CN116326715A - 具有改善便秘和防腐功能的后生元、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有改善便秘和防腐功能的后生元、其制备方法及应用，属于微生物发酵技术领域。本发明的后生元是由副干酪乳杆菌Postbio‑P6和乳酸乳球菌Postbio‑F3经发酵制备而成，所述后生元具有较好的食品防腐作用以及便秘改善功能，从而在食品防腐以及改善便秘症状等方面存在重要应用价值。

Description

具有改善便秘和防腐功能的后生元、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及具有改善便秘和防腐功能的后生元、其制备方法及应用。
背景技术
面食种类繁多，我国主要食用的面食有馒头、油条、面包、面条、糕点等，这些已成为国民生活的必需品。然而，面食中含有丰富的蛋白质、脂类、糖类、维生素等营养物质，且含水量较高，极易导致微生物的生长繁殖。面食的微生物腐败和随之而来的浪费问题给面食行业和消费者造成了巨大的经济损失。在面食的储存、销售中，经常会出现一些因为微生物的生长繁殖而引起的面食发霉变质、变色等质量问题，因此关于面食的防腐保鲜技术一直是人们关注的问题。传统的面食防腐保鲜方法包括低温贮藏、气调包装、改善加工技术等。低温贮藏可有效控制面食中水分的散失，抑制微生物的生长繁殖，但会带来面食的口感及风味下降、成本提高等负面影响；气调包装可以抑制霉菌等微生物的生长，但对于醋酸菌、乳酸菌等可进行无氧呼吸的微生物无抑制作用；加工技术通过改善面食本身的品质，延长面食的保质期，但工业化的防腐保鲜包装技术较难实现。
生物防腐剂指从生物体通过生物培养、提取和分离技术获得的具有抑制和杀灭微生物的一种食品添加剂，常见的有乳酸链球菌素、纳他霉素等。在生物防腐的进程中，乳酸菌的防腐应用还是比较广泛的，而乳酸菌之所以能够用于食品防腐，根本原因在于乳酸菌可以通过多种方式来抑制腐败菌的生长，包括竞争抑制，以及产生抗菌肽、短链脂肪酸、胞外多糖等抑菌活性物质。随着全球对于生物防腐剂的探索，能够应用于生物防腐剂的微生物家族也在不断扩充。后生元是其中值得关注的生物防腐新材料之一。
后生元是指对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂。后生元蕴含多种对机体有益的活性成分，如胞外多糖、短链脂肪酸、有机酸、维生素、抗菌肽以及菌体成分等等，具有抗炎症、抗过敏、抗氧化、调节免疫、预防或治疗代谢性疾病等作用，是一种卓越的健康效应因子。
便秘是由多种因素引起的胃肠道疾病，其特征主要是排便困难或排便不适。鉴于后生元的上述多种作用，便秘症状也有望通过后生元得到相应的治疗或改善。
发明内容
本发明从解决食品绿色防腐关键问题出发，筛选高抑菌活性益生菌并制备具有天然生物防腐功效的后生元，解决了食品天然生物防腐的难题，并同时证明其具有预防治疗便秘的功效，从而进一步实现了后生元的“天然生物防腐”与“功能性”双效合一。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种后生元的制备方法，步骤如下：
将副干酪乳杆菌Postbio-P6和乳酸乳球菌Postbio-F3按活菌数比例混合成益生菌组合物；将益生菌组合物接种于发酵培养基中，进行发酵；发酵结束后对混合益生菌发酵液进行杀菌，得到后生元发酵液；将后生元发酵液进行澄清除杂和浓缩脱盐处理，所获得的浓缩脱盐发酵液，即为后生元。
上述制备方法中，副干酪乳杆菌Postbio-P6和乳酸乳球菌Postbio-F3的活菌数比例选自1:1。
上述制备方法中，益生菌组合物的接种量选自2~4%，优选为2%。
上述制备方法中，发酵选自好氧发酵。
上述制备方法中，发酵条件选自：在37~45℃条件下发酵35~50h，转速为150~250rpm/min，发酵过程中控制pH为6.0~7.0。
上述制备方法中，发酵培养基的配方为：葡萄糖20g，乳清蛋白15g，大豆粉20g，脱脂乳粉10g，蒸馏水1L；初始pH=7.0。在接种发酵前，发酵培养基需要在105℃条件下经过30min高温灭菌处理。
