CN116287040A - 一种链霉菌-霉菌混合发酵合成ε-聚赖氨酸的工艺 - Google Patents

一种链霉菌-霉菌混合发酵合成ε-聚赖氨酸的工艺 Download PDF

Info

Publication number
CN116287040A
CN116287040A CN202211398323.1A CN202211398323A CN116287040A CN 116287040 A CN116287040 A CN 116287040A CN 202211398323 A CN202211398323 A CN 202211398323A CN 116287040 A CN116287040 A CN 116287040A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polylysine
epsilon
fermentation
mould
culturing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211398323.1A
Other languages
English (en)
Inventor
曾昕
朱洺志
泰宝艳
唐慧
苏志伟
李珊珊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huaibei Normal University
Original Assignee
Huaibei Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huaibei Normal University filed Critical Huaibei Normal University
Priority to CN202211398323.1A priority Critical patent/CN116287040A/zh
Publication of CN116287040A publication Critical patent/CN116287040A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C12R2001/47—Streptomyces albus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/685—Aspergillus niger
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/69—Aspergillus oryzae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/80—Penicillium
    • C12R2001/82—Penicillium chrysogenum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/845—Rhizopus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种链霉菌‑霉菌共培养合成ε‑聚赖氨酸的工艺，是以小白链霉菌IFO14147为ε‑聚赖氨酸生产菌，以其他多种霉菌为诱导菌，两者在同一培养基、同一发酵条件下进行共培养合成ε‑聚赖氨酸；在共培养的过程中，采用阳离子交换树脂包浸没发酵液以控制体系中ε‑聚赖氨酸浓度，利用ε‑聚赖氨酸对霉菌的抑制作用，选择适宜的ε‑聚赖氨酸浓度控制霉菌生长，进而霉菌持续合成可促进小白链霉菌合成ε‑聚赖氨酸的生物诱导子，最终获得发酵产量的提升。

Description

一种链霉菌-霉菌混合发酵合成ε-聚赖氨酸的工艺
技术领域
本发明涉及一种促进ε-聚赖氨酸合成的方法，具体地说是将小白链霉菌和霉菌进行混合培养，采用调节阳离子交换树脂包在发酵液中的浸没率，使得阳离子交换树脂能够吸附发酵液中超出浓度范围的ε-聚赖氨酸，从而以ε-聚赖氨酸浓度调控霉菌生长，进而使霉菌在全发酵阶段持续合成微生物信号分子以刺激小白链霉菌高效合成ε-聚赖氨酸的方法，属于工业生物技术领域。
背景技术
