CN116375781B - 一种tna修饰的帽类似物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种TNA修饰的帽类似物及其制备方法和应用,所述TNA修饰的帽类似物是将帽类似物的三个糖环中的一个或两个糖环通过3'位置连接到三磷酸酯链段;所述三磷酸酯链段中间为三磷酸酯,两端无烷端基和/或具有C数不大于3的烷端基;所述帽类似物具有以下优势:(1)IVT产量高以及加帽效率高;(2)经脱帽酶DCP2处理后稳定性高;(3)目标mRNA的翻译效率高。
Description
技术领域
本发明涉及化学及生物工程技术领域,涉及用于体外转录(IVT)合成mRNA的TNA修饰的帽类似物及其制备方法和其在mRNA合成中的应用。
背景技术
在真核细胞中,成熟的mRNA具备一些关键的结构元件来发挥相关的功能,而体外转录的mRNA,则是通过模拟内源性mRNA的结构来发挥作用。成熟mRNA的结构主要有五个部分,从5'到3'包括:5'帽子结构(5'Cap)、5'非翻译区(5'UTR)、编码蛋白的开放阅读框、3'非翻译区(3'UTR)和一个PolyA尾。mRNA“加帽”技术,即对mRNA的5'端帽子结构修饰技术。
帽子结构是mRNA翻译起始的必要结构,为核糖体识别mRNA提供了信号,协助核糖体与mRNA结合,使翻译从AUG开始。同时帽子结构可增加mRNA的稳定性,保护mRNA免遭5’→3’核酸外切酶的攻击。
天然结构的帽类似物由于可以被脱帽酶(DCP2)识别并且水解,降低了mRNA在生物体内的稳定性,最终也是降低了目标mRNA的翻译效率。因此,本领域亟需研发一种经修饰后的新型结构的帽类似物。
TNA是一种与DNA和RNA相似的非天然化学物质,其骨架是通过2'和3'磷酸二酯键连接,由重复排列的苏糖组成。因为TNA具有与天然核酸类似的碱基配对能力,而且TNA的糖环由简单的四碳糖形成。作为原始生命形式的遗传物质,TNA能够像RNA一样折叠形成功能性的高级结构。因此,TNA结构的帽类似物不易被脱帽酶(DCP2酶)水解,具有很高的稳定性,可以避免mRNA帽子结构在生物体内被破坏,最终提高目标mRNA的翻译效果。
美国现代泰克斯公司的CN201910369662.9,在其说明书【0061】段和【0062】段提到了使用苏糖核酸(TNA)作为经修饰的核苷或核苷酸。但是并未提到将TNA修饰作为加帽类似物。核苷或核苷酸跟加帽类似物是两种不同的物质,在合成核酸中起到的作用也是完全不同的。核苷或核苷酸是合成核酸的原料,而加帽类似物是mRNA翻译起始的必要结构,为核糖体识别mRNA提供了信号,协助核糖体与mRNA结合,使翻译从AUG开始。
现有技术中使用TNA结构更多应用于寡核糖核酸结构作为核酸药物,如PCT/US2018/035687及其专利族,提及经修饰的寡核苷酸组合物(例如在RNA干扰和/或RNA酶H介导的敲低中)治疗疾病的方法。参见其说明书【00533】段,加入TNA修饰的寡核苷酸类似物被表征为能够间接或直接增加或降低蛋白质的活性或者抑制或促进蛋白质的表达。在一些实施方案中,所提供的寡核苷酸的特征在于它可用于控制细胞增殖、病毒复制和/或任何其他细胞信号传导过程。
核酸药物和对mRNA进行加帽修饰用的加帽类似物,二者是完全不同的领域,核酸药物中的TNA结构并不能直接应用于mRNA的加帽修饰用加帽类似物中,会带来不可知的肝毒性风险和蛋白翻译不稳定等问题。
发明内容
针对上述问题,本发明提供了一种TNA修饰的帽类似物,所述TNA修饰的帽类似物具有以下优势:(1)IVT产量高以及加帽效率高;(2)经脱帽酶DCP2处理后稳定性高;(3)目标mRNA的翻译效率高。
所述TNA修饰的帽类似物其结构通式如下:
上述结构式中的Ra为第一糖环;Rb为第二糖环;
Y为三磷酸酯链段,其结构符合如下结构式:
m和n分别独立地0、1、2或3;
所述Ra及Rb必有至少一个糖环通过3'位置连接到三磷酸酯链段;
R1为
B3为天然的、修饰的、或非天然的核苷碱基。
作为优选,Ra和Rb的糖环均通过3'位置连接到三磷酸酯链段。
