CN116391026A - 产生丝氨酸蛋白酶抑制剂 - Google Patents

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CN116391026A CN202180043784.4A CN202180043784A CN116391026A CN 116391026 A CN116391026 A CN 116391026A CN 202180043784 A CN202180043784 A CN 202180043784A CN 116391026 A CN116391026 A CN 116391026A
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Abstract

本发明公开了人乳低聚糖LNT用于增加长双歧杆菌长亚种中的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的产生的用途。

Description

产生丝氨酸蛋白酶抑制剂
技术领域
本发明涉及表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的细菌、用于增加细菌中丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生的方法及其在年轻哺乳动物受试者中的用途。
背景技术
丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)是存在于真核细胞(Gettins，2002，Chemicalreviews，102(12)，4751-4804)和原核细胞(Kantyka等人，Biochimie，92(11)，1644-1656)中的蛋白超家族。
最近，丝氨酸蛋白酶抑制剂已在原核细胞中报道。计算机分析显示了在不同的双歧杆菌物种中，存在编码氨酸蛋白酶抑制剂样蛋白的基因，特别是在长双歧杆菌长亚种的细菌中。由长双歧杆菌长亚种(B.longum subsp longum)(称为长双歧杆菌(B.longum))NCC2705编码的蛋白显示出与人丝氨酸蛋白酶抑制剂相似的抗蛋白酶活性(Ivanov et al2006，Journal of Biological Chemistry，281(25)，17246-17252)。
长双歧杆菌NCC 2705根据布达佩斯条约于2001年1月29日保藏于巴斯德研究所，保藏号为CNCM I-2618。
提出双歧杆菌丝氨酸蛋白酶抑制剂在双歧杆菌定殖中发挥重要作用，其保护双歧杆菌抵抗宿主来源的蛋白酶并提供双歧杆菌在竞争性肠道环境中的存活优势(Ivanov etal.2006；Turroni et al.2010)。
在健康、顺产、母乳喂养的婴儿中，双歧杆菌构成了婴儿肠道中微生物群的基础。双歧杆菌的量在出生后头几个月内变化，开始于在出生时平均略低于10％，并且在2.5个月和3个月之间增加至高达接近40％的峰值。
母乳喂养还促进肠屏障发育，加上双歧杆菌占优势，可增强对所摄取营养的吸收，从而提高对所摄取营养的利用率。
根据最近的估计并且取决于地理位置，长双歧杆菌长亚种可以占肠道中双歧杆菌群落的高达20％，其可以构成成人中总微生物群的高达4％。同时，基因组研究令人信服地表明，母乳喂养的婴儿的肠道中存在的双歧杆菌，诸如长双歧杆菌，是专门配备以利用母乳低聚糖作为营养物质。长双歧杆菌也适用于其中从可缓慢吸收的碳水化合物收获能量的大肠中的条件(Turroni et al.2018，Bifidobacteria and the infant gut：an example ofco-evolution and natural selection.Cell 390 Mol Life Sci 75：103-118)。
出现越来越多的证据表明在生命早期建立合适的肠道微生物群在随后的健康发育中是意义重大的，包括以下群体：长双歧杆菌长亚种。
因此清楚的是，需要提供促进婴儿中适当的肠道微生物群的快速建立的手段。
丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)的能力(Ivanov等人，2006)也可涉及菌株的免疫调节能力(Riedel等人，2006)，因为在肠道炎症的位点处由活化的嗜中性粒细胞释放弹性蛋白酶(Burg和Pillinger，2001)。与这种抑制先天免疫的作用一致，最近证明在谷蛋白敏感小鼠模型中，丝氨酸蛋白酶抑制剂在长双歧杆菌NCC 2705的抗炎作用中起关键作用(McCarville et al.，2017，Appl.Envoron.Microbiol.Vol.83，no.19，e01323-17)。最近，报道了来自NCC 2705(CNCM I-2618)菌株的纯化的丝氨酸蛋白酶抑制剂防止体外肠神经活化，这潜在地可以减少肠易激综合征(IBS)患者中的胃肠疼痛。(Buhner等人，2018)。