ε-聚赖氨酸是一种含有25-35个赖氨酸残基的同型单体聚合物，具有广泛的抑菌谱、良好的热稳定性、高效的抑杀菌能力及绿色安全无毒害的特性。其被美国FDA认定为GRAS(总体安全)化合物，并在2014年获得我国卫计委批准作为食品防腐剂在食品加工产业中使用。目前，ε-聚赖氨酸主要作为一种绿色安全的生物食品防腐剂在中国、日本、美国、欧盟、韩国得以应用。此外，ε-聚赖氨酸还能够作为药物载体、高吸水聚合物、脂肪酶抑制剂、生物芯片在医药、保健及卫生用品中使用，具有较大的市场潜力。现阶段制约ε-PL应用的主要原因在于其生产成本过高(市售￥1500kg-1)，提高ε-PL的生物合成水平是解决该问题的重要手段。
在此问题上，学术界和产业界做了大量研究工作，其研究主要集中在优良发酵菌种选育、发酵培养基优化、基于pH及氧气供给的发酵过程调控等方面。在菌种选育方面，目前工作主要集中在通过传统诱变偶联细胞融合手段筛选耐受一定胁迫的ε-PL高产菌株；在发酵培养基优化方面，目前工作主要集中在优化培养基中的碳氮源或在发酵中添加重要的中间代谢物及前体；在发酵过程调控方面，业界主要围绕着强化传质传氧、动态调节发酵pH等方面进行调控。以上工作主要目标在于提高菌种在发酵中的耐受性、保障产物合成所需要的物质能量需求。然而，针对“小白链霉菌为何要合成ε-聚赖氨酸”这一根本问题尚未有相应的研究及相关技术开发。本课题组前期研究发现，霉菌细胞提取物能够大幅促进ε-聚赖氨酸的合成。本课题组对部分霉菌细胞中的诱导物进行了提取，并在ε-聚赖氨酸发酵中添加，开发出了基于霉菌菌体提取物添加的发酵技术。然而，此技术有着其固有瓶颈：(1)霉菌的培养过程需要消耗培养基、电力、人工，同时带来相应的有机发酵废水；(2)霉菌诱导物提取工艺繁琐，有机溶剂消耗大，溶剂回收需消耗能量，带来了额外试剂及能量成本；(3)霉菌菌体提取物中的生物诱导子会被ε-聚赖氨酸产生菌不断降解，其激活ε-聚赖氨酸合成的作用主要表现为添加后的48h，发酵中后期的促进效果不明显。
解决以上问题的方法在于将ε-聚赖氨酸产生菌(小白链霉菌)和诱导子产生菌(霉菌)进行共培养发酵，使得霉菌不断合成诱导子并持续激活小白链霉菌的ε-聚赖氨酸合成能力。然而，ε-聚赖氨酸具有广泛的抑菌谱，在较高浓度下，能够完全抑制绝大多数细菌、酵母和霉菌的生长；反过来，霉菌生长速度比链霉菌快得多，且对ε-聚赖氨酸具有一定抗性，在没有或低浓度ε-聚赖氨酸环境中能够快速生长进而在发酵中占据优势，使得ε-聚赖氨酸无法合成。
发明人经大量实验及分析认识到，“调控发酵液中的ε-聚赖氨酸浓度”是解决该问题的关键。本发明采用动态添加阳离子交换树脂包的方式调控发酵液中的ε-聚赖氨酸浓度，使得其浓度能处于刚好限制霉菌快速生长又不会完全杀死霉菌的适宜范围。此方法可使得霉菌在ε-聚赖氨酸发酵液中处于适宜的丰度，以持续合成诱导子，进而获得持续激活小白链霉菌合成ε-聚赖氨酸的有利效果。相比传统ε-聚赖氨酸发酵和产物原位提取发酵工艺，此方法能显著提高产物产量；相比霉菌菌体提取物添加发酵，此方法此方法省去了提取诱导子的环节，同时活性霉菌能够持续合成生物信号分子以促进ε-聚赖氨酸合成，具有重要的工业应用价值。
发明内容
为省去诱导子提取环节，并持续提供能够促进小白链霉菌合成ε-聚赖氨酸的生物诱导子，本发明以发酵液中ε-聚赖氨酸浓度为调控把手，采用阳离子交换树脂包动态浸没的方式对ε-聚赖氨酸浓度进行调控，进而调控霉菌生长速率，使其与ε-聚赖氨酸产生菌保持适宜的菌群丰度比例，以持续合成生物诱导子并长期促进小白链霉菌合成ε-聚赖氨酸。本发明方法不仅可以显著提高ε-聚赖氨酸发酵产量，还可大幅减少培养霉菌细胞、提取诱导子、处理相关废水、诱导物精密流加控制所需成本，在ε-聚赖氨酸工业化生产中具有重要的应用价值。
本发明链霉菌-霉菌共培养合成ε-聚赖氨酸的工艺，是以小白链霉菌IFO14147(StreptomycesalbulusIFO14147，CICC11022)为ε-聚赖氨酸生产菌，以其他多种霉菌为诱导菌，两者在同一培养基、同一发酵条件下进行共培养合成ε-聚赖氨酸；在共培养的过程中，采用阳离子交换树脂包浸没发酵液以控制体系中ε-聚赖氨酸浓度，利用ε-聚赖氨酸对霉菌的抑制作用，选择适宜的ε-聚赖氨酸浓度控制霉菌生长，进而霉菌持续合成可促进小白链霉菌合成ε-聚赖氨酸的生物诱导子，最终获得发酵产量的提升。
本发明链霉菌-霉菌共培养合成ε-聚赖氨酸的工艺，包括如下步骤：
步骤1：菌种活化
将小白链霉菌孢子涂布于固体贝塔纳培养基上，在恒温培养箱中30℃恒温培养8-10天，待孢子生长成熟；
