CN115851502B - 拟蕈状芽孢杆菌、菌剂和液态生物有机肥以及它们的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物和有机肥技术领域，具体涉及拟蕈状芽孢杆菌、菌剂和液态生物有机肥以及它们的应用。本发明提供的拟覃状芽孢杆菌SH‑1464具有高效解磷、解钾、固氮以及产IAA活性等特点。本发明提供的液态有机肥以黄腐酸钾等生产副产品或废弃物作为主要原料，通过各组分的配合作用，具有提高土壤生物学指标，提高土壤微生物多样性和酶活性等优点，施用后易于形成适于茶树生长的土壤微生态条件，从而促进茶树植株生长，提高茶叶中茶多酚的含量。在该液态有机肥中加入本发明提供的拟蕈状芽孢杆菌后，其效果得到进一步提高。

Description

拟蕈状芽孢杆菌、菌剂和液态生物有机肥以及它们的应用

技术领域

本发明涉及微生物和有机肥技术领域，具体涉及拟蕈状芽孢杆菌、菌剂和液态生物有机肥以及它们的应用。

背景技术

微生物肥料也称菌肥、生物肥料，其中含有活的微生物，通过微生物的生命活动，可以活化土壤中的养分，促进植物对养分的吸收；田间施用微生物肥料，可有效改良农业生态环境，提升农产品品质。化肥、农药的不当施用，造成地力下降、土壤养分流失，阻碍了蔬菜作物的养分吸收，限制了其生长。寻找清洁、绿色、无污染且有较强肥效的肥料对我国粮食产业的发展至关重要，经过不断研究和探索，微生物肥料成为了提高农业生产力并减少环境破坏的最佳选择。

然而，现有的微生物肥料常采用的菌株通常是经过突变筛选，或定向改造的菌株，其虽然在实验室研究阶段能够获得较好的促生参数指标数据，但是实际应用中却易表现出难以在土壤或植物中定殖，或受到环境因素(例如复杂的种植环境变化、土壤中其他微生物的互作等)的影响而难以增殖或难以发挥促生作用等问题。因此，基于天然菌株的微生物肥料研发逐渐成为本领域的热门研究课题。但是，目前仍鲜少有关于茶树促生的微生物肥料，尤其是基于天然微生物制备的用于茶树促生的微生物肥料的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供拟蕈状芽孢杆菌、菌剂和液态生物有机肥以及它们的应用。本发明提供的拟蕈状芽孢杆菌是一株天然的植物根际菌，相比于基因工程改造菌而言具有更好的土壤和植物根际定殖能力。经过研究发现，该菌株在施用后能够有效提高茶叶品质，改善土壤条件。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一株拟蕈状芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)，所述拟蕈状芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2022924。

本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂中含有第一方面所述的拟蕈状芽孢杆菌和任选的辅料。

本发明第三方面提供第一方面所述的拟蕈状芽孢杆菌，和/或，第二方面所述的菌剂在生物有机肥制备中的应用。

本发明第四方面提供一种液态生物有机肥，所述有机肥包括蓝藻多糖、氨基酸源、肥料塑效剂、黄腐酸钾和任选的拟蕈状芽孢杆菌；

其中，所述液态生物有机肥中，蓝藻多糖、氨基酸源、肥料塑效剂和黄腐酸钾的重量比为3-5：5-10：3-5：77-84。

本发明第五方面提供第一方面所述的拟蕈状芽孢杆菌、第二方面所述的菌剂，或者，第四方面所述的液态生物有机肥在土壤养分改良，和/或，促进植物生长中的应用。

本发明第六方面提供一种促进茶树生长的方法，所述方法包括将第一方面所述的拟蕈状芽孢杆菌、第二方面所述的菌剂或第四方面所述的液态生物有机肥施用于土壤中。

通过上述技术方案，本发明至少能够取得如下有益效果：

(1)本发明提供的拟蕈状芽孢杆菌是一株从植物根际土壤分离的天然菌株，其相比于本领域中目前常用于微生物肥料制备的诱导突变菌株或基因工程菌株而言具有更好的土壤定殖能力。使得该菌株或基于该菌株制备的微生物肥料更利于发挥菌株的促生特性，从而能取得优良的促生效果。

(2)本发明提供的液态生物有机肥对于茶树生长的促进效果好，可提高茶叶中茶多酚的含量，能够有效解决目前对于茶树生长促进效果不佳或者无法实现持续促进生长的问题。在该液态生物有机肥中加入本发明提供的拟蕈状芽孢杆菌后，对茶树的促生效果得到进一步提高。

