CN116333895A - 不用灭菌的杀虫真菌专用培养基、杀虫真菌生产方法和真菌制剂及应用 - Google Patents

不用灭菌的杀虫真菌专用培养基、杀虫真菌生产方法和真菌制剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了不用灭菌的杀虫真菌专用培养基、杀虫真菌生产方法和真菌制剂及应用。所述专用培养基包括蟹壳粉，还可以包括黄粉虫粉或/和虾粉，本发明专用培养基有利于杀虫真菌的繁殖、抑制杂菌生长，与接种较大剂量的杀虫真菌孢子相结合，无需高温或高压灭菌处理即可用于杀虫真菌的生产，使用方便、生产工艺简单，可大大降低杀虫真菌生产成本，并提高杀虫防效和延长防控持效期。将杀虫真菌加入本发明专用培养基后得到所述真菌制剂，本发明真菌制剂可用于改良土壤和防治农作物病虫害。

Description

不用灭菌的杀虫真菌专用培养基、杀虫真菌生产方法和真菌 制剂及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种不用灭菌的杀虫真菌专用培养基、不用灭菌生产杀虫真菌的方法，和用杀虫真菌专用培养基制备的真菌制剂以及应用。
背景技术
虫害每年都给农业生产造成巨额损失，但长期单一、大量使用化学农药，造成环境污染严重、抗药性上升以及杀伤天敌和破坏生态平衡。杀虫真菌具有害虫不易产生抗药性及环境友好等优点，在减少化学农药使用方面起着重要作用，是在农业领域应用广泛的农用微生物，已登记用作杀虫微生物农药、微生物菌剂、微生物肥料和微生物种子处理剂等许多农业应用方向。然而，在杀虫真菌生产和应用中，多种限制因素制约了杀虫真菌的广泛应用。
首先，在杀虫真菌发酵生产方面生产成本高。目前，主要采用粮食(大米、小麦)或联合农副产品(麦麸、米糠)等作为原料，这些原料往往携带多种杂菌(如多种曲霉)，也适合这些杂菌的生长。因此，在发酵生产中需要对原料进行灭菌，并保持发酵过程的无菌环境，这极大的增加生产成本和生产难度。因此，国内外绿僵菌、白僵菌等杀虫真菌产品种类较多，但量产的极少，成本高。
其次，杀虫真菌应用技术难度大、效果不稳定。真菌是以活孢子接触害虫的方式控制害虫，需要在环境中存活并生长繁殖。但是，绿僵菌、白僵菌等杀虫真菌孢子在应用过程中需要接触植物表面和根际、种子表面、土壤、有机肥和化肥以及害虫表面，这些场景中都存在大量其它微生物，它们会通过数量优势、占位优势和抑菌杀真菌功能等机制影响杀虫真菌孢子的存活和生长繁殖，从而影响杀虫真菌对害虫的防效和持效性。
综上所述，在杀虫真菌生产和应用中，抑制杂菌生长繁殖的同时促进杀虫真菌的生长繁殖是降低杀虫真菌生产成本、提高杀虫防效和延长防控持效期的技术关键。
体壁是昆虫抵御外来微生物侵入的重要屏障，主要由壳蛋白、几丁质、醌类和酚类等物质组成。其中，壳白质含量最高，通过包裹少量几丁质丝并与之交联成为一种特殊的复合体，多数微生物的水解酶降解壳蛋白比较困难；此外，昆虫体壁中的醌类和酚类等物质具有显著抑制微生物生长的作用。昆虫体壁的这些物理和化学屏障，有效地阻止了其它微生物侵入昆虫。杀虫真菌在长期进化过程中获得了克服昆虫体壁物理和化学屏障的能力，它们能够产生一系列昆虫表皮水解酶，包括丰富的蛋白酶系以及几丁酶、过氧化物酶等水解酶，这些酶可高效降解表皮中的壳蛋白、几丁质、醌类和酚类等主要成分，并利用这些营养进行生长繁殖。因此，自然界中只有极少数真菌进化成为昆虫病原真菌(杀虫真菌)，而曲霉、青霉、立枯丝核菌、腐霉病、根腐病、尖孢镰刀菌等非昆虫病原真菌，无法分泌相应的高效水解酶类，不能有效利用昆虫表皮的壳蛋白、几丁质、醌类和酚类等物质，并且会被其中的醌类和酚类等物质抑制，从而在昆虫表皮上难以生长繁殖。壳蛋白质约占昆虫表皮干重的一半以上，可为杀虫真菌生长繁殖提供丰富的氮源和碳源，而且其它微生物难以利用。因此，以含有壳蛋白等物质的原料与杀虫真菌孢子混合后能够有效促进杀虫真菌的生长繁殖，同时抑制其它真菌等微生物的生长繁殖，在杀虫真菌的生产和应用中可减少生产成本、提高杀虫防效和延长防控持效期。
在节肢动物的表皮成分中壳蛋白含量高，往往达到50％以上，是难被多数微生物利用的物质。由此本发明提出一种利用节肢动物粉作为杀虫真菌的培养基，并与较大量的接种杀虫真菌相结合的技术，从而实现不用灭菌即可生产杀虫真菌及杀虫真菌制剂，该技术包括不用灭菌的杀虫真菌专用培养基、不用灭菌生产杀虫真菌的方法，和用杀虫真菌专用培养基制备真菌制剂以及应用。
发明内容
鉴于此，本发明的目的之一是提供一种不用灭菌的杀虫真菌专用培养基，所述专用培养基包括蟹壳粉。
优选地，专用培养基还包括黄粉虫粉或/和虾粉。蟹壳粉与黄粉虫粉或/和虾粉共同使用更有利于杀虫真菌的增殖。
优选地，专用培养基中蟹壳粉的质量分数为60％以上。
优选地，专用培养基中蟹壳粉、黄粉虫粉和虾粉的质量分数分别为60-80％、10-40％和10-40％。
优选地，专用培养基中蟹壳粉、黄粉虫粉和虾粉的质量分数分别为60％、10％和30％，或质量分数分别为60％、30％和10％，或质量分数分别为60％、20％和20％。该质量分数的培养基由蟹壳粉、黄粉虫粉和虾粉组成，对杀虫真菌的增殖最优，且不利于杂菌繁殖。
本发明的目的之二是提供一种不用灭菌的杀虫真菌生产方法，包括将杀虫真菌直接接种至上述任一专用培养基中发酵，接种前专用培养基不用灭菌处理，接种较大量的杀虫真菌孢子，接种量为大于等于1×106个杀虫真菌孢子/克专用培养基。本发明专用培养基不用高温或高压灭菌即可使用，当接种量大于等于1×106个杀虫真菌孢子/克专用培养基时，杂菌量低，杀虫真菌繁殖效果好，与传统谷物高温灭菌后发酵相比，大大降低杀虫真菌的生产和使用成本。
本发明的目的之三是提供一种杀虫真菌制剂，该制剂包括杀虫真菌和前述的任一专用培养基，所述制剂中杀虫真菌的含量为大于等于1×106个杀虫真菌孢子/克专用培养基。
本发明的目的之四是提供一种杀虫真菌制剂的制备方法，通过将杀虫真菌加入至上述任一专用培养基中得到所述制剂，且在加入杀虫真菌前所述专用培养基不用灭菌处理，杀虫真菌加入的量为大于等于1×106个杀虫真菌孢子/克专用培养基，该制剂应用后杀虫真菌可利用专用培养基生长繁殖。
本发明的目的之五是提供上述真菌制剂的应用，所述应用为在改良土壤和防治农作物病虫害中的应用。可以将本真菌制剂稀释后灌淋土壤使用；也可以将本真菌制剂通过拌种对植物种子进行处理后播种使用；还可以将本真菌制剂与有机肥或复合肥联合使用，即将真菌制剂与肥料混合成后撒施土壤使用，肥料包括有机肥和复合肥。杀虫真菌在本发明专用培养基中具有很好的繁殖效果，可以更好地保护农作物从而降低农作物病虫害。
本发明不用灭菌的专用培养基包括蟹壳粉，还可以包括黄粉虫粉或/和虾粉，此专用培养基不用灭菌处理，直接接种较大剂量的杀虫真菌，即使含量大于等于1×106个杀虫真菌孢子/克专用培养基，然后进行发酵，从而生产杀虫真菌，增殖效果好、杂菌率低、工艺简单，大大降低目前高温灭菌生产杀虫真菌的生产成本；本发明将杀虫真菌加入所述专用培养基制备的真菌制剂，生产简便，有利于杀虫真菌在田间增殖，而且使用方便、效果好，可用于改良土壤和防治农作物病虫害。
具体实施方式
下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。
材料准备：杀虫真菌选用金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)和球孢白僵菌(Beauveria bassiana)，均购自重庆聚立信生物工程有限公司。黄曲霉菌和大肠杆菌由重庆大学基因工程研究中心赠送。节肢动物粉，其中，蟹壳干于亳州意德药业有限公司购买；蚕蛹干于亳州德亿利药业销售有限公司购买；黄粉虫干于宁波奉化添恩生物科技有限公司购买；虾粗粉于山东鲁华海洋科技有限公司购买；蛆粗粉于合肥大元生物科技有限公司购买；蟑螂粗粉于亳州市承安药业有限公司购买；蝉蜕粗粉于亳州市御品堂生物科技有限公司购买。对上述购买回来的节肢动物干和节肢动物粗粉分别用机器过100目筛打磨得到蟹壳粉、蚕蛹粉、蛆粉、黄粉虫粉、蟑螂粉、蝉蜕粉、虾粉备用。当然也可不过筛制备节肢动物粉。
实验例1节肢动物粉与杀虫真菌兼容性的测定
方法：将蟹壳粉、蚕蛹粉、蛆粉、黄粉虫粉、蟑螂粉、蝉蜕粉、虾粉，分别与绿僵菌或白僵菌孢子粉按质量100：1混配均匀，以不添加节肢动物粉的绿僵菌或白僵菌孢子粉为对照，置于37℃培养箱中培养，分别在3天、14天检测孢子萌发率，确定上述节肢动物粉对杀虫真菌孢子的萌发是否有影响。利用无菌水将培养后的各组合物稀释至孢子含量为1×107孢子/mL，取50μL孢悬液均匀涂布至1/4SDAY平板上，26℃培养14-16h后检测萌发率。
结果：由表1可知37℃培养3天蟹壳粉、蚕蛹粉、黄粉虫粉、蝉蜕粉、虾粉对绿僵菌孢子和白僵菌孢子萌发几乎无影响，分别在97％和95％左右，与对照相当，显著高于蛆粉、蟑螂粉，37℃培养14天，与蟹壳粉、蚕蛹粉、黄粉虫粉、蝉蜕粉、虾粉混合的绿僵菌和白僵菌萌发率均在63％左右，与对照相当，不对孢子萌发产生负面影响。因此，蟹壳粉、蚕蛹粉、黄粉虫粉、蝉蜕粉、虾粉与绿僵菌和白僵菌的兼容性更好，可望在杀虫真菌的生产、制剂及田间使用中应用。
表1节肢动物粉对绿僵菌和白僵菌孢子萌发率的影响(37℃)
Figure BDA0004160700110000051
Figure BDA0004160700110000061
实验例2节肢动物粉对杀虫真菌和杂菌生长繁殖的影响
方法：准备PDA平板和含10％节肢动物粉(蟹壳粉、蚕蛹粉、黄粉虫粉、蝉蜕粉或虾粉)的琼脂平板；选用生长7天的绿僵菌、白僵菌和黄曲霉菌的平板，用9mm的打孔器打孔，分别将直径9mm的绿僵菌、白僵菌和黄曲霉菌菌饼接种不同节肢动物粉琼脂平板中央，于27±1℃培养10天，观察平板上绿僵菌、白僵菌和黄曲霉菌生长情况并测菌落大小，以PDA平板为对照，计算菌落生长率，生长率＝100％×(菌落直径-9mm)/9mm。
准备LB液体培养基和含10％节肢动物粉(蟹壳粉、蚕蛹粉、黄粉虫粉、蝉蜕粉或虾粉)的液体培养基。含10％节肢动物粉的液体培养基制备方法为：将高温灭菌的不同节肢动物粉分散在无菌水中制备为质量分数为10％的节肢动物粉液体培养基。每种液体培养基按100mL接种1mL相同浓度的大肠杆菌菌悬液(大肠杆菌在LB液体中36±1℃培养过夜获得大肠杆菌菌悬液)，36±1℃，200r/min，摇培16h，LB培养基为对照，利用梯度稀释涂平板的方法分别测定摇培前和摇培后培养基中大肠杆菌浓度，计算各培养基摇培后相对摇培前大肠杆菌的增长倍数，增长倍数＝(摇培后大肠杆菌数量-摇培前大肠杆菌数量)/摇培前大肠杆菌数量。
结果：如表2所示，可见含蟹壳粉、黄粉虫粉、虾粉的培养基对绿僵菌、白僵菌都有促进生长的作用，且对黄曲霉和大肠杆菌的促进生长作用不明显。
表2节肢动物粉对杀虫真菌和杂菌生长繁殖的影响
Figure BDA0004160700110000062
Figure BDA0004160700110000071
实验例3杀虫真菌不同接种量对杂菌繁殖的影响
分别将蟹壳粉、黄粉虫粉或虾粉作为培养基与适量的绿僵菌或白僵菌孢子粉混合均匀，使每克培养基中孢子含量分别为1×105个孢子、1×106个孢子、1×107个孢子，再按重量比加入50％的水混合均匀，于26-28℃恒温保湿培养，培养10天后，采用CFU法测定发酵后每克物质中真菌和细菌总菌数以及绿僵菌或白僵菌数，并计算杂菌率，
Figure BDA0004160700110000077
Figure BDA0004160700110000078
通过表3可以看出培养基杀虫真菌孢子含量1×105孢子/g时，蟹壳粉、黄粉虫粉、虾粉中绿僵菌和白僵菌的杂菌率分别在
Figure BDA0004160700110000073
和/>
Figure BDA0004160700110000074
之间；当含量提高到1×106孢子/g、1×107孢子/g时，绿僵菌和白僵菌的杂菌含量低，分别为/>
Figure BDA0004160700110000075
和
Figure BDA0004160700110000076
之间，远低于目前杀虫真菌原药生产发酵的杂菌含量。
由此可知，培养基中接种含量高于1×106孢子/g时，节肢动物粉不需要高温高压灭菌，白僵菌和绿僵菌能快速繁殖，形成优势菌群，抑制杂菌的繁殖，满足生产上对杂菌的控制要求，具有很好的应用前景。
表3不同接种量对杂菌繁殖的影响
Figure BDA0004160700110000072
Figure BDA0004160700110000081
注：在同一种节肢动物粉间进行差异分析。
实验例4不同配比培养基促进杀虫真菌繁殖情况测定
1、不同配比培养基的制备
不同配比培养基的成分按质量百分比配制，称取蟹壳粉0-100％、黄粉虫粉0-100％和虾粉0-100％充分混匀得到不同配比成分的培养基，现制备13种不同配比成分的培养基(即13种配方)用于后续实验，每一种配方中蟹壳粉、黄粉虫粉、虾粉的具体含量见表4。
表4不同配比的培养基配方
配方 蟹壳粉含量(％) 黄粉虫粉含量(％) 虾粉含量(％)
配方1 100 - --
配方2 - 100 -
配方3 - - 100
配方4 0 50 50
配方5 0 75 25
配方6 0 25 75
配方7 80 10 10
配方8 60 - 40
配方9 60 10 30
配方10 60 20 20
配方11 60 30 10
配方12 60 40 -
配方13 40 30 30
2、杀虫真菌专用培养基对杀虫真菌增殖的影响
根据表4中13种配方的培养基，培养基分别与的适量的绿僵菌孢子或白僵菌孢子粉混合均匀，使每克培养基中孢子含量为1×106个，按重量比加入50％的水混合均匀，26-28℃恒温保湿培养7天后，采用CFU法测定每克发酵物中总菌含量和不同真菌孢子含量，并计算增殖倍数和杂菌率，增殖倍数＝(培养后真菌孢子含量-培养前真菌孢子含量)/培养前真菌孢子含量，
Figure BDA0004160700110000094
Figure BDA0004160700110000095
结果如表5：配方9-11(蟹壳粉含量60％、黄粉虫粉、虾粉)三种节肢动物粉复配的培养基促进绿僵菌、白僵菌繁殖的效果最明显，绿僵菌和白僵菌的增殖倍数分别在1.3万倍和2.4万倍左右；配方7(蟹壳粉含量80％)、配方8(蟹壳粉含量60％)、配方12(蟹壳粉含量60％)促进绿僵菌、白僵菌繁殖的效果次之，绿僵菌和白僵菌的增殖倍数分别在1.1万倍和2万倍左右，对白僵菌和绿僵菌促进繁殖效果较配方9-11差；配方13(蟹壳粉含量40％)由三种节肢动物蛋白粉复配而成，绿僵菌和白僵菌的增殖倍数分别在8000倍和1.6万倍左右，配方13对绿僵菌和白僵菌的促进繁殖效果较配方7、8、12差；配方1-6，由1种节肢动物粉或2种节肢动物粉复配而成，绿僵菌、白僵菌的增殖倍数分别在5800倍、1.1万倍左右，其中2或3种粉复配的培养基绿僵菌和白僵菌增殖倍数较1种粉配制的培养基高；不同配比培养基绿僵菌中杂菌含量在
Figure BDA0004160700110000093
之间，白僵菌中杂菌含量在/>
Figure BDA0004160700110000092
之间，杂菌含量均较低。因此，配方7-12(蟹壳粉含量60-80％)能很好的促进白僵菌和绿僵菌繁殖并且不利于杂菌增殖，其中配方9-11效果最好。
表5杀虫真菌专用培养基绿僵菌、白僵菌和其他杂菌繁殖情况测定
Figure BDA0004160700110000091
Figure BDA0004160700110000101
实验例5杀虫真菌的生产
将适量的绿僵菌与配方9培养基、白僵菌与配方11培养基混匀，使每克培养基中杀虫真菌孢子的含量为1×106个孢子，按重量比加入50％的水混合均匀，放入40cm×60cm×20cm的方盘中，保持物料厚度为10-12cm，再将方盘置入26-30℃发酵室中培养。
传统固态发酵方法为对照：称取大米500g，20-30℃水中浸泡1.5h，沥干后装入发酵袋中(两端带有透气膜的蘑菇袋)，灭菌30min后冷却至室温，按10％接种量接入26-30℃培养3d的绿僵菌或白僵菌的PDA液体菌，拌匀后于发酵室中发酵，第10天开袋干燥。发酵室温度控制26-30℃、0-10d湿度控制85-95％，11-15d抽吸干燥。分别在5d、10d、15d，采用CFU法测定发酵后杀虫真菌和杂菌数，计算产孢量和杂菌率。
结果：如表6所示，采用未高温灭菌的配方9培养基发酵生产绿僵菌，配方11培养基发酵生产白僵菌，绿僵菌产孢量在10天、15天达到40亿孢子/g以上，白僵菌在10天、15天达到70亿孢子/g以上，都高于传统生产方法15天的产孢量(绿僵菌34亿孢子/g，白僵菌58亿孢子/g)。配方9和11培养基发酵生产产孢量在10天与15天没有显著差异，而传统发酵15天产孢量达到最大，说明本发明专用培养基发酵生产较传统发酵提前5天。未灭菌的配方9和11培养基发酵生产绿僵菌和白僵菌，杂菌率一直保持在低的水平，特别是在干燥过程中，传统发酵杂菌率快速增加。说明本发明专用培养基不利于杂菌的生长，同时受到杀虫真菌的抑制作用。表明，本发明利用节肢动物粉制备的专用培养基并结合较大的接种量生产杀虫真菌孢子，具有生产工艺简单、不需要灭菌、原料易得、产孢量、杂菌少的特点，综合生产成本低，在杀虫真菌孢子生产中具有重要应用价值。
表6杀虫真菌专用培养基在发酵生产中的应用
Figure BDA0004160700110000111
实验例6杀虫真菌专用培养基在土壤处理中对杀虫真菌繁殖的影响
用配方9培养基与适量绿僵菌油悬浮剂(购自重庆聚立信生物工程有限公司)混合均匀，用配方11培养基与适量白僵菌油悬浮剂(购自重庆聚立信生物工程有限公司)混合均匀，制成每克培养基中含有5×108孢子的真菌制剂，将真菌制剂稀释500倍后得到1×106孢子/mL孢子营养液体，淋灌土壤，每平方米灌10L，以不添加培养基的1×106孢子/mL孢悬液灌淋作为对照，分别于当天、10d后取适量表层(5-10cm)土壤，用无菌水梯度稀释后采用CFU法测定绿僵菌和白僵菌菌落数，并根据稀释的对应倍数计算每克干重土壤中杀虫真菌的数量，并计算相对接种当天菌量的增殖倍数。
结果如表7，杀虫真菌专用培养基与杀虫真菌孢子稀释灌土10天后，绿僵菌的数量从34.7×104孢子/克增殖到4230×104孢子/克，增殖120.9倍，对照绿僵菌数量由32.6×104孢子/克减少到12.4×104孢子/克，减少0.6倍；白僵菌的数量从32.1×104孢子/克增殖到4260×104孢子/克，增殖131.7倍，对照白僵菌数量由34.5×104孢子/克减少到21×104孢子/克，减少0.4倍。由此可见本发明专用培养基联合杀虫真菌灌溉土壤处理也能很好的促进绿僵菌和白僵菌的繁殖。
表7杀虫真菌专用培养基在土壤处理中促进白僵菌和绿僵菌繁殖的情况
Figure BDA0004160700110000112
Figure BDA0004160700110000121
实验例7杀虫真菌专用培养基在种子处理中对杀虫真菌繁殖的影响
选取配方9培养基，分别与适量绿僵菌油悬浮剂、白僵菌油悬浮剂混合均匀，制成每克培养基中含有1亿个孢子的真菌制剂，将真菌制剂与黄瓜种子按100g/100kg种子比例拌种风干后，播种于预先高温灭菌(200℃，2h)无菌土中，置光照培养箱中，控制温度25±2℃，定期浇灌无菌水。分别以1亿孢子/mL的绿僵菌孢悬液、1亿孢子/mL的白僵菌孢悬液，按孢悬液与种子100mL/100kg种子的比例拌种处理作为对照。播种前取拌种的种子用CFU法分别测定不同处理绿僵菌和白僵菌数量，计算每粒种子绿僵菌、白僵菌数量。播种10d后，分别取适量黄瓜苗的根和根际土壤，采用CFU法分别测定不同处理绿僵菌和白僵菌数量，根据稀释的对应倍数计算每株黄瓜根际土壤和根上绿僵菌、白僵菌数量，并计算每株植株根和根际土壤绿僵菌、白僵菌相对每粒种子上绿僵菌、白僵菌增殖的倍数。
结果如表8，播种10天后，专用培养基联合杀虫真菌使用的每株黄瓜根和根际土壤绿僵菌和白僵菌数量显著增加，均高于对照，绿僵菌增殖48.3倍，白僵菌增殖70.4倍，而只使用杀虫真菌拌种的处理杀虫真菌数量明显减少了。因此，在杀虫真菌拌种中加入专用培养基能有效促进杀虫真菌的繁殖，提高微环境中杀虫真菌数量，从而保证防效；同时专用培养基的使用也可以减少杀虫真菌孢子的用量，使用较低浓度的真菌孢子也能进行大量繁殖，降低使用成本。
表8杀虫真菌专用培养基在种子处理中促进白僵菌和绿僵菌繁殖的情况
Figure BDA0004160700110000122
Figure BDA0004160700110000131
实验例8专用培养基在杀虫真菌与肥料联合使用中对杀虫真菌繁殖的影响
专用培养基9与适量的绿僵菌孢子粉拌匀，专用培养基10与适量白僵菌孢子粉拌匀，均制成每克培养基中含有1×106个孢子的真菌制剂。其中，含绿僵菌的真菌制剂与有机颗粒肥按重量比1：99混合拌匀，混合后获得含绿僵菌1×104个孢子/克的有机肥颗粒；含白僵菌的真菌制剂与复合肥颗粒按重量比1：99混合拌匀，混合后获得含白僵菌孢子1×104个/克的复合肥颗粒。然后，分别将拌有真菌制剂的有机肥颗粒或复合肥颗粒与含水量25％的沙土按重量比1：10混合，以加入了含孢数相同(绿僵菌含量为1×104个孢子/克，白僵菌含量为1×104个孢子/克)的有机肥颗粒或复合肥颗粒与含水量25％的沙土按重量比1：10混合，分别作为试验对照，每个处理重复3次。上述处理均于25℃放置10天后，取样用无菌水梯度稀释后采用CFU法，分别测定沙土中绿僵菌数量或白僵菌的数量，并据此计算每克肥料中杀虫真菌的数量和相对于接种时真菌增殖的倍数。
从表9可以看出，对照中单独的绿僵菌或白僵菌与肥料混匀后在沙土中放置10天后，每克肥料中绿僵菌孢子数增殖到840×104个，增殖0.84×103倍，复合肥中检测不到白僵菌孢子；采用真菌制剂与有机肥或复合肥混合后在沙土中放置10天后，每克肥料中绿僵菌和白僵菌孢子数分别达到13200×104个和220×104个，分别增殖13.20×103倍和0.22×103倍，均远高于对照。综上表明，在绿僵菌或白僵菌联合有机肥或复合肥使用中，绿僵菌或白僵菌添加专用培养基制备成真菌制剂后再联合有机肥或复合肥使用，施用后能够促进杀虫真菌绿僵菌和白僵菌的生长繁殖，从而促进杀虫真菌与肥料联合产品的开发。
表9专用培养基在杀虫真菌与肥料联合使用中对杀虫真菌繁殖的情况
Figure BDA0004160700110000132
Figure BDA0004160700110000141
实验例9真菌制剂在田间应用中的作用效果
将杀虫真菌加入专用培养基中制备成真菌制剂用于田间实验，制备方法为：用配方9与适量绿僵菌孢子粉混匀，分别制成每克培养基含10亿个孢子、5亿个孢子、1×106个孢子的绿僵菌真菌制剂备用；用制备的1×106个孢子/克的绿僵菌真菌制剂与有机肥按重量比1：99拌匀备用。用配方10与适量白僵菌孢子粉混匀，分别制成每克培养基含10亿个孢子、5亿个孢子、1×106个孢子的白僵菌真菌制剂备用；用制备的1×106个孢子/克的白僵菌真菌制剂与复合肥按重量比1：99拌匀备用。
小麦和番茄田间种植：选用土壤板结严重，往年土传病害，地下虫害发生严重的地块进行试验。(1)拌种。选用含10亿孢子/克的绿僵菌真菌制剂拌种，用量为100g绿僵菌真菌制剂/100kg种子，分别使用3.3g绿僵菌孢子粉/100kg种子拌种，96.7g配方9专用培养基/100kg种子拌种，以清水拌种的处理作为空白对照。在小麦返青后起至拔节期调查小麦幼苗被小地老虎啃食的情况和灌浆期调查小麦茎基腐发病情况，并分别计算防效；在番茄幼苗期调查番茄苗被蛴螬啃食的情况和番茄根腐病发生情况，并分别计算防效。(2)灌土。分别选用5亿孢子/g的绿僵菌真菌制剂、配方9专用培养基稀释500倍后的液体、1×106孢子/g绿僵菌悬液灌溉土壤，分别在小麦播种后以及番茄定植后灌溉，以清水灌溉的处理作为空白对照。在小麦返青后起至拔节期调查小麦幼苗被小地老虎啃食情况和灌浆期调查小麦茎基腐发病情况，并分别计算防效；在番茄幼苗期调查番茄苗被蛴螬啃食的情况和番茄根腐病发生情况，并分别计算防效。(3)拌有机肥。将制备好的含绿僵菌真菌制剂的肥料均匀撒施到地里，每亩用量400-500kg，翻耕均匀后种植小麦和番茄，并设置仅有绿僵菌孢子粉拌有机肥(每克肥料中含绿僵菌孢子1×104个)的处理和配方9培养基拌有机肥(配方9培养基与肥料按重量1：99拌匀)的处理，以仅施用有机肥的处理作为空白对照。在小麦返青后起至拔节期调查小麦幼苗被小地老虎啃食情况和灌浆期调查小麦茎基腐发病情况，并分别计算防效；在番茄幼苗期调查番茄苗被蛴螬啃食的情况和番茄根腐病发生情况，并分别计算防效。
马铃薯田间种植：选用土壤板结严重，往年土传病害，地下虫害发生严重的地块进行试验。(1)拌种。选用含10亿孢子/克的白僵菌真菌制剂拌种，用量为100g白僵菌真菌制剂/100kg种子，分别使用1.25g白僵菌孢子粉/100kg种子拌种，98.75g配方10培养基/100kg种子拌种，以清水拌种的处理作为空白对照。在马铃薯采收期，分别统计马铃薯薯块虫害发生情况和疮痂病病害发生情况，并计算相应的虫果率和病害防效。(2)灌土。选用5亿孢子/克的白僵菌真菌制剂稀释500倍后灌溉长马铃薯的土壤，分别用配方10专用培养基稀释500倍后的培养基液和1×106孢子/g白僵菌悬液灌溉土壤，以清水灌溉的处理作为空白对照。马铃薯采收期，分别统计马铃薯薯块虫害发生情况和疮痂病病害发生情况，并计算相应的虫果率和病害防效。(3)拌复合肥。将制备好含白僵菌真菌制剂肥料均匀撒施到地里，每亩用量30-40kg，翻耕均匀后播种马铃薯，并设置仅有白僵菌孢子粉拌复合肥(每克肥料中含白僵菌孢子1×104个)的处理和仅有配方10培养基拌复合肥(配方10培养基与肥料按重量1：99拌匀)的处理，以仅施用有复合肥的处理作为空白对照。马铃薯采收期，分别统计马铃薯薯块虫害发生情况和疮痂病病害发生情况，并计算相应的虫果率和病害防效。
从表10可以看出绿僵菌在小麦田间应用中，在拌种、灌土和拌有机肥时添加有配方9培养基的真菌制剂，对小麦具有更好的保护作用，对小麦茎基腐的防效分别为86％、91％、87％，对小地老虎的防效分别为84％、88％、90％，对茎基腐和小地老虎的防效显著高于单独绿僵菌和专用培养基的处理；对番茄的作用效果相同；同时观察发现使用了含配方9培养基和绿僵菌的真菌制剂后的土壤板结情况改善效果最明显，土质更疏松。
表10专用培养基在绿僵菌田间应用中的作用效果
Figure BDA0004160700110000161
从表11可以看出白僵菌在马铃薯田间应用中，在拌种、灌土和拌有复合肥时添加有配方10培养基的真菌制剂，对马铃薯具有更好的保护作用，对马铃薯疮痂病的防效分别为84％、80％、77％，蛴螬虫果率分别为7％、8％、5％，对疮痂病和蛴螬的防效均显著高于单独白僵菌和专用培养基的处理。同时观察发现使用了含配方10培养基和白僵菌的真菌制剂土壤板结情况改善效果最明显，土质更疏松。综上所述在杀虫真菌田间应用中，添加杀虫真菌专用培养基的真菌制剂能显著提高杀虫真菌对植物病虫害的防治效果，同时能改良土壤。因此，本发明真菌制剂在植物病虫害防控中有很大的应用前景。
表11专用培养基在白僵菌田间应用中的作用效果
Figure BDA0004160700110000162
Figure BDA0004160700110000171
需要说明的是，上述实验例中所涉及的实验操作，部分实验操作具有一定的通用性，因而未加详细描述，未详细描述部分内容参考其它实验例中相关操作或参考现有技术，不再赘述。

Claims (10)

1.一种不用灭菌的杀虫真菌专用培养基，其特征在于，所述专用培养基包括蟹壳粉。
2.如权利要求1所述的专用培养基，其特征在于，所述专用培养基还包括黄粉虫粉或/和虾粉。
3.如权利要求1所述的专用培养基，其特征在于，所述蟹壳粉占专用培养基的质量分数为60％以上。
4.如权利要求3所述的专用培养基，其特征在于，所述专用培养基中蟹壳粉、黄粉虫粉和虾粉的质量分数分别为60-80％、10-40％和10-40％。
5.如权利要求4所述的专用培养基，其特征在于，所述专用培养基中蟹壳粉、黄粉虫粉和虾粉的质量分数分别为60％、10％和30％，或质量分数分别为60％、30％和10％，或质量分数分别为60％、20％和20％。
6.一种不用灭菌的杀虫真菌生产方法，其特征在于，所述方法包括将杀虫真菌接种至权利要求1-5的任一专用培养基中发酵，接种前所述专用培养基不用灭菌处理，杀虫真菌的接种量为大于等于1×106个孢子/克专用培养基。
7.一种杀虫真菌制剂，其特征在于，所述制剂包括杀虫真菌和权利要求1-5的任一专用培养基，所述制剂中杀虫真菌的含量为大于等于1×106个孢子/克专用培养基。
8.一种杀虫真菌制剂的制备方法，其特征在于，将杀虫真菌加入至权利要求1-5的任一专用培养基中得到所述制剂，在加入前不用对专用培养基进行灭菌处理，加入杀虫真菌的量为大于等于1×106个孢子/克专用培养基。
9.如权利要求7的杀虫真菌制剂在改良土壤和防治农作物病虫害中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述真菌制剂与肥料联合使用。
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