将不同霉菌孢子涂布于PDA培养基，在恒温培养箱中30℃恒温培养8-10天，待孢子生长成熟；
所述不同霉菌包括产黄青霉、米根霉、黑根霉、华根霉、米曲霉、紫色红曲、黑曲霉中的一种或多种。
步骤2：发酵种子培养
刮取2-3环小白链霉菌孢子(约1×107个)接种于装有60mLM3G培养基的500mL三角瓶中，在30℃的条件下于恒温震荡培养箱中200rpm培养1-2天；
刮取2-3环(约1×107个)不同霉菌孢子接种于装有80mLM3G培养基的500mL三角瓶中，在30℃的条件下于恒温震荡培养箱中200rpm培养1-3d。
步骤3：阳离子交换树脂改性
将阳离子交换树脂置于三角瓶中，依次使用5倍树脂体积的1mol/L氨水、1mol/L盐酸、1mol/L氨水溶液，在摇床30℃，200rpm振荡4h，每次碱酸碱改性后均需要用去离子水多次洗涤树脂至洗涤水溶液pH在8.5左右；改性后的阳离子交换树脂以纱布或尼龙袋等网笼介质包裹后获得树脂包，以便于树脂的添加和取出操作。网笼介质在包裹前需要进行无菌处理。
所述阳离子交换树脂包括AmberliteIRC-50、HD-2、D004或D152等，优选为Amberlite IRC-50。
步骤4：发酵操作
采用5L发酵罐，配制M3G培养基于121℃灭菌20min(葡萄糖单独灭菌)，反应器总装液量设置为2-3L，以6-10％的接种量接入步骤2获得的小白链霉菌发酵种子液，于初始pH6.0-7.5(优选6.8)、温度25-33℃(优选29℃)、溶氧20％-40％(优选30％)条件下发酵；分别于发酵0h-60h(优选24h)以10.0％-25％接种量(优选13.3-20％)接入步骤2获得的不同霉菌发酵液过滤菌体，此后用氨水控制pH3.8-4.2(优选pH4.0)直至发酵结束；当葡萄糖浓度低于10g/L时，通过蠕动泵补入600g/L的葡萄糖溶液将发酵液中的浓度维持在5-15g/L；当溶液中氨氮低于0.5g/L时，外源流加预灭菌的40％(NH4)2SO4以维持氨氮浓度0.5-1.0g/L；当ε-聚赖氨酸浓度高于5g/L时，启动树脂包浸没操作，以吸附多余ε-聚赖氨酸，维持发酵罐内ε-聚赖氨酸处于4-7g/L，此时霉菌细胞浓度将维持恒定。补料分批发酵将在ε-聚赖氨酸浓度不再提高时结束。
树脂包浸没操作需要保持无菌环境，比如添加时以补料管口释放固定树脂包的棉绳的方式进行操作等。
步骤5：树脂中ε-聚赖氨酸的再释放
发酵后得到的树脂包用去离子水清洗两遍后，拆开合并所有树脂，再用去离子水清洗两遍，加入100mL0.8mol/L的NaOH溶液于30℃、200rpm的摇床中振荡4h进行解吸。结束后将pH用0.8mol/L的HCl溶液回调至7.0以备产物浓度测定。
步骤6：样品检测
发酵液中ε-聚赖氨酸浓度检测：将发酵液用0.2mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)适当稀释，取出2mL与2mL1mM甲基橙水溶液混合，置于30℃反应30min，4000rpm离心15min，上清液用与9mL甲醇混合，于超声波清洗器中振荡提取20min，4500g离心10min，上清液用0.2mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)稀释20倍后于分光光度计465nm处测定吸光度，并代入ε-聚赖氨酸浓度标准曲线中计算出实际ε-聚赖氨酸浓度。
发酵液中葡萄糖浓度检测：将300μL发酵液和700μL无水乙醇混合，静置1h后离心取上清，过0.45μm滤膜后进行HPLC检测。使用有机酸测试柱(AminexHPX-87H,300×7.8mm；Hercules,USA)，流动相设定为5mM硫酸，柱温控制为60℃，进样量10μL。
菌体干重(Driedcellweight,DCW)采用滤纸差量测重法。从5L发酵罐中取出10mL发酵液，4,500×g离心10min，取沉淀加蒸馏水洗涤两次，用预先105℃烘干并称重的滤纸(Φ7cm，中速，SCRC)进行抽滤，之后滤纸置于105℃烘干至恒重后称重，计算前后重量差值。
本发明中ε-聚赖氨酸产生菌为小白链霉菌IFO14147(StreptomycesalbulusIFO14147，CICC11022)。
