CN116334124B - 一种俄罗斯蒲公英遗传转化方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种俄罗斯蒲公英单遗传转化方法及应用，包括俄罗斯蒲公英外植体预培养、侵染、共培养、恢复培养、筛选培养、生根培养等步骤。本发明能够最终筛选出再生能力强，分化效率高的俄罗斯蒲公英种质，建立了一个简单高效的遗传转化方法，可在2‑3个月内获得转基因植株，且转基因植株生长状态生长良好，简单易行、周期短。

Description

一种俄罗斯蒲公英遗传转化方法及应用
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，特别涉及一种俄罗斯蒲公英单遗传转化方法及应用。
背景技术
俄罗斯蒲公英(Taraxacumkok-saghyz，TKS)是多年生草本植物，菊科，蒲公英属，1931年L.Rodin在哈萨克斯坦天山山脉的高山山谷中发现[1]。TKS在叶脉、花梗和根中都具有乳管结构，但是乳管主要分布在根部[2]。在TKS的乳管中可以合成高分子量的天然橡胶。已有研究表明，在TKS中天然橡胶含量在2％-12％[3]。同时利用分子育种手段可以调控橡胶合成通路中一些基因的表达从而显著提高天然橡胶含量。过表达TkSRPP3转基因植株根部橡胶含量显著高于野生型植株，分别为1.88mg rubber(橡胶)/g DW(干重)和1.43mgrubber/g DW[4]。TKS中利用RNA干扰将TkRALFL1表达水平下调后天然橡胶含量下降[5]。同时有研究表明，过表达HMGS2基因可以显著增加TKS成熟根中的橡胶含量[6]。因此，开发一种高效、简单的遗传转化方法是非常必要的。
参考文献：
[1]AREVIEW OF LITERATURE ON TARAXACUMKOK-SAGHYZ ROD 1.
[2]Epping J,Deenen N V,Niephaus E,et al.A rubber transferaseactivator is necessary for natural rubber biosynthesis in dandelion[J].NaturePlants,2015,1(5):15048.；Stolze A,Wanke A,Deenen N V,et al.Development ofrubber-enriched dandelion varieties by metabolic engineering of the inulinpathway[J].Plant Biotechnology Journal,2016.
[3]Arias M,Herrero J,Ricobaraza M,et al.Evaluation of root biomass,rubber and inulincontents in nine Taraxacum koksaghyz Rodin populations[J].Industrial Crops and Products,2016,83:316-321.；Buranov AU,Elmuradov BJ.Extraction and characterization of latex and natural rubber from rubber-bearing plants.[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2010,58(2):734-43.
[4]Collins-Silva J,Nural AT,Skaggs A,et al.Altered levels of theTaraxacum kok-saghyz(Russian dandelion)small rubber particle protein,TkSRPP3,result in qualitative and quantitative changes in rubber metabolism[J].Phytochemistry,2012,79:46-56.
[5]Wieghaus A,Prüfer D,Schulze Gronover C.Loss of function mutationof the Rapid Alkalinization Factor(RALF1)-like peptide in the dandelionTaraxacum koksaghyz entails a high-biomass taproot phenotype[J].PloS one,2019,14(5):e0217454.
[6]Yu L,Yuan B,Wang L,et al.Identification and characterization ofglycoproteins and their responsive patterns upon ethylene stimulation in therubber latex[J].International journal of molecular sciences,2020,21(15):5282.
