CN116286394B - 一株产黄青霉、微生物菌剂及其应用 - Google Patents

一株产黄青霉、微生物菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株产黄青霉、微生物菌剂及其应用。本发明提供的产黄青霉通过分泌草酸促进难溶性磷酸盐磷素溶解，提高土壤难溶性磷酸盐的利用率，减少化学磷肥的施用和降低磷矿石消耗；另外，本发明提供的产黄青霉对重金属铅具有优异的耐受和吸附能力，还可以释放大量草酸，通过形成难溶性草酸铅矿物来固定铅，可以修复铅污染，有利于改善生态环境；再者，本发明提供的产黄青霉联合秸秆使用时，可以进一步提高草酸的释放量，固定铅的效果优于单独使用产黄青霉，有利于降低环境中的铅污染，实现秸秆资源的高效利用与回收。

Description

一株产黄青霉、微生物菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株产黄青霉、微生物菌剂及其应用。
背景技术
磷是植物生长生产的必需营养元素之一，土壤中的可溶性磷是植物获取磷素的重要途径。但土壤中的磷大部分以难溶性无机磷酸盐的形式存在，难以被植物所吸收利用。虽然施用化学磷肥可以提高作物产量，但是受制于磷在土壤中的低流动性，施用的磷肥仍有很大一部分被土壤颗粒固定，吸附或沉淀为难溶性磷酸盐。
铅是环境中极为常见的一种重金属污染元素，其特点主要是毒性强，污染潜伏期长，且难以降解等。铅污染不仅会直接危害农作物以及微生物的生长发育，同时可以通过食物链富集的方式，进入到人体和牲畜体内。吸附是一种有效且经济的除铅技术，一些微生物能够通过胞内累积和胞外沉淀等作用固定重金属，且这些微生物还能够通过分泌有机酸促进难溶性磷酸盐中磷素的释放和秸秆的降解。但现有报道的微生物在溶磷和固铅方面的效果并不突出。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一株产黄青霉、微生物菌剂及其应用。本发明提供的产黄青霉(Penicillium Chrysogenum)既可以有效促进难溶性磷酸盐溶解，又可以固定重金属铅，能处理铅浓度为1000mg/L的溶液，对铅的去除率达到97.2％，具有较强的固铅能力，有利于改善生态环境，提高土壤中磷的利用率，减少化肥施用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一株产黄青霉(Penicillium Chrysogenum)，所述产黄青霉保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.23271。
本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括上述技术方案所述的产黄青霉。
优选的，所述微生物菌剂中产黄青霉的孢子浓度为1×107～9×107CFU/mL。
本发明还提供了上述技术方案所述的产黄青霉或上述技术方案所述的微生物菌剂在促进难溶性磷酸盐溶解中的应用。
优选的，所述难溶性磷酸盐包括磷酸铁、磷酸铝和磷酸钙中的一种或多种。
本发明还提供了上述技术方案所述的产黄青霉或上述技术方案所述的微生物菌剂在修复铅污染中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的产黄青霉或上述技术方案所述的微生物菌剂联合秸秆在修复铅污染中的应用。
优选的，所述秸秆包括小麦秸秆和/或玉米秸秆。
本发明还提供了一种修复铅污染的方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述的微生物菌剂施入待修复的区域中；
或者，将上述技术方案所述的微生物菌剂和秸秆施入待修复的区域中。
优选的，所述微生物菌剂和秸秆的质量体积比为0.5～2mL：1～2g。
有益效果：