所述不同霉菌包括产黄青霉CICC41585(PenicilliumchrysogenumCICC41585)、米根霉CICC40468(RhizopusoryzaeCICC40468)、黑根霉CICC41346(RhizopusnigricansCICC41346)、华根霉CICC41505(RhizopuschinensisCICC41505)、米曲霉CICC2339(AspergillusoryzaeCICC2339)、紫色红曲CICC41601(MonascuspurpureusCICC41601)、黑曲霉CICC40102(AspergillusnigerCICC40102)，均购于中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)，优选为黑曲霉CICC40102。
本发明采用的培养基配方：
(1)贝塔纳培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，琼脂20，pH7.5；
(2)M3G培养基(g/L)：葡萄糖60，酵母粉5，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O0.5，K2HPO4·3H2O0.8，KH2PO41.36,FeSO4·7H2O0.03，ZnSO4·7H2O0.04，pH＝6.8。
(3)PDA培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，pH自然。
以上凡涉及到葡萄糖，均将含糖物与其他成分分开配制，121℃高温灭菌20min后再合并于同一体系培养基中。
与传统ε-聚赖氨酸液态发酵相比，本发明链霉菌-霉菌共培养合成ε-聚赖氨酸的方法，能够显著提高ε-聚赖氨酸产量和生产强度；与添加真菌诱导子的ε-聚赖氨酸发酵相比，本发明具有更大的产量提升幅度，并省去了提取发酵液/菌体中信号分子涉及的各项成本，简化了发酵中的过程调控，更易于在工业化生产上应用。
下面结合具体实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件以及结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明技术方案作进一步分析说明。
实施例1：可与小白链霉菌共培养合成ε-聚赖氨酸的霉菌筛选
将步骤2获得的小白链霉菌种子以8％接种量接入预灭菌的装有30mLM3G培养基的三角瓶中，置于29℃恒温振荡培养箱中培养24h。此时，加入pH4.0的终浓度为10g/L的柠檬酸钠缓冲液，将发酵液pH调控在4.0，并在无菌环境下进行成熟霉菌种子液(步骤2获得)的菌体过滤，获得的各霉菌菌体经称重后(1g)加入小白链霉菌发酵液中，此类霉菌包括产黄青霉，米根霉，黑根霉，华根霉，米曲霉，紫色红曲，黑曲霉。此后三角瓶封口后继续置于29℃恒温振荡培养箱中培养24h后测定聚赖氨酸浓度，测得产量分别为0.50g/L(不加霉菌)，0.53g/L(加1.0g产黄青霉)，0.50g/L(加1.0g米根霉)，0.52g/L(加1.0g黑根霉)，0.51g/L(加1.0g华根霉)，0.52g/L(加1.0g米曲霉)，0.50g/L(加1.0g紫色红曲)，0.63g/L(加1.0g黑曲霉)；若在29℃恒温振荡培养箱中培养48h后测定聚赖氨酸浓度，测得产量分别为0.90g/L(不加霉菌)，1.39g/L(加1.0g产黄青霉)，1.20g/L(加1.0g米根霉)，0.93g/L(加1.0g黑根霉)，1.14g/L(加1.0g华根霉)，1.08g/L(加1.0g米曲霉)，0.83g/L(加1.0g紫色红曲)，1.92g/L(加1.0g黑曲霉)。由以上数据说明霉菌共培养的有益效果在添加霉菌后48h能够体现出，可促进聚赖氨酸生物合成的霉菌有产黄青霉，华根霉，米根霉，米曲霉和黑曲霉，其中促进效果最显著的是黑曲霉。
实施例2：黑曲霉添加时间的优化
将步骤2获得的小白链霉菌种子以8％接种量接入预灭菌的装有30mLM3G培养基的三角瓶中，置于29℃恒温振荡培养箱中培养0h、12h、24h、36h、48h后，取出三角瓶在超净台中添加黑曲霉菌体。在12h后加入pH4.0的终浓度为10g/L的柠檬酸钠缓冲液，将发酵液pH调控在4.0。通过步骤2获得成熟黑曲霉种子液，其菌体经无菌过滤后称重1g加入小白链霉菌发酵液中，三角瓶封口后继续置于29℃恒温振荡培养箱中培养48h，此后测定聚赖氨酸浓度，测得产量分别为0g/L(0h添加黑曲霉)、1.2g/L(12h添加黑曲霉)、2.9g/L(24h添加黑曲霉)、2.0g/L(36h添加黑曲霉)、0.5g/L(48h添加黑曲霉)，以上数据显示，在小白链霉菌发酵24h时加入黑曲霉菌体的时机最优。
