡种为对照组，通过鉴定待测鸡鹿角冠性状的基因型，若/>则判断待测个体的基因型为鹿角冠纯合基因型；若/> 则判断待测个体的基因型为鹿角冠杂合基因型；若/>则判断待测个体为三叉冠或单冠；
以β-actin作为内参基因，RQ值的计算公式为：
ΔΔCt＝ΔCt(待测鸡)－ΔCt(对照样本)；
RQ＝2-ΔΔCt；
所述对照样本为已知单冠的麻黄鸡；
所述待测鸡为江村黄鸡。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述实时荧光定量核酸扩增的反应体系包括：模板DNA 1μL，10μM浓度正向引物0.4μL，10μM浓度反向引物0.4μL，10μM浓度Taqman探针0.1μL，Probe qPCRMaster mix 5μL，ddH2O 3.1μL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述实时荧光定量核酸扩增的反应程序包括：去污染50℃2min；预变性95℃10min；变性95℃15s，退火并延伸60℃60s，40个循环。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述模板中DNA的浓度为100ng/μL。
5.一种检测与鸡鹿角冠性状相关的分子标记的Taqman探针引物组在检测江村黄鸡鸡冠性状中的应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述Taqman探针引物组由核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的Taqman探针构成；
根据CT值计算RQ值，以单冠性状鸡种为对照组，通过鉴定待测鸡鹿角冠性状的基因型，若/>则判断待测个体的基因型为鹿角冠纯合基因型；若/> 则判断待测个体的基因型为鹿角冠杂合基因型；若/>则判断待测个体为三叉冠或单冠；
以β-actin作为内参基因，RQ值的计算公式为：
ΔΔCt＝ΔCt(待测鸡)－ΔCt(对照样本)；
RQ＝2-ΔΔCt；
所述对照样本为已知单冠的麻黄鸡；
所述待测鸡为江村黄鸡。
6.一种检测与鸡鹿角冠性状相关的分子标记的Taqman探针引物组在江村黄鸡鹿角冠性状选育中的应用，选择鹿角冠纯合基因型的江村黄鸡，所述分子标记的核苷酸序列如SEQID NO:1所示；
所述Taqman探针引物组由核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的Taqman探针构成；
根据CT值计算RQ值，以单冠性状鸡种为对照组，通过鉴定待测鸡鹿角冠性状的基因型，若/>则判断待测个体的基因型为鹿角冠纯合基因型；若/> 则判断待测个体的基因型为鹿角冠杂合基因型；若/>则判断待测个体为三叉冠或单冠；
以β-actin作为内参基因，RQ值的计算公式为：
ΔΔCt＝ΔCt(待测鸡)－ΔCt(对照样本)；
RQ＝2-ΔΔCt；
所述对照样本为已知单冠的麻黄鸡；
所述待测鸡为江村黄鸡。
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