上述制备方法中，可选用陶瓷膜进行澄清除杂处理；可选用纳滤膜进行浓缩脱盐处理。
本发明提供了由上述方法制备的后生元。
上述后生元被证明具有较好的食品防腐作用。基于此，本发明提供了上述后生元在食品防腐中的应用。
上述食品选自面食。
本发明提供了一种食品防腐剂，含有上述后生元。
上述后生元被证明具有较好的便秘改善效果，从而可以防治便秘。基于此，本发明提供了上述后生元在防治便秘中的应用。具体地，本发明提供了上述后生元在制备防治便秘的制剂中的应用。
本发明提供了一种便秘调理剂，含有上述后生元。
上述便秘调理剂还可包含有机体生理上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂或其他介质。所述胃肠调理剂的剂型可选自粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液或片剂。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种后生元，该后生元具有较好的食品防腐作用和便秘防治效果，从而在食品防腐以及改善便秘症状等方面存在重要应用价值。
附图说明
图1为纳滤膜渗析脱盐实验中膜通量和浓液电导率随时间的变化曲线；
图2为商业馒头防腐试验的第4天试验结果图；其中，左侧为对照组，右侧为后生元组；
图3为家庭馒头防腐试验的第8天试验结果图；其中，左侧为对照组，右侧为后生元组；
图4为家庭馒头防腐试验的第12天试验结果图；其中，左侧为对照组，右侧为后生元组；
图5为蔬菜馒头防腐试验的第4天试验结果图；其中，左侧为后生元组，右侧为对照组；
图6为蔬菜馒头防腐试验的第7天试验结果图；其中，左侧为对照组，右侧为后生元组；
图7为蔬菜馒头防腐试验中各试验组的菌落总数；
图8为面食油条防腐试验的第48h试验结果图。
实施方式
本发明所用菌种材料，如下所示：
副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）Postbio-P6和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）Postbio-F3均来自青岛农业大学益生菌与后生元基础研究与开发应用创新实验室乳酸菌菌种库，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号分别为CGMCC No.26237和CGMCC No.26236。
本发明中所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
后生元的制备，步骤如下：
将副干酪乳杆菌Postbio-P6和乳酸乳球菌Postbio-F3菌种分别接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18h，传代培养2次，使各菌株活化后的活菌数为5~10×106 cfu/mL。将活化好的副干酪乳杆菌Postbio-P6和乳酸乳球菌Postbio-F3菌种按照活菌数之比为1:1的比例混合成益生菌组合物。将上述益生菌组合物按照2%的接种量，接种于发酵培养基中。在37℃条件下发酵35h，转速为150 rpm/min，发酵过程中控制pH为6.5。发酵结束后对混合益生菌发酵液进行杀菌，在95℃条件下经过巴氏杀菌30min，得到后生元发酵液。然后对后生元发酵液进行澄清除杂和浓缩脱盐处理，所获得的浓缩脱盐发酵液，即本实施例所述后生元，命名为Postbio-care。
上述发酵培养基的配方为：葡萄糖20g，乳清蛋白15g，大豆粉20g，脱脂乳粉10g，蒸馏水1L，初始pH=7.0。在接种发酵前，发酵培养基需要在105℃条件下经过30min高温灭菌处理。
上述澄清除杂和浓缩脱盐处理中，可采用陶瓷膜进行澄清除杂处理，可采用纳滤膜进行浓缩脱盐处理，具体处理如下：
