CN116377053A - 冠状动脉扩张症的诊断生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了冠状动脉扩张症的诊断生物标志物及其应用。用于冠状动脉扩张症诊断的生物标志物为IGSF10。实验证明，通过检测本发明提供的生物标志物可以诊断受试者是否患有冠状动脉扩张症，具有较高的准确性，本发明具有较高的应用价值。

Description

冠状动脉扩张症的诊断生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及冠状动脉扩张症的诊断生物标志物及其应用。
背景技术
冠状动脉扩张症(Coronary Artery Ectasia，CAE)又称为冠状动脉瘤样扩张，是指冠状动脉弥漫性扩张超过邻近正常冠脉管径1.5倍的罕见异常病症。本病常累及多支血管，以右冠状动脉扩张多见。CAE可以单发也可以多发，形态为囊状或梭状。50％的CAE病例并发冠状动脉粥样硬化。冠状动脉造影是CAE诊断的金标准。单纯性CAE是指排除动脉粥样硬化、血管炎、川崎病、感染性疾病、先天性冠状动脉疾病等病因的不明原因所致的冠脉扩张病例。
CAE在冠状动脉造影人群中发病率为1.2％～7.4％，男性发病率略高，发病率随年龄的增加而增加，平均发病年龄为(55±10)岁。CAE的主要危害是引起冠状动脉慢血流、微循环障碍和促发扩张部位的血栓形成，影响心肌的正常血液供应，以及造成扩张部位的破裂风险，其主要临床表现有：心绞痛、心肌梗死、心律失常、猝死等。
目前CAE的形态学分类方法有两种：第一种方法是按照扩张血管的直径大小，分为轻、中和重三种程度的扩张，分别对应直径小于5mm、直径5～8mm和直径大于8mm，这种分类方法简单明了，但是对于有多处病变的扩张，则不易准确归类。另一种分类方法则是Markis等，在1976年所提出的Markis分类法，按照受累的血管数目及弥漫程度分为四类，这种分类方法能比较全面地反映CAE的病变。按照Markis分类法，半数以上的CAE为单支血管病变(即MarkisⅣ型扩张)，以右冠状动脉最常受累。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供包含对于冠状动脉扩张症诊断的生物标志物。
为了通过改进在整个疾病谱中对冠状动脉扩张症的进展的评估来克服目前的障碍以更好地进行临床试验设计，对冠状动脉扩张症的诊断和进展生物标志物存在着迫切的未满足的需求。本发明人鉴定出了作为用于冠状动脉扩张症的生物标志物。
因此，在本发明第一方面提供了一种诊断试剂在制备诊断冠状动脉扩张症的产品中的应用，所述诊断试剂包括能够检测样本中IGSF10标志物的表达水平的试剂。
其中生物标志物IGSF10(Immunoglobulin Superfamily Member 10，gene ID：285313)，包括基因及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的生物标志物，以及源自细胞中加工的任何形式的生物标志物。该术语涵盖生物标志物的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。Gene ID可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/获得。
在本发明中，所述样本包括但不限于组织样本、血液如全血或血液组分、例如血细胞/细胞组分、血清或血浆、尿液样本、体液样本或其他外周来源的样本。
进一步，所述样本包括血液、组织液、脑脊液、尿液、泪液、唾液、汗液。
进一步，所述样本为血液。
进一步，所述诊断试剂选自：
特异性识别前面所述的IGSF10标志物的寡核苷酸探针；或
特异性扩增前面所述的IGSF10标志物的引物。
在本发明的实施方案中，IGSF10的序列如转录本ENST00000282466.4所示。
进一步，所述诊断试剂采用高通量测序方法和/或基因芯片法和/或定量PCR方法和/或探针杂交方法检测样本中IGSF10标志物的表达水平。
在一个实施方案中，将所述IGSF10基因与对应的参比水平进行比较。上述比较使得能够确定个体是否患有冠状动脉扩张症。
进一步，所述定量PCR方法中使用的试剂包括特异性扩增前面所述的IGSF10标志物的引物。
进一步，所述引物包括天然的寡核苷酸或合成的寡核苷酸，引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物，例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。
进一步，所述探针杂交方法中使用的试剂包括特异性识别前面所述的IGSF10标志物的寡核苷酸探针。
进一步，所述探针包括荧光探针、抗体或基于吸光度的探针。如果是基于吸光度的探针，发色团pNA(对硝基苯胺)可用作检测和/或定量本文公开的靶核酸序列的探针；也可以是包含荧光分子或底物的核酸序列，该荧光分子或底物在暴露于酶时变为发荧光的，并且该核酸序列与一种核酸序列的片段互补。
进一步，所述探针在一般实时荧光定量PCR检测过程中，被设计成熔解温度超过正向和反向引物10℃，实时荧光定量PCR的反应试剂包括但不限于：目标基因靶序列的正反向引物、Taqman荧光探针、优化的PCR缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸以及具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶。
在优选的实施方案中，与正常对照相比，IGSF10在冠状动脉扩张症患者中的表达水平下调。
本发明第二方面提供了一种冠状动脉扩张症的诊断产品，所述诊断产品包括前面所述的诊断试剂。
进一步，所述诊断产品包括试剂盒、芯片、试纸。
在一些实施方案中，所述诊断试剂包括在mRNA水平确定生物标志物IGSF10表达水平的试剂。在mRNA水平确定生物标志物IGSF10表达水平是指为了诊断冠状动脉扩张症，在从冠状动脉扩张症疑似患者分离的生物学样本中确认用于诊断冠状动脉扩张症的基因的mRNA存在与否和表达程度的过程，用于测量mRNA的表达量。
进一步，所述mRNA水平确定生物标志物IGSF10表达水平的试剂包括通过聚合酶链反应、实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或DNA芯片的方法进行确定mRNA水平的试剂。
在一些实施方案中，所述试剂包括在蛋白水平上确定生物标志物IGSF10表达水平的试剂。在蛋白水平确定生物标志物IGSF10表达水平是指为了诊断冠状动脉扩张症，在从冠状动脉扩张症疑似患者分离的生物学样本中确认用于诊断冠状动脉扩张症的基因的蛋白存在与否和表达程度的过程，用于测量蛋白的表达量。
进一步，所述蛋白水平上确定生物标志物IGSF10表达水平的试剂包括通过免疫印迹、酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、放射免疫扩散法、免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、荧光激活细胞分选、质量分析或蛋白质微阵列的方法进行检测蛋白水平的试剂。
本发明第三方面提供了一种预防或治疗冠状动脉扩张症的药物组合物，所述药物组合物包括促进IGSF10表达的试剂。
本发明第四方面提供了一种非治疗非诊断目的的筛选预防或治疗冠状动脉扩张症的候选药物的方法，所述方法包括如下步骤：
1)用待测物质处理表达或含有IGSF10的体系；
2)检测步骤1)所述的体系中IGSF10的表达水平；
3)选择可降低IGSF10表达水平的待测物质为候选药物。
本发明第五方面提供了IGSF10标志物在制备冠状动脉扩张症诊断试剂中的应用。
本发明第六方面提供了IGSF10标志物在诊断冠状动脉扩张症的检测***中的应用。
进一步，所述检测***包括生物标志物的相对含量检测***和分析***。
进一步，所述相对含量检测***包括生物标志物mRNA水平和/或蛋白质水平的表达量的检测。
进一步，所述分析***包括Linear Regression线性回归、Logistic Regression逻辑回归、Polynomial Regression多项式回归、Stepwise Regression逐步回归、RidgeRegression岭回归、Lasso Regression套索回归、ElasticNet回归。
本发明第七方面提供了IGSF10标志物在制备预防或治疗冠状动脉扩张症的药物组合物中的应用。
本发明第八方面提供了IGSF10标志物在筛选预防或治疗冠状动脉扩张症候选药物中的应用。
术语“和/或”是指并且包括一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合，以及在备选方案(或)中解释时缺少组合。
本文所用的术语“诊断”是指通过疾病的体征和症状或遗传分析、病理学分析、组织学分析等识别疾病。具体地，该术语是指冠状动脉扩张症的诊断或检测。
术语“水平”是指本文所述的基因的量(例如以克、摩尔或诸如离子或荧光计数之类的计数所测量的)或浓度(例如绝对浓度或相对浓度)。还包括缩放的量或值、归一化的量或值、或者缩放且归一化的量或值。在一些优选方案中，本文确定的水平是表达水平。
术语“表达水平”是指暂时的和/或局部的核酸分子表达模式(例如在生物样品、体液样品、细胞内和/或之间，或在血液中)中的定性和/或定量差异。因此，差异表达的核酸分子可定性地改变其表达，包括例如相对于来自健康受试者的样品，在来自疾病受试者的样品中的激活或失活。核酸分子表达中的表达水平的差异也可为定量的，例如因为表达被调控，即上调，导致核酸分子的量增加；或者下调，导致核酸分子的量减少。核酸分子表达水平的差异的程度仅需要大到足以通过标准表达表征技术来量化，例如，通过定量杂交(例如与微阵列、与珠)、扩增(PCR、RT-PCR、qRT-PCR、高通量RT-PCR)、定量ELISA、下一代测序(例如ABI SOLID、Illumina Genome Analyzer、Roche 454GS FL)、流式细胞术(例如LUMINEX)等。
术语“生物样品”、“生物样本”、“样本”或“样品”均指来自个体或(对照)受试者的包含本发明生物标志物的任何样本。生物样本可以是体液样品或组织样品。例如，本发明涵盖的生物样品是组织样品、血液(例如全血或血液组分，例如血细胞/细胞组分、血清或血浆)样品、尿液样品、房水或来自其它外周来源的样品。所述生物样品可以混合或合并。所述生物样品可以通过从个体或(对照)受试者中取出样品来提供，但也可以通过使用先前分离的样品来提供。例如，可以通过常规血液采集技术从个体或(对照)受试者获取血液样品，或者可以通过活组织检查(biopsy)从个体或(对照)受试者获取组织样品。如果生物样品是从至少一个(对照)受试者获得的，例如从至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500或1,000个(对照)受试者获得，则将其指定为“参比生物样品”。在一些优选地实施方案中，参比生物样品来自与待测试个体的生物样品相同的来源，例如，两者都是血液样品、尿液样品或组织样品。进一步优选两者来自相同的物种，例如来自人。(替代地或额外地)还优选(对照)受试者的参比生物样品和待测试个体的生物样品的度量是相同的，例如，两者具有相同的体积。特别优选参比生物样品和生物样品来自相同性别和相似年龄的(对照)受试者/个体。
如本文所述的术语“引物”表示寡核苷酸，不管是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下，即在存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶并在合适温度和pH下时它能作为合成起点。引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素，其中包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。
术语“探针”是指可与试样中的所要检测的靶物质特异性结合的物质，是指可通过上述结合特异性确认试样中的靶物质的存在的物质。探针的种类为本领域通常使用的物质，并无限制，优选地，可以为肽核酸(PNA，peptide nucleic acid)、锁核酸(LNA，lockednucleic acid)、肽、多肽、蛋白质、核糖核酸或脱氧核糖核酸，最优选为肽核酸。更具体地，上述探针为生物物质，包括源自生物材料或与其相似或者在体外制造的，例如，可包括酶、蛋白质、抗体、微生物、动植物细胞及器官、神经细胞、脱氧核糖核酸及核糖核酸，脱氧核糖核酸包括互补脱氧核糖核酸(cDNA)、基因组脱氧核糖核酸、寡核苷酸，核糖核酸包括基因组核糖核酸、信使核糖核酸、寡核苷酸，作为蛋白质的例包括抗体、抗原、酶、肽等。
本发明的有益效果：
本发明通过检测IGSF10的表达水平，可以实现冠状动脉扩张症的诊断，增加检测的敏感性，提高检测能力和效率，积极采取干预措施。
附图说明
图1是蛋白互作网络图；
图2是IGSF10诊断冠状动脉扩张症的ROC曲线图。
具体实施方式
以下将对本发明进一步详细说明，应当理解并清楚的是，所述用于旨在描述其目的，而非限制本发明的范围。
如本文所用，术语“敏感性”是指相对于患者总数量(100％)的真阳性患者数量(％)。个体可以是具有冠状动脉扩张症的受试者。敏感性通过以下公式计算：敏感性性＝TP/(TP+FN)(TP＝真阳性；FN＝假阴性)。
如本文所用，术语“特异性”涉及相对于健康受试者总数量(100％)的真阴性个体数量(％)。特异性通过以下公式计算：特异性＝TN/(TN+FP)(TN＝真阴性；FP＝假阳性)。
如本文所用，术语“AUC”涉及曲线下面积的缩写。特别是，它是指受试者工作特征(ROC)曲线下的面积。如本文所用，术语“受试者工作特征(ROC)曲线”是指针对诊断测试的不同可能的切点的真阳性率相对于假阳性率的绘图。它显示了灵敏性和特异性之间的权衡，取决于所选的切点(灵敏性的任何提高都会伴随特异性的降低)。ROC曲线下的面积是诊断测试的准确性的度量(面积越大越好，最优为1，随机测试的ROC曲线位于对角线，面积为0.5)。
在本发明中，为了提高诊断的准确率，可通过使用统计学方法或算法来分析，可利用选自由线性或非线性回归分析方法、线性或非线性分类分析方法、逻辑回归分析方法、方差分析、神经网络分析方法、遗传分析方法、支持向量机分析方法、层次分析或聚类分析方法、使用决策树的层次算法或核主成分分析方法、马尔可夫毯分析方法、回归特征消除或基于熵的回归特征消除分析方法、前向浮动搜索或后向浮动搜索分析方法及它们的组合组成的组中的分析方法。
在本发明具体实施方案中，作为上述统计学方法，优选使用逻辑回归分析方法，但并不局限于此。
实施例1与冠状动脉扩张症相关的生物标志物的筛选
1、筛选方法
(1)筛选所用的数据及预处理
为了筛选可用于冠状动脉扩张症诊断的生物标志物，从基因表达综合数据库(GEO)中下载与冠状动脉扩张症相关的公共基因表达数据。从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载数据集GSE87016。
从基因表达综合数据库(GEO)下载的数据还需要做进一步处理：
1)所选数据集必须为全基因组的DNA甲基化数据；
2)这些数据来自于冠状动脉扩张症和对照血液样本；
3)本研究均考虑经标准化或者原始数据集。
(2)高通量转录组数据及预处理
通过Illumina平台，得到了大量的样本双端测序数据。鉴于数据错误率对结果的影响，采用Trimmomatic软件对原始数据进行质量预处理，并对整个质控过程中的reads数进行统计汇总。
具体步骤及顺序如下：
(1)去接头(Adaptor)；
(2)去除低质量reads；
(3)从3'端及5'端以不同方式去除低质量碱基；
(4)统计原始测序量，有效测序量，Q30，GC含量，并进行综合评价。
对数据质控后的序列进行数据量统计。
(3)mRNA基因表达水平分析
用已知的参考基因序列以及注释文件作为数据库，采取序列相似性比对的方法鉴定出各蛋白编码基因在各样本中的表达丰度。使用htseq-count软件获取每个样本中比对到蛋白编码基因上的reads数。比对获得counts后，需要对蛋白编码基因进行过滤，去除reads数为零的基因。各样本中检出基因数目如表1所示，表1检出基因数目统计部分结果展示
Figure BDA0004128774970000081
Figure BDA0004128774970000091
FPKM法能消除蛋白编码基因长度和测序量差异对计算蛋白编码基因表达的影响，计算得到的基因表达量反应表达高或低。
(4)mRNA的差异分析
首先根据counts均值对基因进行过滤，只保留counts均值大于2的基因进行下一步分析。利用DESeq2对各个样本基因的counts数目进行标准化处理(采用BaseMean值来估算表达量)，计算差异倍数，并采用NB(负二项分布检验的方式)进行差异显著性检验，最终根据差异倍数及差异显著性检验结果来筛选差异蛋白编码基因。筛选差异的条件为p<0.05&|log2foldChange|>1。
(5)差异甲基化分析
从GEO数据库下载GSE87016数据集，该数据集包含23个样本的甲基化数据(NOR:CAE＝12:11)，采用CHAMP包对甲基化数据进行差异甲基化分析。设置的筛选标准是P.Value<0.05。
(6)异常甲基化修饰差异表达基因的蛋白互作分析
为了探讨筛选的异常甲基化修饰差异表达基因之间的蛋白相互作用关系，我们用在线数据库STRING构建筛选的20个异常甲基化修饰差异表达基因的PPI网络。
2、结果
利用DESeq2对各个样本基因的counts数目进行标准化处理(采用BaseMean值来估算表达量)，计算差异倍数，并采用NB(负二项分布检验的方式)进行差异显著性检验，最终根据差异倍数及差异显著性检验结果来筛选差异蛋白编码基因。对高通量测序的转录组的mRNA分析，得到152个差异表达基因，包括93个上调，59个下调。
从GEO数据库下载GSE87016数据集，该数据集包含23个样本的甲基化数据(NOR:CAE＝12:11)，采用CHAMP包对甲基化数据进行差异甲基化分析。设置的筛选标准是P.Value<0.05，得到9377个差异甲基化位点，共4318个差异甲基化基因，包括2289个高甲基化基因，2029个低甲基化基因。
对mRNA差异表达基因和差异甲基化基因取交集以获得异常甲基化调控的差异表达基因，得到9个高甲基化修饰表达下调的基因和11个低甲基化修饰的表达上调基因。
为了探讨筛选的异常甲基化修饰差异表达基因之间的蛋白相互作用关系，我们用在线数据库STRING构建筛选的20个异常甲基化修饰差异表达基因的PPI网络。图1显示了用STRING数据库构建的20个异常甲基化修饰差异表达基因的PPI网络。
接着我们把在STRING数据库中获得的结果导入Cytoscape软件(http://www.cytoscape.org/)，并使用CytoHubba插件来筛选核心基因。我们总共采用了3种算法，将每种算法的前10个基因取交集后总共筛选出10个核心基因(表2)。
表2三种方法筛选异常甲基化修饰差异表达基因的HUB基因
Figure BDA0004128774970000101
实施例2冠状动脉扩张症生物标志物IGSF10诊断效能验证分析
基于高通量转录组数据整合分析的结果，筛选IGSF10作为候选基因，收集冠状动脉扩张症患者血液和对照血液(>15例)，提取RNA样品，利用荧光定量PCR(qRT-PCR)验证候选基因在疾病组和对照组的差异表达。
绘制IGSF10诊断冠状动脉扩张症的ROC曲线图，如图2所示，IGSF10在冠状动脉扩张症诊断中显示出较高的诊断效能，AUC值为0.829，敏感性为0.864，特异性为0.812，提示IGSF10能够针对冠状动脉扩张症进行具有诊断效能的诊断。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种诊断试剂在制备诊断冠状动脉扩张症的产品中的应用，其特征在于，所述诊断试剂包括能够检测样本中IGSF10标志物的表达水平的试剂；
优选地，所述样本包括血液、组织液、脑脊液、尿液、泪液、唾液、汗液；
优选地，所述样本为血液。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂选自：
特异性识别权利要求1所述的IGSF10标志物的寡核苷酸探针；或
特异性扩增权利要求1所述的IGSF10标志物的引物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂采用高通量测序方法和/或基因芯片法和/或定量PCR方法和/或探针杂交方法检测样本中IGSF10标志物的表达水平；
优选地，所述定量PCR方法中使用的试剂包括特异性扩增权利要求1所述的IGSF10标志物的引物；
优选地，所述探针杂交方法中使用的试剂包括特异性识别权利要求1所述的IGSF10标志物的寡核苷酸探针。
4.一种冠状动脉扩张症的诊断产品，其特征在于，所述诊断产品包括权利要求1-3任一项所述的诊断试剂；
优选地，所述诊断产品包括试剂盒、芯片、试纸。
5.一种预防或治疗冠状动脉扩张症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括促进IGSF10表达的试剂。
6.一种非治疗非诊断目的的筛选预防或治疗冠状动脉扩张症的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)用待测物质处理表达或含有IGSF10的体系；
2)检测步骤1)所述的体系中IGSF10的表达水平；
3)选择可降低IGSF10表达水平的待测物质为候选药物。
7.IGSF10标志物在制备冠状动脉扩张症诊断试剂中的应用。
8.IGSF10标志物在诊断冠状动脉扩张症的检测***中的应用。
9.IGSF10标志物在制备预防或治疗冠状动脉扩张症的药物组合物中的应用。
10.IGSF10标志物在筛选预防或治疗冠状动脉扩张症候选药物中的应用。
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