作为优选,所述Ra及Rb的结构各自独立;所述Ra及Rb的2’、3’和/或4’位置具有取代基;所述取代基是羟基,卤素,烷基,取代或未取代的O-烷基、NH-烷基、S-烷基、O-芳烷基、S-芳烷基、炔基、环烷基、环烯基、羧基、杂环基、氰基、氨基或硝基;且取代基C数不大于7。
作为优选,如Ra或Rb的糖环通过3'位置连接到三磷酸酯链段;则另一糖环的2’、3’和/或4’位置具备羟基或烷氧基取代基,所述烷氧基的C数不大于5。
进一步的,所述TNA修饰的帽类似物符合以下结构通式:
其中Ra为Rb为/>
当Ra为时,Rb不为/>当Rb为/>时,Ra不为/>
R1为
m和n分别独立地0、1、2或3;
R2、R3、R4和R5分别独立地为氢、羟基、卤素、烷基、取代或未取代的O-烷基、取代或未取代的NH-烷基、取代或未取代的S-烷基、取代或未取代的O-芳烷基、取代或未取代的S-芳烷基、炔基、环烷基、环烯基或羧基;
R6为H、OH、NH2、烷基、O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基或卤素;
R7、R8分别独立地为氢、羟基、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烯基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的氰基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的羧基、取代或未取代的硝基。
B1和B2分别独立地为天然的、修饰的、或非天然的核苷碱基。
作为优选,所述TNA修饰的帽类似物的结构中,R2、R3、R4和R5分别独立地为氢、C1-5烷基、羟基、O-烷基。
作为优选,所述TNA修饰的帽类似物的结构中,R6为氢、C1-5烷基、羟基、O-烷基。
作为优选,所述TNA修饰的帽类似物的结构中,R7、R8分别独立地为氢、C1-5烷基或羟基。
进一步的,所述TNA修饰的帽类似物结构选自以下任意一种:
所述TNA修饰的帽类似物的应用:用于线性mRNA的体外转录反应,将RNA加帽。
所述TNA修饰的帽类似物用于在体外转录反应中将RNA加帽的方法,包括以下步骤:
步骤(1):制备DNA模板;
步骤(2):进行体外转录反应,所述反应体系中含有RNA聚合酶、核苷三磷酸和如本发明所述的TNA修饰的加帽类似物。
所述TNA修饰的帽类似物具有以下优势:可促进体外转录,提高目标mRNA的翻译效果。TNA修饰的帽类似物不易被脱帽酶水解,帽类似物稳定性增加,可促进体外转录的开始,进而提高mRNA的产量。TNA修饰的帽类似物的核酸可通过碱基互补配对原则与互补链形成稳定的双螺旋结构,可有效抵抗核酸酶的降解,进而提高mRNA稳定性,增加蛋白质的表达,提高mRNA的翻译效率。
术语解释
本发明中的“糖环”包括但不限于 R2、R3、R4、R5、R6和R8如本发明中定义。
具体实施方式
化学合成部分
实施例1:以中间体A和B为原料的含alpha-L-苏糖结构的起始加帽寡核苷酸引物,即本发明所述TNA修饰的帽类似物,合成方法如下:
将中间体A(2.0mol)悬浮在含有ZnCl2(20.0mol)的DMF溶液中,随后将中间体B(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应24小时后,用10L的0.25M EDTA-Na2溶液终止反应。将混合物装载到DEAE Sephadex柱上。将产物使用0-1.0M的氯化钠水溶液线性梯度洗脱,纳滤除盐,浓缩得目标产物,反应路线流程,如下方程式
其中,化合物A通过以下步骤得到:
(1)称取20.0g N2-异丁酰基-(alpha-L-苏糖)鸟苷溶解在乙腈(10V)中,室温下将双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺(1.8eq.)和四氮唑(1.8eq.)加入后,氮气氛围下室温搅拌2小时。点板检测N2-异丁酰基-(alpha-L-苏糖)鸟苷无剩余。将70%的叔丁基过氧化氢水溶液(3.0eq.)滴加到反应液中,室温反应1小时。点板检测反应结束后,加入5%亚硫酸钠水溶液(10V),乙酸乙酯萃取(3V*3)后旋干得到中间体粗品A1。