另外，需要提供可以治疗或预防婴儿肠道中的炎性病症的营养溶液。
发明内容
本发明人惊奇地发现，LNT在添加到长双歧杆菌长亚种物种的细菌生长培养基中时可以增加丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生。
因此，在本发明的第一方面，提供了LNT用于增加长双歧杆菌长亚种中丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生的用途。
在本发明的另一方面，提供了增加长双歧杆菌长亚种物种的细菌中丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生的方法，其中所述方法包括使长双歧杆菌长亚种在培养基中生长，其特征在于所述培养基包含LNT。
根据本发明的另一方面，提供了通过使长双歧杆菌长亚种在培养基中生长的方法产生的长双歧杆菌长亚种物种的细菌，其特征在于所述培养基包含LNT。
相对于在不存在LNT的情况下生长的相同长双歧杆菌长亚种菌株，根据本发明产生的长双歧杆菌长亚种与增加的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平相关联。
根据本发明，长双歧杆菌长亚种可在包含浓度为例如0.02重量％至5重量％，优选地为0.05重量％至2重量％的LNT的培养基中培养。
例如，长双歧杆菌菌株CNCM I-2618可在包含浓度为0.02重量％至5重量％、0.05重量％至2重量％、0.1重量％至1.5重量％或约0.5重量％的LNT的培养基中培养。
根据本发明的另一方面，提供了一种组合物，该组合物包含根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种。
在一个实施方案中，该组合物为食品、医疗食品、管饲或营养组合物。
在一个实施方案中，食品选自乳、酸奶、凝乳、奶酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、基于稻的产品、奶粉、和宠物食品。
在另一个实施方案中，营养组合物是婴儿配方食品、成长乳、强化剂和/或补充剂，例如儿科或产妇补充剂。
根据本发明的另一方面，提供了根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种，或包含所述长双歧杆菌长亚种的组合物，其用于在婴儿或儿童中促进双歧杆菌肠道菌群的形成。
根据本发明的另一方面，提供了根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种，或包含所述长双歧杆菌长亚种的组合物，其用于在婴儿或儿童中治疗或预防肠道炎性病症。
在本发明的一个实施方案中，肠道炎性病症是选自小肠结肠炎、NEC(坏死性小肠结肠炎)和与胃肠道感染相关的炎症的病症。
长双歧杆菌长亚种可以是任何长双歧杆菌长亚种菌株。在一些优选的实施方案中，长双歧杆菌长亚种菌株可选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2170、长双歧杆菌长双歧杆菌菌株ATCC 15707(T)或它们的组合，特别是长双歧杆菌CNCM I-2618(NCC 2705)。
还应理解，当LNT与长双歧杆菌长亚种组合施用时，LNT还可以在体内增加长双歧杆菌长亚种中丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生。
因此，根据本发明的另一方面，还提供了(i)长双歧杆菌长亚种和(ii)LNT的组合。
根据本发明的另一个方面，还提供了(i)长双歧杆菌长亚种和(ii)LNT的组合，其用于通过增加原位丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的产生来促进婴儿或儿童中双歧杆菌肠道微生物群的形成。
根据本发明的另一个方面，还提供了(i)长双歧杆菌长亚种和(ii)LNT的组合，其用于治疗或预防婴儿或儿童中的肠道炎性病症。
在一个实施方案中，治疗或预防婴儿或儿童中的肠道炎性病症通过增加原位丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的产生来进行。
在本发明的一个实施方案中，肠道炎性病症是选自小肠结肠炎、NEC(坏死性小肠结肠炎)和与胃肠道感染相关的炎症的病症。
在一个实施方案中，该组合是长双歧杆菌菌株CNCM I-2618和LNT的组合。
