CN116334209B - 基于crispr技术的病理切片原位基因检测产品及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,公开了一种病理切片上原位基因检测的产品及其用途,所述产品包括经过修饰的切口酶、靶向突变位点的引导RNA、RCA扩增试剂、荧光报告***;所述经过修饰的切口酶无核酸内切酶活性,所述荧光报告***中包括荧光染料修饰的核酸探针,所述核酸探针的个数为两个以上,两个核酸探针中的荧光染料之间能发生FRET(
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及基于CRISPR技术的病理切片原位基因检测产品及其用途。
背景技术
目前疾病相关基因表达异常(基因突变、扩增等)的检测主要是利用荧光定量PCR技术,以患者石蜡包埋病理切片组织中提取的DNA为检测样本。而以荧光定量PCR技术为基础的基因突变检测存在以下缺点:1.对于穿刺等含量小的组织,核酸提取质量对检测结果的准确性有较大影响;2.基因突变在试管中检测得到的结果,与细胞形态信息通常是分离的,一定程度影响病理诊断时间和准确性。
目前在临床诊断与生命科学领域广泛使用的病理切片原位检测技术是荧光原位杂交技术(FISH),该方法本质上是将荧光修饰、序列已知的核酸探针与细胞或组织中的靶标DNA/RNA进行原位杂交,并通过荧光分析法显示,实现靶标DNA/RNA的原位显示。
但FISH方法存在着精度不足的缺陷:其适合于对中高拷贝数的靶标分子检测,但不适合于低拷贝数(甚至单拷贝数)的靶标分子的检测,这主要是由于FISH方法的信号放大能力有限。这一缺陷无疑限制了FISH方法向着单分子精度的突变检测、多基因突变的同时检测方向发展。目前常用的解决方法有两种,一是通过增加荧光互补探针的数量来增大信号强度,但该方法的成本较高;二是使用共聚焦显微镜,而共聚焦显微镜高昂的价格将阻碍该技术向普通医院推广。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种用于病理切片原位基因检测的产品及其用途。本发明基于CRISPR(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)技术开发的病理切片原位基因检测***是极具潜力的分子病理检测新方向。本发明的检测***能够快捷且可视化地对基因突变位点进行原位检测,具有高灵敏度、高特异性的特点。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供一种病理切片原位检测基因突变的产品,所述产品中包括经过修饰的切口酶或其编码基因、靶向突变位点的引导RNA或其编码基因、RCA扩增试剂、以及荧光报告***,所述经过修饰的切口酶无核酸内切酶活性,所述荧光报告***中包括荧光染料修饰的核酸探针,所述核酸探针的个数为两个以上,两个核酸探针中的荧光染料之间能发生FRET。
本发明的另一目的是提供一种如上所述的检测产品在制备用于病理切片原位靶基因检测产品中的用途。
本发明的另一目的是提供经过修饰的切口酶和/或引导RNA或包含两者的CRISPR体系在制备用于病理切片原位基因检测例如BRAF V600E突变位点的原位检测产品中的用途;所述经过修饰的切口酶、sgRNA分别如上所述的检测体系中所述。
本发明的另一目的是提供一种病理切片原位基因检测突变位点的方法,将所述的产品施用于病理切片中,利用荧光显微镜进行荧光检测,获得基因检测结果。
如上所述,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明的一种可在病理切片上开展基于CRISPR/dCas9的BRAF V600E突变检测***。为了保证检测的特异性,所设计的sgRNA已经过NCBI核酸数据库检索比对,确定与包括人、动植物和微生物在内的基因组无高度同源性匹配。
(2)本发明涉及的病理切片原位检测技术,其检测结果可在普通荧光显微镜下进行肉眼直接判读,而不需要依赖共聚焦显微镜,这降低了该***的检测门槛,有利于向医疗不发达的地区、医院进行推广,可以大大助力病理医师快速精准诊断。
(3)本发明涉及的病理切片原位检测方法可视作一种通用检测工具,适用于任何满足CRISPR/dCas9蛋白识别的基因位点的检测,在应用于不同基因检测时,只需要更换sgRNA即可。
(4)本发明提供了一种在病理切片上进行原位基因检测的方法,该方法可以同时获取组织形态和基因表达信息,可提高病理诊断的准确性。