(2)将中间体粗品A1溶解在甲醇和浓氨水(10V,1:1)中,室温反应14小时,监测反应结束后旋干。粗品用反相制备色谱纯化后浓缩得到中间体A2。
(3)将中间体A2,三苯基膦(2.0eq.),2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌15小时。反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中,析出固体,抽滤后滤饼用丙酮充分洗涤得中间体A3。
(4)将磷酸三乙胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)悬浮在无水DMF中后室温搅拌5分钟。将中间体A3分批加入到反应液中,室温搅拌5小时。反应结束后用用10倍体积的0.25MEDTA-Na2溶液终止反应。反应液用离子色谱纯化得到中间体A4。
(5)将中间体A4溶解在20倍体积的纯化水中,反应液冷却至4℃,缓慢滴加硫酸二甲酯(6.0eq.),过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5,HPLC监测反应,反应结束后用二氯甲烷洗涤后,水相用离子色谱纯化得到中间体A5。
(6)将中间体A5,三苯基膦(2.0eq.),2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌10小时,反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出固体,抽滤,滤饼用丙酮充分洗涤得中间体A。反应路线流程,如下方程式化合物A反应路线流程,如下方程式():
其中,化合物B通过以下步骤得到:
(1)称取200.0g的2’OMe-rA亚磷酰胺单体和N2-异丁酰基-2’,3’-乙酰基鸟苷(1.0eq.)于单口瓶中,用2.0L的二氯甲烷溶解。氮气鼓吹下加入四氮唑(2.1eq.),25℃反应3小时。监测反应结束后,将70%的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中,25℃反应1小时。监测反应结束后,向反应液滴加三氯乙酸(4.0eq.)的二氯甲烷溶液,室温反应1小时。监测反应结束后,反应液分别用10%亚硫酸钠水溶液,10%碳酸氢钠水溶液,饱和食盐水洗涤后,有机相浓缩后用柱层析纯化得到中间体B1。
(2)将中间体B1溶解在乙腈(10V)中,加入1.8eq.的双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺、1.8eq.的四氮唑后氮气氛围下室温搅拌2小时。反应结束后将70%的叔丁基过氧化氢水溶液(1.2eq.)滴加到反应液中,室温反应1小时。监测反应结束后旋干,在旋瓶中加入甲醇和浓氨水(10V,1:1),室温反应14小时,监测反应,反应结束后旋干。粗品用离子色谱纯化后浓缩得到中间体B,反应路线流程,如下:
实施例2:以中间体C和D为原料的含alpha-L-苏糖结构的起始加帽寡核苷酸引物,即本发明所述TNA修饰的帽类似物,合成方法如下:
以中间体C和D为原料,参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例2的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程,如下:
其中,化合物C通过以下步骤得到:
(1)称取5.0g鸟苷,溶解在50.0mL的磷酸三甲酯中,反应液冷却至0℃,氮气氛围下缓慢滴加三氯氧磷(1.8eq.)。0℃下搅拌4小时后,加水淬灭反应。用二氯甲烷洗涤两次除去大部分磷酸三甲酯。减压浓缩除去残留有机溶剂后用反相制备液相色谱纯化后浓缩得中间体C1。
(2)将中间体C1,三苯基膦(2.0eq.),2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌15小时。反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中,析出固体,抽滤后滤饼用丙酮充分洗涤得中间体C2。
