CN1163600C - 人胰岛素原的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化学式(I)代表的人胰岛素原的制备方法，其中R是可以被酶解或化学降解的氨基酸残基或肽；倘若从A-1到A-21的区域是胰岛素A链，从B-1到B-30的区域是胰岛素B链，X就是胰岛素A链A-1氨基和胰岛素B链B-30羧基之间的键，其可以被酶或化学法从A链或B链中分开。按照本发明，人重组胰岛素前体可以具备良好重现性地方便生产，因为溶解、磺化、浓缩、脱盐和纯化被大大简化，同时重折叠反应的产率增高。

Description

人胰岛素原的制备方法
发明背景
发明领域
本发明涉及人胰岛素原的制备方法，更具体地说，如下列化学式(I)所代表的人胰岛素原的制备方法：
其中，
R是可以被酶或化学降解的氨基酸残基或肽，和
倘若从A-1到A-21的区域是胰岛素A链，从B-1到B-30的区域是胰岛素B链，X是胰岛素A链中A-1氨基和胰岛素B链中B-30羧基之间的键，其可以通过酶法或化学法从A链或B链中分离。
在化学式(I)中，存在由A链和B链中的6个半胱氨酸残基形成的3个二硫键(A-6和A-11之间，A-7和B-7之间，以及A-20和B-19之间)。
现有技术描述
一般，在通过包括将结构基因***大肠杆菌(E.coli)质粒DNA步骤的重组DNA技术生产成熟胰岛素(“胰岛素”)过程中，已经制备了人胰岛素前体(“胰岛素原”)。
如图1所示，含胰岛素原的融合蛋白质在大肠杆菌中以内含体的形式表达，细胞溶解后，通过离心获得的内含体用非离子型或离子型去污剂，或者用低浓度变性剂清洗。重复进行该处理并进行离心，以使所需蛋白质的纯度增加(参见：Mukhopadhyay，A.等，生物化学工程/生物技术进展(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology)，56，61-108，1997)。为了减小分子间疏水作用力和不正确二硫键的形成，将清洗后的内含体溶解于变性剂，例如含有还原剂(例如二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇)的脲或胍·盐酸溶液中，或者溶解于NaOH中(参见：Fischer等，生物技术和生物工程(Biotechnology&Bioengineering)41，3-13，1993)。将溶解的内含体高速离心，用冷水稀释上清液，以便提取作为沉淀的内含体(参见：EP 0 055 945 A2)。由此获得的内含体含有由胰岛素原和异源蛋白质(例如β-半乳糖苷酶，其通过支链连接到蛋氨酸残基上)构成的融合蛋白。用溴化氰(CNBr)处理融合蛋白质，存在于胰岛素原中的六个(6)-SH基取代为-SSO3 -基，之后得到胰岛素原S-磺酸盐。该磺酸化步骤导致胰岛素前体的稳定性增加，以及后期重折叠反应的效能增加(参见：EP 0055945 A2)。利用例如2-巯基乙醇、DTT等还原剂，或氧化还原***例如谷胱甘肽使胰岛素原S-磺酸盐重折叠，使其具有天然构象(参见：Fischer等，生物技术和生物工程41，3-13，1993)。通过用胰蛋白酶和羧肽酶B处理而去除连接A链和B链的X(或C链)，使上述得到的天然胰岛素原转化成有生物活性胰岛素(参见：Kemmler W.等，J.B.C.，246，6786-6790，1971)。最后，胰岛素通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)等纯化(参见：Kroeff，E.P.，等，色谱杂志(J.Chromatogr.)，461，45-61，1989)，并通过Zn-结晶化技术进行结晶(参见：Mirsky，等，临床研究杂志(J.Clinical Investigation)42，1869-1872，1963；Brader M.L.，TIBS，16，341-345，1991)。