发明内容
针对现有技术的至少一个缺陷或改进需求，本发明提供了一种俄罗斯蒲公英高效的遗传转化方法及应用，利用俄罗斯蒲公英叶片作为外植体，建立了一套简单高效的遗传转化***，成功将外源基因RUBY和GUS成功转入俄罗斯蒲公英中，转化效率高且稳定，诱导分化出来的不定芽出芽率高，生长状态良好。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种俄罗斯蒲公英单遗传转化方法，包括以下步骤：
S1：俄罗斯蒲公英外植体预培养：挑选长势良好的俄罗斯蒲公英叶片，进行切割和灭菌处理后作为外植体，预培养3天；
S2：侵染：取步骤S1中预培养的外植体放入预先制备好的侵染液中，28℃，220rpm培养30min，从侵染液中取出外植体，将叶片表面的侵染液用无菌滤纸吸干；
S3：共培养：待步骤S2中的外植体表面菌液干透后，将叶片置于共培养基中培养3天；
S4：恢复培养：将步骤S3中的外植体转入恢复培养基中培养7天；
S5：筛选培养：将步骤S4中的外植体转入筛选培养基中，每隔10天更换一次新鲜培养基直至分化出不定芽，所述筛选培养基配方包括：MS盐+30g/L蔗糖+1mg/L KT,0.4mg/LIAA+300mg/L Timentin+10mg/Lhygromycin和3g/L植物凝胶，pH 5.8；
S6：生根培养：将步骤S5中分化出来的不定芽转入生根培养基中进行生根，每隔7天更换一次新的培养基直至生根，将已生根的不定芽转入新的生根培养基中继续培养，直至成为完整的俄罗斯蒲公英植株。
优选的，所述侵染液的制备包括：
利用化学转化法将第一双元表达载体和第二双元表达载体转化到农杆菌菌株中，将转化成功的农杆菌菌株在加有相应抗生素的LB固体培养基上进行培养；
挑取转化成功的单菌落在含有相同抗生素LB液体培养基中28℃，220rpm振荡培养30-36h；
将OD600＝0.4-0.5的菌液5000rpm离心10min，倒掉上清，并用MS+150mM乙酰丁香酮(AS)液体培养基重悬，5000rpm离心10min；倒掉上清，将菌斑用MS+150mM AS液体培养基重悬，并加入等体积液体培养基，配制配制成OD600＝0.3-0.4的侵染液。
优选的，所述第一双元表达载体含有报告基因RUBY和化学筛选标记基因；所述第二双元表达载体含有报告基因β-葡糖苷酸酶GUS、绿色荧光蛋白GFP和化学筛选标记基因。
优选的，所述预培养、共培养、恢复培养、筛选培养和生根培养的条件为：温度24-25℃、湿度60-70％、光周期16h/8h光照/黑暗、光照强度60-80μmol m-2s-1。
优选的，所述预培养培养基配方包括：MS盐+30g/L蔗糖+1mg/L KT,0.4mg/L IAA,3g/L植物凝胶,pH 5.8。
优选的，所述共培养培养基配方包括：MS盐+30g/L蔗糖+1mg/L KT,0.4mg/L IAA+150mM乙酰丁香酮和3g/L植物凝胶,pH 5.8。
优选的，所述恢复培养培养基配方包括：MS盐+30g/L蔗糖+1mg/L KT,0.4mg/L IAA+300mg/L Timentin，10mg L-1hygromycin和3g/L植物凝胶，pH 5.8。
优选的，所述生根培养培养基配方包括：1/2MS盐+30g/L蔗糖+300mg/LTimentin+10mg/L hygromycin和2.5g/L植物凝胶,pH 5.8。
按照本发明的另一个方面，还提供了一种如上述的俄罗斯蒲公英单遗传转化方法在俄罗斯蒲公英遗传转化和筛选中的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明提供的一种俄罗斯蒲公英高效的遗传转化方法，通过构建两个双元表达载体，其中第一双元表达载体含有报告基因RUBY和化学筛选标记基因；第二双元表达载体含有报告基因β-葡糖苷酸酶GUS、绿色荧光蛋白GFP和化学筛选标记基因，成功地将外源基因RUBY和GUS成功转入俄罗斯蒲公英中，可直接通过观察表型就能鉴定出是否转化成功，增加阳性鉴定结果的可靠性。本发明大大简化了筛选转基因成功植株的步骤，方法简单稳定高效，结合表型鉴定和PCR鉴定的方法发现，两种双元表达载体转化俄罗斯蒲公英的阳性率达到30％左右，最终筛选出再生能力强，分化效率高的俄罗斯蒲公英种质。