实施例3：共培养体系中黑曲霉添加量优化
将步骤2获得的小白链霉菌种子以8％接种量接入预灭菌的装有30mLM3G培养基的三角瓶中，置于29℃恒温振荡培养箱中培养24h后，取出三角瓶在超净台中添加黑曲霉菌体。在12h后加入pH4.0的终浓度为10g/L的柠檬酸钠缓冲液，将发酵液pH调控在4.0。通过步骤2获得成熟黑曲霉种子液，其菌体经无菌过滤后称重1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g加入小白链霉菌发酵液中，三角瓶封口后继续置于29℃恒温振荡培养箱中培养48h，此后测定聚赖氨酸浓度，测得产量分别为0.9g/L(0g)、2.9g/L(1g)，3.1g/L(2g)，3.2g/L(3g)，3.3g/L(4g)，3.4g/L(5g)，3.3g/L(6g)，3.3g/L(7g)，2.9g/L(8g)。由以上数据可得促进聚赖氨酸合成最有效的黑曲霉添加量为4-6g/30mL，即13.3-20.0％。
实施例4：共培养体系中最适温度的优化
将步骤2获得的小白链霉菌种子以8％接种量接入预灭菌的装有30mLM3G培养基的三角瓶中，分别置于27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、34℃、35℃、36℃、37℃恒温振荡培养箱中培养24h后，取出三角瓶在超净台中添加黑曲霉菌体。在12h后加入pH4.0的终浓度为10g/L的柠檬酸钠缓冲液，将发酵液pH调控在4.0。通过步骤2获得成熟黑曲霉种子液，其菌体经无菌过滤后称重5g黑曲霉菌体加入小白链霉菌发酵液中，三角瓶封口后继续置于相应温度的恒温振荡培养箱中培养48h，此后测定聚赖氨酸浓度，测得产量分别为2.2g/L(27℃)，2.7g/L(28℃)，3.3g/L(29℃)，3.1g/L(30℃)，2.7g/L(31℃)，1.1g/L(32℃)，0.4g/L(33℃)，0.1g/L(34℃)，0g/L(35℃)，0g/L(36℃)，0g/L(37℃)。由以上数据说明28-30℃为最适共培养温度，温度过低两种菌活力均处于低水平，发酵效率较低；温度过高提升黑曲霉活力，同时损害小白链霉菌活力，造成菌群失调，使得产物无法合成。
实施例5：共培养体系中最适聚赖氨酸维持浓度优化
按照步骤3进行AmberliteIRC-50树脂改性，制备铵型树脂，采用步骤4的方式进行树脂包裹，在步骤5指导下完成发酵罐的简单改造，并按照步骤7进行聚赖氨酸的补料分批发酵，期间按照步骤6进行树脂包的浸没以维持罐内聚赖氨酸浓度。采用步骤发酵罐改造：用304不锈钢网制作树脂包网笼，网笼下端用不锈钢网封口，上端打开。选择5L液体发酵罐，在发酵罐内4组挡板处采用焊接或棉绳、不锈钢丝固定预先制备的树脂包网笼。
将AmberliteIRC-50置于三角瓶中，依次使用5倍树脂体积的1mol/L氨水、盐酸、氨水溶液，在摇床30℃，200r/min振荡4h，每次碱酸碱改性后均需要用去离子水多次洗涤树脂至洗涤水溶液pH在8.5左右，制备AmberliteIRC-50铵型树脂。将改性完成的阳离子交换树脂用适宜大小的尼龙袋包裹，用棉绳捆绑封口。在一根棉绳的一端(A端)串联2-5个以上树脂包，并悬挂在发酵罐树脂包网笼上方，棉绳另一端(B端)从补料口导出发酵罐，发酵罐外部的棉绳采用硅胶管包裹以防止杂菌感染，棉绳末端(B端)固定在补料瓶中。在发酵罐体系灭菌完成后，在固定有棉绳B端的无菌补料瓶中倒入75％乙醇以浸没棉绳B端，为后续调整棉绳长度奠定无菌环境基础。当发酵罐内ε-聚赖氨酸浓度超过指定浓度时，启动树脂包浸没操作。打开补料瓶，用无菌镊子调整棉绳B端进行放线，放线程度以棉绳A端树脂包能够刚好饱和吸附高出的ε-聚赖氨酸含量为准。放线时，关闭发酵罐搅拌功能防止树脂包发生偏离，使其进入树脂网笼并浸没发酵液中。操作完成后，在补料瓶中固定好棉绳B端，并旋紧补料瓶。