然而，已证明制备胰岛素原或胰岛素的常规方法在以下几个方面不令人满意：其需要复杂的溶解和磺化、纯化、浓缩和脱盐步骤；和其采用的是一种低效率的重折叠反应，该反应导致所需蛋白质的产量降低。因此，有足够的原因需开发和研制一种以简便有效同时保留其生物活性的方式制备胰岛素原或胰岛素的改进方法。
发明概述
本发明人努力解决以内含体形式表达的人重组胰岛素原的常规制备方法中的问题，并成功地建立了制备人胰岛素原的方法，其中溶解和磺化、纯化、浓缩和脱盐步骤大大简化，同时增加了重折叠反应的效率。
因此，本发明的主要目的在于提供一种具有良好重现性的制备人重组胰岛素原的简便方法。
附图简述
本发明的上述和其它目的以及特征通过结合附图给出的下文描述将变得更清楚，其中：
图1是显示由在重组大肠杆菌中表达的融合人胰岛素前体制备人胰岛素的常规方法的示意图。
图2是显示按照本发明由在重组大肠杆菌中表达的融合人胰岛素前体制备人胰岛素的方法的示意图。
图3描述了在本发明的人胰岛素原制备方法中应用的重折叠***。
发明详述
按照本发明的制备人胰岛素原的方法，在将内含体溶解到脲或胍盐酸溶液的步骤中，用连四硫酸钠(Na2S4O4)和亚硫酸钠(Na2SO3)处理以内含体形式表达的人胰岛素前体，其导致胰岛素前体中的半胱氨酸残基中的-SH基取代为-SSO3 -基，得到下列化学式(II)所示的胰岛素原S-磺酸盐，通过使该胰岛素原S-磺酸盐在含水介质中与2-巯基乙醇反应，使其转化成化学式(I)所示的胰岛素原。
其中，
R和X与前面所述的相同。
下面结合图2和图3更详细地描述本发明的人胰岛素原的制备方法。在制备人胰岛素原的过程中，所有步骤均优选在约4℃的低温下进行，当然为了操作者方面，也可以在室温下进行。
步骤1：内含体的纯化
为了制备重组人胰岛素，本发明人应用在大肠杆菌中表达的一种由经修蚀的β-半乳糖苷酶和胰岛素原构成的融合蛋白质(参见：韩国专利公开号94-1855)。将表达内含体形式的融合蛋白质的大肠杆菌细胞以1∶5-10(w/v)的比例悬浮于溶胞缓冲液，在约9,000psi的压力下进行溶胞。离心内含体，用Triton X-100和蒸馏水清洗，然后离心得到纯化的内含体。
步骤2：溶解和磺化
纯化的内含体以1∶10-20(w/v)，更优选1∶5-10(w/v)的比例溶解于含有6-8M脲或胍盐酸变性剂的0.02-0.1M Tris缓冲液(pH8-10)中，同时加入0.1-0.6M，更优选0.2-0.5M亚硫酸钠(Na2SO3)和0.01-0.1M，更优选0.05-0.1M连四硫酸钠(Na2S4O4)。然后，搅拌含有内含体的混合溶液，以引发胰岛素前体的磺化，其导致胰岛素前体中的-SH基取代为-SSO3 -基。在该步骤中，pH和温度分别维持在pH7.0-9.5和4-8℃范围内。最后，通过胰岛素中的原半胱氨酸残基中的-SH基取代为-SSO3 -基而得到磺化的胰岛素原融合蛋白。
步骤3：用溴化氰处理
磺化反应后，在12,000rpm下离心反应混合物30分钟，除去沉淀物。以5-20∶1(v/v)的比例向上清液中加入冷水，调整pH到5-6，以得到沉淀。将沉淀出的蛋白质溶解于70％(v/v)甲酸，使浓度达到10-30mg/ml，接着用溴化氰处理，使溴化氰对蛋白质的摩尔比为100∶1。这使得胰岛素原S-磺酸盐从融合蛋白质中分离出来。然后，在减压条件下进行干燥。
步骤4：离子交换色谱
将胰岛素原S-磺酸盐溶解于含1mM EDTA和7M脲的pH为7-9的20mM Tris缓冲液(例如pH8.0)中，使浓度达到30mg/ml，并将之装到用同样缓冲液平衡的DEAE-Sephacel树脂柱上。然后，应用0-1M NaCl的浓度梯度进行洗脱，在0.3-0.5M NaCl的浓度范围内得到胰岛素原S-磺酸盐。