(5)基于dCas9-sgRNA复合物,可以靶标到细胞内的单分子突变,基于RCA扩增体系,还可以有效放大低拷贝数(甚至单拷贝数)的靶标分子的信号;基于可发生FRET的荧光探针,可以降低***荧光背景。因此基于CRISPR技术的病理切片原位检测方法和***,可以实现高灵敏度、高特异性,且不依赖昂贵成像仪器的原位基因检测。该***将大大助力临床病理诊疗的精细化水平研究,具有潜在的临床应用前景。
附图说明
图1显示为本发明的基于CRISPR技术的病理切片原位基因检测***原理示意图。
图2显示为原位BRAF V600E的不同sgRNA筛选的柱状图。
图3显示为本发明的不同sgRNA检测BRAF V600E突变体和野生型的荧光比值散点图。
图4显示为本发明的基于dCas9***原位检测病理切片中(以BRAF V600E突变为实施案例)的显微镜成像图,DIC代表荧光显微镜明场成像,FRET代表荧光共振成像,下方图为组织样本一代测序峰图。
图5显示为本发明的荧光染料Cy3.5与AF647的吸收、发射光谱;图中Cy3.5(FRET供体,蓝线)和AF647(FRET受体,红线)两种荧光染料的吸收(虚线)和发射(实线)光谱,以及在荧光显微镜观测时用于Cy3.5和AF647检测的透射带通滤波器的透射光谱区域(灰色)。
具体实施方式
本发明开发了一种基于CRISPR(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)技术的病理切片原位基因检测产品,产品中经过核酸修饰的dCas9蛋白可以在针对靶序列设计的sgRNA的引导下特异性识别并结合靶标序列;随后,dCas9蛋白上修饰的核酸序列作为引物序列与后续添加的Padlock DNA结合,启动RCA扩增;扩增产生的RCP与后续添加的荧光染料修饰探针结合,由于荧光探针的染料间会发生FRET,因此可使用荧光显微镜直接观察FRET荧光而无需洗涤。本发明的检测***能够快捷且可视化地对基因突变例如BRAF V600E突变进行原位检测,具有高灵敏度、高特异性的特点。
具体的,本发明提供了一种病理切片原位基因检测的产品,所述产品包括经过修饰的切口酶或其编码基因、靶向突变位点的引导RNA或其编码基因、RCA扩增试剂、荧光报告***;所述经过修饰的切口酶无核酸内切酶活性,所述荧光报告***中包括荧光染料修饰的核酸探针,所述核酸探针的个数为两个以上,两个核酸探针中的荧光染料之间能发生FRET。
所述经过修饰的切口酶为连接有醛基的寡核苷酸修饰的切口酶。所述经过修饰的切口酶为将切口酶与醛基化修饰优选为5'端醛基化修饰的寡核苷酸连接后获得的切口酶;即所述经过修饰的切口酶中包括切口酶与醛基化修饰的寡核苷酸。在一种实施方式中,所述醛基化修饰位点为5'端腺嘌呤脱氧核糖核酸的磷酸基团上。
本发明的某些实施方式中,醛基化修饰的寡核苷酸使用S-HyNic(SANH)连接剂与切口酶连接。醛基化修饰的寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示:AAAAAAAAAAGACGCTAATAGTTAAGACGCTT(SEQ ID NO.21)。
所述切口酶选自CRISPR/Cas效应蛋白或其变体;优选地,所述Cas蛋白选自Cas9、Cas12家族蛋白或其变体的任意一种或几种。优选地,所述Cas蛋白选自Cas9家族蛋白的任意一种或几种组合。在一种实施方式中,所述Cas蛋白选自dCas9即核酸内切酶失活的Cas9(nuclease-dead mutants of Cas9,dCas9)。更优选地,所述Cas9家族蛋白选自spCas9中的一种或其任意组合;更优选地,所述spCas9家族蛋白选自spdCas9。
在本发明的某些实施方式中,所述dCas9蛋白通过市购获得。在另一种实施方式中,所述dCas9蛋白通过构建获得。构建方法为本领域现有技术,例如包括:在NCBI数据库中获取dCas9蛋白的核酸序列,对dCas9蛋白核酸序列的原核密码子进行优化,将其构建到pET28a表达载体上,转化入BL21菌株。通过低温诱导dCas9蛋白表达,然后经过亲和纯化及阴阳离子交换层析即获得目的蛋白。
所述经过修饰的切口酶可以作为引物用于RCA扩增。
所述靶向突变位点的引导RNA为sgRNA。进一步优选地,所述sgRNA覆盖突变点且与突变型靶向序列匹配。进一步优选地,所述sgRNA包含一处或几处错配碱基。
在一些实施方式中,所述sgRNA长度为18~22bp。在一些优选实施方式中,所述sgRNA长度为20bp。
