CN116355859B - 包含shp2 n-sh2结构域的靶向her2阳性肿瘤的car-t及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种包含SHP2 N‑SH2结构域的靶向HER2阳性肿瘤的CAR‑T及制备方法和应用,用于缓解现有研究中HRE2阳性表达的实体瘤疗效不佳的问题。本发明的CAR‑T胞外结构域为靶向HER2阳性肿瘤的纳米抗体，胞内结构域包括SHP2蛋白结构域；所述SHP2蛋白结构域为N‑SH2结构域，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

Description

包含SHP2 N-SH2结构域的靶向HER2阳性肿瘤的CAR-T及制备 方法和应用
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种包含SHP2 N-SH2结构域的靶向HER2阳性肿瘤的CAR-T及制备方法和应用。
背景技术
人表皮生长因子受体2（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER2）是一种细胞来源的原癌基因，又称为c-erbB-2基因，在多种肿瘤中过度表达和扩增。过多的HER2蛋白出现在肿瘤细胞表面会促进肿瘤细胞的***和生长，进而形成HER2阳性肿瘤。HER2过表达常见于乳腺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中。
CAR-T细胞（简称CAR-T）疗法（Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy）全称为嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种新型的***的精准靶向疗法。研究发现，CAR-T细胞能够精准、快速、高效、特异地识别并杀伤肿瘤细胞，近几年通过优化改良在协助肿瘤的治疗上取得了良好的效果，是一种非常有前景且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗研究方向。但目前CAR-T疗法在不同肿瘤,尤其是在实体瘤的效果上仍存在争议，实体瘤是CAR-T疗法亟待攻克的一个具有挑战性的目标。
Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶（Src homology-2 domain-containingprotein tyrosine phosphatase 2, SHP2）是一种去磷酸化酶，属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族。SHP2全长由两个SH2结构域（N-SH2和C-SH2）、一个保守的PTP结构域和一个灵活的C末端尾组成。完整的SHP2磷酸酶活性受其自身构象变化而调控，基态时N-SH2结构域与PTP结构域结合并直接阻断其活性位点，保持自抑制构象；当SHP2的信号蛋白被肿瘤细胞的信号激活后，上游受体酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinase，RTK）会触发PD1上的pTyr（磷酸化的酪氨酸）残基与SHP2两个SH2结构域结合，将PTP结构域从自抑制状态释放，传递激活PD1下游信号，从而抑制T细胞活性。
综上所述，本发明将提供一种结构改良的特异性靶向HER2阳性表达肿瘤细胞的新型CAR-T，以补充现有研究的不足。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种包含SHP2 N-SH2结构域的靶向HER2阳性肿瘤的CAR-T及制备方法和应用，具体技术方案如下。
一种靶向HER2阳性肿瘤的CAR-T，其嵌合抗原受体部分包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域为靶向HER2阳性肿瘤的纳米抗体（简称为HER2纳米抗体），所述胞内结构域包括SHP2蛋白结构域；所述SHP2蛋白结构域为N-SH2结构域，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步，所述嵌合抗原受体的胞内结构域还包括4-1BB共刺激分子和CD3ζ截短信号域，其中CD3ζ优选为截短的仅含有ITAM1部分。
进一步，所述嵌合抗原受体还包括CD8铰链区。
进一步，所述CAR-T表达上述任一项所述的嵌合抗原受体。
上述CAR-T在制备抗肿瘤药物中的应用，所述CAR-T中的SHP2 N-SH2结构域用于竞争性结合PD-1，阻碍PD-1和/或PD-L1免疫抑制信号的传递。
进一步，所述肿瘤为HER2阳性表达的实体肿瘤。
进一步，所述实体肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌或肠癌等。
上述CAR-T的制备方法，包括以下步骤：
1）合成包括靶向HER2阳性肿瘤的纳米抗体、CD8铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激分子、CD3ζ截短信号域和SHP2 N-SH2结构域的CAR结构序列；
2）用限制性内切酶分别对质粒载体和合成的CAR结构进行双酶切，以T4连接酶连接后进行转化和筛选培养，将得到的阳性克隆进行测序鉴定；
3）将合成的CAR与T细胞结合。
进一步，扩增所述SHP2 N-SH2结构域的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
有益技术效果
本发明提供了一种结构改良的新型靶向HRE2阳性肿瘤细胞的CAR-T，本发明CAR-T结构中的SHP2 N-SH2结构域可以用于竞争性结合PD-1，阻碍PD-1和/或PD-L1免疫抑制信号的传递，进而维持T淋巴细胞的免疫活性状态，持续保持对HER2阳性表达的肿瘤细胞具有杀伤效果。
其次，虽然目前有研究显示PD1上的pTyr残基可以与SHP2的两个SH2结构域结合。但本发明实验验证，单独的SHP2 N-SH2片段并不能发挥理想的抗肿瘤效力，特征是在效靶比E:T=1:1时（E代表Effector cell，即效应细胞；T代表Target cell，即肿瘤细胞），在连续杀伤24小时后，本发明制备的CAR-T细胞已经可以看出明显的杀伤/杀死肿瘤的效果，而单独的SHP2 N-SH2片段却几乎没有发挥出抗肿瘤效果。由此可见，本发明制备的CAR-T细胞在免疫治疗领域具有很大的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明合成的CAR结构（Her2 VH-BBZ(short)-P2A-SHP2 N-SH2）示意图；
图2为本发明合成的CAR阳性表达率结果图（APC为荧光染料，H代表高度）；
图3为CAR-T细胞体外杀伤（LDH）效果图；
图4为肿瘤细胞与CAR-T细胞在1:1的效靶比下连续杀伤情况的效果图；
图5为统计肿瘤细胞与CAR-T细胞在1:1的效靶比下连续杀伤情况的曲线图；
图6为肿瘤细胞与CAR-T细胞在1：2.5的效靶比下连续杀伤情况的效果图；
图7为统计肿瘤细胞与CAR-T细胞在1：2.5的效靶比下连续杀伤情况的曲线图；
图8为肿瘤细胞与CAR-T细胞在1：5的效靶比下连续杀伤情况的效果图；
图9为统计肿瘤细胞与CAR-T细胞在1：5的效靶比下连续杀伤情况的曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5%，更典型的是所述值的+/-4%，更典型的是所述值的+/-3 %，更典型的是所述值的+/-2 %，甚至更典型的是所述值的+/-1 %，甚至更典型的是所述值的+/-0.5%。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1〜6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
实施例1
本实施例提供一种CAR-T细胞的制备方法。
1.CAR表达载体的构建：
1）CAR结构由胞外HER2纳米抗体，CD8铰链区、跨膜区，胞内4-1BB共刺激分子、CD3ζ截短信号域以及SHP2 N-SH2结构域构成，结构片段采用基因合成的方法制备。
2）用限制性内切酶EcoR I和BamH I分别对Pwpxld载体和CAR结构片段进行双酶切，以T4连接酶连接后进行转化和筛选培养，将得到的阳性克隆进行测序鉴定，最终获得HER2 CAR-Pwpxld表达载体以及SHP2 N-SH2-Pwpxld对照载体（该对照载体仅含有SHP2 N-SH2片段）。本发明合成得到的CAR全称为Her2 VH-BBZ(short)-P2A-SHP2 N-SH2，结构见图1。
本实施例中合成/扩增得到的各片段序列如表1所示。
表1
2.慢病毒包装：
1）复苏培养293T细胞，融合度达到80%左右时进行病毒包装。
2）按照培养基（DMEM+10%FBS）的量加入氯喹溶液，使终浓度为100μmol/L。
3）病毒包装体系(10cm培养皿)为：50μl CaCl2、20μg 构建的核心质粒、10μgPspax2、5μg PMD2.0G、500μl Nuclease-free wate（无核酸酶水）、500μl 2X BBS。
4）10h左右换新鲜预温培养基（DMEM+10%FBS）。
5）收集培养了48h和72h病毒液，0.22μm滤膜过滤去除杂质。
6）超速离心，用病毒原液1/400的DPBS重悬浓缩的病毒，并按后续用量进行分装，-80℃冻存备用。
3.外周血细胞分离：
1）提前一天孵育T细胞培养方瓶（T25），4℃孵育过夜。T细胞培养基中含有抗人CD3和CD8D单克隆抗体：3ml DPBS、4μg/mL CD3、4μg/mL CD28.
2）抽取适量健康志愿者新鲜血液。
3）取15mL BD管，加入5mL Ficoll，轻缓加入5mL新鲜血液。
4）常温离心，升1降1，1000g，30min。
5）离心后小心吸取中间层（白色）的外周血淋巴细胞。
6）加入三倍体积预温的DPBS洗涤，300g，10min。
7）可选地加入5mL红细胞裂解液，室温裂解5min，加入等体积预温DPBS。
8）细胞计数，常温离心，100g，10min。
9）按2*10^6/mL加入适量T细胞培养液（X-vivo，5%AB血清，400IU IL2）重悬细胞。
10）吸除T25方瓶中的抗体孵育液，加入T细胞培养液重悬的T细胞，37℃正常培养48h左右。
4.CAR-T细胞制备：
1）提前一天孵育T细胞培养板，4℃孵育过夜。采用24孔板，每一孔中加入0.5mlDPBS和10μl RetroNectin（1mg/mL）。
2）吸除RetroNectin溶液。
3）每孔加入1 mL 2% BSA溶液，37℃封闭30min。
4）吸除封闭液，使用DPBS洗涤一次。
5）每孔（非黏附孔板）加入200μl 400X病毒，300μl X-vivo完全培养基，32℃，1000g 升2降2离心2h。
6）每孔加入2-2.5*10^6个激活48h左右的T细胞，X-vivo完全培养基补足至1mL/孔，32℃，300g 升2降2离心15min。
7）37℃正常培养72h左右，流式检测CAR阳性表达率，见图2。结果显示，本发明构建的CAR的阳性表达率为75.7%。
实施例2
本实施例提供体外杀伤检测试验。
1）96孔板杀伤：肿瘤细胞1*10^4/孔，用本发明构建的CAR-T细胞和仅含SHP2 N-SH2的对照T细胞，分别按照与肿瘤细胞以效靶比1:1、2.5:1、5:1进行铺板，每个效靶比3个复孔，并做空白T细胞（Mock）对照。
本实施例采用Skov3-mCherry细胞系，其为一种具有广泛代表性的细胞模型。
2）使用活细胞动态检测仪连续检测CAR-T细胞体外杀伤情况。
3）24h左右取培养上清检测LDH以计算肿瘤裂解率。
实验结果见图3-图9。
图3显示，随着效靶比的增高，肿瘤裂解率逐渐增大，说明随着效靶比的增高CAR-T细胞发挥了更大的杀伤效力。
图4-图9显示了不同的效靶比下的连续杀伤效果。从中可以看出，即使是在效靶比（又称为E/T比率），E:T=1:1时（E代表Effector cell，即效应细胞；T代表Target cell，即肿瘤细胞），在连续杀伤24小时后，视野里的肿瘤细胞数量也明显少于对照组。说明本发明构建的CAR-T细胞对HER2阳性表达的肿瘤细胞具有明显的杀伤效果；而对照单独的SHP2 N-SH2 T细胞却几乎没有发挥出抗肿瘤效果。此外，本发明的CAR-T能保持连续48h的杀伤效力，说明其效力具有较好的持续性。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (4)

1.一种靶向HER2阳性表达实体肿瘤的CAR-T，其嵌合抗原受体部分包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其特征在于，所述胞外结构域为靶向HER2阳性表达实体肿瘤的纳米抗体，所述胞内结构域包括合成的SHP2蛋白结构域；所述合成的SHP2蛋白结构域为N-SH2结构域，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述嵌合抗原受体的胞内结构域还包括4-1BB共刺激分子和CD3ζ截短信号域；所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的CAR-T在制备抗实体肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述CAR-T中的SHP2 N-SH2结构域用于竞争性结合PD-1，阻碍PD-1和/或PD-L1免疫抑制信号的传递。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述实体肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌或肠癌。
4.权利要求1所述的CAR-T的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）合成包含靶向HER2阳性表达实体肿瘤的纳米抗体、CD8铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激分子、CD3ζ截短信号域和SHP2 N-SH2结构域的CAR结构序列，其中扩增如SEQ ID NO:1所示的SHP2 N-SH2结构域的引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；
2）用限制性内切酶分别对质粒载体和合成的CAR结构序列进行双酶切，以T4连接酶连接后进行转化和筛选培养，将得到的阳性克隆进行测序鉴定；
3）用T细胞表达步骤2）合成的所述CAR结构序列。
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