根据本发明的另一个方面，还提供了长双歧杆菌长亚种，其用于通过增加丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的产生而促进婴儿或儿童中的双歧杆菌肠道微生物群的形成，其中长双歧杆菌长亚种与LNT组合施用。
根据本发明的另一个方面，提供了LNT，其用于通过增加丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的产生来促进婴儿或儿童中的双歧杆菌肠道微生物群的形成，其中LNT与长双歧杆菌长亚种组合施用。
根据本发明的另一个方面，还提供了用于治疗或预防婴儿或儿童中的肠道炎性病症的长双歧杆菌长亚种，其中长双歧杆菌长亚种与LNT组合施用。
根据本发明的另一个方面，提供了用于治疗或预防婴儿或儿童中的肠道炎性病症的LNT，其中LNT与长双歧杆菌长亚种组合施用。
在一些实施方案中，长双歧杆菌长亚种可选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCMI-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2170、长双歧杆菌长双歧杆菌菌株ATCC15707(T)或它们的组合。
在一些优选的实施方案中，长双歧杆菌长亚种可选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCMI-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2170、长双歧杆菌长双歧杆菌菌株ATCC 15707(T)或它们的组合。
在一些优选的实施方案中，使用长双歧杆菌长亚种菌株长双歧杆菌CNCM I-2618(NCC 2705)。
附图说明
图1-示出了在不同的人乳低聚糖(即2′-FL、LnNT、LNT3′-SL和DiFL)上温育16小时的长双歧杆菌NCC 2705中测量的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平。
图2-示出了在葡萄糖或人乳低聚糖LNT上生长16小时的属于长双歧杆菌长亚种的一组菌株中测量的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平。
具体实施方式
定义
在本发明的上下文中，术语″双歧杆菌肠道微生物群″是指由双歧杆菌诸如短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌，特别是长双歧杆菌主导的肠道微生物群。
术语″婴儿″是指年龄在12个月以下的儿童。表述″儿童″是指介于12月龄和七岁之间的儿童。表述″幼儿″是指年龄介于一岁和小于三岁之间的儿童，也称为学步儿童。
″剖腹产出生的婴儿或幼儿″是指通过剖腹产术分娩的婴儿或幼儿。这意味着婴儿或幼儿不是经***分娩的。
″***娩出婴儿或幼儿″是指经***分娩而不是通过剖腹产术分娩的婴儿或幼儿。
″早产儿″是指不足月出生的婴儿或幼儿。通常是指在妊娠满37周之前出生的婴儿或幼儿。
″低出生体重婴儿″是指由于早产或胎儿生长受限，体重低于2500g(5.5磅)的新生婴儿。因此其涵盖：
-出生时体重为1500g至2500g的婴儿或幼儿(通常称为″低出生体重″或LBW)
-出生时体重为1000g至1500g的婴儿或幼儿(称为″极低出生体重″或VLBW)
-出生时体重不足1000g的婴儿或幼儿(称为″超低出生体重″或ELBW)。
″小于胎龄出生的婴儿(SGA)″是指出生体重低于相同胎龄婴儿的第10个百分位数的婴儿。
表述″营养组合物″是指可供给受试者养分的组合物。该营养组合物通常以口服或静脉注射方式摄入，并通常包含脂质或脂肪源、碳水化合物源和/或蛋白质源。营养组合物的非限制性示例是：婴儿配方食品、2段婴儿配方食品、幼儿食品、成长乳、强化剂、儿科补充剂或婴儿谷物组合物。
在一个具体实施方案中，本发明的组合物是低变应原营养组合物。表述″低变应原营养组合物″是指不大可能引起过敏反应的营养组合物。
在一个具体实施方案中，本发明的组合物或营养组合物是″合成营养组合物″。表述″合成的营养组合物″是指通过化学和/或生物方法所获得的混合物，该混合物的化学性质可能与哺乳动物乳汁中天然存在的混合物相同(也就是说，合成的组合物不是母乳)。
如本文所用，表述″婴儿配方食品″是指旨在专用于供给在生命的头几个月期间的婴儿营养，而且本身满足这类人的多种营养需求的食料(符合欧盟委员会2006年12月22日颁发的针对婴儿配方食品和较大婴儿配方食品的第91/321/EEC 2006/141/EC号指令中第2(c)条的规定)。也是指旨在用于婴儿的营养组合物，并且如在食品法典委员会(法典STAN72-1981)和婴儿特殊品(包括针对特殊医学目的的食物)中所定义。表述″婴儿配方食品″既涵盖″1段婴儿配方食品(starter infant formula)″，也涵盖″2段婴儿配方食品(follow-up formula)″或″较大婴儿配方食品(follow-on formula)″。