在本发明的某些实施方式中,以BRAF基因的V600E突变位点为例,sgRNA的设计方法为:在BRAF基因的V600E位点附近寻找包含dCas9识别序列(PAM)NGG的靶向序列,设计20bp长度的覆盖突变点且与突变型靶向序列匹配的sgRNA。例如所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-20任一所示。
所述sgRNA的制备可通过现有技术获得,例如构建载体pUC57-T7-sgRNA,经体外转录获得目的sgRNA;或直接合成sgRNA序列对应的RNA。
所述经过修饰的切口酶能与靶向突变位点的引导RNA形成切口酶-引导RNA复合体。
本发明所述检测产品中,所述经过修饰的切口酶如Cas蛋白本身并不表现活性,与靶向突变位点的引导RNA形成切口酶-引导RNA复合体后,sgRNA识别目标突变序列,引导经过修饰的切口酶特异性结合靶标位点,经过修饰的切口酶中的5'端醛基化修饰的寡核苷酸作为引物,参与后续的RCA扩增。
本发明所述检测产品针对的靶标核酸选自DNA、RNA、cDNA、核酶、核酸适配体(aptamer)、肽-核酸嵌合体中的一种或其任意组合。优选地,所述靶标核酸为DNA。进一步优选地,所述核酸突变位点是BRAF V600E基因突变类型。
本发明所述检测产品中,可以包含所述经过修饰的切口酶的表达载体。所述表达载体表达经过修饰的切口酶,与引导RNA形成复合体。
所述RCA扩增试剂即滚环扩增试剂。
在本发明的某些实施方式中,所述RCA扩增试剂包括Padlock DNA或RCA缓冲液。
所述Padlock DNA的设计根据本领域的常规技术设计即可。
在一种实施方式中,Padlock DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
在本发明的某些实施方式中,所述RCA缓冲液包括如下成分:BSA、phi29-polymerase Buffer、dNTP、Tween-20、Phi-29聚合酶。以RCA缓冲液的总体积为基准,BSA的终浓度为0.15~0.3mg/ml、dNTP的终浓度为0.15~0.3mM、Tween-20的终浓度为0.03%~0.07%、Phi-29聚合酶的终浓度为0.2~0.3U/μl。优选的,BSA的终浓度为0.25mg/ml、dNTP的终浓度为0.25mM、Tween-20的终浓度为0.05%、Phi-29聚合酶的终浓度为0.25U/μl。
在本发明的某些实施方式中,5'端连接有醛基的寡核苷酸适于与Padlock DNA结合以形成环状DNA;优选的,所述5'端连接有醛基的寡核苷酸含有与所述Padlock DNA的两端互补的片段;优选的,5'端连接有醛基的寡核苷酸中还包括poly A片段;更优选的,5'端连接有醛基的寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
在本发明的某些实施方式中,所述荧光染料修饰的核酸探针为在核酸探针的5'端修饰荧光染料。
所述荧光染料选自荧光蛋白或荧光素。两种荧光染料之间能发生FRET,发生FRET后激发、发射波长有较大的斯托克斯位移。一般两种荧光染料的空间距离为10nm以下优选为7~10nm时,两种荧光染料之间能发生FRET。使用被称为Forster共振能量转移(FRET)的方法,在溶液中游离的供体和受体不发射FRET信号,可以在免洗的情况下与目标结合供体和受体区分开来,因此可以实现免洗的荧光成像分析。
所述荧光染料选自FAM、FITC、Dylight系列荧光素、Alexa Flour系列荧光素、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TRITC、TAMRA、Pacific blue以及罗丹明中的至少一种。在一种实施方式中,两种荧光染料分别选自Cy3.5、Alexa Flour647。
所述核酸探针特异识别Padlock DNA,优选的,所述核酸探针中包含有与PadlockDNA匹配的片段,以用于检测以Padlock DNA为模板进行RCA扩增后的产物(RCP)。在一种实施方式中,所述核酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示。在一种实施方式中,核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的核酸探针用cy3.5标记,核苷酸序列如SEQ IDNO.24所示的核酸探针用AF647标记。
本发明的5'端连接有醛基的寡核苷酸修饰的切口酶、荧光染料修饰的核酸探针、Padlock DNA等试剂均为通用试剂,可以用于检测各种核酸突变位点,因此本发明所述检测产品所针对的核酸突变位点可以是任意满足dCas9结合要求的基因突变位点,包括但不限于是BRAF V600E,即所述检测产品可以作为通用***用于任何其他基因突变位点的检测。