(3)本发明提供的液态生物有机肥具有原料来源广、成本低、绿色环保等特点。同时，该液态生物有机肥还具有制备方法简单、存储稳定性高等优点。此外，通过对该液态生物有机肥中的原料种类和用量的甄选，还能使得在其中加入本发明提供的拟蕈状芽孢杆菌时，肥料中活菌数能够达到较高水平。

(4)本发明提供的促进茶树生长的方法简单易行，并且不会对环境安全产生不利影响，能够促进农业生产可持续发展。

附图说明

图1为实施例1中构建的拟蕈状芽孢杆菌SH-1464的***发育树。

图2为实施例1中拟蕈状芽孢杆菌SH-1464的解磷测试结果图。

图3为实施例1中拟蕈状芽孢杆菌SH-1464的固氮测试结果图。

图4为实施例1中拟蕈状芽孢杆菌SH-1464的产IAA定性测试结果图。

生物保藏

本发明提供的拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus paramycoides SH-1464)，已于2022年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022924。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明中，拟蕈状芽孢杆菌SH-1464和拟蕈状芽孢杆菌CCTCC NO：M2022924是同一菌株，其二者意义相同，其名称(编号)可以互换使用。

本发明中，“任选的”是指该成分属于非必须成分，本领域技术人员可以根据实际情况选择是否添加该成分。本发明提供的技术方案中，不添加“任选的”成分时即可实现本发明的目的(例如促进茶树生长，提高茶叶中茶多酚含量等)，但是若添加该“任选的”成分，则可以进一步提高效果。

本发明的发明人在研究的过程中分离获得一株拟蕈状芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)，命名为SH-1464，于2022年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022924。经过进一步研究，发明人巧妙地发现，将该拟蕈状芽孢杆菌施用于种植茶树的土壤中时，能够有效促进茶树生长，提升茶叶品质。

基于上述发现，本发明一方面提供一株拟蕈状芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)，所述拟蕈状芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2022924。

本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂中含有第一方面所述的拟蕈状芽孢杆菌(CCTCC NO：M 2022924)和任选的辅料。

本发明中，对于所述菌剂的具体剂型没有特别限制，任意本领域常用的菌剂类型均可适用于本发明。例如可以为固体菌剂、液体菌剂或是半固体(浓缩)菌剂等常见的菌剂类型。

优选地，所述菌剂中，拟蕈状芽孢杆菌的含量不低于1×10¹⁰cfu/g(固体菌剂)或1×10¹⁰cfu/mL(液体菌剂或浓缩菌剂)。例如可以为1×10¹⁰-1×10¹¹cfu/g或1×10¹⁰-1×10¹¹cfu/mL。

本发明中，对于所述菌剂中选用的辅料及其含量没有特别限制，只要其对于拟蕈状芽孢杆菌CCTCC NO：M 2022924的作用没有不利影响，或基本没有不利影响(例如加入辅料后该菌株的作用效果不低于仅采用该菌株时的80％)即可。本领域中常用于菌剂制备的辅料均可适用于本发明，例如保护剂、赋形剂、黏合剂、填充剂等。

本发明的发明人在研究中发现，将本发明提供的拟蕈状芽孢杆菌单独或与某些有机肥物料一同施用于土壤中时能够有效促进作物生长，提高作物产量和产品品质。尤其是对茶树具有较好的促生效果，不仅能够促使茶树更快生长，而且还能提高茶叶中茶多酚等活性成分的含量，获得更高品质的茶叶。

基于此，本发明第三方面提供第一方面所述的拟蕈状芽孢杆菌，和/或，第二方面所述的菌剂在生物有机肥制备中的应用。

本发明的发明人在研究中还发现，将蓝藻多糖与适量氨基酸源、肥料塑效剂、黄腐酸钾等混合制成的液态生物有机肥施用于土壤中，可有效提高土壤有效氮、磷、钾素含量，提升土壤肥力，促进植物根际氮、磷、钾素转化及对氮、磷、钾素的吸收，降低化学肥料的使用量。此外施用该液态有机肥还可提高土壤生物学指标，调节土壤微生物多样性和酶活性，促进形成对茶树健康生长的土壤微生态条件，从而促进茶树生长，并提高茶叶中茶多酚的含量，提高高品质茶叶的产量。经过进一步研究，发明人还发现，在上述成分制备的液态生物有机肥的基础上加入本发明提供的拟蕈状芽孢杆菌CCTCC NO：M 2022924(或基于该菌株制成的菌剂)，还能够进一步提高对茶叶产量的品质的提升效果。