步骤5：重折叠(胰岛素原S-磺酸盐转化为胰岛素原)
纯化的胰岛素原S-磺酸盐用含有1M脲的pH为9-11的50mM甘氨酸缓冲液(例如pH10.6)稀释，使浓度达到0.1-10mg/ml，不需要脱盐或预处理。然后，通入氮气以排除氧，并封好容器。在另一个容器中，将2-巯基乙醇加入含1M脲的50mM甘氨酸缓冲液(pH10.6)中，使其与胰岛素原S-磺酸盐中的-SSO3 -基的当量比为1-3。然后，通过将两个容器连接到一个体积为0.1ml-10L的混合池，使蛋白质溶液和含有2-巯基乙醇的缓冲液以1∶1(v/v)的比例迅速混合，将重折叠反应混合物引入储库，同时缓慢搅拌，在4-5℃下反应15-20小时(见：图3)。通过该重折叠步骤，至少80％的胰岛素原S-磺酸盐可以转化成天然胰岛素原。
步骤6：吸附色谱
为了纯化和浓缩重折叠后的胰岛素原，使含有重折叠的胰岛素原的重折叠反应混合物与极性甲基丙烯酸酯树脂HP-2MG接触，同时调整反应混合物的pH至3-4范围内，使8g含重折叠胰岛素原的混合蛋白质与1升树脂接触。在该接触中，根据胰岛素原重折叠反应的条件，将上载样品的蛋白质浓度控制在0.1-5mg/ml范围内。吸附后，用乙酸缓冲液(pH3-4)清洗树脂，用含15-50％(v/v)，优选30-50％(v/v)丙酮的含水乙酸缓冲液(pH3-4)洗脱重折叠的胰岛素原。然后，通过将合并的活性组分蒸发和冷冻干燥而从洗脱液中提取粉末形式的重折叠人胰岛素原，或者通过用NaOH调整洗脱液的pH到5-7，优选5-6，然后向合并的活性组分中加入终浓度为0.004-4％(w/v)，优选0.004-0.04％(w/v)的氯化锌，然后离心，以提取沉淀形式的重折叠人胰岛素原。
本发明的人胰岛素前体的制备方法比常规方法具有以下优点：首先，溶解和磺化同步进行，其使得大规模生产步骤得以简化；其次，可以成功地防止由于高浓度样品的分子间聚合作用导致的变性，例如胶凝；第三，在溶解过程中，由错误分子间二硫键导致的样品溶解性降低的问题可以从根本上得以解决。虽然该问题可以通过应用还原剂例如2-巯基乙醇或DTT克服，但是应用亚硫酸盐和连四硫酸盐的磺化更稳定，并得到比用还原剂处理更好的稳定性；第四，在用溴化氰处理之前，半胱氨酸残基的-SH基取代为-SSO3 -基，其防止可能发生在溶解步骤和下列步骤例如半胱氨酸到半胱磺酸的变性(参见：USP4,451,396)中的半胱氨酸残基的不可逆变性；第五，溴化氰处理和蒸发之后，进行离子交换色谱或吸附色谱，不需要任何预处理例如脱盐，因此在连续的工业规模过程中这是有利的。
本发明的进一步特征在于有效的重折叠反应，它是胰岛素工业规模生产的最关键步骤之一。特别是在大规模生产过程中，通过应用混合池的连续反应可获得增加的产率和良好的重现性。重折叠反应后，还可以利用工业应用的吸附树脂，从反应混合物将天然胰岛素原同时纯化、浓缩和脱盐。
在制备人胰岛素前体的常规过程中(本质上包括重折叠反应)，上述化学式(I)代表的多肽的半胱氨酸残基被磺化得到胰岛素原S-磺酸盐，它在pH7到11.5的中性或碱性条件下与每当量-SSO3 -基1-5当量的2-巯基乙醇反应(参见：USP 4,430,266)。该分批型反应得到约60％的重折叠率，虽然通过在重折叠反应后应用调整pH为4-6的复杂步骤以获得表现为聚集物形式的错误重折叠的中间物质、再次磺化和重折叠的一种循环***，可以将重折叠率提高到80％的水平(参见：USP 4,801,684)。然而，按照本发明，仅通过一步重折叠反应步骤即可使高达80％的胰岛素原S-磺酸盐转化成天然胰岛素原，这就导致步骤大大简化，并增加了产率。