本发明提供了一株产黄青霉，所述产黄青霉保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.23271。本发明提供的产黄青霉通过分泌草酸促进难溶性磷酸盐磷素溶解，提高土壤难溶性磷酸盐的利用率，减少化学磷肥的施用和降低磷矿石消耗；另外，本发明提供的产黄青霉对重金属铅具有优异的耐受和吸附能力，还可以释放大量草酸，通过形成难溶性草酸铅矿物来固定铅，可以修复铅污染，有利于改善生态环境；再者，本发明提供的产黄青霉联合秸秆使用时，可以进一步提高草酸的释放量，固定铅的效果优于单独使用产黄青霉，有利于降低环境中的铅污染，实现秸秆资源的高效利用与回收。
生物保藏说明
产黄青霉，拉丁名为Penicillium Chrysogenum，于2021年09月30日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23271。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明提供的产黄青霉的菌落图；
图2为本发明提供的产黄青霉的显微镜图像；
图3为本发明提供的产黄青霉的***进化树分析图。
具体实施方式
本发明提供了一株产黄青霉(Penicillium Chrysogenum)，所述产黄青霉保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.23271。
本发明所述产黄青霉的菌落中心呈蓝绿色，边缘有白色菌丝，质地绒状，孢子多，菌落面上呈颗粒状，有同心环纹(见图1)；该菌株分生孢子梗单枝，较长，孢子梗顶端膨大，呈帚状，单个分生孢子为球形或椭圆形(见图2)。
在本发明中，所述产黄青霉的ITS序列优选如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供的产黄青霉可以通过分泌草酸促进难溶性磷酸盐中磷素的溶解，降低环境中铅的生物有效性，有利于改善生态环境，提高土壤中磷的利用率，减少化肥施用。
本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括上述技术方案所述的产黄青霉。
在本发明中，所述微生物菌剂中产黄青霉的孢子浓度优选为1×107～9×107CFU/mL，更优选为1×107CFU/mL。
在本发明中，制备所述微生物菌剂的培养基优选包括PDA培养基；制备所述微生物菌剂的培养温度优选为28～30℃，更优选为30℃。
本发明还提供了上述技术方案所述的产黄青霉或上述技术方案所述的微生物菌剂在促进难溶性磷酸盐溶解中的应用。
在本发明中，所述难溶性磷酸盐优选包括磷酸铁、磷酸铝和磷酸钙中的一种或多种。
本发明还提供了上述技术方案所述的产黄青霉或上述技术方案所述的微生物菌剂在修复铅污染中的应用。本发明提供的产黄青霉对重金属铅具有优异的耐受和吸附能力，还可以释放大量草酸，通过形成难溶性草酸铅矿物来固定铅，可以修复铅污染，降低环境中铅的生物有效性，有利于改善生态环境。本发明所提供的产黄青霉能处理铅浓度为1000mg/L的溶液，对铅的去除率达到97.2％，具有较强的固铅能力。
本发明还提供了上述技术方案所述的产黄青霉或上述技术方案所述的微生物菌剂联合秸秆在修复铅污染中的应用。
在本发明中，所述秸秆优选包括小麦秸秆和/或玉米秸秆，更优选为玉米秸秆。农业废弃物秸秆中含有的纤维素能有效地对重金属离子进行吸附、络合，降低重金属的生物有效性。本发明提供的产黄青霉联合秸秆比单独的产黄青霉和单独的秸秆对铅污染的修复效果更好，且产黄青霉联合玉米秸秆的修复效果优于产黄青霉联合小麦秸秆。
本发明还提供了一种修复铅污染的方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述的微生物菌剂施入待修复的区域中；
或者，将上述技术方案所述的微生物菌剂和秸秆施入待修复的区域中。
在本发明中，所述微生物菌剂和秸秆的体积质量比优选为0.5～2mL：1～2g，更优选为1mL：1g；所述秸秆优选包括小麦秸秆和/或玉米秸秆，更优选为玉米秸秆；所述秸秆的长度优选为1～2cm。
在本发明中，所述待修复的区域优选包括铅污染的土壤或水体。