(3)将磷酸三乙胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)悬浮在无水DMF中后室温搅拌5分钟。将中间体C2分批加入到反应液中,室温搅拌5小时。反应结束后用用10倍体积的0.25MEDTA-Na2溶液终止反应。反应液用离子色谱纯化得到中间体C3。
(4)将中间体C3溶解在20倍体积的纯化水中,反应液冷却至4℃,缓慢滴加硫酸二甲酯(6.0eq.),过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5,HPLC监测反应,反应结束后用二氯甲烷洗涤后,水相用离子色谱纯化得到中间体C4。
(5)将中间体C4,三苯基膦(2.0eq.),2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌10小时,反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出固体,抽滤,滤饼用丙酮充分洗涤得中间体C。反应路线流程,如下方程式
化合物C反应路线流程,如下方程式():
其中,化合物D通过以下步骤得到:
(1)称取200.0g的N6-苯甲酰基-(alpha-L-苏糖)腺苷亚磷酰胺单体和N2-异丁酰基-2’,3’-乙酰基鸟苷(1.0eq.)于单口瓶中,用2.0L的二氯甲烷溶解。氮气鼓吹下加入四氮唑(2.1eq.),25℃反应3小时。监测反应结束后,将70%的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中,25℃反应1小时。监测反应结束后,向反应液滴加三氯乙酸(4.0eq.)的二氯甲烷溶液,室温反应1小时。监测反应结束后,反应液分别用10%亚硫酸钠水溶液,10%碳酸氢钠水溶液,饱和食盐水洗涤后,有机相浓缩后用柱层析纯化得到中间体D1。
(2)将中间体D1溶解在乙腈(10V)中,加入1.8eq.的双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺、1.8eq.的四氮唑后氮气氛围下室温搅拌2小时。反应结束后将70%的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中,室温反应1小时。监测反应结束后旋干,在旋瓶中加入甲醇和浓氨水(10V,1:1),室温反应14小时,监测反应,反应结束后旋干。粗品用离子色谱纯化后浓缩得到中间体D,反应路线流程,如下:
实施例3以中间体A和D为原料的含alpha-L-苏糖结构的起始加帽寡核苷酸引物,即本发明所述TNA修饰的帽类似物,合成方法如下:
以中间体A和D为原料,参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例3的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程,如下:
实施例4以中间体E和B为原料的苏糖结构的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
以中间体E和B为原料,参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例4的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程,如下:
其中,化合物E通过以下步骤得到:
(1)称取25.0g(3’脱氧-3’-羟甲基-呋喃糖环)鸟苷,溶解在250.0mL的磷酸三甲酯中,反应液冷却至0℃,氮气氛围下缓慢滴加三氯氧磷(1.8eq.)。0℃下搅拌4小时后,加水淬灭反应。用二氯甲烷洗涤两次除去大部分磷酸三甲酯。减压浓缩除去残留有机溶剂后用反相制备液相色谱纯化后浓缩得中间体E1。
(2)将中间体E1,三苯基膦(2.0eq.),2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌15小时。反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中,析出固体,抽滤后滤饼用丙酮充分洗涤得中间体E2。