基于上述发现，本发明第四方面提供一种液态生物有机肥，所述液态生物有机肥包括蓝藻多糖、氨基酸源、肥料塑效剂、黄腐酸钾和任选的拟蕈状芽孢杆菌；

其中，所述液态生物有机肥中，蓝藻多糖、氨基酸源、肥料塑效剂和黄腐酸钾的重量比为1:1-5:0.5-1.5:10-30。

也即，本发明提供的液态生物有机肥配方为以下任意一种：

(1)重量比为1:1-5:0.5-1.5:10-30的蓝藻多糖、氨基酸源、肥料塑效剂和黄腐酸钾；

(2)重量比为1:1-5:0.5-1.5:10-30的蓝藻多糖、氨基酸源、肥料塑效剂和黄腐酸钾，以及拟蕈状芽孢杆菌(菌剂)。

优选地，所述液态生物有机肥中，蓝藻多糖、氨基酸源、肥料塑效剂和黄腐酸钾的重量比为1:1.5-4.5:0.8-1.2:15-28。更优选为1:2-4:0.8-1.2:15-20。

本发明中，对于用作液态肥的原料(如蓝藻多糖、氨基酸、肥料塑效剂和黄腐酸钾等)没有特别限制，其可以是本领域任意能够用于液态肥制备的相关产品，既可以是商购获得的相关产品，也可以是按照现有技术自行制备的相关产品。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述蓝藻多糖中水分含量为30-40重量％。优选为30-32重量％。本发明对于选用的蓝藻多糖的具体成分和来源没有特别限制，任意具有上述特征的蓝藻多糖均可适用于本发明。其既可以直接通过商购获得，也可以为根据现有技术自行制备的相关产品。

优选地，所述蓝藻多糖中，以干物质计，糖含量为20-40重量％，可溶性胶体含量为10-20重量％，矿物质含量为5-12重量％，粗蛋白含量为3-10重量％。

更优选地，所述蓝藻多糖中，以干物质计，糖含量为25-35重量％，可溶性胶体含量为12-18重量％，矿物质含量为5-10重量％，粗蛋白含量为3-6重量％。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述氨基酸源中，以干物质计，游离氨基酸含量为20-40重量％。优选为25-35重量％。

本发明中，对于所述氨基酸源的具体类型和来源没有特别限制，任意能够为液态生物有机肥提供游离氨基酸的试剂均可作为氨基酸源适用于本发明。优选地，所述氨基酸源可以选自采用植物源蛋白或动物源蛋白制备的氨基酸(溶液)。优选其中植物源蛋白可以由大豆、豆粕、玉米麸、花生麸中的至少一种的发酵产物提供，也可以由豆制品、味精、木材加工的下脚料等中的至少一种提供。动物源蛋白可以由动物毛发(例如羽毛、猪鬃等)、动物血液、内脏、皮骨、低脂鱼粉、蚕蛹、以及屠宰场废弃物等中的至少一种提供。所述氨基酸源可以是直接购买获得的具有上述特征的相关产品，也可以是根据现有技术，采用以上原料自行制备获得的相关产品。

本发明的发明人在研究中发现，采用聚谷氨酸作为肥料增效剂应用于本发明提供的液态生物有机肥中时，不仅肥效能够得到进一步提高，而且对于作物，尤其是茶树的抗逆性和茶叶品质也有提高的效果。此外，在含有拟蕈状芽孢杆菌的液态有机肥中，采用聚谷氨酸作为肥料增效剂还能进一步提高有机肥中的活菌数。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述肥料增效剂选自聚谷氨酸。

优选地，所述聚谷氨酸的重均分子量为1万-1.5万。

更优选地，所述聚谷氨酸的重均分子量为1万-1.3万。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述黄腐酸钾中，以干物质计，黄腐酸含量为40-60重量％，腐殖酸含量为10-20重量％，全氮含量为2-5重量％，全磷含量为0.1-0.5重量％，全钾含量为5-15重量％。