本发明的某些实施方式中,所述检测产品还包括用于预处理病理切片的试剂。所述预处理病理切片的试剂例如为脱蜡水化试剂、抗原修复试剂、免疫染色通透试剂。病理切片进行原位检测前进行预处理即脱蜡水化、抗原修复、通透,目的是使细胞基因组序列暴露以便于原位检测。
本发明的某些实施方式中,所述检测产品还包括缓冲液,例如清洗缓冲液、连接缓冲液等。所述清洗缓冲液中包括TBS和Tween-20。在一种实施方式中,所述清洗缓冲液中包括:每升TBS(pH 7.7)中加入500μl Tween-20。
以40μl体系为例,所述连接缓冲液的配方为:向21μl水中加入1μl BSA(10mg/ml)、4μl T4 DNA连接酶缓冲液(10×)、4μl Tween-20(0.5%)、4μl NaCl(2.5M)、4μl ATP(10mM)、2μl Padlock DNA(10μM)。其他体积的连接缓冲液中各物质可以按照该比例同比扩大或缩小。
本发明所述检测产品针对的样本是通过任何合适的手段直接从目的来源获得的组织样本。所述组织样本可以是新鲜组织样本或石蜡组织样本。在一些实施方案中,通过选自以下的方法获得组织样本:活组织检查(例如,细针抽吸或组织活组织检查)、手术组织。
所述组织样本为来源于炎症、自身免疫性疾病、肿瘤或由新冠病毒COVID-19引起或伴发的上述疾病的组织样本。
所述肿瘤选自淋巴瘤或实体瘤的组织样本;具体选自乳腺癌、淋巴样肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、肾透明细胞癌、脑低度胶质瘤、肺腺癌、卵巢癌、***癌、黑色素瘤、甲状腺癌、子宫肉瘤、急性淋系白血病、宫颈鳞状细胞癌、结肠腺癌、胃癌、直肠癌、胸腺癌的一种或多种;优选地,所述肿瘤为甲状腺癌、结直肠癌、黑色素细胞瘤中的一种或几种。
所述产品中还可根据需要包括:容器、对照物(阴性或阳性对照)、助剂等,本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。
本发明的用于病理切片原位基因检测的产品亦可称为用于病理切片原位基因检测的检测体系。
本发明提供了一种基于CRISPR/dCas9的用于病理切片原位检测BRAF V600E突变的试剂盒,所述检测试剂盒中包含特异性检测BRAF V600E突变型DNA的dCas9荧光检测体系;所述检测体系内包含:dCas9蛋白、针对BRAF V600E突变型的特异性sgRNA、RCA扩增试剂和荧光报告***。
具体的,所述经过修饰的切口酶为dCas9;所述dCas9蛋白识别的PAM序列为NGG。所述sgRNA长度为20bp,其覆盖突变位点且与突变位点序列匹配,且包含一个或多个人为引入的错配碱基;所述sgRNA为覆盖BRAF V600E突变位点且包含一个引入的错配碱基,命名为sgRNA-8,核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。所述RCA扩增引物、Padlock分别如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示;所述荧光报告***所用荧光染料为:Cy3.5和AF647,其对应的寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示。
本发明的检测产品的机理为:基于dCas9蛋白的CRISPR检测体系在sgRNA的引导下特异性(单碱基精度)的识别、结合靶标突变位点;随后dCas9蛋白上修饰的核酸序列作为引物与Padlock DNA结合,启动RCA扩增;最后RCA扩增得到的RCP为两种荧光染料修饰的探针提供了足够接近的结合位点,因此两种染料间可以发生FRET,使研究人员能够通过荧光显微镜观察到阳性检测结果。而该***在检测不含突变的原始序列时,因为sgRNA与靶标序列碱基错配无法结合,因此后续的RCA扩增无法进行,最终研究人员通过荧光显微镜观察到阴性检测结果。
本发明还提供了如上所述的检测产品在制备用于核酸突变位点检测产品中的用途。优选用于制备病理切片原位基因检测产品中的用途。
本发明还提供了经过修饰的切口酶和/或引导RNA或包含两者的CRISPR体系在制备用于核酸突变位点原位检测产品中的用途;所述经过修饰的切口酶、sgRNA分别如上所述的检测体系中所述。
本发明还提供一种病理切片原位基因检测的方法,所述方法包括将所述检测产品施用于病理切片中,利用荧光显微镜进行荧光检测,获得基因检测结果。
本发明所述检测方法包括以下步骤:
步骤a:制备或预处理包含组织样本,例如为新鲜组织和/或石蜡切片的载玻片;
步骤b:将醛基化修饰的寡核苷酸与切口酶连接,构建核酸修饰的切口酶
步骤c:将核酸修饰的切口酶与sgRNA共同孵育,构建切口酶-引导RNA复合体;
步骤d:将切口酶-引导RNA复合体加至步骤a的载玻片上进行孵育,以使复合体结合靶标序列;
步骤e:将包含有Padlock DNA的连接缓冲液加至步骤d处理后的载玻片上,以使Padlock DNA结合dCas9蛋白;
步骤f:将RCA扩增试剂加至步骤e处理后的载玻片上以进行RCA扩增;
步骤g:将荧光染料修饰的核酸探针加至步骤f处理后的载玻片上,孵育后利用荧光显微镜肉眼观察判读结果。
在一种实施方式中,检测方法中孵育的温度可以根据实际需要在24-40℃间进行选择;优选地,为37℃。所述孵育反应的时间可以根据实际需要在10-60min间进行选择;优选地,为30min。
本发明还提供了上述用于BRAF V600E突变快速原位检测的dCas9试剂盒的制备方法。
所述dCas9蛋白的制备方法包括:对dCas9蛋白核酸序列的原核密码子进行优化获得序列,将其构建到pET28a表达载体上,通过低温诱导可溶蛋白表达,然后经过亲和纯化及分子筛纯化即获得目的蛋白。
所述特异性sgRNA的制备方法包括:在BRAF基因的V600E位点附近寻找包含dCas9识别序列(PAM)的靶向序列,设计20bp长度的覆盖突变点且与突变型靶向序列匹配的sgRNA;完成设计后,制备sgRNA;
作为优选,所述sgRNA的制备可通过构建载体pUC57-T7-sgRNA,经体外转录获得目的sgRNA;或直接合成sgRNA序列对应的RNA。
将制备获得的dCas9蛋白、sgRNA和荧光报告***按照一定的配比,即配制获得所述dCas9试剂盒。
本发明提供的病理切片原位基因检测快速检测试剂盒的结果判读既可利用酶标仪进行荧光读数,也可在荧光显微镜下进行肉眼观察进行定性测定。对于本发明中的ssDNAFQ reporter,酶标仪的检测激发光应设定为485nm-520nm。肉眼观察使用的荧光显微镜可选用激发波长为510±21nm,发射波长720±7nm。
本发明中,蛋白的变体为原始蛋白的片段、衍生物和类似物,其可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白,或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。根据本发明的定义,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。例如,在一些实施方式中,所述经过修饰的切口酶片段的变体是指与所述经过修饰的切口酶的氨基酸序列具有75%或更高,或85%或更高,或90%或更高,或95%或更高同一性,且具有所述经过修饰的切口酶相同或相似功能的蛋白。所述相似功能是指保留原蛋白的75%或更高,或85%或更高,或90%或更高,或95%或更高的功能。
本发明所述检测体系、检测产品、试剂盒、方法等适用于任何原因引起的疾病中BRAF V600E的基因突变检测。
如本文所用,序列相似性或同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件,两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(%)表示,其可以用来评价相关序列之间的同一性。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
以下以临床病理切片中BRAF V600E基因突变的检测为例介绍本发明的病理切片原位检测方法,大致过程如图1所示:首先,对获得的病理切片样本进行脱蜡、渗透处理,使细胞内的基因组序列得到暴露;然后将“核酸序列修饰的dCas9蛋白-sgRNA”复合体添加到玻片上孵育,在sgRNA的引导下,复合物与靶标位点(BRAF V600E)特异性结合;随后以核酸序列修饰的dCas9蛋白上的核酸序列为引物,Padlock DNA为模板,进行滚环式循环放大(RCA),在dCas9蛋白上扩增出一个长RCP;随后加入两种荧光染料修饰的核酸探针(两种染料间可发生FRET),使其与RCP特异性结合;最后在荧光显微镜下观察荧光染料的FRET反应。该方法背景信号干扰低、信号放大效率高、无需共聚焦显微镜,有潜力成为新型的肿瘤基因突变筛查和床旁检测技术。
实施例1:筛选针对BRAF V600E突变体的sgRNA
1.1BRAF V600E突变体特异性sgRNA的序列设计和制备