″2段婴儿配方食品″或″较大婴儿配方食品″从第6个月开始给予。婴儿配方食品构成了这类人逐渐多样化饮食中的主要液体元素。
表述″婴孩食物″是指旨在专用于供给在生命的头一年期间的婴儿或幼儿营养的食料。
表述″婴儿谷物组合物″是指旨在专用于供给在生命的头一年期间的婴儿或幼儿营养的食料。
表述″成长乳″(或GUM)是指通常添加有维生素和矿物质的乳基饮料，其旨在用于幼儿或儿童。
术语″强化剂″是指适用于强化或混合人乳、婴儿配方食品、成长乳或用其它营养物质强化的人母乳的液体或固体营养组合物。因此，本发明的强化剂可在溶解于人母乳、婴儿配方食品、成长乳或用其它营养物质强化或以其它方式强化的人母乳中之后施用，它可作为独立组合物施用。当作为独立组合物施用时，本发明的乳强化剂也可被鉴定为″补充剂″。在一个实施方案中，本发明的乳强化剂是补充剂。
术语″营养补充剂″是指旨在补充受试者的一般饮食的产品。
术语″儿科补充剂″是指旨在补充婴儿或儿童的一般饮食的产品。
表述″离乳期″是指在婴儿或幼儿的饮食中逐步用其它食物替代母乳期间的时期。
表述″胃肠道″、″GI道″、″GIT″、″肠道″和″GUT″可互换使用。该通道由胃和肠组成，分为上胃肠道和下胃肠道。它是指负责消耗和消化食品、吸收营养物质以及排出废物的***(包括消化器官)。GI道尤其包括口腔和***之间的所有消化结构。上胃肠道通常包括食管和胃。下胃肠道通常包括小肠和所有大肠(结肠)。
表述″预防和/或治疗肠胃道炎症″涵盖以下所述中的一项或若干项：
-预防胃肠炎症，即肠道炎症
-治疗胃肠炎症，即肠道炎症
在本发明的上下文中，表述″原位丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白产生″是指在施用所述组合的受试者例如婴儿或儿童的肠道中丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的产生。
组合物
本发明的组合物可为食品、医疗食品、管饲、营养组合物或营养补充剂的形式。
在一个实施方案中，食品选自乳、酸奶、凝乳、奶酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、基于稻的产品、奶粉、婴儿配方食品和宠物食品。
该组合物可为医疗食品的形式。如本文所用，术语″医疗食品″是指专门配制用于医疗疾病或病症的膳食管理的食物产品。医疗食品可以在医疗监督下施用。医疗食品可用于口服摄取或管饲。
该组合物可为管饲的形式。术语″管饲″是指旨在通过饲管将营养物质直接引入个体的胃肠道的产品。管饲可通过例如穿过受试者的鼻子放置的饲管(诸如鼻胃管、鼻窦管和鼻空肠管)或者直接放置到受试者的腹部中的饲管(诸如，胃造口术、胃空肠吻合术或空肠造口术饲管)来施用。
在另一个实施方案中，营养组合物或合成营养组合物选自：婴儿配方食品、2段婴儿配方食品、幼儿食品、成长乳、强化剂、儿科补充剂和婴儿谷物组合物。
对于本领域的技术人员显而易见的是，理想的剂量将取决于待治疗的个体、其健康状况(例如性别、年龄或体重)以及施用途径。理想使用的剂量将因此改变，但可由本领域的技术人员容易地确定。
然而，一般来讲，优选的是本发明的组合物每日剂量包含106至1010cfu和/或106至1010个长双歧杆菌长亚种细胞。其还可包含每克组合物干重106至1011cfu和/或106至1011个双歧杆菌长亚种细胞。
长双歧杆菌
长双歧杆菌可以是任何长双歧杆菌长亚种菌株。在一些实施方案中，长双歧杆菌长亚种菌株可选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8810、长双歧杆菌长亚种菌株CNCMI-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2170、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC15707(T)，长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-103、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2334、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-3864、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-3853或它们的组合。