选用50nm×19通道陶瓷膜对后生元发酵液进行澄清除杂处理，加三倍发酵液体积的纯水，获得陶瓷膜清液；本次共进料49.85 kg，一共运行了80 min，实验过程中温度维持在25℃以下，共出40.65 kg陶瓷膜清液清液；然后选用1000 Da-2540纳滤膜进行脱盐处理：本次处理进料40.65 kg陶瓷膜清液，在30 min后逐渐加入陶瓷膜渗析水进行脱盐，共进料70.65 kg，一共运行了73 min，共得到60.70 kg清液，9.95 kg浓液，即浓缩了约7.1倍，平均通量22.41 L/h·m2，浓液锤度7%，电导10.66 mS/cm。继续进行纳滤膜渗析脱盐处理：取80kg纯水分多次加入浓液中，对浓液进行渗析处理，最后得到浓液电导为0.87 mS/cm，脱盐率91.84%，如图1所示。
图1表明，在纳滤浓缩过程中，浓液电导率呈现下降趋势，说明纳滤对浓液具有显著的脱盐效果。
实施例2
食品生物防腐试验：
1、商业馒头
将后生元稀释在蒸馏水中，配制成浓度为10%的后生元溶液。将馒头样品（王哥庄馒头）分为对照组和后生元组。将后生元溶液装入贴好标签纸的喷壶中，将喷壶嘴对准馒头样品，进行均匀喷涂，喷涂后，在常温下进行观察。在第4天观察馒头样品的组织形态、色泽、滋气味、杂质等状况。
试验结果如图2所示：
对照组：组织结构不均匀、组织偏硬、腐烂变质，色泽发黑、颜色变暗，具有明显的酸臭气味，令人不适，肉眼可见霉斑、长毛。后生元组：外形完整，具有馒头应有的形态，不变形，组织偏硬，颜色正常，正常气味，没有异味，外表及内部均无肉眼可见杂质。这说明，在常温下，本发明制备的后生元可以至少延长王哥庄商业馒头保质期4天以上，具有良好的生物防腐功效。
2、家庭馒头
将后生元稀释在蒸馏水中，配制成浓度为5%的后生元溶液。将馒头样品（家庭馒头）分为对照组和后生元组。将后生元溶液装入贴好标签纸的喷壶中，将喷壶嘴对准馒头样品，进行均匀喷涂，喷涂后，在常温下进行观察。分别在第8和12天观察馒头样品的组织形态、色泽、滋气味、杂质等状况。
试验结果如图3和图4所示：
第8天：
对照组：组织结构不均匀，进一步腐烂，肉眼可见发霉、长毛与腐烂，色泽发黑，颜色变暗，具有明显的酸臭气味，令人不适。后生元组：外形完整，具有馒头应有的形态，不变形，不破损，组织结构均匀，呈黄色，无异味，无肉眼可见杂质。如图3所示。
第12天：
对照组：组织结构不均匀，组织偏硬，进一步腐烂，色泽发黑，颜色变暗，具有明显的酸臭气味，令人不适。后生元组：外形完整，具有馒头应有的形态，不变形，组织偏硬，颜色暗淡，无异味，无肉眼可见杂质。如图4所示。
上述结果说明，在常温下，本发明制备的后生元可将家庭馒头的保质期延长至12天以上，具有良好的生物防腐功效。
3、蔬菜馒头
将后生元稀释在蒸馏水中，配制成浓度为10%的后生元溶液。将馒头样品（蔬菜馒头）分为对照组和后生元组。将后生元溶液装入贴好标签纸的喷壶中，将喷壶嘴对准馒头样品，进行均匀喷涂，喷涂后，在常温下进行观察。分别在第4和7天观察馒头样品的组织形态、色泽、滋气味、杂质等状况，并于第5天记录菌落总数情况。
试验结果如图5~图7所示：
第4天：
对照组：组织结构不均匀、肉眼可见霉斑、白毛与腐烂组织，馒头外表及内部均无肉眼可见杂质。后生元组：外形完整，具有馒头应有的形态，不变形，不破损，组织结构均匀，外表及内部均无肉眼可见杂质。如图5所示。
第7天：
对照组：组织结构不均匀、进一步腐烂、肉眼可见发霉、长毛、腐烂。后生元组：外形完整，具有馒头应有的形态，不变形，不破损，组织结构均匀，外表及内部均无肉眼可见杂质。如图6所示。
微生物测试结果如图7所示，喷涂后生元的馒头样品，其霉菌数显著低于对照组。这说明，在常温下，本发明制备的后生元可将蔬菜馒头的保质期延长至7天以上，具有良好的生物防腐功效。
4、面食油条
将后生元稀释在蒸馏水中，配制成浓度为10%的后生元溶液。将油条样品（面食油条）分为对照组和后生元组。油条样品经过后生元溶液的快速过液处理，置于室温下存放，然后与对照组分时段进行感官测试；在第12h、24h和48h后分别观察油条样品的组织形态、色泽、滋气味、杂质等状况。
试验结果如下：