本实施例中所用的甲状腺癌患者石蜡切片样本为按照相关法律法规合格操作获得。
在BRAF基因的V600位点附近寻找包含dCas9识别序列(PAM)NGG的靶向序列,设计20bp长度的覆盖突变点且与突变型靶向序列匹配的sgRNA,为了进一步降低WT的杂信号,在sgRNA上非突变位点处再设计一处错配碱基,共设计20条sgRNA(表1);序列交由南京金斯瑞公司公司直接合成。
表1针对BRAF V600E突变体的sgRNA
1.2核酸修饰的dCas9蛋白的设计与制备
利用SANH作为连接剂,连接dCas9蛋白与5'端醛基化修饰的寡核苷酸(SEQ IDNO.21),构建核酸修饰化的dCas9蛋白:dCas9-DNA。
所述dCas9蛋白的制备方法为:在NCBI数据库中获取dCas9蛋白的核酸序列,进行原核密码子优化后委托南京金斯瑞进行片段合成。将合成的片段构建到pET28a表达载体上,转化入BL21菌株。通过添加IPTG与低温诱导dCas9蛋白表达,然后经过亲和层析纯化及阴阳离子交换层析即可获得目的蛋白。
所述表达载体pET28a购买自索莱宝(货号:P3110);
所述dCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示:
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO.25)。
所述醛基化修饰的寡核苷酸制备步骤:序列设计完成后由南京金斯瑞公司合成,并委托其在寡核苷酸5'端修饰一个醛基(修饰位点为5'端腺嘌呤脱氧核糖核酸的磷酸基团上)。
连接dCas9蛋白与5'端醛基化修饰的寡核苷酸:首先,在无胺缓冲液(pH7.4的PBS)中准备dCas9蛋白(浓度为2.0mg/ml)。以1:20的SANH∶dCasa9摩尔比,将溶解在DMSO中的SANH(10mM)添加到dCasa9溶液中,室温下孵育2h,使SANH与dCas9蛋白连接为SANH-dCas9;随后,使用购买自赛默飞的Zeba脱盐离心柱(货号:89935)将SANH-dCas9与游离的SANH分离。脱盐Buffer及SANH-dCas9存储溶液为无胺缓冲液;以1:3的SANH-dCas9∶寡核苷酸摩尔比将SANH-dCas9与醛基修饰的寡核苷酸混合。室温下孵育2h,使SANH-dCas9与醛基修饰的寡核苷酸充分连接;最终,使用购买自默克的超滤管(货号:UFC903096)将核酸修饰的dCas9蛋白与醛基修饰的寡核苷酸分离出来。超滤Buffer及核酸修饰的dCas9蛋白的存储溶液为无胺缓冲液。
1.3“核酸修饰的dCas9蛋白-sgRNA复合体”的制备
经过核酸修饰的dCas9蛋白与1.1中构建的sgRNA组成“dCas9-sgRNA”复合物,靶标组织切片中BRAF V600E突变位点。具体的,将1.2中制备的核酸修饰的dCas9蛋白(2.0mg/ml)与1.1中所述sgRNA以1:4的摩尔比在无胺缓冲液中混合,并在室温下孵育10分钟,使核酸修饰的dCas9蛋白与sgRNA组成“核酸修饰的dCas9蛋白-sgRNA复合体”,并在进行下一步之前储存在冰上。
1.4“核酸修饰的dCas9蛋白-sgRNA复合体”结合靶标序列
将1.3中制备的“核酸修饰的dCas9蛋白-sgRNA复合体”稀释至2.0mg/ml,以1cm2滴加40μl的量加到预先处理过(脱蜡水化、抗原修复、通透)的载玻片上。孵育30min,在sgRNA的引导下,复合体与靶标序列结合。孵育结束后,使用清洗缓冲液清洗玻片;本发明中,清洗缓冲液配方:向1升1×TBS(pH 7.7)中加入500μl Tween-20,混合均匀后得到。
所述脱蜡水化试剂为二甲苯与浓度从高到低的乙醇溶液;脱蜡水化步骤为:提前准备9个溶液缸,编号为1-9,其中1、2、3号装无水乙醇、4、5、6号装95%的乙醇、7、8、9号装80%的乙醇。经二甲苯处理后,石蜡切片需要按照从1到9的顺序浸入不同浓度的乙醇溶液进行水化。在每个缸子中涮洗3min后转移到下一个缸子(本步骤目的是用乙醇取代二甲苯),当在9个缸子中涮洗完毕后,使用纯水冲洗玻片,洗去乙醇。
所述抗原修复液为购买自碧云天的EDTA抗原修复液(P0085);
所述通透液为购买自碧云天的免疫染色通透液(货号:P0096);
所述通透的操作为:脱蜡、水化、抗原修复后,向载玻片上滴加通透液(1cm2滴加40μl),室温孵育10min。
1.5Padlock DNA结合dCas9蛋白