在另一个实施方案中，长双歧杆菌长亚种菌株可选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCMI-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8810、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC15707(T)或它们的组合。
菌株已经存放在下表(表1)所指示的保藏机构，并且已经得到以下保藏日期和保藏号：
Figure BDA0004006246380000091
表1
CNCM指法国巴黎巴斯德研究所国立微生物培养物保藏中心(法国巴黎第15区红色医生路28号巴斯德研究所，邮编F-75724(Collection nationale de cultures de micro-organismes，Institut Pasteur，28，rne du Dr Roux，F-75724 Paris Cedex 15，France))。ATCC是指美国标准菌库
(美国弗吉尼亚周马纳萨斯大学大道10801号，20110-2209(10801 UniversityBlvd.，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A))。DSM是指德国莱布尼茨植物遗传和作物研究所(德国布伦瑞克Inhoffenstr.7B，D-38124(Inhoffenstr.7B，D-38124Braunschweig，Germany))。NCIMB是指NCIMB有限公司(苏格兰阿伯丁BuckburnLtd，Craibstone Estate弗格森大楼，AB21 9YA(Ferguson Building，Craibstone Estate，Buckburn，Aberdeen AB21 9YA，Scotland))。
菌株1、2、5、9—13已由Nestec S.A.(avenue Nestlé55，1800 Vevey，Switzerland)保藏。此后，Nestec S.A.已合并到Sociétédes Produits NestléS.A。因此，根据《布达佩斯条约》第2(ix)条，Sociétédes Produits NestléS.A.是Nestec S.A.的继承者。所有其它菌株都是可商购获得的。
在一些优选的实施方案中，长双歧杆菌长亚种可选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCMI-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2170、长双歧杆菌长双歧杆菌菌株ATCC 15707(T)或它们的组合。
在一些优选的实施方案中，使用长双歧杆菌长亚种菌株长双歧杆菌CNCM I-2618(NCC 2705)。
LNT
本发明人惊奇地发现，LNT在长双歧杆菌长亚种物种的细菌中可以增加丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生。
合适的LNT来源是可商购获得的，并且包括例如Glycom。
长双歧杆菌长亚种可在包含浓度为例如0.02重量％至5重量％的LNT的培养基中培养。例如，长双歧杆菌长亚种可在包含浓度为0.02重量％至5重量％、0.05重量％至2重量％、0.1重量％至1.5重量％或约0.5重量％的半乳糖或GOS、或它们的混合物的培养基中培养。
可将LNT添加到常规培养基中，该常规培养基包含至多8重量％，优选至多6重量％，例如至多4重量％的适于维持长双歧杆菌生长的另一种糖，诸如但不限于葡萄糖。发明人惊奇地发现，LNT可诱导长双歧杆菌长亚种中丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生，即使存在葡萄糖，但仅当葡萄糖以允许其在发酵期间耗尽的水平存在时。优选地，发酵结束时的培养基含有少于0.4重量％的葡萄糖，诸如0重量％至0.3重量％的葡萄糖，例如0.02重量％至0.4重量％，或约0.05重量％至约0.3重量％。适于长双歧杆菌生长的常规培养基是本领域技术人员众所周知的。
在一个实施方案中，长双歧杆菌长亚种可在包含浓度为0.05重量％至2重量％、0.1重量％至1.5重量％或约0.5重量％的LNT的培养基中培养，任选地在浓度使其能够耗尽直至发酵结束的葡萄糖存在下培养。优选地，发酵结束时的培养基含有少于0.4重量％的葡萄糖，诸如0重量％至0.3重量％的葡萄糖。如果存在葡萄糖，则培养基可以在发酵结束时包含例如0.02重量％至0.4重量％，或约0.05重量％至约0.3重量％的葡萄糖。
用于产生培养物粉末的方法
属于菌种长双歧杆菌的菌株在厌氧条件下生长。厌氧条件下的发酵方法是公知的。根据待生长的微生物，技术人员能够鉴定发酵培养基的合适组分并基于常识调整发酵条件。发酵培养基通常包含
-氮源，诸如酵母提取物；
-碳源，诸如糖；
-微生物所需的各种生长因子(例如矿物质、维生素等)以及
-水。
用于长双歧杆菌的典型生长培养基的非限制性示例为补充有0.05％半胱氨酸的MRS(De Man、Rogosa和Sharpe)培养基(MRSc)。
发酵优选以两个步骤进行，发酵剂发酵在主发酵步骤之前进行。发酵培养基对于发酵剂发酵和主发酵可以是不同的，或者可以是相同的。
该方法的第二步是生物质的浓缩。这也可使用本领域技术人员已知的方法进行，诸如例如离心或过滤。基于生物质的总干重(即发酵培养基和产生的微生物的总量)计，浓缩后生物质的总固体含量优选地为10重量％至35重量％，优选地为14重量％至35重量％。
任选地，浓缩可在洗涤步骤之前或与洗涤步骤组合以去除发酵培养基的残余物和/或在发酵期间产生的化合物。例如，可通过浓缩生物质，将浓缩的生物质重悬于缓冲液诸如磷酸盐缓冲液或类似组合物中并重新浓缩生物质来进行洗涤。
例如，可应用全文以引用方式并入的WO2017/001590中描述的方法。
组合
在本发明的一个方面，提供了(i)长双歧杆菌长亚种和(ii)LNT的组合。
如本文所用，术语″组合″是指长双歧杆菌长亚种和LNT的组合施用，其中长双歧杆菌长亚种和LNT可以同时或依次施用。
如本文所用，术语″同时″或″同时地″用于表示同时(即，在同一时间)施用两种试剂。
术语″依次″或″依次地″用于表示两种试剂一个接一个地施用，其中可以先施用长双歧杆菌长亚种、或半乳糖或GOS或它们的组合中的任一者。
试剂可作为单独的制剂或作为单个组合制剂来施用。
当化合物被共同配制时，即共同配制在相同的组合物或制剂中时，它们只能被同时施用。当化合物被配制在单独的组合物或制剂中时，它们可以被同时施用或依次施用。相同制剂或单独制剂中的试剂的同时施用也可被描述为两种化合物的共同或联合施用。
在一个实施方案中，长双歧杆菌长亚种和LNT在掺加物中。在另一个实施方案中，长双歧杆菌长亚种和LNT以试剂盒的形式存在，该试剂盒包含这两种试剂的制剂以及任选向对有需要的受试者同时或按顺序施用该制剂的说明。
肠道炎性疾病
根据本发明产生的长双歧杆菌长亚种菌株或包含该菌株的组合物可用于在治疗或预防肠胃道炎性病症。
胃肠炎症与涉及胃肠道的炎症有关。类似地，可能是上胃肠道或下胃肠道的炎症。肠胃道炎症的示例为小肠结肠炎和NEC(坏死性小肠结肠炎)。肠胃道感染还可能与肠胃道炎症相关。
小肠结肠炎是涉及小肠和结肠的消化道炎症。小肠结肠炎的常见临床表现为频繁的腹泻排便，伴或不伴有恶心、呕吐、腹痛、发热、寒颤、全身症状的改变。一般表现是由感染原或其毒素在体内的传播引起的，或者最常见的是由严重的水分和矿物质流失引起，最终导致腹泻和呕吐。
坏死性小肠结肠炎(NEC)是主要见于早产儿的医学病症，其中部分肠道发生坏死(组织死亡)。它发生在出生后，并且是早产儿死亡的第二大常见原因。初期症状包括喂食不耐受、胃残留物增多、腹胀和血便。症状可迅速进展为腹部变色，伴随重要肠道坏死、肠穿孔、腹膜炎、需要大量医疗支持的***性低血压、需要手术干预，并且有时会死亡。
例如，根据本发明产生的长双歧杆菌长亚种、或包含其的组合物、或根据本发明的组合可以用于治疗或预防胃肠炎症和与胃肠感染相关的炎症。
施用
本文所述的长双歧杆菌长亚种或组合物优选地经肠施用。
经肠施用可以是口服、胃和/或直肠施用。
一般来讲，本文所述的组合或组合物的施用可例如通过口服途径或另一种途径进入胃肠道，例如可通过管饲施用。
在一个另选的实施方案中，本文所述的组合施用或组合物的施用可以是局部施用。
受试者可以是年轻哺乳动物，诸如人类、犬科动物、猫科动物、马科动物、山羊、牛科动物、绵羊、猪、鹿科动物和灵长类动物。优选地，受试者是年轻的人类。
在本发明的一个实施方案中，受试者是人类婴儿或儿童。在另一个实施方案中，受试者是婴儿。
在一个实施方案中，受试者是婴儿(至多12月龄)或1至3岁大的幼儿。
在另一个实施方案中，受试者是大于3岁且小于8岁的儿童。
现将通过非限制性实施例来描述本发明的优选特征和实施方案。
除非另外指明，本发明的实践将采用常规化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有所阐述。参见：例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，1989年，《MolecularCloning：A Laboratory Manual》，第二版，冷泉港实验室出版社二Ausubel，F.M.等人，(1995年和定期补充)，《Current Protocols in Molecular Biology》，第9、13和16章，JohnWiley&Sons二Roe，B.、Crabtree，J.和Kahn，A.，1996年，《DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques》，John Wiley&Sons二Polak，J.M.和McGee，J.O’D.，1990年，《InSitu Hybridization：Principles and Practice》，牛津大学出版社二Gait，M.J.，1984年，《Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach》，IRL出版社；以及Lilley，D.M.AndDahlberg，J.E.，1992年，《Methods in Enzymology：DNA Structures Part A：Synthesisand Physical Analysis of DNA》，学术出版社。这些一般性文本均以引用的方式并入本文。
实施例
实施例1：由人乳低聚糖进行的长双歧杆菌NCC 2705丝氨酸蛋白酶抑制剂诱导
长双歧杆菌菌株CNCM I-2618(NCC 2705)在不含糖的MRS+5mM L-半胱氨酸(MRSc)碱基中在微型生物反应器(Biolector)(生长条件-厌氧，37℃)中生长，以0.5重量％的浓度向其中添加不同的可商购获得的人乳低聚糖(HMO)。
使用配有pH传感器和溶解氧(DO)传感器的48孔微量滴定板在微型生物反应器(德国m2p-labs Aachen公司(m2p-labs Aachen，Germany))中培养菌株。将其连续摇动16小时以防止细菌聚集。通过离心收获培养物并去除上清液。将沉淀重悬于补充有halt蛋白酶抑制剂(西格玛公司(Sigma))的PBS中并使用玻璃珠裂解。然后收集含有可溶性和不溶性材料的裂解物。使用Pierce BCA试剂盒(赛默飞世尔公司(Thermofisher))测量总蛋白含量，并且使用ELISA测定丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白浓度。
在所有测试的HMO中，乳糖-N-四糖(LNT)是支持长双歧杆菌NCC 2705的生长的唯一HMO。如图1所示，LNT不仅支持细菌的生长，而且还显著增加了丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白在长双歧杆菌NCC 2705中的水平。
实施例2：由LNT进行的长双歧杆菌长亚种丝氨酸蛋白酶抑制剂诱导
丝氨酸蛋白酶抑制剂编码基因及其周围环境在长双歧杆菌长亚种物种中高度保守。长双歧杆菌长亚种的菌株被选择为表示遗传***树的整个跨度(表2)。所有菌株都在微型生物反应器中(根据实施例1)在不含糖的MRSc碱基中培养，向其中添加0.5％的葡萄糖或0.5％的LNT。使培养物生长16小时并收获。进一步分析获得的沉淀的总蛋白含量和丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白含量(参见实施例1)。
表2：所测试的长双歧杆菌长亚种菌株的列表及其丝氨酸蛋白酶抑制剂基因与BL0108(长双歧杆菌NCC 2705丝氨酸蛋白酶抑制剂编码基因)的同源性。
Figure BDA0004006246380000151
所有长双歧杆菌长亚种的菌株都能够作为唯一碳水化合物源在LNT上生长。如图2所示，在LNT存在下，丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平在所有长双歧杆菌长亚种菌株中都增加，这意味着LNT的诱导能力在所有属于长双歧杆菌长亚种的测试菌株中是保守的。

Claims (17)

1.LNT用于增加长双歧杆菌长亚种中的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的产生的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述长双歧杆菌长亚种在包含浓度为0.02重量％至2重量％的LNT的培养基中培养。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述培养基包含浓度为0.02重量％至2重量％的LNT，以及任选的在发酵结束时浓度为0.02重量％至0.3重量％的葡萄糖。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述长双歧杆菌长亚种选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2170、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15707(T)、或它们的组合。
5.用于增加长双歧杆菌长亚种中丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平的方法，其中所述方法包括使长双歧杆菌长亚种在培养基中生长，其特征在于所述培养基包含LNT。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述培养基包含浓度为0.02重量％至2重量％的LNT。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述长双歧杆菌长亚种选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2170、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15707(T)、或它们的组合。
8.通过使所述长双歧杆菌长亚种在培养基中生长的方法产生的长双歧杆菌长亚种，其特征在于所述培养基包含LNT。
9.通过根据权利要求8所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种，其中所述培养基包含浓度为0.02重量％至2重量％的LNT。
10.通过根据权利要求8或9所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种，其中所述长双歧杆菌长亚种选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCMI-2170、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15707(T)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-103、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2334、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-3864、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-3853或它们的组合。
11.组合物，所述组合物包含根据权利要求8至10所述的方法中的任一项产生的所述长双歧杆菌长亚种。
12.根据权利要求8至10所述的方法中的任一项产生的长双歧杆菌长亚种，或根据权利要求11所述的组合物，其用于促进婴儿或儿童中的双歧杆菌肠道微生物群的形成。
13.根据权利要求8至10所述的方法中的任一项产生的长双歧杆菌长亚种，或根据权利要求11所述的组合物，其用于治疗或预防婴儿或儿童中的肠道炎性病症，例如选自小肠结肠炎、NEC(坏死性小肠结肠炎)和与胃肠道感染相关的炎症的病症。
14.(i)长双歧杆菌长亚种和(ii)LNT的组合，其用于通过增加原位丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的产生来促进婴儿或儿童中的双歧杆菌肠道微生物群的形成。
15.(i)长双歧杆菌长亚种和(ii)LNT的组合，其用于治疗或预防婴儿或儿童中的肠道炎性病症。
16.根据权利要求15用于所述用途的组合，其增加原位丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的产生。
17.根据权利要求14至16中任一项用于所述用途的组合，其中所述长双歧杆菌长亚种选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCMI-2170、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15707(T)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-103、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2334、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-3864、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-3853或它们的组合。
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