(2)本发明提供的一种俄罗斯蒲公英高效的遗传转化方法，建立了一个简单高效的遗传转化方法，在筛选得到不定芽的培养基中，本发明通过比较不同生长激素梯度浓度组合，最终得到最适于诱导分化俄罗斯蒲公英的筛选培养基配方，其诱导出芽的再生能力强，出芽率高，获得的再生芽形态颜色正常，生长状态良好。
(3)本发明提供的一种俄罗斯蒲公英高效的遗传转化方法，侵染后，在筛选抗性再生芽的芽诱导培养基中，未能成功遗传转化的外植体会出现褐化的状态，但是转化成功的外植体会分化出绿色健康的芽，便可以很容易将未能成功遗传转化的再生芽直接剔除，方法简单。
附图说明
图1是2-吗啉乙磺酸(MES)浓度筛选；A、B:0mg/L MES；C、D:0.8mg/LMES；
图2是特美汀(Timentin)半致死浓度筛选；A、B:50mg/L Tim；C、D:100mg/L Tim；E、F:150mg/L Tim；G、H:200mg/L Tim；I、J:250mg/L Tim；
图3是潮霉素(Hygromycin)半致死浓度筛选；A:5mg/L Hygr；B:10mg/LHygr；C:15mg/L Hygr；D:20mg/L Hygr；
图4是本发明实施例提供的图双元表达载体pHDE和pCAMBIA1303的结构示意图；
图5是本发明实施例提供的侵染液制备实物图；A:农杆菌振荡培养；B:农杆菌5000rpm，离心10min；C:侵染液；D:侵染液5000rpm，离心10min；
图6是本发明实施例提供的俄罗斯蒲公英无菌苗获取实物图；A:俄罗斯蒲公英叶片消毒恢复培养；B:芽分化诱导；C:芽分化诱导14天；D:生根无菌苗生长1.5个月；
图7是本发明实施例提供的俄罗斯蒲公英外植体预培养实物图；
图8是本发明实施例提供的外植体共培养实物图；A:外植体侵染；B:外植体共培养；
图9是本发明实施例提供的侵染外植体恢复培养实物图；
图10是本发明实施例提供的外植体筛选培养实物图；
图11是本发明实施例提供的转基因植株瓶中培养1个月实物图；
图12是本发明实施例提供的pHDE-35S::RUBY转基因植株DNA水平检测电泳图；
图13是本发明实施例提供的pHDE-35S::RUBY转基因植株实物图；
图14是本发明实施例提供的pCAMBIA1303-35S::GUS转基因植株DNA水平检测电泳图；L:DL2000；-:H2O；W:野生型；1,7,9,16:HypR基因；P:pCAMBIA1303-35S::GUS质粒图；
图15是本发明实施例提供的pCAMBIA1303-35S::GUS转基因植株GUS染色图；1:pCAMBIA1303-35S::GUS转基因；2:野生型植株实物图；
图16是本发明实施例提供的图13.pCAMBIA1303-35S::GUS转基因植株扩繁实物图；A:pCAMBIA1303-35S::GUS转基因植株；B:野生型植株；
图17是本发明实施例提供的不同梯度浓度6BA+IAA外植体分化出芽实物图；
图18是本发明实施例提供的不同梯度浓度KT+IAA外植体分化出芽实物图；
图19是本发明实施例提供的相同浓度KT+IAA和6BA+IAA外植体分化出芽实物图对比。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1 2-吗啉乙磺酸浓度筛选，步骤如下：
2-吗啉乙磺酸(MES)，是一种生物缓冲剂，通常在植物培养过程中会加入MES来稳定pH值，从而促进植物生长。植物在组织培养过程中，随着培养时间延长会产生一些不利于植物生长的分泌物。因此本发明在实验开始之前对MES是否对俄罗斯蒲公英的组织培养有促进作用，进行验证。
首先，配制液体MS培养基，分别加入0g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L、1.8g/L和2g/L的MES。分别在灭菌前后测定pH值，记录变化。随后挑选合适的MES浓度加入芽诱导培养基，进行分化诱导。液体MS培养基：MS盐+30g/L蔗糖；芽诱导培养基：MS盐+30g/L蔗糖+1mg/L 6BA,0.4mg/L IAA。
表1.MES对培养基pH稳定性的影响
注:1:培养基灭菌前pH；2:培养基灭菌后pH
结果表明，与对照组相比，加入不同浓度MES后，灭菌后液体MS培养基的pH会相对稳定。如表1所示，在对照组中，灭菌后培养基pH下降3.5，0.8g/L MES灭菌后pH下降0.7，当MES浓度在1.6g/L～1.8g/L时，培养基pH只下降0.3～0.4。但是鉴于MES价格相对昂贵，所以后期本发明选用0.8g/L MES进行后续实验。如图1C、1D所示，当在芽诱导培养基中加入0.8g/L MES，芽诱导培养21天后，与对照组无明显差别(如图1A、1B所示)。以上结果表明对于俄罗斯蒲公英的组织培养，后续分泌物质不会影响外植体的分化和生长，因此本发明后续实验不加入MES来促进植物生长。
实施例2特美汀(Timentin)浓度筛选，步骤如下：
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，可用于感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，诱导受伤细胞分泌大量酚类化合物，从而使农杆菌移向这些细胞产生冠状瘤或发状根，最终将目的基因转入植物细胞。特美汀对革兰阳性菌、阴性菌、需氧及厌氧菌都具有抑制作用，能达到很好的抑菌效果。
本发明旨在不影响植物生长并可以抑制农杆菌生长的情况下，对特美汀浓度进行筛选。首先，利用野生型俄罗斯蒲公英叶片，进行特美汀半致死浓度筛选，在芽诱导培养基中分别加入50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L和250mg/L特美汀。芽诱导培养基：MS盐+30g/L蔗糖+1mg/L 6BA,0.4mg/LIAA。
结果表明，在芽诱导培养基中加入不同浓度特美汀后，外植体均会分化，并未因为特美汀浓度的增加而出现致死情况。如图3所示，在50mg/L和100mg/L特美汀培养下，外植体的分化情况较好，但无法抑制农杆菌的生长。随着特美汀浓度增加，虽然生长受到抑制，但是外植体均会分化。因此，本发明中，在进行遗传转化实验时，加入250mg/L特美汀抑制农杆菌生长。在共培养结束后，加入250mg/L特美汀发现农杆菌会有个别外植体轻微溢出的情况，因此将特美汀浓度调至300mg/L，农杆菌受到有效抑制。在后续实验中，发现特美汀调至300mg/L后外植体依然可以正常分化出抗性芽，并未产生致死或抑制作用，因此本发明后续实验中特美汀浓度为300mg/L。
实施例3中筛选培养基加入潮霉素(hygromycin)浓度的确定
首先潮霉素B(Hygromycin B)是由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读而抑制蛋白合成，从而杀死原核(如细菌)、真核(如酵母菌，真菌)和高等哺乳动物真核细胞。潮霉素作为一种植物筛选标记，在遗传转化过程中可用来筛选未转化成功的细胞。但是在植物筛选过程中，若潮霉素浓度过高，会抑制抗性芽的分化和伸长；若浓度过低，会导致未成功转化的细胞也可正常生长，从而后续阳性植株的鉴定的工作大幅度增加。因此，本发明在未开始转化之前对潮霉素进行半致死浓度筛选。
本发明旨在筛选有效的潮霉素浓度，可将未转化细胞筛死，使成功转化细胞可正常生长。以未转化的俄罗斯蒲公英叶片为外植体，在芽诱导培养基中分别加入5mg/L、10mg/L、15mg/L和20mg/L潮霉素。观察一周内外植体生长情况。芽诱导培养基：MS盐+30g/L蔗糖+1mg/L 6BA,0.4mg/L IAA。
对野生型俄罗斯蒲公英外植体筛选一周培养后，如图3所示，20mg/L潮霉素的外植体以全部褐化甚至出现完全枯萎。15mg/L潮霉素除个别完全枯萎外，也出现大部分褐化，但是也有个别外植体只有叶片边缘褐化。10mg/L潮霉素筛选条件下，并未出现完全枯萎的情况，只有外植体边缘存在褐化，并且褐化情况好于15mg/L和20mg/L潮霉素筛选培养。5mg/L潮霉素筛选培养7天，只有部分外植体出现边缘褐化的状态。因此，本发明在遗传转化实验中利用10mg/L潮霉素进行筛选培养。确保转化成功的抗性芽可正常生长，同时未转化成功细胞的生长受到部分抑制作用。