在水体中，环境修复时微生物菌剂的用量优选为100～200mL的水体接种菌剂0.5～2mL，秸秆的用量优选为100～200mL的水体添加1～2g；土壤的接种量优选为100～200g的风干土壤接种菌剂10～20mL，秸秆接种量为20～40g，即保证土壤中菌的数量优选维持在10的6次方以上，秸秆和土壤的质量比优选维持在1:20以上。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例和附图对本发明提供的一株产黄青霉、微生物菌剂及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)菌株的分离
产黄青霉菌株分离材料来自于安徽农业大学宿州皖北试验站玉米根际，应用PVK固体培养基分离产黄青霉。称取土样10g放入90mL无菌水中，25℃，180rpm摇床振荡30min，取上清液以10-2、10-3、10-4和10-5逐级稀释，各取稀释后的上清液0.1mL涂布于PVK固体培养基上，每个浓度进行3次平行重复实验，28℃培养3～5天，挑取溶磷圈明显的单菌落，划线培养于PDA固体培养基。经过上述筛选，获得一株可降解难溶性磷酸盐的菌株，命名为AH-F-1-1。
PVK固体培养基：葡萄糖10g、磷酸钙5g、氯化钠0.2g、七水合硫酸镁0.25g、七水合硫酸铁0.03g、四水硫酸锰0.03g、氯化钾0.2g、硫酸铵0.5g和琼脂15g，去离子水补足至1000mL。
PDA固体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂20g，去离子水补足至1000mL。
(2)菌株的鉴定
纯化后的AH-F-1-1菌株于28℃条件下在PDA固体培养基上培养，观察菌落形态和显微特征。菌落结构如图1所示，菌落中心呈蓝绿色，边缘有白色菌丝，质地绒状，孢子多，菌落面上呈颗粒状，有同心环纹；显微图像如图2所示，该菌株分生孢子梗单枝，较长，孢子梗顶端膨大，呈帚状，单个分生孢子为球形或椭圆形。在无菌条件下利用真菌DNA提取试剂盒抽提基因组DNA，提取产物利用PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶产物切割回收并纯化后进行测序，所述AH-F-1-1菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所示：5’-AGGG TCTCTGGGTCACCTCCCACCCGTGTTTATTTTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTAACTGGCCGCCGGGGGGCTTACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCCTCGAACTCTGTCTGAAGATTGTAGTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCTCCGATCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCCAAATTTTTATCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA-3’；
PCR扩增引物为ITS1和ITS4；所述ITS1的序列如SEQ ID NO.2所示：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；所述ITS4的序列如SEQ ID NO.3所示：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
PCR扩增体系(25μl)：12.5μl PCR MasterMix、1.0μl ITS1、1.0μl ITS4、2μlDNA片段和8.5μl dH2O。
PCR反应程序：95℃预变性5min；以95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s为一个循环，循环35次；72℃延伸5min，4℃保温30min。
在GenBank数据库中，将AH-F-1-1菌株的ITS序列采用BLAST检索，发现其与产黄青霉同源性较高，选取同源性高于99％的菌株进行***发育树构建，结果显示AH-F-1-1菌株与产黄青霉MK267448.1:24-609聚于同一分支，且遗传距离较近，鉴定为产黄青霉(如图3所示)。