将含有Padlock DNA(SEQ ID NO.22)的连接缓冲液以1cm2滴加40μl的量滴加到1.4中清洗后的玻片上,37℃孵育30min,Padlock DNA(SEQ ID NO.22)与dCas9-DNA(SEQ IDNO.21)特异性结合,并在T4 DNA连接酶的作用下填补缺口,孵育结束后,使用清洗缓冲液清洗玻片;所述连接缓冲液配方:向21μl水中加入1μl BSA(10mg/ml)、4μl T4 DNA连接酶缓冲液(10×)、4μl Tween-20(0.5%)、4μl NaCl(2.5M)、4μl ATP(10mM)、2μl Padlock DNA(10μM),混合均匀后得到。
1.6RCA扩增
将现用现配的RCA缓冲液(配方见表2)以1cm2滴加40μl的量滴加到1.5中清洗后的玻片上,37℃孵育30min,在phi-29聚合酶的作用下,以Padlock DNA(SEQ ID NO.22)作为模板、dCas9-DNA(SEQ ID NO.21)作为引物,进行RCA扩增。孵育结束后,使用清洗缓冲液清洗玻片;
本发明采用40μL扩增体系,成分如表2:
表2 RCA扩增体系
1.7荧光探针FRET及荧光显微镜检测筛选sgRNA
将含有荧光染料标记探针(SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24)的探针溶液以1cm2滴加40μl的量添加到1.6中清洗后的玻片上,置于黑暗条件下孵育30min。孵育过程中,探针与RCA产物特异性结合,且荧光染料Cy3.5与AF647间发生FRET;孵育结束后,使用吹风机吹干玻片,无需洗涤步骤,即可于荧光显微镜上观察。所述探针溶液配方:向28μl水中加入1μlBSA(10mg/ml)、4μl SSC(10×)、4μl Tween-20(0.5%)、1μl荧光染料标记的探针1(10μM)、1μl荧光染料标记的探针2(10μM)和1μl Hoechst 33342(100μM)。
所述荧光结果的观察是使用奥林巴斯BX43荧光显微镜进行的;
所述荧光观察时的激发波长为510±21nm,发射波长720±7nm;
表3所用DNA序列
对于每一个sgRNA,均设计检测样品分别为野生型、突变型的两个组织切片,以检测和比较交叉反应、灵敏度及背景信号。
检测结果如图2和图3所示,针对突变体与野生型的比值越大,特异性和灵敏度越高,结果表明sgRNA-8(SEQ ID NO.8)的特异性和灵敏度均较好,sgRNA-1、sgRNA-17(SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.17)的特异性和灵敏度也较优。因此选择sgRNA-8(SEQ ID NO.8)为检测BRAF V600E突变的最优sgRNA。
实施例2:利用基于CRISPR技术的原位检测法检测病人的组织样本
本实施例中所用的甲状腺癌患者石蜡切片样本均为按照相关法律法规合格操作获得。
首先利用SANH将醛基化修饰的核酸与dCas9蛋白连接,构建核酸修饰化的dCas9蛋白。
将石蜡切片置于二甲苯中10min,随后置于无水乙醇10min、95%乙醇10分钟、85%乙醇10分钟,以去离子水冲洗以去除蜡组织。
使用40μL稀释缓冲液将核酸修饰化的dCas9蛋白与sgRNA稀释至合适浓度,滴加到脱蜡后的载玻片上(1cm2滴加40μl)。37℃下孵育载玻片30min,随后使用清洗缓冲液清洗载玻片。
将40μL连接缓冲液滴加到清洗后的载玻片上,37℃下孵育30min,随后使用清洗缓冲液清洗载玻片。
按照现用现配原则,配置RCA缓冲液后立即滴加到清洗后的载玻片上。37℃下孵育30min,随后使用清洗缓冲液清洗载玻片。
将探针溶液滴加到清洗后的载玻片上,37℃下孵育30min,孵育完成后使用吹风机干燥玻片,并于荧光显微镜上进行FRET观察。
检测结果如图4和图5所示,利用基于CRISPR技术的原位检测法检测病人的组织样本,可以观察到:用荧光显微镜观察时,在不同染料(Cy3.5、AF647)对应的通道(图5),切片有较高的荧光背景;而在FRET对应的通道时,切片背景荧光很低,检测灵敏度较高。
图4为dCas9原位检测BRAF V600E甲状腺癌患者组织样本的结果及组织样本一代测序峰图,在本实施例中,患者组织样本切片经过探针孵育等处理,在显微镜明场成像结果如图4中DIC所示,在荧光共振通道成像结果如图4中FRET所示,红色荧光点为BRAFV600E突变。组织切片在荧光显微镜下的判读结果与该样本的一代测序结果吻合。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案,并不能理解为对本发明的限制。此外,本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化,在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述,但应当理解,本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上,各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (15)