实施例4一种俄罗斯蒲公英单高效的遗传转化方法，步骤如下：
(1)双元表达载体结构以及转化
本发明提供的两个双元表达载体：第一双元表达载体含有报告基因RUBY和化学筛选标记基因；第二双元表达载体含有报告基因β-葡糖苷酸酶GUS、绿色荧光蛋白GFP和化学筛选标记基因。在一个具体的实施例中，如图4所示，第一双元表达载体为pHDE，是一种改造过的组合表达载体。甜菜红素是以酪氨酸为底物经三种酶催化合成的天然产物。通常在一些鲜红色的植物就是由于甜菜红素积累所导致的，例如火龙果、甜菜等。由于在植物体内每个细胞中都含有酪氨酸，因此使用酪氨酸作为底物来合成甜菜红素可避免外源底物的添加。因此，pHDE载体通过在双元载体T-DNA上***含有CYP76AD1、DODA、GT三个酶的阅读框(简称为RUBY)，由CaMV35S驱动，用来代替真核抗性筛选基因，即可用红色来表征转基因阳性愈伤或植株(He et al.,2020)。利用该载体则可直接通过观察红色的表型就能直观的鉴定出目的基因是否转化成功；化学筛选标记为潮霉素抗性基因，由CaMV35S驱动。上述经改造的pHDE载体，虽然肉眼可视化，但是目前只成功应用到拟南芥植物中。对于俄罗斯蒲公英转入RUBY报告基因是否能达到同等效果目前未知，因此本发明同时选择了第二种双元表达载体进行遗传转化实验。第二个载体选用pCAMBIA1303，含有CaMV35S驱动的β-葡糖苷酸酶(GUS)和GFP，可直接通过观察是否有荧光就能直观的鉴定出目的基因是否转化成功，筛选标记抗性基因同样是由CaMV35S驱动的潮霉素抗性基因。
本实施例的宿主细胞为农杆菌菌株EHA105，利用化学转化法将pCAMBIA1303或pHDE表达载体转化到EHA105菌株中。将转化成功的含有pCAMBIA1303或pHDE质粒的农杆菌菌株EHA105在50mg/L卡那霉素(pCAMBIA1303)或50mg/L壮观霉素(pHDE)固体LB培养基上进行培养。挑取转化成功的单菌落在含有相同抗生素的液体LB培养基中振荡培养30-36h，28℃，220rpm。
(2)侵染液制备
将转化成功的含有pCAMBIA1303或pHDE质粒的农杆菌菌株EHA105在50mg/L卡那霉素(pCAMBIA1303)或50mg/L壮观霉素(pHDE)和25mg/L利福平的固体LB培养基上进行培养。挑取转化成功的单菌落在含有相同抗生素的液体LB培养基中振荡培养30-36h，28℃，220rpm；将摇好的菌液吸取100μL放入100mL液体LB培养基中，液体LB培养基提前加好50mg/L卡那霉素(pCAMBIA1303)或50mg/L壮观霉素(pHDE)和25mg/L利福平，28℃，220rpm振荡培养(如图5A所示)，当菌液OD600＝0.4-0.5时5000rpm离心10min(如图5B所示)，倒掉上清，并用MS+150mM乙酰丁香酮(AS)液体培养基重悬，5000rpm离心10min(如图5D所示)；倒掉上清，将菌斑用MS+150mM AS液体培养基重悬，并加入等体积液体培养基，配制成OD600＝0.3-0.4的侵染液(如图5C所示)。
(3)俄罗斯蒲公英无菌材料的获取
a.俄罗斯蒲公英采自新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州，在室内进行培育。取第二轮座叶以上生长良好的叶片(无褐化萎蔫斑点等现象)，不包括植株新生叶片；
b.70％酒精消毒30s，迅速取出放入2％次氯酸钠溶液中消毒3min30 s，然后用无菌蒸馏水洗4次，每次洗1-2min；
c.用无菌滤纸吸干多余水分，放入MS培养基，恢复培养2天，培养条件24℃，16h/8h光照/黑暗，60-80μmol m-2s-1(如图6A所示)。
d.用23号手术刀片将叶片从叶脉分开，然后将叶片切成长宽为0.5-1cm左右的小块(如图6B所示)，放入1mg/L KT和0.4mg/L IAA(TKS叶片组织扩繁专利)进行不定芽诱导(如图6C所示)。
e.将诱导出来的芽用镊子掰下放入1/2MS进行生根培养；将生根2-5cm的幼苗移入1/2MS组培瓶中(如图6D所示)。
f.移入瓶中生长1-2个月，挑选生长状态好的植株用于侵染。
(3)外植体预培养
挑选生长状态良好的无菌苗，用无菌剪刀剪取嫩绿色，表面无斑点生长状态良好的叶片，沿叶脉分开，切成长宽为0.5-1cm的外植体，在预培养培养基上放置3天(如图7所示)。预培养培养基配方包括：MS盐+30g/L蔗糖+1mg/LKT,0.4mg/L IAA,3g/L植物凝胶,pH5.8。
(5)共培养
将预培养3天的外植体放入已制备好的侵染液中，28℃，220rpm振荡培养30min(如图8A所示)。将叶片表面的菌液用无菌滤纸吸干，并放入共培养培养基培养3天，此时叶片边缘已长出农杆菌(如图8B所示)。共培养培养基配方包括：MS盐+30g/L蔗糖+1mg/L KT,0.4mg/L IAA+150mM乙酰丁香酮和3g/L植物凝胶,pH 5.8。
(6)恢复培养
将共培养结束的外植体，移入恢复培养基中7天，可抑制农杆菌的生长(如图9所示)。恢复培养培养基配方包括：MS盐+30g/L蔗糖+1mg/L KT,0.4mg/LIAA+300mg/LTimentin，10mg L-1hygromycin和3g/L植物凝胶，pH 5.8。
(7)筛选培养
恢复培养结束后，将外植体移入已加入10mg/L潮霉素的筛选培养基中，此时外植体会出现褐化或枯死的状态，但是侵染成功的外植体，在筛选培养10-30天会分化出抗性芽(如图10所示)。每10天更换一次新鲜的培养基。筛选培养基配方包括：MS盐+30g/L蔗糖+1mg/L KT,0.4mg/L IAA+300mg/LTimentin+10mg/L hygromycin和3g/L植物凝胶，pH 5.8。
(8)生根培养
将分化出的抗性芽从外植体上掰下，放入生根培养基继续筛选生根培养，此步会筛死部分芽，但抗性芽仍可以维持健康的生长并生根，一般15-20天可完成生根。然后将生根2-5cm的抗性芽移入瓶中，生长一个月(如图11所示)。生根培养培养基配方包括：1/2MS盐+30g/L蔗糖+300mg/L Timentin+10mg/L hygromycin和2.5g/L植物凝胶,pH 5.8。
根据上述遗传转化方法，将所获得的抗性植株进行检测。首先提取抗性植株的基因组DNA，利用PCR技术扩增目标条带；将成功克隆出目标条带的植株，进一步进行GUS染色(pHDE携带RUBY基因，可直接用肉眼观察)，以观察蛋白水平的表达情况。只有DNA水平和蛋白水平同时表达的植株可作为一株独立的转化事件。转化效率＝获得到的阳性植株(独立转化事件)/获得抗性芽总数。利用该方法两种双元表达载体pHDE和pCAMBIA1303转化俄罗斯蒲公英的阳性率达到30％左右。
实施例5-一种俄罗斯蒲公英单高效的遗传转化方法，步骤如下：
将实施例1中获得的转基因阳性植株种入土中生长一个月后，对其进行扩繁，方法如下：
(1)取第二轮座叶以上生长良好的叶片(无褐化萎蔫斑点等现象)，不包括植株新生叶片；70％酒精消毒30s，迅速取出放入2％次氯酸钠溶液中消毒3min30 s，然后用无菌蒸馏水洗4次，每次洗1-2min；用无菌滤纸吸干多余水分，放入MS培养基，恢复培养2天，培养条件24℃，16h/8h光照/黑暗，60-80μmol m-2s-1。
(2)用23号手术刀片将叶片从叶脉分开，然后将叶片切成长宽为0.5-1cm左右的小块，放入筛选芽诱导培养基；将诱导出来的芽用镊子掰下放入1/2MS进行生根培养；将生根2-5cm的幼苗移入1/2MS组培瓶中。
步骤(1)中所述MS培养基为：MS盐+30g/L蔗糖和3g/L植物凝胶，pH＝5.8。
步骤(2)中所述筛选芽诱导培养基为：MS盐+30g/L蔗糖+1mg/L KT+0.4mg/L IAA+10mg/L hygromycin和3g/L植物凝胶，pH 5.8。
根据实施例1中，步骤(2)俄罗斯蒲公英无菌材料的获取，首先取第二轮座叶以上生长良好的叶片(无褐化萎蔫斑点等现象)，不包括植株新生叶片，用70％酒精消毒30s，迅速取出放入2％次氯酸钠溶液中消毒3min30 s，然后用无菌蒸馏水洗4次，每次洗1-2min；
然后用无菌滤纸吸干多余水分，放入MS培养基，恢复培养2天，培养条件24℃，16h/8h光照/黑暗，60-80μmol m-2s-1(如图5A所示)；用23号手术刀片将叶片从叶脉分开，然后将叶片切成长宽为0.5-1cm左右的小块，放入1mg/L KT和0.4mg/L IAA进行不定芽诱导(如图5B所示)；每10天更换一次新鲜培养基，约15-20天分化出芽(如图5C所示)；将诱导出来的芽用镊子掰下放入1/2MS进行生根培养；生根2-5cm后1/2MS组培瓶中，培养1-2个月(如图5D所示)。
实施例6转基因阳性植株的筛选
将含有pHDE质粒的农杆菌菌株EHA105转入俄罗斯蒲公英中，获得转基因植株。pHDE双元表达载体含有RUBY报告基因，所以获得的转基因植株呈现红色，可以直观的看见。利用植物基因组DNA提取试剂盒提取转基因植株的DNA，通过PCR技术扩增RUBY，如图12所示，转基因植株均有明显的目的条带，而阴性对照和野生型植株没有，说明携带RUBY的pHDE载体已成功转入俄罗斯蒲公英中。如图13所示，将已生根转基因植株移入瓶中培养，可以看到转基因植株呈现深红色。RUBY引物如下，上游引物：
5’-TTGAGGTGGGCAAGAAGC-3’；下游引物：5’-CGAATGTGGAGGATGTGGTAT-3’。
pCAMBIA1303双元表达载体则需要分子手段进行检测。首先利用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取转基因植株的DNA，在基因组水平检测，通过PCR技术成功扩增潮霉素片段(515bp)，如图14所示，转基因植株均有明显的目的条带，而阴性对照和野生型植株没有。pCAMBIA1303双元表达载体携带由CaMV35S驱动的GUS基因，因此利用GUS组织化学染色法对获得的转基因植株进一步验证，如图15所示(以转基因植株#1为例)，转基因成功的植株叶片所有组织均呈现蓝色，而野生型植株则没有被染色。潮霉素引物如下，上游引物：5’-ATGTTGGCGACCTCGTATT-3’；下游引物：5’-CGTTATGTTTATCGGCACTTT-3’
根据实施例2中，步骤(1)和(2)对转基因植株(以pCAMBIA1303-35S::GUS转基因植株为例)进行扩繁，取第二轮座叶以上生长良好的叶片(无褐化萎蔫斑点等现象)，不包括植株新生叶片；70％酒精消毒30s，迅速取出放入2％次氯酸钠溶液中消毒3min30 s，然后用无菌蒸馏水洗4次，每次洗1-2min；用无菌滤纸吸干多余水分，放入MS培养基，恢复培养2天，培养条件24℃，16h/8h光照/黑暗，60-80μmol m-2s-1；然后用23号手术刀片将叶片从叶脉分开，将叶片切成长宽为0.5-1cm左右的小块，放入筛选芽诱导培养基，同时以野生型植株作为对照，筛选培养7天后野生型植株外植体基本全部筛死，而转基因植株生长状态良好，叶片边缘已经开始分化(如图16所示)；大约15-20天外植体叶片边缘分化出芽，然后将诱导出来的芽用镊子掰下放入1/2MS进行生根培养；将生根2-5cm的幼苗移入1/2MS组培瓶中，与实施例1中步骤一致。
在俄罗斯蒲公英遗传转化的过程中，筛选培养基中激素的种类和配比对外植体出芽率的影响至关重要，因此我们进行了不同筛选培养基配方的对比，参照实施例1实施例6的转化方法和筛选培养基配方(MS盐+30g/L蔗糖+1mg/L KT+0.4mg/L IAA+300mg/LTimentin+10mg/L hygromycin和3g/L)，分别进行KT+IAA和6BA+IAA不同浓度梯度激素组合来统计外植体的出芽率，进而比较KT+IAA和6BA+IAA分别对外植体出芽的影响，每种培养基做三组重复实验，取出芽率的平均值，本发明中出芽率是统计再生出的正常的芽总数/外植体总数，结果如下表所示：
由表中数据可知，采用KT+IAA激素组合的筛选培养基总体上出芽率明显比6BA+IAA激素组合的筛选培养基出芽率高，说明KT+IAA相比6BA+IAA更有利于俄罗斯蒲公英外植体的出芽分化，进一步比较不同浓度的KT+IAA，在添加1mg/L KT+0.4mg/L IAA的筛选培养基中进行芽诱导培养，其平均出芽率最高，可达1517％。
如图17-19所示，是KT+IAA和6BA+IAA不同浓度梯度激素组合的外植体出芽实物图，从图中可以看出，采用6BA+IAA激素组合的筛选培养基进行诱导分化会产生大量玻璃化不正常的芽，而采用KT+IAA激素组合的筛选培养基进行诱导分化产生的不定芽形态颜色正常，进一步说明KT+IAA激素组合更适于俄罗斯蒲公英外植体不定芽的诱导分化。
本申请实施例中RUBY报告基因序列的核苷酸序列如序列表ID NO.1所示；
本申请实施例中GUS报告基因序列的核苷酸序列如序列表ID NO.2所示；
本申请实施例中潮霉素基因序列的核苷酸序列如序列表ID NO.3所示；
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种俄罗斯蒲公英单遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：俄罗斯蒲公英外植体预培养：挑选长势良好的俄罗斯蒲公英叶片，进行切割和灭菌处理后作为外植体，预培养3天；
S2：侵染：取步骤S1中预培养的外植体放入预先制备好的侵染液中，28℃，220 rpm培养30 min，从侵染液中取出外植体，将叶片表面的侵染液用无菌滤纸吸干；
S3：共培养：待步骤S2中的外植体表面菌液干透后，将叶片置于共培养基中培养3天；
S4：恢复培养：将步骤S3中的外植体转入恢复培养基中培养7天；
S5：筛选培养：将步骤S4中的外植体转入筛选培养基中，每隔10天更换一次新鲜培养基直至分化出不定芽，所述筛选培养基配方为：MS盐+30 g/L 蔗糖+1 mg/L KT+0.4 mg/L IAA+ 300 mg/L Timentin + 10 mg/L hygromycin+3 g/L 植物凝胶，pH 5.8；
S6：生根培养：将步骤S5中分化出来的不定芽转入生根培养基中进行生根，每隔7天更换一次新的培养基直至生根，将已生根的不定芽转入新的生根培养基中继续培养，直至成为完整的俄罗斯蒲公英植株。
2.如权利要求1所述的俄罗斯蒲公英单遗传转化方法，其特征在于，所述侵染液的制备包括：
利用化学转化法分别将第一双元表达载体和第二双元表达载体转化到农杆菌菌株中，将转化成功的农杆菌菌株在加有相应抗生素的LB固体培养基上进行培养；所述第一双元表达载体含有报告基因RUBY和化学筛选标记基因；所述第二双元表达载体含有报告基因β-葡糖苷酸酶GUS、绿色荧光蛋白GFP和化学筛选标记基因；
挑取转化成功的单菌落在含有相同抗生素LB液体培养基中28℃，220rpm振荡培养30-36h；
将OD600=0.4-0.5的菌液5000 rpm离心10 min，倒掉上清，并用MS+150 mM乙酰丁香酮（AS）液体培养基重悬，5000 rpm离心10min；倒掉上清，将菌斑用MS+150 mM AS液体培养基重悬，并加入等体积液体培养基，配制配制成OD600=0.3-0.4的侵染液。
3. 如权利要求1所述的俄罗斯蒲公英单遗传转化方法，其特征在于，所述预培养、共培养、恢复培养、筛选培养和生根培养的条件为：温度24-25℃ 、湿度60-70% 、光周期16h/8h光照/黑暗、光照强度60-80 μmol m-2 s-1。
4. 如权利要求1所述的俄罗斯蒲公英单遗传转化方法，其特征在于，所述预培养培养基配方为：MS盐+30 g/L 蔗糖+1 mg/L KT+0.4 mg/L IAA+3 g/L 植物凝胶, pH 5.8。
5. 如权利要求1所述的俄罗斯蒲公英单遗传转化方法，其特征在于，所述共培养培养基配方为：MS盐+30 g/L 蔗糖+1 mg/L KT+0.4 mg/L IAA +150 mM 乙酰丁香酮 和3 g/L植物凝胶, pH 5.8。
6. 如权利要求1所述的俄罗斯蒲公英单遗传转化方法，其特征在于，所述恢复培养培养基配方为：MS盐+30 g/L 蔗糖+1 mg/L KT+0.4 mg/L IAA + 300 mg/L Timentin+10 mgL-1 hygromycin和3 g/L 植物凝胶，pH 5.8。
7. 如权利要求1所述的俄罗斯蒲公英单遗传转化方法，其特征在于，所述生根培养培养基配方为：1/2MS盐+30 g/L 蔗糖+ 300 mg/L Timentin + 10 mg/L hygromycin和2.5g/L 植物凝胶, pH 5.8。
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