采用以上经小幅改造的5L发酵罐，配制M3G培养基于121℃灭菌20min(葡萄糖单独灭菌)，反应器总装液量设置为3L，以10％的接种量接入步骤2获得的小白链霉菌发酵种子液，于初始pH6.8、温度29℃、溶氧30％条件下发酵；于发酵24h以18％接种量接入步骤2获得的霉菌发酵液过滤菌体，此后用氨水控制pH3.8-4.2直至发酵结束；当葡萄糖浓度低于10g/L时，通过蠕动泵补入600g/L的葡萄糖溶液将发酵液中的浓度维持在5-15g/L；当溶液中氨氮低于0.5g/L时，外源流加预灭菌的40％(NH4)2SO4以维持氨氮浓度0.5-1g/L；设置ε-聚赖氨酸维持梯度，分别维持ε-聚赖氨酸浓度0-2g/L、2-4g/L、4-7g/L、7-11g/L范围，当ε-聚赖氨酸浓度高于相应维持浓度时，启动树脂包浸没操作，以吸附多余ε-聚赖氨酸，补料分批发酵均持续168h。最终产量为整罐合计产量(包括发酵液中产物及树脂解吸后产物)，各批次发酵最终产量(包括)分别为0g/L(ε-聚赖氨酸维持浓度0-2g/L)、19.3g/L(ε-聚赖氨酸维持浓度2-4g/L)、67.3g/L(ε-聚赖氨酸维持浓度4-7g/L)、37.2g/L(ε-聚赖氨酸维持浓度7-11g/L)。数据显示，ε-聚赖氨酸维持浓度过低将导致黑曲霉快速生长，后期成为主要菌群，不仅无法合成ε-聚赖氨酸，还将把前期积累的产物降解，发酵无法持续；ε-聚赖氨酸维持浓度过高，将对黑曲霉的生长带来强烈抑制作用，霉菌带来的诱导作用只体现在发酵前期，后期黑曲霉逐渐被ε-聚赖氨酸杀死，不再发挥诱导作用。尽管如此，对聚赖氨酸进行部分吸附，仍然具有促进产物合成的效应，这可能是吸附作用能够缓解部分产物抑制作用，以促进ε-聚赖氨酸合成。此部分显示，发酵过程中采用树脂吸附的作用将ε-聚赖氨酸浓度控制在4-7g/L范围内，可使得链霉菌-霉菌菌群丰度保持平衡，进而持续合成生物信号以促进ε-聚赖氨酸合成。
实施例6：传统聚赖氨酸发酵工艺、产物原位提取发酵工艺、霉菌菌体提取添加发酵工艺及本发明发酵工艺效果对比
采用传统ε-聚赖氨酸发酵工艺，即配制M3G培养基于121℃灭菌20min(葡萄糖单独灭菌)，反应器总装液量设置为3L，以10％的接种量接入步骤2获得的小白链霉菌发酵种子液，于初始pH6.8、温度29℃、溶氧30％条件下发酵，用氨水控制pH4.0直至发酵结束(168h)；当葡萄糖浓度低于10g/L时，通过蠕动泵补入600g/L的葡萄糖溶液将发酵液中的浓度维持在5-15g/L；当溶液中氨氮低于0.5g/L时，外源流加预灭菌的40％(NH4)2SO4以维持氨氮浓度0.5-1g/L。最终ε-聚赖氨酸发酵产量为22.6g/L。
采用聚赖氨酸原位提取发酵工艺，用步骤5所述经小幅改造的5L发酵罐，配制M3G培养基于121℃灭菌20min(葡萄糖单独灭菌)，反应器总装液量设置为3L，以10％的接种量接入步骤2获得的小白链霉菌发酵种子液，于初始pH6.8、温度29℃、溶氧30％条件下发酵，用氨水控制pH4.0直至发酵结束(168h)；当葡萄糖浓度低于10g/L时，通过蠕动泵补入600g/L的葡萄糖溶液将发酵液中的浓度维持在5-15g/L；当溶液中氨氮低于0.5g/L时，外源流加预灭菌的40％(NH4)2SO4以维持氨氮浓度0.5-1g/L；加入大量步骤3、4处理过的AmberliteIRC-50铵型树脂作为原位提取载体，将发酵罐中发酵合成的ε-聚赖氨酸尽可能多的吸附，最终ε-聚赖氨酸总产量为32.4g/L。
采用霉菌菌体提取添加发酵工艺，即先用M3G培养基培养黑曲霉菌体，采用75％乙醇粗提取后，将提取液3000rpm离心，上清液旋转蒸发，并用水复溶，121℃灭菌20min。配制M3G培养基于121℃灭菌20min(葡萄糖单独灭菌)，反应器总装液量设置为3L，以10％的接种量接入步骤2获得的小白链霉菌发酵种子液，于初始pH6.8、温度29℃、溶氧30％条件下发酵，用氨水控制pH4.0直至发酵结束(168h)；在发酵24h时一次性添加上述预制的终浓度为36g湿菌体/L的霉菌菌体提取液进入发酵罐。当葡萄糖浓度低于10g/L时，通过蠕动泵补入600g/L的葡萄糖溶液将发酵液中的浓度维持在5-15g/L；当溶液中氨氮低于0.5g/L时，外源流加预灭菌的40％(NH4)2SO4以维持氨氮浓度0.5-1g/L，最终ε-聚赖氨酸总产量为39.4g/L。
采用实施例6中最优发酵条件，最终能够获得ε-聚赖氨酸总产量67.3g/L。即本发明的方法所带来的产量为传统ε-聚赖氨酸发酵工艺产量的3.0倍，是添加树脂原位吸附-非共培养发酵工艺产量的2.1倍，是直接添加霉菌菌体提取物的1.7倍。故本发酵工艺具有显著的产物提升效果，具有较大的工业化应用价值。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种链霉菌-霉菌共培养合成ε-聚赖氨酸的工艺，其特征在于：