本发明筛选获得的AH-F-1-1菌株鉴定为产黄青霉，分类命名为产黄青霉(Penicillium Chrysogenum)，将菌株于2021年9月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23271。
实施例2
一种微生物菌剂，由以下方法制备得到：
将实施例1筛选的产黄青霉菌株接种到PDA固体培养基中，接种量为一环，30℃恒温培养5天；将形成的孢子收集到装有无菌水的锥形瓶中，并通过三层无菌纱布过滤，得浓度为1×107CFU/mL产黄青霉孢子悬浮液。
应用例1产黄青霉对难溶性磷酸盐中磷素释放能力的作用
摇瓶培养试验：本试验共分为四种处理，PCH、PCH+Fe-P、PCH+Al-P和PCH+Ca-P，每个处理设置3个锥形瓶，分别培养1、3和5天，每个锥形瓶进行3次平行重复实验；具体如下：
PCH：将50mL PDB液体培养基装于150mL锥形瓶中，接种1mL实施例2制备的微生物菌剂，封口后于28℃，180rpm条件下摇床培养；
PCH+Fe-P：将50mL PDB液体培养基装于150mL锥形瓶中，加入0.5g磷酸铁作为初始磷源，接种1mL实施例2制备的微生物菌剂，封口后于28℃，180rpm条件下摇床培养；
PCH+Al-P：与PCH+Fe-P相似，唯一区别在于，初始磷源为磷酸铝；
PCH+Ca-P：与PCH+Fe-P相似，唯一区别在于，初始磷源为磷酸钙；
PDB液体培养基的配方为：马铃薯200g和葡萄糖20g，去离子水补足至1000mL。
采用ICP-OES测定每个处理培养液中的有效磷含量，测定结果见表1。
采用HPLC测定每个处理培养液中草酸含量，测定结果见表2。
表1不同处理组培养液中有效磷含量(mg/L)
注：a，b，c，d表示处理之间的显著差异(p<0.05)
表2不同处理组培养液中草酸含量(mg/L)
注：a，b，c，d表示处理之间的显著差异(p<0.05)
由表1和表2可知，经过1、3、5天的培养后所有处理中的有效磷浓度和草酸含量都呈上升趋势(PCH+Ca-P处理中的草酸与钙离子形成稳定的草酸钙矿物，导致培养液中草酸含量较低)，且Fe-P存在条件下能够显著刺激产黄青霉分泌草酸，产黄青霉能通过分泌草酸有效促进难溶性磷酸盐中磷素释放。
应用例2产黄青霉固铅能力的测定
摇瓶培养试验：在配置好的PDB液体培养基中加入硝酸铅(Pb(NO3)2)，用于模拟现实环境中的铅污染物，设定所用铅浓度为1000mg/L。将100mL PDB液体培养基装于250mL锥形瓶中，接种1mL实施例2制备的微生物菌剂，封口后于28℃，180rpm条件下摇床培养10天，进行三次平行重复实验。采用ICP-OES测定培养液中的铅含量，结果如表3所示。
表3培养液中的铅含量(mg/L)
由表3可知，培养液中铅浓度降低至28.3mg/L，对铅的去除率达到97.2％，结果表明实施例1筛选的产黄青霉具有较强的固铅能力。
应用例3产黄青霉复合秸秆对铅污染修复的能力
摇瓶培养试验：本试验共分为五种处理，PCH+Pb、WST+Pb、MST+Pb、PCH+WST+Pb和PCH+MST+Pb，每个处理设置3个锥形瓶，分别培养2、4和6天，每个锥形瓶进行3次平行重复实验；具体如下：
PCH+Pb：将0.1599g硝酸铅(Pb)添加到装有100mL PDB液体培养基的250mL锥形瓶中(Pb的浓度为1000mg/L)，接种1mL实施例2制备的微生物菌剂，封口后于28℃，180rpm条件下培养；
WST+Pb：将0.1599g硝酸铅添加到装有100mL PDB液体培养基的250mL锥形瓶中，加入1g小麦秸秆，封口后于28℃，180rpm条件下培养；
MST+Pb：将0.1599g硝酸铅添加到装有100mL PDB液体培养基的250mL锥形瓶中，加入1g玉米秸秆，封口后于28℃，180rpm条件下培养；
PCH+WST+Pb：将0.1599g硝酸铅添加到装有100mL PDB液体培养基的250mL锥形瓶中，加入1mL实施例2制备的微生物菌剂和1g小麦秸秆，封口后于28℃，180rpm条件下培养；
PCH+MST+Pb：将0.1599g硝酸铅添加到装有100mL PDB液体培养基的250mL锥形瓶中，加入1mL实施例2制备的微生物菌剂和1g玉米秸秆，封口后于28℃，180rpm条件下培养。