一些关于重折叠反应的研究已经发现：蛋白质重折叠率降低的根本原因是在重折叠反应过程中，通过中间物质的表面疏水残基之间的非共价键形成聚集物；以及，所述聚集物的形成由几个因素极大地影响，例如蛋白质的浓度、反应体积、温度、pH等，而蛋白质浓度对生产率影响最大。因此，如果蛋白质的重折叠反应在低浓度下进行，则不能获得工业规模生产的高产率。因此，本领域提出了各种重折叠重组蛋白质的选择方法。例如，已经成功地推荐了加入聚集抑制剂例如精氨酸、去污剂例如聚乙二醇或变性剂的方法，和逐步增加重折叠反应中的蛋白质浓度的方法。
然而已经发现上述方法的一个缺点，不能实现反应物例如胰岛素原S-磺酸盐和2-巯基乙醇的迅速均匀混合，这会导致聚集而降低重折叠率，因为工业规模的胰岛素重折叠反应需要大反应体积。在这种情况下，为了减少胰岛素原S-磺酸盐和2-巯基乙醇混合过程中平衡所需的时间，本发明人通过将它们在小体积混合池中连续混合而进行重折叠反应，最终以高产率得到胰岛素原，即使应用的是高浓度胰岛素原S-磺酸盐。
重折叠反应后为了纯化重折叠的胰岛素原，通常应用凝胶过滤色谱例如Sephadex G-50和离子交换色谱，其基本上都需要更换缓冲溶液的步骤和除去残留盐的脱盐步骤(参见：USP 4,430,266)。常规脱盐方法包括凝胶过滤、透析、超滤等。其中，凝胶过滤应用聚右旋糖苷凝胶例如Sephadex G-25，根据物质的分子量或结构，基于物质通过凝胶的保留时间不同来分离物质。另一方面，代替凝胶的是用于透析技术的透析膜，以及用筒状物例如中空纤维和过滤片，和圆盘膜进行超滤。
然而，发现所述方法具有下列几个缺点：即，在凝胶过滤时，样品的容量依赖于装填于柱中的凝胶体积而不是样品的量或浓度(容量：10-25％的凝胶体积)。因此，如果在凝胶过滤中应用稀释样品，柱尺寸将变得相当大。另外，洗脱出来的样品被稀释，这使后面的步骤变得麻烦。另一方面，透析技术的缺点在于由样品非特异性结合到透析膜上而造成的样品损失，以及容量有限。超滤也存在缺点，即需要特殊设备，非特异性结合所致的样品损失，淤积和堵塞，流速降低，虽然它的优点在于高容量和有效的浓缩能力。
按照本发明，脱盐步骤与常规方法不同，它采用吸附色谱进行，其成功地解决了上述问题，即容量有限、样品稀释、非选择性结合等问题。特别是将含有活性胰岛素原的重折叠反应溶液调整到pH3-4的酸性条件，然后上样到极性甲基丙烯酸树脂，用含有15-50％(v/v)丙酮的缓冲液(pH3-4)回收几乎全部的重折叠胰岛素原。在该过程中，优选使用用于吸附表现出相对较高极性的有机物质的、可从Mitsubishi Chemical Co.购得的、商标名为HP-2MG的极性甲基丙烯酸树脂。为了得到最好的脱盐、浓缩和纯化效果，吸附/洗脱步骤在柱中进行。然而，它可以以分批或柱的方式进行。在该步骤中，根据上样样品的浓度，可以获得超过90％的产率和几到十几倍的有效浓缩。
简而言之，经重折叠的胰岛素原可以在一个步骤中经济地脱盐、浓缩、和纯化，洗脱液可以直接用于后面的步骤。
下面的实施例将进一步说明本发明，它们不应该被看作为对本发明范围的限制。
实施例1：内含体的纯化
将以内含体形式表达胰岛素原融合蛋白质的大肠杆菌细胞(参见：韩国专利公开号：94-1855)以1∶5-10(w/v)的比例悬浮于含有50mM EDTA、10％蔗糖和0.1mM PMSF的0.1M Tris缓冲液(pH7.9)中，在9,000psi压力下溶解细胞。在4℃，5,000rpm下离心细胞溶解液30分钟以得到沉淀。用10体积2％Triton-X100和蒸馏水冲洗含有内含体的300g(湿重)沉淀，离心得到纯化的内含体。
实施例2：内含体的碱溶解