(3)将磷酸三乙胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)悬浮在无水DMF中后室温搅拌5分钟。将中间体E2分批加入到反应液中,室温搅拌5小时。反应结束后用用10倍体积的0.25MEDTA-Na2溶液终止反应。反应液用离子色谱纯化得到中间体E3。
(4)将中间体E3溶解在20倍体积的纯化水中,反应液冷却至4℃,缓慢滴加硫酸二甲酯(6.0eq.),过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5,HPLC监测反应,反应结束后用二氯甲烷洗涤后,水相用离子色谱纯化得到中间体E4。
(5)将中间体E4,三苯基膦(2.0eq.),2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0
eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌10小时,反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出固体,抽滤,滤饼用丙酮充分洗涤得中间体E。反应路线流程,如下方程式
化合物E反应路线流程,如下方程式():
对比例1以中间体C和B为原料的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
以中间体C和B为原料,参考实施例1目标产物的合成方法得到对比例1的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程,如下:
生物测试部分
1、mRNA体外转录产量及加帽效率的测定
利用TNA核苷帽类似物进行mRNA的体外合成:线性内切酶酶切质粒;抽提线性化DNA模板;体外转录合成mRNA。分别使用实施例1-4及对比例1的帽类似物作为帽结构。
反应体系如表1:
表1体外转录反应体系
备注:在实验过程中,首先计算好体系所需物料体积,然后进行加样。首先在体系中加入无菌无酶水,随后依次加入10X buffer、NTPs、帽类似物,混匀后轻轻离心,随后加入核酸酶抑制剂、无机焦磷酸酶、T7 RNA聚合酶、线性化DNA模板,充分混匀后轻轻离心,37℃孵育2小时后加入DNase I 1U,37℃继续孵育30分钟去除DNA模板,使用磁珠纯化方法纯化mRNA。无菌无酶水溶解纯化后的mRNA,使用Nanodrop One仪检测mRNA产量。
液相色谱质谱法(LC-MS)被用来检测不同起始帽类似物的mRNA的IVT加帽率;首先需要设计一段与转录产物mRNA起始碱基匹配的具有标记的DNA探针,通常的标记为biotin标记,将链霉亲和素标记的磁珠清洗后与合成的DNA探针、mRNA及10×RNase H reactionbuffer室温室温孵育30分钟,边孵育边缓慢混匀,随后加入20ul RNase H(5U/ul)孵育37℃3h,每半个小时混匀一次。孵育结束后对磁珠进行清洗,清洗完成后的磁珠加入100μL加热到80℃的75%甲醇,混合物在加热板上加热到80℃,保持3分钟,然后放置磁力架上吸取上清,使用蒸发离心机在室温下干燥45分钟至10μl。然后将样品重新悬浮在50μl的100μMEDTA/1% MeOH中,即可用于LC-MS分析,确定转录反应中RNA的加帽情况。由于加帽与非加帽的碱基在分子量上有明显区别,利用分子质量差别即可判定不同帽类似物起始的mRNA转录的加帽率。
由表2可知,实施例1-4TNA核苷帽类似物均能转录为相应的目标mRNA,且实施例1,2,4的TNA核苷帽类似物的产量和加帽率显著优于对比例1。
表2mRNA的体外转录产量以及加帽率
编号 | 产量(μg) | 加帽率(%) |
实施例1 | 110 | 98.3 |
实施例2 | 108 | 96.5 |
实施例3 | 95 | 89.2 |
实施例4 | 118 | 95.3 |
对比例1 | 98 | 93.5 |
2、脱帽酶对帽子结构的稳定性研究