培养结束后用定性滤纸过滤，收集滤液和除去滤液后的产物，将所得产物在65℃下干燥24h。
采用HPLC测定每个处理培养液中草酸含量，测定结果见表4，采用ICP-OES测定每个处理滤液中的铅含量，测定结果见表5。
采用TCLP法浸取沉淀物中铅含量，具体如下：取2g除去滤液后的产物加入40mL提取剂，在28℃下以180rpm的速度振荡18h，静置，取上清液用0.45μm聚醚砜(PES)滤膜过滤后再用ICP-OES测定铅含量，测定结果见表6。
在采用TCLP法提取之前先测定滤液的pH值，根据滤液pH的不同选用不同的提取剂：(1)pH小于5时，选用提取剂1；所述提取剂1由以下方法配制得到：将5.7mL冰醋酸溶入500mL去离子水，再加入浓度为1mol/L的NaOH溶液64.3mL，定容至1L，用1mol/L的HNO3或1mol/L的NaOH调节溶液pH值，保持溶液pH值在4.93±0.05范围；(2)pH大于5时，选用提取剂2；所述提取剂2由以下方法配制得到：将5.7mL冰醋酸溶入去离子水中，定容至1L，用1mol/L的HNO3或1mol/L的NaOH调节溶液pH值，保持溶液pH值在2.88±0.05范围。
表4产黄青霉复合秸秆对培养液中草酸浓度的影响(mg/L)
注：a，b，c，d，e表示处理之间的显著差异(p<0.05)。
表5产黄青霉复合秸秆对培养液中铅浓度的影响(mg/L)
注：a，b，c，d，e表示处理之间的显著差异(p<0.05)。
表6产黄青霉复合秸秆对培养后的产物中有效铅含量的影响(mg/L)
注：a，b，c，d，e表示处理之间的显著差异(p<0.05)。
由表4～6可知，产黄青霉复合秸秆可有效促进草酸的释放，产黄青霉复合秸秆比单独的产黄青霉和单独的秸秆更能促降低培养液中铅浓度及培养后的产物中有效铅含量(秸秆具有一定的吸附性，能够快速的吸附溶液中的铅，但是缺点是吸附量有限，而且吸附的铅容易再次释放出来，不稳定，故表5中单用秸秆中培养液的铅浓度呈现先降低后升高的趋势)，产黄青霉复合秸秆对铅污染的修复效果更好，且产黄青霉复合玉米秸秆的修复效果优于产黄青霉复合小麦秸秆。
综上所述，本发明提供的产黄青霉能促进难溶性磷酸盐中磷素的溶解，对重金属铅离子具有较强的固定能力，在提高土壤中磷的利用率，减少化肥施用，改善生态环境中起着重要作用。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一株产黄青霉（Penicillium Chrysogenum），其特征在于，所述产黄青霉保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.23271。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括权利要求1所述的产黄青霉。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中产黄青霉的孢子浓度为1×107~9×107CFU/mL。
4.权利要求1所述的产黄青霉或权利要求2或3所述的微生物菌剂在促进难溶性磷酸盐溶解中的应用；所述难溶性磷酸盐为磷酸铁、磷酸铝和磷酸钙中的一种或多种。
5.权利要求1所述的产黄青霉或权利要求2或3所述的微生物菌剂在修复铅污染中的应用。
6.权利要求1所述的产黄青霉联合秸秆或权利要求2或3所述的微生物菌剂联合秸秆在修复铅污染中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述秸秆为小麦秸秆和/或玉米秸秆。
8.一种修复铅污染的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求2或3所述的微生物菌剂施入待修复的区域中；
或者，将权利要求2或3所述的微生物菌剂和秸秆施入待修复的区域中。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述微生物菌剂和秸秆的体积质量比为0.5~2mL：1~2g。
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