将实施例1得到的内含体均匀悬浮于20体积蒸馏水中，搅拌3小时，然后在12,000rpm下离心30分钟，去除沉淀。由此得到的上清液的pH用1M HCl调整到5.5，在5,000rpm下离心30分钟得到沉淀。将沉淀出的蛋白质溶解于70％(v/v)甲酸，使浓度达到10mg/ml。然后，以相对于蛋白质的量100∶1的摩尔比加入溴化氰，并于25℃搅拌12小时。然后，进行减压蒸发至完全干燥，将由此得到的蛋白质溶解于含7M脲的20mM Tris缓冲液(pH9.5)中。加入亚硫酸钠和连四硫酸钠至终浓度分别为0.3M和0.1M，搅拌6小时。然后，进行HPLC分析，确定经磺化的胰岛素原的浓度(见：表1)。
实施例3：胍盐酸和还原剂导致内含体的溶解
将实施例1中得到的内含体悬浮于10体积含有下述变性剂的几种缓冲液中：第一，将它们溶解于含有6-7M胍盐酸和1mM EDTA的20mM Tris缓冲液(pH9.5)；第二，将它们溶解于含有6-7M胍盐酸和1mM EDTA的20mM Tris缓冲液(pH9.5)中，然后加入1mM 2-巯基乙醇；第三，将它们溶解于含有6-7M胍盐酸和1mM EDTA的20mM Tris缓冲液(pH9.5)中，然后加入终浓度分别为0.3M和0.1M的亚硫酸钠和连四硫酸钠。然后，将各种溶液在4℃搅拌12小时，在12,000rpm下离心30分钟，除去沉淀。然后，向由此得到的上清液中加入约10体积的冷水，并在5,000rpm下离心30分钟得到沉淀。将沉淀出的蛋白质溶解于70％(v/v)的甲酸，使浓度达到10mg/ml。然后，加入相对于蛋白质的量100∶1摩尔比的溴化氰，在25℃搅拌12小时。然后，进行减压蒸发至完全干燥，将由此得到的蛋白质溶解于含7M脲的20mM Tris缓冲液(pH9.5)中。加入亚硫酸钠和连四硫酸钠至终浓度分别为0.3M和0.1M，并于25℃搅拌6小时。然后，进行HPLC分析，确定经磺化的胰岛素原的浓度(见：表1)。
实施例4：脲和还原剂导致的内含体的溶解
将实施例1得到的内含体悬浮于10体积含有下述变性剂的几种缓冲液中：第一，将它们溶解于含有7-8M脲和1mM EDTA的20mM Tris缓冲液(pH9.5)；第二，将它们溶解于含有7-8M脲和1mM EDTA的20mM Tris缓冲液(pH9.5)中，然后加入1mM 2-巯基乙醇；第三，将它们溶解于含有7-8M脲和1mM EDTA的20mM Tris缓冲液(pH9.5)中，然后加入终浓度分别为0.3M和0.1M的亚硫酸钠和连四硫酸钠。然后，将各种溶液在4℃搅拌12小时，在12,000rpm下离心30分钟，除去沉淀。然后，向由此得到的上清液中加入约10体积的冷水，并在5,000rpm下离心30分钟得到沉淀。将沉淀出的蛋白质溶解于70％(v/v)的甲酸，使浓度达到10mg/ml。然后，加入相对于蛋白质的量100∶1摩尔比的溴化氰，并于25℃搅拌12小时。然后，进行减压蒸发至完全干燥，将由此得到的蛋白质溶解于含7M脲的20mMTris缓冲液(pH9.5)中。加入亚硫酸钠和连四硫酸钠至终浓度分别为0.3M和0.1M，于25℃搅拌6小时。然后，进行HPLC分析，确定经磺化的胰岛素原的浓度(见：表1)。
   表1：在实施例2到4的磺化中，不同溶解方法的效果*
    处理 溶解后蛋白质的量(克)     磺化产率(％)(磺化胰岛素原(克)/蛋白质的量)
    对照     10.2     28.6
    用碱溶解     7     6.7
  用胍盐酸溶解     -     -
用胍盐酸+1mM 2-巯基乙醇溶解     7.1     24
用胍盐酸+亚硫酸盐+连四硫酸盐溶解     6.3     48
    用脲溶解     7.0     31.5
用脲+1mM 2-巯基乙醇溶解     7.1     28