取30pmol经聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE纯化后的RNAs与50U mRNA脱帽酶(NewEngland Biolabs)、1×MDE缓冲液混匀后37℃酶促反应45min。将酶促反应物进行PAGE电泳、SYBR Green II(Lonza)染色后在Typhoon FLA7000(GE Healthcare)仪器上观察电泳后的胶图。使用Image Quant(GE Healthcare)软件统计加帽RNA与脱帽RNA电泳条带强度比率,计算得出经脱帽酶(DCP2酶)处理后,TNA结构的帽类似物的脱帽效率。使用KaleidaGraph(Synergy)软件的Dunnett检验进行统计学检验。从表3的数据可知,经脱帽酶(DCP2酶)处理后,TNA结构帽类似物实施例1,2,3,4的脱帽率明显低于对比例1。
表3脱帽酶处理后脱帽率检测
编号 | 脱帽率(%) |
实施例1 | 7.2 |
实施例2 | 29.3 |
实施例3 | 10.5 |
实施例4 | 9.7 |
对比例1 | 52.5 |
3、mRNA的翻译效率的检测
以eGFP编码序列为DNA模板,利用实施例1-4及对比例1的帽类似物为起始进行体外转录,体外转录合成的mRNA转染293T细胞。
293T细胞以(0.5-1)×105个细胞进行铺板(24孔板),推荐使用在50代以内的细胞进行转染实验。要求在转染前24小时对细胞再次传代,在培养基中加入抗生素对转染效果没有影响。转染时细胞密度一般60-80%为佳,每孔转染2μgmRNA,转染试剂选用Lipofectamine MessengerMAX Transfection Reagent(Invitrogen)并参考其使用方法进行操作。转染后的细胞放置在37℃,CO2培养箱中,转染4-6小时后,更换为新鲜的完全培养基。在37℃的CO2培养箱箱中孵育24小时以后,荧光显微镜观察GFP的荧光强度。
结果见表4,实施例1,2,4经体外转录合成的mRNA在细胞内翻译成蛋白质的效率明显高于对比例1,同时均未引起明显的细胞死亡。上述试验数据表明本申请中的含TNA结构帽类似物可高效应用于体外转录mRNA和细胞内蛋白表达。
表4细胞内mRNA的翻译表达效率
/>
Claims (8)
1.一种TNA修饰的帽类似物,其特征在于,所述TNA修饰的帽类似物符合以下结构通式:
,
其中Ra为或/>;Rb为/>或/>;
当Ra为时,Rb不为/>;当Rb为/>时,Ra不为/>;
R1为;
m和n分别独立地为0、1;
R2、R3、R4和R5分别独立地为氢、羟基、卤素、C1-5烷基、O-C1-5烷基;
R6为H、OH、NH2、C1-5烷基、O-C1-5烷基;
R7、R8分别独立地为氢、羟基、卤素、C1-5烷基;
所述Ra及Rb必有至少一个糖环通过3'位置连接到三磷酸酯链段;
B1和B2分别独立地为天然的核苷碱基。
2.根据权利要求1所述的TNA修饰的帽类似物,其特征在于,Ra或Rb的糖环通过3'位置连接到三磷酸酯链段;另一糖环的2’、3’和/或4’位置具备羟基或O-C1-5烷基。
3.根据权利要求1所述的TNA修饰的帽类似物,其特征在于,所述TNA修饰的帽类似物的结构中,R2、R3、R4和R5分别独立地为氢、C1-5烷基、羟基、O-C1-5烷基。
4.根据权利要求1所述的TNA修饰的帽类似物,其特征在于,所述TNA修饰的帽类似物的结构中,R6为氢、C1-5烷基、羟基、O-C1-5烷基。
5.根据权利要求1所述的TNA修饰的帽类似物,其特征在于,所述TNA修饰的帽类似物的结构中,R7、R8分别独立地为氢、C1-5烷基或羟基。
6.一种TNA修饰的帽类似物,其特征在于所述TNA修饰的帽类似物选自以下任意一种:
;
;
;
。
7.权利要求1-6的任一项所述的TNA修饰的帽类似物的应用,其特征在于:用于线性mRNA的体外转录,将RNA加帽。
8.根据权利要求7所述应用,其特征在于,具体步骤如下:
步骤(1):制备DNA模板;
步骤(2):进行体外转录反应,所述反应体系中含有RNA聚合酶、核苷三磷酸和权利要求1-6的任一项所述的TNA修饰的加帽类似物。
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