12小时后，对照组与测试组在感官方面没有特殊差异。24小时后，后生元组油条组织形态完整，对照组油条发软，并且对照组有明显的酸味，令人不适，这说明，在室温下，经过24小时存放，对照组油条已经腐败变质。48小时后，如图8所示，对照组油条外形不完整，不具有油条应有的形态，变形，破损，并且组织结构不均匀，油条发软，组织凹陷、肉眼可见腐烂组织，并且具有明显的酸臭气味，令人非常不适，这说明样品腐败变质；而后生元组油条的形态、色泽、气味均得到保持；这说明，本发明制备的后生元具有保鲜、防腐、抗氧化的作用，并且不会影响产品本身的色泽形态。
实施例3
便秘症状改善试验：
本试验招募了20名功能性便秘志愿者，连续食用实施例1制备的后生元（每天1g）四周，结合志愿者症状和问卷调查，评估后生元改善志愿者便秘症状的情况。
（一）便秘志愿者招募
招募自检为便秘的志愿者，填写调查问卷（附录1），根据罗马标准Ⅲ，筛选出慢性功能性便秘且同意入组的志愿者，并签署知情同意书，具体筛选条件如下：
1、纳入标准：
① 年龄：20-40岁；② 性别：男女比例1:1；③ 将排便出现下面两项症状纳入研究对象：
A、排便费力（至少每4次排便中有一次）；
B、排便为干块状或硬便（至少每4次排便中有一次）；
C、有排便不尽感（至少每4次排便中有一次）；
D、有***直肠梗阻或阻塞感（至少每4次排便中有一次）；
E、需要用手操作（如手指辅助排便、盆底支撑排便）以促进排便（至少每4次排便中有一次）；
F、排便少于每周3次。
④ 排便粪便类型为布里斯托大便分类第一型（一颗颗硬球）或第二型（香肠状，但表面凹凸）。
2、排除标准：
① 未按要求服用后生元；
② 不配合随访者；
③ 采集标本前1个月服用影响肠道菌群药物；
④ 器质性便秘、神经性便秘和顽固性便秘；
符合入组条件的志愿者每天服用1g后生元，日常饮食及生活不做限制。如果试验期间志愿者服用了药物，需要详细记录。后生元每周发放1次，由志愿者置于4℃冰箱或者阴凉处保存。
（二）体格检查及临床问卷调查
通过电子问卷调查并记录志愿者参与试验过程中每周排便频次、布里斯托大便类型、排便疼痛感、排便费力程度、排便不尽感、排便不成功次数和排便时间。对各项排便指标进行得分制度计算，除排便频次和布里斯托大便类型外，排便疼痛感、排便费力程度、排便不尽感、排便不成功次数和排便时间得分越高排便越困难。试验期为4周，共填写5次问卷（0周，1周，2周，3周和4周），问卷见附录2。
（三）试验结果
1、志愿者基本信息
本试验共招募符合条件的慢性功能性便秘志愿者20人，包括9名男性和11名女性，他们的平均年龄和BMI分别为25.8±3.2岁和20.11±3.12 kg/m2。
2、志愿者便秘情况
20名志愿者在第0周表现出多种便秘症状，其中2名未按照要求提供粪便样品。因此仅对按试验要求提供粪便样本的18名志愿者的便秘症状做了统计分析，结果显示，16.7％（n=3）志愿者每周的排便频率<3，约83％（n=15）志愿者表现出两次以上排便不成功，28％（n=5）志愿者的粪便类型属于布里斯托大便（Bristol Stool Scale，BSS）分类的Ⅰ型或Ⅱ型（即粪便干硬），89％（n=16）志愿者的排便不尽感得分高于2分（从1到5分），77.7％（n=14）志愿者的排便困难程度得分高于2分（从1到5），55.5％（n=10）志愿者排便疼痛感得分大于2分（从1到5分），11％志愿者（n=2）的排便时间得分大于3分。
注：除排便频次和布里斯托大便类型外，排便疼痛感、排便费力程度、排便不尽感、排便不成功次数和排便时间得分越高便秘症状越严重（1-5分）。
3、后生元缓解便秘症状
连续服用后生元4周后，志愿者便秘症状均得到明显改善。连续服用4周后排便频次（P=0.012）显著增加。连续服用后生元4周后，排便不尽感（P=2.4×10-4），排便疼痛感（P=0.0012），排便时间（P=0.001），排便用力程度（P=8×10-6）和排便不成功次数（P=0.042）均极显著改善。服用后生元1周后，布里斯托大便类型Ⅳ（表面光滑的香肠状）的比例从12％增加到了73％，之后粪便类型Ⅴ（柔软块状）的比例上升，这可能反映了后生元可缩短肠道运输时间，并因此减少了水分吸收。上述结果表明，本发明制备的后生元可缓解志愿者便秘症状。
附录
附录1 便秘志愿者筛选问卷
1、姓名
2、性别
3、年龄
4、职业
5、联系方式
6、请说明您的排便频次（选A为便秘）