用脲+亚硫酸盐+连四硫酸盐溶解     6.2     45.2
*：各种样品均应用Triton X-100和冷蒸馏水清洗后的30克(湿重)内含体，仅用CNBr处理的同样量内含体用作对照。
从表1可以看到，在由脲或胍盐酸溶解后加入亚硫酸钠和连四硫酸钠使磺化胰岛素原的产率比对照增加1.5-2倍。另一方面，如果仅用胍盐酸溶解，而不用任何还原剂，则在加入70％(v/v)甲酸过程中发生凝胶作用。于是，不能够测定溶解后蛋白质的量和磺化产率。该结果可能是由于分子间疏水相互作用或二硫键形成的聚合作用所致。另外，加入2-巯基乙醇导致产率显著降低，也可能是由于上述同样原因所致。
清楚地表明：可以通过磺化胰岛素原融合蛋白质中-SSO3 -基的取代使整个分子表现负电荷来防止分子间相互作用；和，碱溶解影响蛋白质的稳定性。另一方面，在由脲或胍盐酸溶解后加入亚硫酸盐和连四硫酸盐对于磺化胰岛素原的产率没有产生显著影响。因此，在工业规模溶解中脲的应用将导致费用显著降低。
另外，对经溶解和磺化、溴化氰处理和溶解于含7M脲的20mMTris缓冲液步骤得到的样品的HPLC分析表明：溴化氰处理后加入亚硫酸盐和连四硫酸盐没有增加磺化产率。
实施例5：内含体的脲溶解和磺化
基于上述实施例2到4的结果，将内含体溶解于脲溶液，然后进行磺化。也就是说，将110g(湿重)纯化的内含体溶解于10体积含8M脲和1mM EDTA的20mM Tris缓冲液(pH8.5)中。然后，加入终浓度分别为0.3M和0.1M的亚硫酸钠和连四硫酸钠，在4℃下搅拌12小时，在12,000rpm下离心30分钟，除去沉淀。然后，向由此得到的上清液中加入约10体积的冷水，用2N HCl溶液将该溶液的pH调整到约5.5，在5,000rpm下离心30分钟得到湿重250g的沉淀。蛋白质的定量分析表明最终获得了约40g的蛋白质。
实施例6：溴化氰处理
将沉淀出的蛋白质溶解于2L 70％(v/v)的甲酸。然后，以相对于蛋白质的量100∶1的摩尔比加入溴化氰(CNBr)，在25℃搅拌12小时。然后，进行减压蒸发至完全干燥。将由此得到的蛋白质溶解于含7M脲的20mM Tris缓冲液(pH8.0)，然后通过HPLC进行分析。
实施例7：阴离子交换色谱
用DEAE-Sephacel装柱(2.5×30cm)，流速为每小时1.5柱体积，用含7M脲的20mM Tris缓冲液(pH8.0)平衡。然后，将实施例6中得到的样品以20mg/ml树脂的比例装到柱上，用1柱床体积的平衡缓冲液洗柱。利用含0-1M NaCl的平衡缓冲液通过浓度梯度洗脱蛋白质。然后，通过HPLC分析在0.35-0.45M NaCl处收集的洗脱液，结果表明纯度大于等于80％，回收率为91％。
实施例8：胰岛素原S-磺酸盐的重折叠
将经RP-HPLC纯化的活性重组胰岛素原磺化而得到的胰岛素原S-磺酸盐1g溶解于500ml 50mM甘氨酸缓冲液(pH10.6)。然后，通入氮气以排除氧气，然后封好容器。在另一个容器中，将104μl 2-巯基乙醇加入500ml 50mM甘氨酸缓冲液(pH10.6)，同样通入氮气以排除氧气并封好该容器。然后，将这两种溶液以50ml/hr的流速迅速加入容积为1ml的混合池，同时搅拌。将由此混合得到的重折叠反应溶液以100ml/hr的流速引入通氮气的储库，缓慢搅拌，在4℃下反应18小时。反应完成后，用2M HCl酸化溶液，使pH为2.9±0.1。HPLC分析表明重折叠率为55％。
实施例9：蛋白质浓度对重折叠的影响
通过除蛋白质浓度之外其余均如实施例8类似地进行一系列反应，考察蛋白质浓度对重折叠产率(即，胰岛素原S-磺酸盐转化为胰岛素原)的影响(见：表2)。
            表2：蛋白质浓度对重折叠产率的影响
蛋白质浓度(mg/ml) 产率(％) 蛋白质浓度(mg/ml) 产率(％)