以小白链霉菌IFO14147为ε-聚赖氨酸生产菌，以其他多种霉菌为诱导菌，两者在同一培养基、同一发酵条件下进行共培养合成ε-聚赖氨酸；在共培养的过程中，采用阳离子交换树脂包浸没发酵液以控制体系中ε-聚赖氨酸浓度，利用ε-聚赖氨酸对霉菌的抑制作用，选择适宜的ε-聚赖氨酸浓度控制霉菌生长，进而霉菌持续合成可促进小白链霉菌合成ε-聚赖氨酸的生物诱导子，最终获得发酵产量的提升；
所述不同霉菌包括产黄青霉、米根霉、黑根霉、华根霉、米曲霉、紫色红曲、黑曲霉中的一种或多种；
所述阳离子交换树脂包括Amberlite IRC-50、HD-2、D004或D152。
2.根据权利要求1所述的链霉菌-霉菌共培养合成ε-聚赖氨酸的工艺，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：菌种活化
将小白链霉菌孢子涂布于固体贝塔纳培养基上，在恒温培养箱中30℃恒温培养8-10天，待孢子生长成熟；
将不同霉菌孢子涂布于PDA培养基，在恒温培养箱中30℃恒温培养8-10天，待孢子生长成熟；
步骤2：发酵种子培养
刮取2-3环小白链霉菌孢子接种于装有60mL M3G培养基的500mL三角瓶中，在30℃的条件下于恒温震荡培养箱中200rpm培养1-2天；
刮取2-3环不同霉菌孢子接种于装有80mLM3G培养基的500mL三角瓶中，在30℃的条件下于恒温震荡培养箱中200rpm培养1-3d；
步骤3：阳离子交换树脂改性
将阳离子交换树脂置于三角瓶中，依次使用5倍树脂体积的1mol/L氨水、1mol/L盐酸、1mol/L氨水溶液，在摇床30℃，200rpm振荡4h，每次碱酸碱改性后均需要用去离子水多次洗涤树脂至洗涤水溶液pH值8.5；改性后的阳离子交换树脂以网笼介质包裹后获得树脂包；
步骤4：发酵操作
采用5L发酵罐，配制M3G培养基于121℃灭菌20min，反应器总装液量设置为2-3L，接入步骤2获得的小白链霉菌发酵种子液进行发酵；于发酵0h-60h接入步骤2获得的不同霉菌发酵液过滤菌体，此后用氨水控制pH3.8-4.2直至发酵结束；当体系ε-聚赖氨酸浓度高于5g/L时，启动树脂包浸没操作，以吸附多余ε-聚赖氨酸，维持发酵罐内ε-聚赖氨酸浓度处于4-7g/L。
3.根据权利要求2所述的链霉菌-霉菌共培养合成ε-聚赖氨酸的工艺，其特征在于：
步骤4中，小白链霉菌发酵种子液的接种量为6-10％。
4.根据权利要求2所述的链霉菌-霉菌共培养合成ε-聚赖氨酸的工艺，其特征在于：
步骤4中，接种小白链霉菌发酵种子液后发酵条件为：初始pH6.0-7.5、温度25-33℃、溶氧20％-40％。
5.根据权利要求2所述的链霉菌-霉菌共培养合成ε-聚赖氨酸的工艺，其特征在于：
步骤4中，不同霉菌发酵液过滤菌体的接种量为10％-25％。
6.根据权利要求5所述的链霉菌-霉菌共培养合成ε-聚赖氨酸的工艺，其特征在于：
于发酵48h接入步骤2获得的不同霉菌发酵液过滤菌体。
7.根据权利要求2所述的链霉菌-霉菌共培养合成ε-聚赖氨酸的工艺，其特征在于：
在发酵过程中，当体系葡萄糖浓度低于10g/L时，通过蠕动泵补入600g/L的葡萄糖溶液将发酵液中的浓度维持在5-15g/L；当体系氨氮浓度低于0.5g/L时，外源流加预灭菌的40％(NH4)2SO4以维持氨氮浓度0.5-1.0g/L。
CN202211398323.1A 2022-11-09 2022-11-09 一种链霉菌-霉菌混合发酵合成ε-聚赖氨酸的工艺 Pending CN116287040A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211398323.1A CN116287040A (zh) 2022-11-09 2022-11-09 一种链霉菌-霉菌混合发酵合成ε-聚赖氨酸的工艺

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211398323.1A CN116287040A (zh) 2022-11-09 2022-11-09 一种链霉菌-霉菌混合发酵合成ε-聚赖氨酸的工艺

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116287040A true CN116287040A (zh) 2023-06-23