A. 少于3次/周
B. 4-5次/周
C. 6-7次/周
D. 8-14次/周
7、多选题（两项以上为便秘）
A. 排便费力（至少每4次排便中有一次）
B. 排便为干块状或硬便（至少每4次排便中有一次）
C. 有排便不尽感（至少每4次排便中有一次）
D. 有***直肠梗阻或阻塞感（至少每4次排便中有一次）
E. 需要用手操作（如手指辅助排便、盆底支撑排便）以促进排便（至少每4次排便中有一次）
F. 排便少于每周3次
8、是否在不使用泻药时很少出现稀便
A. 是
B. 否
9、多选题（A、B为便秘）
A. 第一型：一颗颗硬球（很难通过）
B. 第二型：香肠状，但表面凹凸
C. 第三型：香肠状，但表面有裂痕
D. 第四型：像香肠或蛇一样，且表面很光滑
E. 第五型：断边光滑的柔软块状（容易通过）
F. 第六型：粗边蓬松块，糊状大便
G. 第七型：水状，无固体块（完全液体）
10、是否患有器质性或神经性便秘
A. 是
B. 否
11、15天内是否使用过抗生素
A. 是
B. 否
12、是否对乳蛋白过敏
A. 是
B. 否
附录2 便秘临床调查周问卷
1、姓名
2、编号
3、请问您上周服用后生元的产品的次数为
A. 每天服用
B. 服用6天
C. 服用5天
D. 服用小于5天
4、请问您上一周的排便频次为
5、请问您上一周主要的排便类型为
6、您上一周排便不尽感的严重程度
A. 无
B. 极轻
C. 轻度
D. 中度（排便后仍有很多粪便未排出）
E. 重度（排便后仍有便意，或为将粪便排干净多次上厕所）
7、您上周平均每天排便不成功的次数
A.无
B. 1次
C. 2次
D. 3次
E. 大于3次
8、您上周排便过程中的费力程度
A. 无
B. 极轻
C. 轻度
D. 中度
E. 重度
9、您上周排便过程中的疼痛感
A. 无
B. 极轻
C. 轻度
D. 中度
E. 重度
10、请问您上周排便过程的平均持续时间
A. 小于3 min
B. 极轻3-5 min
C. 5-10 min
D. 10-15 min
E. 大于15 min
11、请问您上周是否有服用抗生素类药物？若有请说明服用药物种类、用量及服用时长，若没有请填无。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种后生元的制备方法，其特征在于，步骤如下：
将副干酪乳杆菌Postbio-P6和乳酸乳球菌Postbio-F3按活菌数比例混合成益生菌组合物；将益生菌组合物接种于发酵培养基中，进行发酵；发酵结束后对混合益生菌发酵液进行杀菌，得到后生元发酵液；将后生元发酵液进行澄清除杂和浓缩脱盐处理，所获得的浓缩脱盐发酵液，即为后生元。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，副干酪乳杆菌Postbio-P6和乳酸乳球菌Postbio-F3的活菌数比例选自1:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，益生菌组合物的接种量选自2~4%，优选为2%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵条件选自：在37~45℃条件下发酵35~50h，转速为150~250 rpm/min，发酵过程中控制pH为6.0~7.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，选用纳滤膜进行浓缩脱盐处理。
6.权利要求1~5任一项所述方法制备的后生元。
7.权利要求6所述后生元在食品防腐和/或制备防治便秘的制剂中的应用。
8.一种食品防腐剂，其特征在于，含有权利要求6所述的后生元。
9.一种便秘调理剂，其特征在于，含有权利要求6所述的后生元。
10.根据权利要求9所述的便秘调理剂，其特征在于，所述便秘调理剂还包含有机体生理上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂或其他介质。
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