优选地，所述黄腐酸钾中，以干物质计，黄腐酸含量为45-55重量％，腐殖酸含量为15-20重量％，全氮含量为2-4重量％，全磷含量为0.2-0.3重量％，全钾含量为5-10重量％。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述拟蕈状芽孢杆菌选自保藏编号为CCTCCNO：M 2022924的拟蕈状芽孢杆菌，或者，所述拟蕈状芽孢杆菌由第二方面所述的菌剂提供。

优选地，以所述液态生物有机肥总重量计，所述拟蕈状芽孢杆菌菌剂的用量为0.1-1重量％。优选为0.3-0.8重量％。更优选为0.5-0.7重量％。

更优选地，所述拟蕈状芽孢杆菌或菌剂的用量使得所述液态生物有机肥中拟蕈状芽孢杆菌的含量为不低于1×10⁶cfu/mL。优选为1×10⁶-5×10⁷cfu/mL。更优选为1×10⁷-5×10⁷cfu/mL。进一步优选为1×10⁷-2×10⁷cfu/mL。当在液态生物有机肥中以固体菌剂的形式添加所述拟蕈状芽孢杆菌时，按照1mL最终获得的液态生物有机肥即为1g的比例换算添加后液态生物有机肥中的拟蕈状芽孢杆菌含量。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述液态生物有机肥中还含有辅料，优选所述辅料选自氮肥、磷肥和钾肥中的至少一种。

本发明中，对于选用作辅料的氮肥、磷肥和钾肥没有特别限制，任意本领域常用作上述肥料的试剂均可适用于本发明。例如可以选用尿素、过磷酸钙、硫酸钾等作为本发明提供的液态生物有机肥中的辅料。

对于用作辅料的氮肥、磷肥和钾肥的具体用量和比例，本发明中没有特别限制，可以根据实际情况(例如种植地土壤情况，作物生长情况和生长特性等)进行相应调整。根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述辅料选自氮肥、磷肥和钾肥的混合物，其用量使得辅料中N、P和K的重量比为1:1.5-2.5:3-4。

优选地，以所述液态生物有机肥总重量计，所述辅料的总含量为0.1-3重量％。优选为0.5-2重量％。更优选为0.5-1重量％。例如可以为0.5重量％、0.55重量％、0.6重量％、0.65重量％、0.7重量％、0.75重量％、0.8重量％、0.9重量％、1重量％，或者也可以为上述任意两个数值的任意中间值。

本发明第五方面提供第一方面所述的拟蕈状芽孢杆菌、第二方面所述的菌剂，或者，第四方面所述的液态生物有机肥在土壤养分改良，和/或，促进植物生长中的应用。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述植物为山茶属植物。优选为茶树。

本发明中，促进植物生长是指提高植物的生长速度(例如一定时间内的株高增长量、叶片生长量等)，以及提高作物的品质(例如提高作物中有益活性成分的含量等)。

本发明中，土壤养分改良是指提高土壤中有效营养成分含量(即可被植物直接吸收和利用的营养成分，如N、P、K等)、提高土壤生物学指标(例如提高土壤微生物多样性、提高土壤中的酶活性等)、改善土壤微环境使其更利于作物生长等。

本发明第六方面提供一种促进茶树生长的方法，所述方法包括将第一方面所述的拟蕈状芽孢杆菌、第二方面所述的菌剂或第四方面所述的液态生物有机肥施用于土壤中。

也即，上述方法可以包括以下几种方式：

(1)将拟蕈状芽孢杆菌或拟蕈状芽孢杆菌菌剂直接施用于土壤中(通常可以以培养物的形式施用)；

(2)将不含拟蕈状芽孢杆菌的液态生物有机肥施用于土壤中；

(3)将含有拟蕈状芽孢杆菌的液态生物有机肥施用于土壤中。

本发明中，对于菌剂和/或液态生物有机肥的具体施用方式没有特别限定，任意本领域中常用的在土壤中进行施肥的方式均可适用于本发明。例如可以先将植株周围土壤刨沟后采用本发明的菌剂和/或液态生物有机肥进行灌根再覆土，也可直接将本发明的菌剂和/或液态生物有机肥浇淋在植株根际。

本发明提供的方法中采用的拟蕈状芽孢杆菌、菌剂以及液态生物有机肥的具体特征如前所述，在此不再赘述。

本发明中，对于拟蕈状芽孢杆菌、菌剂以及液态生物有机肥的具体用量没有特别限制，只要能够起到促进茶树植株生长的作用即可。

根据本发明的一种优选实施方式，其中，对于上述方式(1)和(3)，所述拟蕈状芽孢杆菌、菌剂或液态生物有机肥的施用量使得拟蕈状芽孢杆菌的用量不低于1×10⁸cfu/株/次。优选为1×10⁹-1×10¹³cfu/株/次。更优选为3×10⁹-3×10¹¹cfu/株/次。例如可以为3×10⁹cfu/株/次、4×10⁹cfu/株/次、5×10⁹cfu/株/次、6×10⁹cfu/株/次、8×10⁹cfu/株/次、1×10¹⁰cfu/株/次、5×10¹⁰cfu/株/次、8×10¹⁰cfu/株/次、1×10¹¹cfu/株/次、2×10¹¹cfu/株/次、3×10¹¹cfu/株/次，或者也可以为上述任意两个数值的任意中间值。拟蕈状芽孢杆菌的用量为按照菌剂或液态有机肥的施用量以及其中所含拟蕈状芽孢杆菌数量计算获得，其中液体菌剂和液态有机肥按照1g/mL进行换算。

本发明提供的生物有机肥和拟蕈状芽孢杆菌共同使用时具有协同增效作用，因此，采用上述方式(1)时，为了获得更好的效果，可以采用适当高于采用方式(3)时的拟蕈状芽孢杆菌用量。

根据本发明的一种优选实施方式，其中，对于上述方式(2)和(3)，所述液态生物有机肥施用于土壤中的用量可以为200-500mL/株/次。优选为300-400mL/株/次。

优选地，所述拟蕈状芽孢杆菌、菌剂或液态生物有机肥的施用频率为每年2-3次。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的拟蕈状芽孢杆菌SH-1464的分离、纯化、鉴定以及保藏。

(1)菌株分离和纯化

发明人在研究过程中，采用稀释涂布平板法从云南省丽江市长期轮作的健康烟草根际土壤分离获得一株编号为SH-1464的菌株。

(2)菌株鉴定

参照《伯杰氏***分类手册》和《常见细菌***鉴定手册》对菌株SH-1464进行菌株形态学及生理生化特征鉴定。结果如下：菌株SH-1464为***，菌落粉白色、形态呈扁平状，接触酶、淀粉水解、硝酸还原反应、吲哚反应、柠檬酸反应、精氨酸双水解、蔗糖发酵反应、葡萄糖发酵反应、固氮作用及明胶反应等均为阳性，MR反应和尿素酶反应为阴性。

采用以下方法对菌株SH-1464进行分子生物学鉴定：将菌株SH-1464接种至纯化液体培养基中，37℃恒温摇床中180r/min振荡培养过夜，无菌条件下取样于紫外分光光度计下读取培养菌液OD₆₀₀值，当OD₆₀₀值近似于1(约1×10⁹cfu/mL)时停止培养。采用TaKaRaMiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取菌株基因组DNA。采用细菌16S rDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性60s；53℃退火60s；72℃延伸2min；35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。反应结束后，取5μL反应产物，经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像***中观察。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，送至北京擎科生物科技有限公司测序。测序结果经BLAST搜索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)后与GenBank数据库中相关种属的基因序列进行比较分析，选用同源性较高的模式菌株序列作为参比对象，用Clustal X 1.8软件进行多序列比对，计算供试菌株与参比菌株序列的相似性。***发育分析时排除碱基缺失位点，采用邻接法(Neighbor-joining analysis)用MEGA 7.0构建供试菌株与参比菌株之间的***发育树。其中，Bootstrap值设定为1 000，其余均为默认值。

分子生物学鉴定鉴定结果如下：经NCBI Blast分析，SH-1464的16SrDNA序列与拟蕈状芽孢杆菌MAOI01000012相似度为100％，利用邻接法(Neighbour-Joining)构建的***发育树如图1所示。

结合形态学生理生化特征及分子生物学鉴定结果，菌株SH-1464为拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)

(3)菌株特征研究

解磷效果检测：将纯化的菌株SH-1464接种至解无机磷细菌选择培养基(葡萄糖10.0g/L，硫酸铵0.5g/L，酵母浸粉0.5g/L，氯化钠0.3g/L，氯化钾0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，磷酸钙5.00g/L，pH 7-7.5)上，置于30℃培养箱中培养72h，观察记录溶磷圈产生情况。

结果详见图2。从图中能够看出菌株SH-1464具有较好的解磷能力，溶磷圈平均直径为16.11mm。

固氮活性检测：将纯化的菌株SH-1464接种至固氮菌选择培养基(KH₂ PO₄ 0.2g/L、MgSO₄ 0.2g/L、NaCl 0.2g/L、CaCO₃ 5.0g/L、甘露醇10.0g/L、CaSO₄ 0.1g/L、琼脂18.0g/L、pH6.8-7)，置于30℃培养箱中培养72h，观察记录具透明圈产生情况。

结果详见图3。从图中能够看出菌株SH-1464可在固氮菌选择培养基上产生透明圈，且透明圈直径较大，说明菌株SH-1464具有较好的固氮活性。

产吲哚乙酸(IAA)检测：(1)定性检测：挑取SH-1464单菌落接入KB培养基中，30℃下180rpm/min震荡培养24h，无菌条件吸取1mL发酵液于离心管中，快速与4mL Sackowcki’s显色剂(制备方法：将150mL的浓硫酸缓缓加入到250mL的去离子水中，边加边搅拌，待溶液冷却后加入7.5mL 0.5mol/L的FeCl₃·6H₂O溶液)混合，常温下避光静置显色40min，观察并记录颜色变化。

(2)定量检测：称取10mg IAA标准品溶解于少量乙醇，蒸馏水定容至100mL(浓度为100μg/mL)，梯度稀释至0(仅含蒸馏水)、4μg/mL、8μg/mL、12μg/mL、16μg/mL、20μg/mL、24μg/mL，各取1mL，并加入4mL显色剂混匀，40℃避光静置显色40min，测定OD₅₃₅值，并绘制标准曲线。将菌悬浮液和空白对照10000r/min离心10min后取上清液4mL，向其中加入4mL比色液混匀，在黑暗中静置40min，用分光光度计测定其OD₅₃₅值，重复3次，以空白比色液调零，对比绘制的标准曲线，连续测定7天，记录不同发酵时间颜色变化，并计算各时间段菌株的IAA产量，以得出菌株产IAA最佳发酵时间和产量。

结果详见图4。从图中能够看出菌株能与Sackowcki’s显色剂发生显色反应，且随着发酵时间延长，IAA产量有所增加(图中最右侧48h培养液的颜色略深于其左侧的24h培养液)，经定量检测计算出菌株SH-1464的IAA分泌量约为21.56-24.88μg/mL。

(4)菌株保藏

发明人于2022年6月20日将采用上述方法分离获得的拟蕈状芽孢杆菌SH-1464保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022924。

实施例2

按照表2中的配方配制液态生物有机肥。具体配制方法包括：按照表2中的比例称取原料，1L/kg加水，混合均匀即获得液态生物有机肥。

其中采用的蓝藻多糖购自云南玉溪驰骋化工有限公司，聚谷氨酸购自河南艾普生农业科技有限公司(重均分子量为1.2万)，黄腐酸钾购自河南艾普生农业科技有限公司。菌剂为通过将实施例1中获得的拟蕈状芽孢杆菌SH-1464经扩培、干燥后制备的固体菌剂，其中拟蕈状芽孢杆菌的含量约为2×10¹⁰cfu/g。辅料为采用尿素、过磷酸钙和硫酸钾自行配制获得，其中的N、P、K的重量比为8:16:26。氨基酸源为购自四川浩青生物科技有限公司的植物源氨基酸浓缩液，其中游离氨基酸的含量为30±0.5重量％。

蓝藻多糖中的糖含量采用硫酸苯酚法测定，可溶性胶体含量采用3,5-二甲基苯酚比色法测定，矿物质含量采用原子吸收分光光度法测定，粗蛋白含量采用凯式定氮法测定。黄腐酸钾中的黄腐酸含量采用重铬酸钾氧化比色法测定，腐殖酸含量采用焦磷酸钠碱液提取法测定，全氮含量采用凯氏消解方法测定，全磷含量采用钼锑抗比色法测定，全钾含量采用火焰光度计法测定，黄腐酸钾含量为按照其他物质含量计算获得。

检测结果如表1所示(其中水含量以物料总重量为基准计算，其余成分以物料中干物质为基准计算)。

表1液态生物有机肥物料成分

表2液态生物有机肥配方

实施例3

采用表2中液态生物有机肥B1的配方，将其中的黄腐酸钾替换为等重量的生化黄腐酸钾(成分详见表3)。获得液态生物有机肥B6。

表3替换生化黄腐酸钾成分

测试例1

选取一批初始高度基本一致(各株之间差异不超过1cm)的盆栽茶树苗，每盆栽种1株。将其按照10株一组进行分组并编号，按照表4中的用量，在茶苗根际土壤中施用上述实施例中获得的液态生物有机肥，然后在其他条件均保持一致的情况下同时进行培养。具体施肥方式包括：对施肥前的盆栽茶苗进行刨坑处理，即用刨土铲沿茶苗四周3-5cm且距离地面10-13cm深刨土，将液态生物有机肥对茶树进行四周灌根处理后，再覆土，完成施肥。

于施肥后两个月调查茶树生长情况和茶树根际土壤生物学指标。具体包括测量各组茶树平均株高；采用中华人民共和国国家标准《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》(GB/T 8313-2008)中的方法测量茶叶中茶多酚总量；采集各组茶树根际土壤，采用购自北京索莱宝科技有限公司的多酚氧化酶(PPO)活性检测试剂盒测定土壤多酚氧化酶活性，采用高通量测序(High-throughput sequencing)测定土壤细菌Shannon多样性指数(具体测试方法参考《洱海流域高碳储量农田水稻根际厌氧微生物群落多样性特征》)。结果详见表4。

从表4中的数据可以看出，施用本发明提供的液态生物有机肥的情况下，茶树的生长情况以及茶叶中茶多酚的含量均超过对照组茶苗，当施用的液态生物有机肥采用本发明的优选组分且其中各组分的含量比在本发明优选范围内时，效果进一步得到提高。另外，从茶树根际土壤生物学指标的测定结果还能看出，施用本发明提供的液态生物有机肥后，对于土壤的活性有较好的改良效果，土壤微生物的多样性也得到了很大改善。

表4液态生物有机肥对茶树促生效果试验测试条件及结果

注：表4中各组数据均为组中10株茶苗测量数据的平均值，“对照”是指未施用任何肥料的对照组，“化肥”是指施用化肥的对照组，其中所用的化肥为市售尿素、硫酸钾和钙镁磷复合肥的混合物(重量比为12.5：4：2.5)。

测试例2

采用NB培养基(购自海博科技有限公司的粉末状培养基，制备方法为用天平称取18g培养基粉末，加1000mL去离子水溶解后分装。121℃高温蒸汽灭菌15分钟)对实施例1获得的拟蕈状芽孢杆菌SH-1464进行培养，培养结束后采用适量新鲜NB培养基将获得的培养液进行稀释，获得活菌数约为3×10⁸cfu/mL的拟蕈状芽孢杆菌液体菌剂。

按照以下方式对盆栽茶树苗进行处理，然后按照测试例1中的方式进行茶树生长情况和茶树根际土壤生物学指标调查。

实验组I：将拟蕈状芽孢杆菌培养液浇淋至茶树植株根际(每个试验组10株)，于施用后两个月调查茶树生长情况和茶树根际土壤生物学指标(具体检测指标和检测方法与测试例1中相同，后同)。

实验组II：将拟蕈状芽孢杆菌菌剂(将液体菌剂干燥处理获得的固体菌剂，活菌数约为2×10⁸cfu/g)按照测试例1中的方法施用于茶树植株根际土壤中(每个试验组10株)，于施用后两个月调查茶树生长情况和茶树根际土壤生物学指标。

实验组III：将表2中的液态生物有机肥A2、B1分别浇淋至茶树植株根际(每个试验组10株)，于施用后两个月调查茶树生长情况和茶树根际土壤生物学指标。

对照组：既不施用拟蕈状芽孢杆菌菌剂，也不施用任何肥料。

按照测试例1中的计算方法，对各组茶树促生长效果和土壤生物学指标进行测定，结果详见表5。

从表5中实验组I和II的结果可以看出，本发明提供的拟蕈状芽孢杆菌对于茶树具有较好的促生效果，不论施用液体菌剂还是固体菌剂都能有效促进茶树的生长，提高茶叶中茶多酚的含量，而且对于土壤的活性具有很好地改善作用，尤其提高了土壤中多酚氧化酶的活性和微生物的多样性。通过对比表5中实验组III和表4中A2和B1的结果可以看出，本发明提供的液态生物有机肥以不同方式施用时对于茶树的促生效果以及对土壤活性的改良效果相差不大，说明本发明提供的液态生物有机肥能够适应不同种植和管理方式，在生产实践中具有较好的普适性。

表5拟蕈状芽孢杆菌及液态有机肥浇淋施用对茶树促生效果试验测试条件及结果

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (20)

1.一株拟蕈状芽孢杆菌，其特征在于，所述拟蕈状芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2022924。

2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂中含有权利要求1所述的拟蕈状芽孢杆菌和任选的辅料。

3.权利要求1所述的拟蕈状芽孢杆菌，和/或，权利要求2所述的菌剂在生物有机肥制备中的应用。

4.一种液态生物有机肥，其特征在于，所述液态生物有机肥包括蓝藻多糖、氨基酸源、肥料塑效剂、黄腐酸钾和任选的拟蕈状芽孢杆菌；

其中，所述液态生物有机肥中，蓝藻多糖、氨基酸源、肥料塑效剂和黄腐酸钾的重量比为1:1-5:0.5-1.5:10-30；

所述拟蕈状芽孢杆菌选自保藏编号为CCTCC NO：M 2022924的拟蕈状芽孢杆菌，或者，所述拟蕈状芽孢杆菌由权利要求2所述的菌剂提供。

5.根据权利要求4所述的液态生物有机肥，其中，所述蓝藻多糖中水分含量为30-40重量％；

所述氨基酸源中，以干物质计，游离氨基酸含量为20-40重量％；

所述肥料塑效剂为聚谷氨酸；

所述黄腐酸钾中，以干物质计，黄腐酸含量为40-60重量％，腐殖酸含量为10-20重量%，全氮含量为2-5重量％，全磷含量为0.1-0.5重量％，全钾含量为5-15重量％。

6.根据权利要求5所述的液态生物有机肥，其中，所述蓝藻多糖中，以干物质计，糖含量为20-40重量％，可溶性胶体含量为10-20重量％，矿物质含量为5-12重量%，粗蛋白含量为3-10重量%；

所述聚谷氨酸的重均分子量为1万-1.5万。

7.根据权利要求4所述的液态生物有机肥，其中，以所述液态生物有机肥的总重量计，所述拟蕈状芽孢杆菌菌剂的用量为0.1-1重量％。

8.根据权利要求4所述的液态生物有机肥，其中，所述拟蕈状芽孢杆菌在所述液态生物有机肥中的含量不低于1×10⁶cfu/mL。

9.根据权利要求4-8中任意一项所述的液态生物有机肥，其中，所述液态生物有机肥中还含有辅料。

10.根据权利要求9所述的液态生物有机肥，其中，所述辅料选自氮肥、磷肥和钾肥中的至少一种。

11.根据权利要求10所述的液态生物有机肥，其中，以所述液态生物有机肥总重量计，所述辅料的总含量为0.1-3重量%。

12.根据权利要求11所述的液态生物有机肥，其中，以所述液态生物有机肥总重量计，所述辅料的总含量为0.5-2重量%。

13.权利要求1所述的拟蕈状芽孢杆菌、权利要求2所述的菌剂，或者，权利要求4-12中任意一项所述的液态生物有机肥在土壤养分改良，和/或，促进植物生长中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其中，所述植物为山茶属植物。

15.根据权利要求14所述的应用，其中，所述植物为茶树。

16.一种促进茶树生长的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的拟蕈状芽孢杆、权利要求2所述的菌剂，或权利要求4-12中任意一项所述的液态生物有机肥施用于土壤中。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述拟蕈状芽孢杆菌、菌剂或液态生物有机肥的施用量使得拟蕈状芽孢杆菌的用量不低于1×10⁸cfu/株/次；

和/或，所述液态生物有机肥施用于土壤中的用量为200-500 mL/株/次。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述拟蕈状芽孢杆菌、菌剂或液态生物有机肥的施用量使得拟蕈状芽孢杆菌的用量为1×10⁹-1×10¹³ cfu/株/次；

和/或，所述液态生物有机肥施用于土壤中的用量为300-400mL/株/次。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述拟蕈状芽孢杆菌、菌剂或液态生物有机肥的施用量使得拟蕈状芽孢杆菌的用量为3×10⁹-3×10¹¹ cfu/株/次。

20.根据权利要求16-19中任意一项所述的方法，其中，所述拟蕈状芽孢杆菌、菌剂或液态生物有机肥的施用频率为每年2-3次。

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