1.一种基于CRISPR技术的病理切片原位基因检测的产品,其特征在于,所述产品中包括经过修饰的切口酶或其编码基因、靶向突变位点的引导RNA或其编码基因、RCA扩增试剂以及荧光报告***,所述经过修饰的切口酶无核酸内切酶活性,所述经过修饰的切口酶为将切口酶与5'端连接有醛基的寡核苷酸连接后获得的切口酶;5'端连接有醛基的寡核苷酸中适于与Padlock DNA结合以形成环状DNA;所述5'端连接有醛基的寡核苷酸含有与所述Padlock DNA的两端互补的片段;5'端连接有醛基的寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示;所述切口酶为Cas蛋白;所述引导RNA为sgRNA;所述sgRNA覆盖突变点且与突变型靶向序列匹配;所述经过修饰的切口酶能与靶向突变位点的引导RNA形成切口酶-引导RNA复合体;所述RCA扩增试剂包括Padlock DNA;Padlock DNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示;所述荧光报告***中包括荧光染料修饰的核酸探针,所述核酸探针的个数为两个,两个核酸探针中的荧光染料之间能发生FRET,所述核酸探针特异识别Padlock DNA;所述核酸探针中包含有与Padlock DNA匹配的特异性片段,所述核酸探针的核苷酸序列如SEQID NO.23、SEQ ID NO.24所示。
2.如权利要求1所述的产品,其特征在于,所述寡核苷酸5'端腺嘌呤脱氧核糖核酸的磷酸基团上连接有醛基。
3.如权利要求1所述的产品,其特征在于,包含:
1)所述Cas蛋白选自Cas9或Cas12家族蛋白;
2)所述sgRNA包含一处或几处错配碱基。
4.如权利要求1所述的产品,其特征在于,包含:
1)所述Cas蛋白为spCas9;
2)所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-20任一所示。
5.如权利要求1所述的产品,其特征在于,所述Cas蛋白为spdCas9。
6.如权利要求1所述的产品,其特征在于,所述RCA扩增试剂包括RCA缓冲液。
7.如权利要求6所述的产品,其特征在于,所述RCA缓冲液包括如下成分:BSA、phi29-polymerase Buffer、dNTP、Tween-20、Phi-29聚合酶。
8.如权利要求1所述的产品,其特征在于,所述荧光染料选自荧光蛋白或荧光素。
9.如权利要求1所述的产品,其特征在于,所述荧光染料选自FAM、FITC、Dylight系列荧光素、Alexa Flour系列荧光素、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TRITC、TAMRA、Pacific-blue以及罗丹明中的至少两种。
10.如权利要求1所述的产品,其特征在于,两个核酸探针中的荧光染料分别选自Cy3.5、Alexa Flour647。
11.如权利要求1所述的产品,其特征在于,核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的核酸探针用cy3.5荧光染料修饰,核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的核酸探针用AF647荧光染料修饰。
12.如权利要求1所述的产品,其特征在于,所述产品还包括用于预处理病理切片的试剂。
13.如权利要求12所述的产品,其特征在于,所述预处理病理切片的试剂为脱蜡水化试剂、抗原修复试剂、免疫染色通透试剂。
14.如权利要求1~13任一项所述的产品在制备用于检测病理切片原位基因检测产品中的用途。
15.一种非疾病诊断的病理切片原位基因检测突变位点的方法,其特征在于,将权利要求1~13任一所述的产品施用于病理切片中,利用荧光显微镜进行荧光检测,获得基因检测结果。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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