    0.1     95     1     53
    0.2     90     2     20
    0.5     83     4     8
实施例10：-SH∶-SSO3 -比例对重折叠的影响
通过除-SH∶-SSO3 -比例之外其余均如实施例8类似地进行一系列反应，考察-SH∶-SSO3 -比例对重折叠产率的影响(见：表3)。
         表3：-SH∶-SSO3 -比例对重折叠产率的影响
  -SH∶-SSO3 -比例 产率(％)   -SH∶-SSO3 -比例 产率(％)
    1     41     2     54
    1.5     59     3     30
实施例11：脲浓度对重折叠的影响
通过除脲浓度之外其余均如实施例8所述类似地进行一系列反应，考察脲浓度对重折叠产率的影响(见：表4)。
         表4：脲浓度对重折叠产率的影响
    脲浓度(M) 产率(％)     脲浓度(M) 产率(％)
    0     52     0.5     79
    0.25     67     1.0     83
实施例12：经离子交换色谱纯化的胰岛素原S-磺酸盐的重折叠
用含1M脲的50mM甘氨酸缓冲液(pH10.6)稀释实施例7中得到的含10g胰岛素原S-磺酸盐的洗脱液，使终体积达到5L。然后，通入氮气以排除氧，并封好容器。在另一个容器中，将781μl 2-巯基乙醇加入5L含1M脲的50mM甘氨酸缓冲液中，通入氮气以排除氧气并封好该容器。然后，将这两种溶液以500ml/hr的流速迅速引入容积为1ml的混合池，同时搅拌。将由此混合得到的重折叠混合液以1L/hr的流速引入用氮气排除了空气的储库，缓慢搅拌，在4℃下反应18小时。反应完成后，用2M HCl酸化该溶液，使pH为2.9±0.1。HPLC分析表明重折叠率为81％。
实施例13：利用吸附色谱对人重组胰岛素原的纯化
将HP-2MG树脂(Mitsubishi Chemical Co.，Japan)，一种极性甲基丙烯酸酯树脂，以1g树脂/5ml丙酮的比例在室温下溶胀6小时。然后，用0.1N NaOH、蒸馏水、0.1N HCl、蒸馏水和20mM乙酸(pH3.2±0.2)依次充分清洗树脂，然后装柱。然后，用3柱床体积的平衡缓冲液(20mM乙酸，pH3.2±0.2)以每小时1个柱床体积的流速平衡上述柱。然后，将实施例12得到的含重折叠胰岛素原的反应溶液以每1L树脂8g蛋白质的比例上柱，并用1个柱床体积的20mM乙酸缓冲液(pH3.2±0.2)洗柱。然后，用含30％丙酮的同样缓冲液洗脱上述重折叠的胰岛素原。结果发现，提取到92％或更高的重折叠胰岛素原，而且无杂质例如甘氨酸和脲。HPLC和定量蛋白质分析也表明蛋白质被浓缩近10倍，纯度增加约1.3倍。然后，蒸发所述含活性胰岛素原的洗脱液以除去丙酮，并冷冻干燥，或者用1N NaOH将洗脱液的pH调到5.4，然后加入终浓度为0.04％(w/v)的氯化锌以回收重折叠的胰岛素原。
如前面清楚地说明和论证，本发明提供了一种胰岛素原的制备方法，其溶解和磺化、浓缩、脱盐和纯化步骤被大大简化，同时使重折叠反应的产率增加。按照本发明，可以在具备良好重现性的情况下生产人重组胰岛素前体。

Claims (19)

1.一种制备人胰岛素原的方法，包括以下步骤：
(i)将表达内含体形式的胰岛素原融合蛋白质的大肠杆菌细胞悬浮于缓冲液中，溶解所述细胞以得到内含体；
(ii)将步骤(i)中得到的所述内含体悬浮于含有变性剂的缓冲液中，同时用亚硫酸钠和连四硫酸钠磺化所述的胰岛素原融合蛋白质，得到如下列通式(II)所代表的胰岛素原S-磺酸盐融合蛋白质；
(iii)将步骤(ii)得到的胰岛素原S-磺酸盐融合蛋白质离心，得到沉淀，将沉淀溶解于甲酸，然后通过用溴化氰处理从所述融合蛋白质切下胰岛素原S-磺酸盐，然后在减压下干燥；
(iv)使步骤(iii)得到干燥的胰岛素原S-磺酸盐溶解于缓冲液，在阴离子交换色谱上纯化所述胰岛素原S-磺酸盐；
(v)将步骤(iv)得到的所述纯化的胰岛素原S-磺酸盐稀释于第一缓冲液，通入氮气以排除氧气而得到第一混合物，将第一混合物与含有2-巯基乙醇的第二缓冲液在混合池中混合，并在储库中搅拌，得到含有如下列通式(I)所代表的胰岛素原的重折叠反应混合物；和
(vi)将步骤(v)得到的重折叠反应混合物应用于吸附色谱树脂，用水溶液洗脱，得到重折叠的人胰岛素原，
Figure C988127570002C1
Figure C988127570003C1
其中，
R是可以被酶或化学降解的氨基酸残基或肽；和
X是胰岛素A链A-1氨基和胰岛素B链B-30羧基之间的键，其可以被酶或化学法从A链或B链中分离，其中A-1到A-21的区域是胰岛素的A链，从B-1到B-30的区域是胰岛素的B链。
2.权利要求1的制备人胰岛素原的方法，其中变性剂是脲或胍盐酸。
3.权利要求1的制备人胰岛素原的方法，其中变性剂的浓度范围为6-8M。
4.权利要求1的制备人胰岛素原的方法，其中内含体被悬浮于含有变性剂的pH为8-10的0.02-0.1M Tris缓冲液中。
5.权利要求1的制备人胰岛素原的方法，其中亚硫酸钠和连四硫酸钠的浓度范围分别为0.1-0.6M和0.01-0.1M。
6.权利要求1的制备人胰岛素原的方法，其中内含体以1∶10-20(w/v)的比率被悬浮于含有变性剂的缓冲液中。
7.权利要求1的制备人胰岛素原的方法，其中内含体在4-8℃的反应温度下被悬浮于含有变性剂的缓冲液中。
8.权利要求1的制备人胰岛素原的方法，其中所述经干燥的胰岛素原S-磺酸盐被溶解于含1mM EDTA和7M脲的pH为7-9的Tris缓冲液中，然后在用同样缓冲液平衡的阴离子交换色谱上进行纯化。
9.权利要求1的制备人胰岛素原的方法，其中纯化的胰岛素原S-磺酸盐用含有1M脲的pH为9-11的甘氨酸缓冲液稀释，使浓度达到0.1-10mg/ml。
10.权利要求1的制备人胰岛素原的方法，其中将相对于胰岛素原S-磺酸盐中的-SSO3 -基1-3当量比的2-巯基乙醇加入含有1M脲的缓冲液中。
11.权利要求1的制备人胰岛素原的方法，其中将含有经稀释的胰岛素原S-磺酸盐的缓冲液和含有2-巯基乙醇的缓冲液以1∶1的比例(v/v)混合。
12.权利要求10或11的制备人胰岛素原的方法，其中应用的缓冲液是pH为10.6的50mM甘氨酸缓冲液。
13.权利要求11的制备人胰岛素原的方法，其中所述的混合在容积为0.1ml-10L的混合池中进行。
14.权利要求1的制备人胰岛素原的方法，其中吸附色谱采用极性甲基丙烯酸酯树脂。
15.权利要求14的制备人胰岛素原的方法，其中使重折叠反应混合物在pH为3-4时吸附到极性甲基丙烯酸酯树脂上。
16.权利要求14的制备人胰岛素原的方法，其中在进行所述重折叠的人胰岛素原的洗脱之前，所述极性甲基丙烯酸酯树脂用pH为3-4的乙酸缓冲液冲洗。
17.权利要求1的制备人胰岛素原的方法，其中水溶液是含有15-50％(v/v)丙酮的pH为3-4的乙酸缓冲液。
18.权利要求1的制备人胰岛素原的方法，其中通过加入氯化锌而将经水溶液洗脱下来的重折叠人胰岛素原从含有重折叠胰岛素原的洗脱液中提取出来。
19.权利要求18的制备人胰岛素原的方法，其中将氯化锌加入含重折叠胰岛素原的洗脱液，至终浓度为0.004-4％(w/v)，pH值为5-7。
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