Family

ID=86785707

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211398323.1A Pending CN116287040A (zh) 2022-11-09 2022-11-09 一种链霉菌-霉菌混合发酵合成ε-聚赖氨酸的工艺

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116287040A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116768971A (zh) * 2023-07-31 2023-09-19 浙江昊清生物科技有限公司 一种微生物发酵生产硫链丝菌素的方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116768971A (zh) * 2023-07-31 2023-09-19 浙江昊清生物科技有限公司 一种微生物发酵生产硫链丝菌素的方法
CN116768971B (zh) * 2023-07-31 2024-05-14 浙江昊清生物科技有限公司 一种微生物发酵生产硫链丝菌素的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109439701B (zh) 生物合成制备麦角硫因的方法和发酵培养基
CN105695543B (zh) 一种生物表面活性素的生产方法
CN112760271B (zh) 一种负压条件下高密度发酵生产丁酸梭菌的工艺及应用
CN104928202A (zh) 一种芽孢杆菌的发酵培养方法
CN101659924A (zh) 一种黑曲霉菌种及其在厌氧发酵制备低聚果糖中的应用
CN1654482A (zh) 一种生产普鲁兰的方法
CN103173507A (zh) 一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺
CN116287040A (zh) 一种链霉菌-霉菌混合发酵合成ε-聚赖氨酸的工艺
CN107557407B (zh) 一种调控裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的方法
CN110734938A (zh) 枯草芽孢杆菌YB18及其在发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用
CN105420127B (zh) 高分子量普鲁兰多糖的高产菌株及利用该菌株生产高分子量普鲁兰多糖的方法
CN102154168A (zh) 一种阿维菌素产生菌及其制备方法
CN107686854B (zh) 利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法
CN110093281B (zh) 桑黄液体深层发酵培养工艺
WO2013155864A1 (zh) 一种利用蛹虫草液体发酵生产虫草酸的方法
CN115466685B (zh) 藤仓镰刀菌及其发酵生产赤霉素a4+7的方法及运用
CN110172407A (zh) 一株产果糖基转移酶的米曲霉及其应用
CN115895974A (zh) 一株富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌及其应用
CN106922386A (zh) 一种蝉花的人工培养方法
CN101736034A (zh) 深层发酵低桔霉素红曲红色素的制备方法
CN108342429A (zh) 一种银耳孢子发酵高产银耳多糖的制备方法
CN114854617A (zh) 高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌及其固态发酵模拟方法
CN114271277A (zh) 一种利云型果聚糖的应用
CN113403206A (zh) 一种小规模化生产富硒荷叶离褶伞菌丝体的方法及应用
CN108203693A (zh) 利用烟草废弃物生产高浓度l-型乳酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination