CN116270739A - 细胞结构体在制造溶酶体贮积病处置剂中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供细胞结构体在制造溶酶体贮积病处置剂中的用途，所述细胞结构体包含多个生物相容性高分子嵌段物和至少1种多个细胞，且在多个上述细胞的间隙至少配置有1个上述高分子嵌段物。

Description

细胞结构体在制造溶酶体贮积病处置剂中的用途
本申请是申请日为2018年6月29日、优先权日为2017年6月30日、中国专利申请号为201880044009.9、发明名称为“溶酶体贮积病处置剂”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种包含在多个细胞的间隙配置有多个高分子嵌段物的细胞结构体的溶酶体贮积病处置剂。
背景技术
溶酶体贮积病为因如下原因而发病的疾病的统称，该原因为：由于因基因异常而位于溶酶体中的1个以上的酶缺乏活性，因此未分解的物质贮积于细胞内胞器即溶酶体内、或者因位于溶酶体中的的膜蛋白的功能障碍而物质贮积于溶酶体内。关于溶酶体贮积病，分别根据具有异常的酶或基因分类为多种，且为存在60种以上的疑难杂症。
通常，对于溶酶体贮积病，进行从体外人工补充酶的酶补充疗法。例如进行针对法布里病(Fabry病)(瀰漫性躯体血管角化瘤)的酶补充疗法，但是酶制剂的体内滞留时间明显较短，因此必须以2周1次的频率终生持续注射酶制剂，对于患者来说负担较大且QOL(生活品质：Quality of Life)较低。并且，也有不存在酶制剂的溶酶体贮积病，在该情况下没有有效的治疗方法。
并且，还研发了如下技术：将过度表达溶酶体贮积病的治疗中所需的酶的基因的细胞用于治疗中。例如，在专利文献1中，记载有α-半乳糖苷酶A缺乏症治疗用细胞，过度表达人α-galA，并且以分泌的方式经遗传修饰的人细胞。并且，在专利文献2中记载有：将未进行基因转移的多能成体祖细胞(MAPC)等干细胞用于溶酶体贮积病。
另一方面，在专利文献3中记载有细胞结构体，该细胞结构体包含具有生物相容性的高分子嵌段物和细胞，且在多个上述细胞之间的间隙配置有多个上述高分子嵌段物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4313381号公报
专利文献2：美国专利第7,927,587号公报
专利文献3：国际公开WO2011/108517号
发明内容
发明要解决的技术课题
从针对生物的有害性及危险性的观点考虑，也不提倡使用如专利文献1中所记载那样的过度表达基因的细胞。并且，在如专利文献2中所记载那样的单独使用多能成体祖细胞(MAPC)等干细胞的情况中，其效果不会持续而无法用于治疗中。本发明应解决的课题为提供一种优异的溶酶体贮积病处置剂。
用于解决技术课题的手段
为了解决上述问题，本发明人进行深入研究，其结果发现了包含生物相容性高分子嵌段物和细胞，且在多个细胞的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体为有利于处置溶酶体贮积病，从而完成了本发明。
即，根据本发明，提供以下发明。
＜1＞一种溶酶体贮积病处置剂，其包含细胞结构体，该细胞结构体包含多个生物相容性高分子嵌段物和至少1种多个细胞，且在多个上述细胞的间隙至少配置有1个上述高分子嵌段物。
＜2＞如＜1＞所述的处置剂，其中，
上述细胞至少包含间充质干细胞或成纤维细胞。
＜3＞如＜1＞或＜2＞所述的处置剂，其中，
上述细胞结构体的每一个细胞包含0.0000001μg以上且1μg以下的生物相容性高分子嵌段物。
＜4＞如＜1＞至＜3＞中任一项所述的处置剂，其中，
1个上述生物相容性高分子嵌段物的大小为10μm以上且300μm以下。
＜5＞如＜1＞至＜4＞中任一项所述的处置剂，其中，
上述细胞结构体的厚度或直径为100μm以上且3cm以下。
＜6＞如＜1＞至＜5＞中任一项所述的处置剂，其中，
上述生物相容性高分子嵌段物由重组肽组成。
＜7＞如＜6＞所述的处置剂，其中，
上述重组肽由下述式表示。
式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数。另外，n个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。
＜8＞如＜6＞或＜7＞所述的处置剂，其中，
上述重组肽为如下肽中的任一种：
由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
由在序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或加成一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
＜9＞如＜1＞至＜8＞中任一项中所记载的处置剂，其中，
上述生物相容性高分子嵌段物中，上述生物相容性高分子通过热、紫外线或酶进行交联。
＜10＞如＜1＞至＜9＞中任一项所述的处置剂，其中，
上述生物相容性高分子嵌段物处于通过对生物相容性高分子的多孔体进行粉碎而获得的颗粒的形态。
＜11＞如＜1＞至＜10＞中任一项所述的处置剂，其中，
溶酶体贮积病为法布里病。
＜12＞如＜11＞所述的处置剂，其中，
通过在生物体内分泌α-半乳糖苷酶A来降低生物体内的神经酰胺三己糖苷(Globotriaosylsphingosine)。
根据本发明，还提供以下发明。
(A)一种溶酶体贮积病的处置方法，该方法包含将细胞结构体移植到需要处置溶酶体贮积病的对象的工序，该细胞结构体包含多个生物相容性高分子嵌段物和至少1种多个细胞，且在多个上述细胞的间隙至少配置有1个上述高分子嵌段物。
(B)一种用于处置溶酶体贮积病的细胞结构体，该细胞结构体包含多个生物相容性高分子嵌段物及至少1种多个细胞，且在多个上述细胞的间隙配置有至少1个上述高分子嵌段物。
(C)一种用于制造溶酶体贮积病处置剂的细胞结构体的应用，该细胞结构体包含多个生物相容性高分子嵌段物和至少1种多个细胞，且在多个上述细胞的间隙至少配置有1个上述高分子嵌段物。
发明效果
本发明的处置剂适用于溶酶体贮积病处置剂。
附图说明
图1表示条件A中所记载的实验的液温剖析。
图2表示条件B中所记载的实验的液温剖析。
图3表示条件C中所记载的实验的液温剖析。
图4表示源自人骨髓的间充质干细胞(hBMSC)中的溶酶体贮积病相关酶的表达量。
图5表示源自人骨髓的间充质干细胞(hBMSC)中的溶酶体贮积病相关酶的表达量。
图6表示源自人骨髓的间充质干细胞(hBMSC)、源自人脂肪的干细胞(hADSC)及源自人牙髓的干细胞(hDPSC)中的溶酶体贮积病相关酶的表达量。关于NEU1、CTSA、GLB1及HEXA，未研发酶制剂，并且相当于患者数较多中的前6种。IDS为患者数最多中的1种。
图7表示源自人骨髓的间充质干细胞(hBMSC)、源自人脂肪的干细胞(hADSC)及源自人牙髓的干细胞(hDPSC)中的溶酶体贮积病相关酶的表达量。关于PPTI和GNPTAB，未研发酶制剂，并且相当于患者数较多中的前6种。
图8表示对从细胞或细胞结构体分泌出的αGalA酶量进行测定的结果。
图9表示确定由各种给药路径注射细胞结构体之后经4周后的肝脏中的神经酰胺三己糖苷(LysoGb3)量的结果。
图10表示确定由各种给药路径注射细胞结构体之后经4周后的肾脏中的LysoGb3量的结果。
图11表示确定由各种给药路径注射细胞结构体之后经4周后的心脏中的LysoGb3量的结果。
图12表示确定将细胞或细胞结构体注射于门静脉内或尾静脉内之后经4周后的肝脏中的LysoGb3量的结果。
图13表示确定将细胞结构体移植到肾包膜下之后经4周后的肝脏中的LysoGb3量的试验的流程。
图14表示确定将细胞结构体移植到肾包膜下之后经4周后的肝脏中的LysoGb3量的结果。
图15表示将细胞结构体移植到肾包膜下之后经4周后的肾包膜下的细胞结构体的苏木素·伊红(HE)染色图像。
具体实施方式
以下，对用于实施本发明的方式进行详细说明。
本说明书中，有时将本发明中所使用的细胞结构体还称为镶嵌细胞块(呈镶嵌状的细胞块)。并且，本说明书中，“～”表示将其前后中所记载的数值分别作为最小值及最大值而包含的范围。
本发明涉及一种溶酶体贮积病处置剂，其包含细胞结构体，该细胞结构体包含多个生物相容性高分子嵌段物和至少1种多个细胞，且在多个上述细胞的间隙至少配置有1个上述高分子嵌段物。根据本发明的溶酶体贮积病处置剂，能够持续维持处置效果。
如后述实施例所示可知：与未注射细胞结构体的群组及仅注射了细胞的群组相比，对法布里病小鼠注射了细胞结构体的群组中，肝脏中的LysoGb3明显减少。根据实施例所示的结果明确可知：在注射了细胞来作为细胞结构体的情况下，对法布里病小鼠显示出高效性，这是完全出乎意料的效果。
(1)生物相容性高分子嵌段物
(1-1)生物相容性高分子
生物相容性是指，与生物接触时不会引起如长期且慢性炎症反应等的明显的不良反应。关于本发明中所使用的生物相容性高分子，只要对生物具有相容性，则对于是否在生物内被降解并无特别限定，优选为生物可降解高分子。作为非生物可降解材料，具体而言，可举出聚四氟乙烯(PTFE)、聚氨酯、聚丙烯、聚酯、氯乙烯、聚碳酸酯、丙烯酸、不锈钢、钛、硅酮及MPC(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)等。作为生物可降解材料，具体而言，可举出源自天然的肽、重组肽或化学合成肽等聚肽(例如，以下进行说明的明胶等)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸·乙醇酸共聚物(PLGA)、玻尿酸、醣胺聚醣、蛋白多糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素及壳聚糖等。上述中，尤其优选为重组肽。对该些生物相容性高分子，可以对提高细胞粘附性进行研究。具体而言，能够使用“基于对基材表面的细胞粘附基质(纤连蛋白、玻璃粘连蛋白、层连结蛋白)、细胞粘附序列(由氨基酸单字母标记表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列)肽进行的包覆”，“基材表面的胺基化、阳离子化”或“基材表面的等离子体处理、基于电晕放电的亲水处理”等方法。
关于包含重组肽或化学合成肽的聚肽的种类，只要为具有生物相容性的聚肽，则并无特别限定，例如优选为明胶、胶原蛋白、去端肽胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、Pronectin、层连蛋白、腱生蛋白、纤维蛋白、丝蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、RetroNectin(注册商标)，最优选为明胶、胶原蛋白、去端肽胶原。作为用于本发明中的明胶，优选为天然明胶、重组明胶或化学合成明胶，进一步优选为重组明胶。在此所述的天然明胶是指，由源自天然的胶原蛋白制成的明胶。
化学合成肽或化学合成明胶是指，经人工合成的肽或明胶。关于明胶等肽的合成，可以为固相合成，也可以为液相合成，但优选为固相合成。对于本领域技术人员来说肽的固相合成是公知的，例如可举出使用Fmoc基团(芴基-甲氧基-羰基：Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基团)来作为胺基的保护的Fmoc基团合成法、以及使用Boc基团(叔丁氧羰基：tert-Butyl Oxy Carbonyl基团)来作为胺基的保护的Boc基团合成法等。另外，化学合成明胶的优选方式能够应用在本说明书中后述的重组明胶中所记载的内容。
本发明中所使用的生物相容性高分子的亲水性值“1/IOB”值优选为0至1.0。更优选为0至0.6，进一步优选为0至0.4。IOB是指，基于由藤田淳提出的表示有机化合物的极性/非极性的有机概念图的、亲疏水性的指标，关于其详细内容，例如在“"PharmaceuticalBulletin”，vol.2，2，pp.163-173(1954)、“化学的领域”vol.11，10，pp.719-725(1957)、“Fragrance Journal”，vol.50，pp.79-82(1981)等中进行了说明。简单而言，将所有的有机化合物的来源设为甲烷(CH4)，且将其他化合物均视作甲烷的衍生物，对其碳数、取代基、转换部、环等分别设定一定的数值，并相加其分数来求出有机性值(OV)、无机性值(IV)，将该值绘制在将有机性值作为X轴且将无机性值作为Y轴的图上。有机概念图中的IOB是指，有机概念图中的无机性值(IV)与有机性值(OV)的比，即“无机性值(IV)/有机性值(OV)”。关于有机概念图的详细内容，可参考“新版有机概念图-基础和应用-”(甲田善生等著，SANKYOSHUPPANCo.,Ltd，2008)。本说明书中，由取IOB的倒数而得的“1/IOB”值表示亲疏水性。其表示“1/IOB”值越小(接近0)，越亲水性的标记。
通过将本发明中所使用的高分子的“1/IOB”值设在上述范围，亲水性变高，并且吸水性变高，因此有效地作用于保持营养成分，作为结果，推断为有助于本发明的细胞结构体(镶嵌细胞块)中的细胞的稳定化/生存力。
当本发明中所使用的生物相容性高分子为多肽时，由总平均亲水性(Grandaverage of hydropathicity(GRAVY))值表示的亲疏水性指标中，优选为0.3以下且-9.0以上，进一步优选为0.0以下且-7.0以上。亲水性平均(GRAVY)值能够通过“Gasteiger E.,Hoogland C.,Gattiker A.,Duvaud S.,Wilkins M.R.,Appel R.D.,Bairoch A.；ProteinIdentification and Analysis Tools on the ExPASy Server；(In)John M.Walker(ed)：The Proteomics Protocols Handbook，Humana Press(2005).pp.571-607”及“GasteigerE.,Gattiker A.,Hoogland C.,Ivanyi I.,Appel R.D.,Bairoch A.；ExPASy：theproteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.；Nucleic AcidsRes.31：3784-3788(2003).”的方法来获得。
根据将本发明中所使用的高分子的GRAVY值设在上述范围，亲水性变高，并且吸水性变高，因此有效地对营养成分的保持起作用，其结果，推定有助于本发明所涉及的细胞结构体(镶嵌细胞块)中的细胞的稳定化、易生存性。
(1-2)交联
本发明中所使用的生物相容性高分子可以被交联，也可以不被交联，但优选被交联。通过使用被交联的生物相容性高分子，能够得到防止在培养基中培养时及移植到生物时瞬间降解的效果。作为通常的交联方法，已知有热交联、基于醛类(例如，甲醛、戊二醛等)的交联、基于缩合剂(碳二亚胺、氰胺等)的交联、酶交联、光交联、紫外线交联、疏水性相互作用、氢键及离子性相互作用等，本发明中也能够使用上述交联方法。作为本发明中所使用的交联方法，进一步优选为热交联、紫外线交联或酶交联，尤其优选为热交联。
当进行基于酶的交联时，作为酶，只要具有高分子材料之间的交联作用，则并无特别限制，能够优选使用谷氨酰胺转氨酶或漆酶，最优选使用谷氨酰胺转氨酶来进行交联。作为用谷氨酰胺转氨酶进行酶交联的蛋白质的具体例，只要为具有赖氨酸残基及谷氨酰胺残基的蛋白质，则并无特别限制。谷氨酰胺转氨酶可以是源自哺乳类的谷氨酰胺转氨酶，也可以是源自微生物的谷氨酰胺转氨酶，具体而言，可列举AJINOMOTO CO.，INC.制ACTIVA系列、作为试剂而出售的源自哺乳类的谷氨酰胺转氨酶、例如，Oriental Yeast Co.，ltd.制、Upstate USA Inc.制、Biodesign International制等源自豚鼠肝脏的谷氨酰胺转氨酶、源自山羊的谷氨酰胺转氨酶、源自兔子的谷氨酰胺转氨酶等及源自人的凝血因子(FactorXIIIa，Haematologic Technologies，Inc.)等。
关于进行交联(例如，热交联)时的反应温度，只要能够进行交联，则并无特别限定，优选为-100℃～500℃，更优选为0℃～300℃，进一步优选为50℃～300℃，尤其优选为100℃～250℃，最优选为120℃～200℃。
(1-3)重组明胶
本发明中所述的重组明胶是指，通过基因重组技术制成的类似明胶的具有氨基酸序列的多肽或蛋白样物质。本发明中能够使用的重组明胶优选具有胶原中特征性的由Gly-X-Y表示的序列(X及Y分别独立地表示氨基酸中的任一种)的重复。其中，多个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。优选在一分子中含有两个序列以上且的细胞粘附信号。作为本发明中所使用的重组明胶，能够使用具有来源于胶原的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶。例如，能够使用EP1014176、美国专利6992172号、国际公开WO2004/085473、国际公开WO2008/103041等中所记载的重组明胶，但并不限定于这些。作为本发明中所使用的重组明胶而优选的重组明胶为以下方式的重组明胶。
重组明胶因天然明胶原有的性能而生物相容性优异，并且因非天然来源而不存在牛海绵状脑病(BSE)等忧患，从而非感染性优异。并且，与天然明胶相比，重组明胶均匀，且序列已确定，因此在强度及降解性方面也能够通过交联等而模糊较少且精密设计。
关于重组明胶的分子量，并无特别限定，优选为2000以上且100000以下(2kDa(千道尔顿)以上且100kDa以下)，更优选为2500以上且95000以下(2.5kDa以上且95kDa以下)，进一步优选为5000以上且90000以下(5kDa以上且90kDa以下)，最优选为10000以上且90000以下(10kDa以上且90kDa以下)。
重组明胶优选具有胶原中特征性的由Gly-X-Y表示的序列的重复。其中，多个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸，X及Y表示任意氨基酸(优选为除甘氨酸以外的任意氨基酸)。胶原中特征性的由Gly-X-Y表示的序列为明胶-胶原的氨基酸组成及序列中的与其他蛋白质相比非常特殊的部分结构。在该部分，甘氨酸占整体的约3分之1，在氨基酸序列三个中一个为重复。甘氨酸为最简单的氨基酸，对分子链的配置的束缚也较少，且在凝胶化时大大有助于螺旋结构的再生。由X及Y表示的氨基酸含有较多的亚氨基酸(脯氨酸、氧脯氨酸)，优选占整体的10％～45％。优选重组明胶的序列的80％以上且，更优选95％以上且，最优选99％以上且的氨基酸为Gly-X-Y的重复结构。
通常的明胶中，极性氨基酸中的带电荷的氨基酸与无电荷的氨基酸以1:1存在。在此，极性氨基酸具体指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及精氨酸，其中极性无电荷氨基酸是指半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸。本发明中所使用的重组明胶中，所构成的所有的氨基酸中的极性氨基酸的比例为10～40％，优选为20～30％。并且，优选上述极性氨基酸中的无电荷氨基酸的比例为5％以上且小于20％，优选为5％以上且小于10％。优选在序列上不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸中的任一个氨基酸，优选不包含2以上的氨基酸。
通常多肽中，已知作为细胞粘附信号而作动的最小氨基酸序列(例如，NagaiShoten Co.，Ltd.出版发行的“病态生理”Vol.9、No.7(1990年)527页)。本发明中所使用的重组明胶优选在一分子中具有两个以上且的这些细胞粘附信号。作为具体的序列，从所粘附的细胞的种类较多的方面考虑，优选以氨基酸单字母符号表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列的序列。进一步优选为RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列及HAV序列，尤其优选为RGD序列。RGD序列中，优选为ERGD序列。通过使用具有细胞粘附信号的重组明胶，能够提高细胞的基质产生量。
作为本发明中使用的重组明胶中的RGD序列的配置，优选RGD之间的氨基酸数在0～100之间而不均匀，更优选RGD之间的氨基酸数在25～60之间而不均匀。
从细胞粘附性、生长性的观点考虑，该最小氨基酸序列的含量在蛋白质1分子中优选为3～50个，进一步优选为4～30个，尤其优选为5～20个，最优选为12个。
本发明中所使用的重组明胶中，优选RGD基序相对于氨基酸总数的比例至少为0.4％。当重组明胶包含350以上且的氨基酸时，优选350个氨基酸的各段至少包含一个RGD基序。RGD基序相对于氨基酸总数的比例更优选至少为0.6％，进一步优选至少为0.8％，进一步更优选至少为1.0％，尤其优选至少为1.2％，最优选至少为1.5％。重组肽内的RGD基序的数量在每250个氨基酸中优选至少为4个，更优选为至少6个，进一步优选为至少8个，尤其优选为12个以上且16个以下。RGD基序的0.4％这一比例对应于在每250个氨基酸中有至少一个RGD序列。RGD基序的数量为整数，因此为了满足0.4％的特征，由251个氨基酸组成的明胶应至少包含两个RGD序列。优选本发明的重组明胶在每250个氨基酸中至少包含两个RGD序列，更优选在每250个氨基酸中至少包含3个RGD序列，进一步优选在每250个氨基酸中至少包含4个RGD序列。作为本发明的重组明胶的另一方式，优选为至少包含4个RGD基序，更优选为至少包含6个RGD基序，进一步优选为至少包含8个RGD基序，尤其优选为包含12个以上且16个以下的RGD基序。
重组明胶可以部分水解。
优选为，本发明中所使用的重组明胶由式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B表示。n个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种。m优选为表示2～10的整数，更优选为表示3～5的整数。n优选为3～100的整数，进一步优选为15～70的整数，最优选为50～65的整数。A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列。另外，n个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。
更优选为，本发明中所使用的重组明胶表示由Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly(式中，63个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，63个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种。另外，63个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。)表示。
优选重复单元与多个天然存在的胶原的序列单元键合。在此所述的天然存在的胶原是指，若天然存在则可以为任一个，但优选为I型、II型、III型、IV型或V型胶原。更优选为I型、II型或III型胶原。根据另一方式，上述胶原的来源优选为人、牛、猪、小鼠或大鼠，更优选为人。
本发明中所使用的重组明胶的等电点优选为5～10，更优选为6～10，进一步优选为7～9.5。关于重组明胶的等电点的测定，如等电聚焦法(参考Maxey，C.R.(1976)；Phitogr.Gelatin2，Editor Cox，P.J.Academic，London，Engl.)中所记载那样，能够通过对将1质量％明胶溶液通入阳离子及阴离子交换树脂的混晶柱之后的pH进行测定来实施。
优选重组明胶没有被脱氨化。
优选重组明胶不具有端肽。
优选重组明胶为由对氨基酸序列进行编码的核酸制备的实质上的纯多肽。
作为本发明中所使用的重组明胶，尤其优选以下肽中的任一个，
(1)由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
(2)由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或加成一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
(3)由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上(进一步优选为90％以上,尤其优选为95％以上,最优选为98％以上)的序列同源性的氨基酸序列组成,并且具有生物相容性的肽。
本发明中的序列同源性是指通过以下式计算的值。
％序列同源性＝[(相同的残基数)/(对准长度)]×100
本领域技术人员能够通过公知的任意方法来确定2个氨基酸序列中的序列同源性，且能够使用BLAST((Basic Local Alignment Search Tool：本地序列基本搜索工具))程序(J.Mol.Biol.215：403-410,1990)等来确定。
“缺失、取代或加成一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列”中的“一个或多个”是指，优选1～20个，更优选1～10个，进一步优选1～5个，尤其优选1～3个。
关于本发明中所使用的重组明胶，本领域技术人员能够通过公知的基因重组技术而制造，例如能够依照EP1014176A2号公报、美国专利第6992172号公报、国际公开WO2004/085473号、国际公开WO2008/103041号等中所记载的方法来制造。具体而言，获取对规定的重组明胶的氨基酸序列进行编码的基因，将其编入表达载体来制作重组表达载体，并将其导入到适当的宿主来制作形成转化体。通过使用适当的培养基对所得到的转化体进行培养而产生重组明胶，因此能够通过回收从培养物产生的重组明胶来制备本发明中所使用的重组明胶。
(1-4)生物相容性高分子嵌段物
本发明中，使用由上述生物相容性高分子组成的嵌段物(块)。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的形状并无特别限定。例如，为无规则形、球状、粒状(颗粒)、粉状、多孔状、纤维状、纺锤状、扁平状及片状，优选无规则形、球状、粒状(颗粒)、粉状及多孔状。无规则形表示表面形状不均匀的形状，例如表示如岩石那样的具有凹凸的物体。另外，上述形状的例示并不是分别独立的，例如有时还作为粒状(颗粒)的下位概念的一例而成为无规则形。
如上所述，本发明中的生物相容性高分子嵌段物的形状并无特别限定，但是振实密度优选为10mg/cm3以上且500mg/cm3以下，更优选为20mg/cm3以上且400mg/cm3以下，进一步优选为40mg/cm3以上且220mg/cm3以下，尤其优选为50mg/cm3以上且150mg/cm3以下。
振实密度为表示能够向某一体积紧密地填充多少嵌段物的值，值越小，则越无法紧密地填充，即可知嵌段物的结构复杂。认为生物相容性高分子嵌段物的振实密度表示生物相容性高分子嵌段物的表面结构的复杂性及作为聚集体而聚集生物相容性高分子嵌段物时形成的空隙的量。振实密度越小，生物相容性高分子嵌段物之间的空隙越大，细胞的移植区域越大。并且，认为由于不会过小而能够在细胞彼此之间适当地存在生物相容性高分子嵌段物，且作为细胞结构体时能够向相同结构体内部传递营养成分，因此优选抑制在上述范围内。
本说明书中所述的振实密度并无特别限定，能够如下测定。为了测定，准备(直径6mm、长度21.8mm的圆筒状：容量0.616cm3)的容器(以下，记载为帽(cap))。首先，仅测定帽的质量。然后，将帽装在漏斗上，并使嵌段物从漏斗流入而使其积蓄在帽中。添加充分量的嵌段物之后，将帽部分在桌子等较硬的部位敲击200次并卸下漏斗，并用刮刀刮平。在刮平并装满该帽的状态下测定质量。通过从与仅帽的质量之差计算仅嵌段物的质量，并除以帽的体积而能够求出振实密度。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的交联度并无特别限定，优选为2以上，进一步优选为2以上且30以下，进一步优选为4以上且25以下，尤其优选为4以上且22以下。
生物相容性高分子嵌段物的交联度(每一分子的交联数)的测定方法并无特别限定，在生物相容性高分子为CBE3的情况下，例如能够通过后述实施例中所记载的TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)法来进行测定。具体而言，分别制备将生物相容性高分子嵌段物、NaHCO3水溶液及TNBS水溶液进行混合并在37℃下使其反应3小时之后停止反应而得到的样品、及将生物相容性高分子嵌段物、NaHCO3水溶液及TNBS水溶液进行混合，紧接着使反应停止的空白培养基，并测定用纯水进行稀释的样品及空白培养基的吸光度(345nm)，从而能够根据下述(式2)及(式3)计算交联度(每一分子的交联数)。
(式2)(As-Ab)/14600×V/w
(式2)表示每1g生物相容性高分子嵌段物的赖氨酸量(摩尔当量)。
(式中，As表示样品吸光度，Ab表示空白培养基吸光度，V表示反应液量(g)，w表示生物相容性高分子嵌段物质量(mg)。)
(式3)1-(样品(式2)/未交联的高分子(式2))×34
(式3)表示每一分子的交联数。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的吸水率并无特别限定，优选为300％以上，更优选为400％以上，进一步优选为500％以上，尤其优选为600％以上，最优选为700％以上。另外，吸水率的上限并无特别限定，通常为4000％以下，或2000％以下。
生物相容性高分子嵌段物的吸水率的测定方法并无特别限定，例如能够通过后述实施例中所记载的方法进行测定。具体而言，在25℃下于3cm×3cm的尼龙网孔制的袋中，填充约15mg的生物相容性高分子嵌段物，并使其在离子交换水中膨润两小时之后，风干10分钟，在每一阶段测定质量，从而能够根据(式4)来求出吸水率。
(式4)
吸水率＝(w2-w1-w0)/w0
(式中，w0表示吸水前的材料的质量，w1表示吸水后的空袋子的质量，w2表示吸水后的包含材料的袋子整体的质量。)
本发明中的一个生物相容性高分子嵌段物的大小并无特别限定，优选为20μm以上且200μm以下，更优选为20μm以上且150μm以下，进一步优选为50μm以上且120μm以下，尤其优选为53μm以上且106μm以下。
通过将一个生物相容性高分子嵌段物的大小设定在上述范围内，能够良好地从外部向细胞结构体的内部传递营养。另外，一个生物相容性高分子嵌段物的大小并不是指多个生物相容性高分子嵌段物的大小的平均值在上述范围内，而是指对多个生物相容性高分子嵌段物进行过筛而得到的每一个生物相容性高分子嵌段物的尺寸。
一个嵌段物的大小能够由对嵌段物进行区分时所使用的筛子的大小来定义。例如，能够使将用180μm的筛子进行过筛，并用106μm的筛子对所通过的嵌段物进行过筛时残留于筛子上的嵌段物成为106～180μm大小的嵌段物。接着，能够使将用106μm的筛子进行过筛，并用53μm的筛子对所通过的嵌段物进行过筛时残留于筛子上的嵌段物成为53～106μm大小的嵌段物。接着，能够使将用53μm的筛子进行过筛，并用25μm的筛子对所通过的嵌段物进行过筛时残留于筛子上的嵌段物成为25～53μm大小的嵌段物。
(1-5)生物相容性高分子嵌段物的制造方法
生物相容性高分子嵌段物的制造方法并无特别限定，例如使用粉碎机(新动力磨机(New Power Mill)等)对含有生物相容性高分子的固态物质(生物相容性高分子的多孔体等)进行粉碎，由此能够得到生物相容性高分子嵌段物。含有生物相容性高分子的固态物质(多孔体等)例如能够通过对含有生物相容性高分子的水溶液进行冻干来获得。
如上所述，通过对含有生物相容性高分子的固体物质进行粉碎，能够制造表面形状不均匀的无规则形的生物相容性高分子嵌段物。
作为制造生物相容性高分子的多孔体的方法，并无特别限定，还能够通过冻干包含生物相容性高分子的水溶液而得到。例如，通过包括在溶液内液温最高的部分的液温(内部最高液温)在未冷冻状态下成为“溶剂熔点-3℃”以下的冷冻工序，所形成的冰能够成为球状。经过该工序之后，冰被干燥，由此可得到具有球状的各向同性的空孔(球孔)的多孔体。不包括在未冷冻的状态下，溶液内液温最高的部分的液温(内部最高液温)成为“溶剂融点-3℃”以上且的冷冻工序而冷冻，由此所形成的冰能够成为柱/平板状。经过该工序之后，若冰被干燥，则可得到在单轴或双轴上较长且具有柱状或平板状空孔(柱/平板孔)的多孔体。当将生物相容性高分子的多孔体进行粉碎而制造生物相容性高分子嵌段物时，粉碎之前的多孔体的空孔会影响所得到的生物相容性高分子嵌段物的形状，因此如上所述，能够通过调整冻干的条件来调整所得到的生物相容性高分子嵌段物的形状。
作为生物相容性高分子的多孔体的制造方法的一例，可举出如下方法，但是并不限定于上述方法，该方法包含：
工序(a)，在溶液内液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下，并且在溶液内液温最高的部分的温度为溶剂的熔点以下，将生物相容性高分子的溶液冷却至未冷冻状态；
工序(b)，对在工序(a)中所得到的生物相容性高分子的溶液进行冷冻；及
工序(c)，对在工序(b)中所得到的已冷冻的生物相容性高分子进行冻干。
将生物相容性高分子的溶液冷却至未冷冻状态时，液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下(优选2.3℃以下，更优选2.1℃以下)，即通过减小温度差，所得到的多孔质孔的大小偏差得以减少。另外，液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差的下限并无特别限定，只要是0℃以上且即可，例如可以是0.1℃以上且、0.5℃以上且、0.8℃以上且或0.9℃以上且。由此，使用了用所制造的多孔体而制造的生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体可实现表示高细胞数这一效果。
关于工序(a)的冷却，例如优选经由导热率比水低的原材料(优选特氟龙(注册商标))进行冷却，能够将在溶液内液温最高的部分假设为最远离冷却侧的部分，且能够将在溶液内液温最低的部分假设为冷却面的液温。
优选在工序(a)中，在即将产生凝固热之前的、在溶液内液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下，更优选为2.3℃以下，进一步优选为2.1℃以下。其中，“即将产生凝固热之前的温度差”是指，产生凝固热时的1秒钟前～10秒钟前之间温度差变最大时的温度差。
优选在工序(a)中，在溶液内液温最低的部分的温度为溶剂熔点-5℃以下，更优选为溶剂熔点-5℃以下且溶剂熔点-20℃以上且，进一步优选溶剂熔点-6℃以下且溶剂熔点-16℃以上且。另外，溶剂熔点的溶剂为生物相容性高分子的溶液的溶剂。
在工序(b)中，对在工序(a)得到的生物相容性高分子的溶液进行冷冻。在工序(b)用于冷冻的冷却温度并无特别限制，还取决于进行冷却的机器，但优选为比在溶液内液温最低的部分的温度低3℃～30℃的温度，更优选为低5℃～25℃的温度，进一步优选为低10℃～20℃的温度。
在工序(c)中，对在工序(b)得到的已冷冻的生物相容性高分子进行冻干。冻干能够通过常规方法进行，例如能够通过在比溶剂的熔点低的温度下进行真空干燥，进而在室温(20℃)下进行真空干燥来进行冻干。
本发明中优选能够通过对在上述工序(c)中得到的多孔体进行粉碎而制造生物相容性高分子嵌段物。
(2)细胞
关于本发明中所使用的细胞，其种类并无特别限定，能够优选地使用作为本发明的目的的具有处置溶酶体贮积病的功能的细胞，并能够根据实际治疗目的而使用任意的细胞。并且，所使用的细胞可以是1种，也可以组合使用多种细胞。作为所使用的细胞，优选为动物细胞，更优选为源自脊椎动物的细胞，尤其优选为源自人的细胞。源自脊椎动物的细胞(尤其，源自人的细胞)的种类可以为多能细胞、成体干细胞、前体细胞或成熟细胞中的任一个，尤其优选为成体干细胞。
作为多能细胞，例如能够使用胚性干(ES)细胞、生殖干(GS)细胞或人工多能性干(iPS)细胞。作为成体干细胞，例如能够使用间充质干细胞(MSC)、造血干细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、源自骨髓的细胞(例如，源自骨髓的MSC等)、心肌干细胞、源自脂肪的干细胞或神经干细胞。作为前体细胞及成熟细胞，例如能够使用来源于皮肤、真皮、表皮、肌肉、心肌、神经、骨骼、软骨、内皮、脑、上皮、心脏、肾脏、肝脏、胰腺、脾脏、口腔内、角膜、骨髓、脐带血、羊膜或毛的细胞。作为源自人的细胞，例如能够使用ES细胞、iPS细胞、MSC、软骨细胞、成骨细胞、成骨前体细胞、间充质细胞、成肌细胞、心肌细胞、成心肌细胞、神经细胞、肝细胞、β细胞、成纤维细胞、角膜内皮细胞、血管内皮细胞、角膜上皮细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、源自骨髓的细胞或造血干细胞。并且，细胞的来源可以是自体细胞或异体细胞中的任一个。并且，可以为从ES细胞、iPS细胞分化衍生的***、间充质干细胞。上述中，作为细胞，优选为使用至少间充质干细胞或成纤维细胞。作为间充质干细胞，优选源自脂肪的间充质干细胞或源自骨髓的间充质干细胞。作为间充质干细胞的来源，优选源自人的或源自狗。
本发明中所使用的细胞优选为通过引入溶酶体贮积病的治疗中所需的基因而使上述基因的细胞不过度表达的细胞。
(3)细胞结构体
本发明的细胞结构体为包含上述本发明的多个生物相容性高分子嵌段物和至少1种多个细胞，且在多个上述细胞的间隙至少配置有1个上述高分子嵌段物的细胞结构体。本发明中，通过使用上述的生物相容性高分子嵌段物和上述的细胞，在多个细胞之间的间隙以镶嵌状三维配置多个高分子嵌段物，生物相容性高分子嵌段物和细胞以镶嵌状三维配置，由此形成在结构体中细胞均匀存在的细胞三维结构体，且如前述，具有物质渗透性。
本发明的细胞结构体在多个细胞的间隙配置有多个高分子嵌段物，其中，“细胞的间隙”是指，被细胞夹住即可，而无需为因所构成的细胞而密闭的空间。另外，无需在所有的细胞中存在间隙，也可以存在细胞彼此接触的部位。隔着高分子嵌段物的细胞的间隙的距离、即选择一细胞与存在于离该细胞最短距离处的细胞时的间隙距离并无特别限制，优选为高分子嵌段物的大小，优选的距离也为高分子嵌段物的优选的大小范围。
并且，本发明所涉及的高分子嵌段物成为被细胞夹住的结构，但无需在所有的高分子嵌段物之间存在细胞，而可以存在高分子嵌段物彼此接触的部位。隔着细胞的高分子嵌段物之间的距离、即选择高分子嵌段物和存在于离该高分子嵌段物最短距离处的高分子嵌段物时的距离并无特别限制，优选为所使用的细胞聚集1～数个时的细胞块的大小，例如为10μm以上且1000μm以下，优选为10μm以上且100μm以下，更优选为10μm以上且50μm以下。
另外，本说明书中使用了“在结构体中细胞均匀存在的细胞三维结构体”等“均匀存在”这一表达方式，但并不是指完全均匀。
本发明的细胞结构体的厚度或直径能够设为所希望的厚度，作为下限，优选为100μm以上，更优选为215μm以上，进一步优选为400μm以上，最优选为730μm以上。厚度或直径的上限并无特别限定，作为使用中的一般的范围，优选为3cm以下，更优选2cm以下，进一步优选为1cm以下。并且，作为细胞结构体的厚度或直径的范围，优选为100μm以上且3cm以下，更优选为400μm以上且3cm以下，进一步优选为500μm以上且2cm以下，进一步优选为720μm以上且1cm以下。
本发明的细胞结构体优选由高分子嵌段物组成的区域及由细胞组成的区域配置成镶嵌状。另外，本说明书中的“细胞结构体的厚度或直径”表示以下。选择细胞结构体中的某一点A时，在通过该点A的直线内，以距离细胞结构体外界的距离成为最短距离的方式将分割细胞结构体的线段的长度设为线段A。在细胞结构体中选择该线段A成为最长的点A，将此时的线段A的长度作为“细胞结构体的厚度或直径”。
本发明的细胞结构体中，细胞与高分子嵌段物的比率并无特别限定，优选每一细胞的高分子嵌段物的质量为0.0000001μg以上且1μg以下，更优选为0.000001μg以上且0.1μg以下，进一步优选为0.00001μg以上且0.01μg以下，最优选为0.00002μg以上且0.006μg以下。通过设为上述范围，能够使细胞更均匀地存在。并且，将下限设定在上述范围内，由此能够在使用于上述用途时发挥细胞的效果，并将上限设定在上述范围内，由此能够向细胞供给任意存在的高分子嵌段物中的成分。在此，高分子嵌段物中的成分并无特别限制，可列举后述的培养基中所含有的成分。
(4)细胞结构体的制造方法
本发明中使用的细胞结构体能够通过将生物相容性高分子嵌段物与至少一种细胞进行混合而制造。更具体而言，本发明的细胞结构体能够通过将生物相容性高分子嵌段物(由生物相容性高分子组成的块)与细胞交替配置而制造。另外，交替，并不是指完全的交替，例如是指混合有生物相容性高分子嵌段物和细胞的状态。制造方法并无特别限定，优选为在形成高分子嵌段物之后，播种细胞的方法。具体而言，能够通过孵化生物相容性高分子嵌段物与含细胞培养液的混合物而能够制造细胞结构体。例如，在容器中、保持于容器的液体中，将细胞和预先制作的生物相容性高分子嵌段物配置成镶嵌状。作为配置方法，优选通过使用自然凝聚、自然下落、离心、搅拌来促进、控制包括细胞和生物相容性高分子嵌段物的镶嵌状序列的形成。
作为所使用的容器，优选为由细胞低粘附性材料、细胞非粘附性材料制成的容器，更优选为由聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯、聚对酞酸乙二酯制成的容器。容器底面的形状优选为平底型、U字型、V字型。
通过上述方法获得的镶嵌状细胞结构体例如能够通过如下方法来制造所希望的大小的细胞结构体，即(a)使分别制备的镶嵌状细胞块彼此融合或(b)在分化培养基或增殖培养基下增大体积等。融合的方法、增大体积的方法并无特别限制。
例如，在对生物相容性高分子嵌段物与细胞含有培养液的混合物进行孵化的工序中，通过将培养基交换为分化培养基或增长培养基，能够对细胞结构体进行增量。优选在对生物相容性高分子嵌段物与细胞含有培养液的混合物进行孵化的工序中，通过进一步添加生物相容性高分子嵌段物，能够制造规定大小的细胞结构体，且细胞均匀存在于细胞结构体中的细胞结构体。
关于上述使分别制备的镶嵌状细胞块彼此融合的方法，具体而言是指细胞结构体的制造方法，该方法包括使细胞结构体融合多个的工序，该细胞结构体包含多个生物相容性高分子嵌段物和多个细胞，且在由上述多个细胞形成的多个间隙的一部分或全部配置有一个或多个上述生物相容性高分子嵌段物。
本发明中使用的细胞结构体的制造方法中的“生物相容性高分子嵌段物(种类、大小等)”、“细胞”、“多个细胞的间隙”、“所得到的细胞结构体(大小等)”、“细胞与高分子嵌段物的比率”等优选的范围与本说明书中上述的范围相同。
(5)溶酶体贮积病处置剂
溶酶体贮积病是指，因基因异常而位于溶酶体中的酶1个或者多个缺乏活性，因此在细胞内胞器即溶酶体内未分解的物质会贮积、或者因位于溶酶体中的膜蛋白的功能障碍而物质贮积在溶酶体中而发病的疾病的统称。
关于溶酶体贮积病，根据各自具有异常的酶、基因而分类为多种，存在60种以上。
作为溶酶体贮积病，可举出法布里病、高歇氏病、唾液腺病、尼曼-匹克二氏病A型、B型、半乳糖唾液沉积症、尼曼-匹克二氏病C型、I-细胞病、粘脂贮积病III型、GM1神经节醣苷病、β半乳糖苷酶缺乏症、α-甘露醣储积症、GM2神经节醣苷病、β-甘露醣储积症、克拉培氏病、岩藻糖苷酶缺乏症、异染性白质失养症、天门冬葡萄糖胺尿(aspartylglucosaminuria)、Multiplesulfatase缺乏症、辛德勒/神崎病、Farber氏病、庞贝氏病、Hurler-Scheie氏症候群、伍尔曼氏病、Hunter氏症候群、Danon氏病、Sanfilippo症候群、游离唾液酸贮积病、Morquio氏症候群、蜡脂褐质病(ceroid-lipofuscinosis)、马-拉二氏症(Maroteaux-Lamy二氏症)、Sly氏症、β葡萄醣醛酸酶缺乏症、山多夫氏病及胆固醇酯贮积病。上述中，优选为法布里病。
关于本发明的处置剂，能够通过在生物体内分泌α-半乳糖苷酶A来降低生物体内中的神经酰胺三己糖苷，因此能够处置法布里病。
在每一种溶酶体贮积病中确认到致病基因/蛋白质的情况较多。将其具体例示于后述表1中。
处置是指，针对各种疾病的预防或治疗等。
预防是指，预先抑制成为对象的疾病特有的症状的进展，且包括抑制发作，降低发病危险或延迟发病等。进展的抑制程度无任何限定，程度即使很小但只要可抑制进展，则也包含于预防中。
治疗是指，改善成为对象的疾病或状态，或者抑制进展等。
处置剂是指，以处置的目的而提供的物质。
本发明的溶酶体贮积病处置剂能够移植到生物而使用。作为移植方法，能够使用切开、注射、内视镜等方法。本发明的溶酶体贮积病处置剂与细胞片等细胞移植物不同，能够减小结构体的尺寸，因此能够进行基于注射的移植等微创移植方法。
移植本发明的溶酶体贮积病处置剂时的量能够根据移植対象(人、动物)的状态等而适当选择，但是作为所移植的细胞数，优选为1.0×105cells/kg以上且2.0×109cells/kg以下，更优选为1.0×106cells/kg以上且2.0×108cells/kg以下。
关于本发明的溶酶体贮积病处置剂的移植次数，可仅移植1次，也能够根据需要移植2次以上。
(6)各种用途
根据本发明，提供一种包含将本发明中所规定的细胞结构体移植到需要处置溶酶体贮积病的对象的工序的溶酶体贮积病的处置方法。上述溶酶体贮积病的处置方法中，细胞结构体的优选的范围与前述相同。
根据本发明，提供一种用于处置溶酶体贮积病的、本发明中所规定的细胞结构体。上述细胞结构体中，细胞结构体的优选的范围与前述相同。
根据本发明，提供一种用于制造溶酶体贮积病处置剂的、本发明中所规定的细胞结构体的应用。上述应用中，细胞结构体的优选的范围与前述相同。
通过以下实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明并不限定于实施例。
[实施例]
[参考例1]重组肽(重组明胶)
准备了下述CBE3来作为重组肽(重组明胶)(国际公开WO2008/103041号公报中所记载)。
CBE3：
分子量：51.6kDa
结构：GAP[(GXY)63]3G
氨基酸的数量：571个
RGD序列数：12个
亚氨基酸含量：33％
大致100％的氨基酸为GXY的重复结构。CBE3的氨基酸序列中不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸。CBE3具有ERGD序列。
等电点：9.34
GRAVY值：-0.682
1/IOB值：0.323
氨基酸序列(序列表的序列号1)(与国际公开WO2008/103041号公报的序列号3相同。其中末尾的X修正为“P”
Figure BDA0004060541490000221
[参考例2]重组肽多孔体的制作
[PTFE厚度·圆筒形容器]
准备了底面厚度为3mm、直径为51mm、侧面厚度为8mm、高度为25mm的聚四氟乙烯(PTFE)制圆筒杯状容器。将圆筒杯的曲面设为侧面时，侧面被8mm的PTFE封闭，且底面(圆形的平板状)也被3mm的PTFE封闭。另一方面，上表面呈开放的形状。因此，圆筒杯的内径成为43mm。之后，以下，将该容器称为PTFE厚/圆筒形容器。
[铝玻璃板、圆筒形容器]
准备了厚度1mm、直径47mm的铝制圆筒杯状容器。圆筒杯中，将曲面设为侧面时，侧面被1mm的铝密封，且底面(平板圆形)也被1mm的铝密封。另一方面，上面呈开放的形状。并且，仅在侧面的内部均匀地铺满了壁厚1mm的特氟龙(注册商标)，其结果，圆筒杯的内径成为45mm。并且，将该容器的底面设为呈在铝的外侧接合2.2mm的玻璃板的状态。以下，将该容器称为铝玻璃板/圆筒形容器。
[温度差较小的冷冻工序及干燥工序]
使CBE3水溶液流入PTFE厚/圆筒形容器或铝玻璃板/圆筒形容器，并在真空冻干机(TF5-85ATNNN：TAKARA.Co.Ltd)内使用冷却搁板从底面冷却了CBE3水溶液。此时的容器、CBE3水溶液的最终浓度、液量及搁板温度的设定的组合按照如下所记载的那样进行了准备。
条件A：
PTFE厚/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，并在-10℃下进行了1小时，然后在-20℃下进行了2小时，进而在-40℃下进行了3小时，最后在-50℃下进行了1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行了24小时的真空干燥，在24小时之后直接在持续进行真空干燥的状态下使搁板温度上升至20℃，并直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冻干机取出。如上述那样得到了多孔体。
条件B：
铝玻璃板/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，并在-10℃下进行了1小时，然后在-20℃下进行了2小时，进而在-40℃下进行了3小时，最后在-50℃下进行了1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行了24小时的真空干燥，在24小时之后直接在持续进行真空干燥的状态下使搁板温度上升至20℃，并直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冻干机取出。如上述那样得到了多孔体。
条件C：
PTFE厚/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量10mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，并在-10℃下进行了1小时，然后在-20℃下进行了2小时，进而在-40℃下进行了3小时，最后在-50℃下进行了1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行了24小时的真空干燥，在24小时之后直接在持续进行真空干燥的状态下使搁板温度上升至20℃，并直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冻干机取出。如上述那样得到了多孔体。
[各冷冻工序中的温度测定]
关于条件A～条件C的每一个，作为在溶液内最远离冷却侧的部位的液温(非冷却面液温)测定了容器内的圆中心部的水表面液温，并且，作为在溶液内最接近冷却侧的液温(冷却面液温)测定了容器内的底部的液温。
其结果，各自的温度与其温度差的分布成为如图1～图3。
从图1、图2、图3可知，在条件A、条件B、条件C下，液温在搁板温度-10℃设定区间(降低到-20℃之前)低于熔点即0℃，并且其状态处于不会发生冷冻(未冷冻/过冷却)状态。并且，在该状态下，冷却面液温与非冷却面液温的温度差为2.5℃以下。另外，本说明书中，“温度差”是指“非冷却面液温”-“冷却面液温”。然后，将搁板温度进一步降低到-20℃，由此确认到液温向0℃附近急速上升的时刻，可知是在此产生凝固热而开始进行冷冻的。并且，确认到是在该时刻实际上开始形成冰的。然后，温度在0℃附近经过一定时间。在此，成为存在水与冰的混合物的状态。最后，温度从0℃再次开始下降，此时，液体部分消失而成为冰。从而，所测定的温度成为冰内部的固态温度，即并非液温。
以下，关于条件A、条件B、条件C，记载非冷却面液温成为熔点(0℃)时的温度差、将搁板温度从-10℃降低至-20℃紧前的温度差及产生凝固热紧前的温度差。另外，本发明中所述的“紧前的温度差”表示能够在活动(产生凝固热等)的1秒钟前～20秒钟前的期间检测出的温度差内的最高温度。
条件A
非冷却面液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.1℃
从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：0.2℃
产生凝固热紧前的温度差：1.1℃
条件B
非冷却面液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.0℃
从-10℃降低之-20℃紧前的温度差：0.1℃
产生凝固热紧前的温度差：0.9℃
条件C
非冷却面液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.8℃
从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：1.1℃
产生凝固热紧前的温度差：2.1℃
[参考例3]生物相容性高分子嵌段物的制作(多孔体的粉碎和交联)
利用新动力磨机(New Power Mill)(OSAKA CHEMICAL Co.，Ltd.，新动力磨机(NewPower Mill)PM-2005)粉碎了在参考例2中得到的条件A及条件B的CBE3多孔体。关于粉碎，以最大转速1分钟×5次，合计进行了5分钟的粉碎。对所得到的粉碎物，利用不锈钢制筛子进行了尺寸分类，从而得到了25～53μm、53～106μm、106～180μm的未交联嵌段物。然后，在减压下以160℃实施热交联(实施了交联时间为8小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时这6种)来得到了生物相容性高分子嵌段物(CBE3嵌段物)。
以下，将源自实施了48小时交联的条件A的多孔体的嵌段物称为E，将源自实施了48小时交联的条件B的多孔体的嵌段物称为F。E及F为由通过温度差小的冷冻工序制造的多孔体制成的温度差小的嵌段物。另外，未发现交联时间的不同在本实施例的评价中影响性能，因此以下以实施了48小时交联的嵌段物为代表而使用。并且，E及F中在性能方面未发现差异。以下的参考例、实施例及比较例中，使用了在条件A、尺寸53～106μm、交联时间48小时下制作的生物相容性高分子嵌段物。
[参考例4]生物相容性高分子嵌段物的振实密度测定
振实密度为表示能够向某一体积紧密地填充多少嵌段物的值，且值越小，则越无法紧密地填充，即可以说嵌段物的结构复杂。如下测定了振实密度。首先，准备在漏斗的前端带帽(直径6mm、长度21.8mm的圆筒状：容量0.616cm3)的漏斗，并仅测定了帽的质量。然后，将帽装在漏斗上，并使嵌段物从漏斗流入而使其积蓄在帽中。添加充分量的嵌段物之后，将帽部分在桌子等较硬的部位敲击200次并卸下漏斗，并用刮刀刮平。在刮平并装满该帽的状态下测定了质量。通过从与仅帽的质量之差计算仅嵌段物的质量，并除以帽的体积而求出了振实密度。
其结果，参考例3的生物相容性高分子嵌段物的振实密度为98mg/cm3。
[参考例5]生物相容性高分子嵌段物的交联度测定
计算出在参考例3中交联的嵌段物的交联度(每一分子的交联数)。测定利用了TNBS(2，4，6-三硝基苯磺酸)法。
＜样品制备＞
向玻璃小瓶添加样品(约10mg)、4质量％的NaHCO3水溶液(1mL)及1质量％的TNBS水溶液(2mL)，在37℃下将混合物摇晃了3小时。然后，加入37质量％的盐酸(10mL)及纯水(5mL)之后，在37℃下将混合物静置16小时以上且来作为样品。
＜空白培养基制备＞
向玻璃小瓶添加样品(约10mg)、4质量％的NaHCO3水溶液(1mL)及1质量％的TNBS水溶液(2mL)，紧接着加入37质量％的盐酸(3mL)，在37℃下将混合物摇晃了3小时。然后，加入37质量％的盐酸(7mL)及纯水(5mL)之后，在37℃下将混合物静置16小时以上且来作为空白培养基。
对用纯水稀释了10倍的样品及空白培养基的吸光度(345nm)进行测定，并从以下(式2)及(式3)计算出交联度(每一分子的交联数)。
(式2)(As-Ab)/14600×V/w
(式2)表示每1g重组肽的赖氨酸量(摩尔当量)。
(式中，As表示样品吸光度，Ab表示空白培养基吸光度，V表示反应液量(g)，w表示重组肽质量(mg)。)
(式3)1-(样品(式2)/未交联重组肽(式2))×34
(式3)表示每一分子的交联数。
其结果，参考例3的生物相容性高分子嵌段物的交联度为4.2。
[参考例6]生物相容性高分子嵌段物的吸水率测定
计算出在参考例3中制作的生物相容性高分子嵌段物的吸水率。
在25℃下，向3cm×3cm的尼龙网孔制袋中，填充约15mg的生物相容性高分子嵌段物，并使其在离子交换中膨润两小时之后，风干了10分钟。在每一阶段测定质量，并根据(式4)求出了吸水率。
(式4)
吸水率＝(w2-w1-w0)/w0
(式中、w0表示吸水前的材料的质量，w1表示吸水后的空袋子的质量，w2表示包含吸水后的材料的袋子整体的质量。)
其结果，参考例3的嵌段的吸水率为786％。
[参考例7]细胞的溶酶体贮积病相关酶的表达确认试验
关于源自人骨髓的间充质干细胞(hBMSC)、源自人脂肪的干细胞(hADSC)、源自人牙髓的干细胞(hDPSC)，通过聚合酶链反应(PCR)对细胞的mRNA进行检测，因此对有无溶酶体贮积病相关酶的表达进行了评价。其结果，如图4～图7所示，可知hBMSC、hADSC及hDPSC表达下述表中所示的50种相关酶的基因。图4～图7中，hBMSC、hADSC及hDPSC分别标记为BMSC、ADSC及DPSC，P5，表示第5次传代。
[表1]
Figure BDA0004060541490000281
[实施例1]源自细胞结构体(镶嵌细胞块)的溶酶体贮积病相关酶的分泌试验细胞结构体的准备：
通过D-MEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium：杜尔贝寇改进的伊戈培养基)+10％FBS(Fetal Bovine Serum：胎牛血清)培养基，将源自人骨髓的间充质干细胞(hBMSC)调整为10万cells/mL，将在参考例3中制作的生物相容性高分子嵌段物(53-106μm)以成为0.1mg/mL的方式进行添加之后，将200μL接种于Sumilon Celltight X96U板(SumitomoBakelite Co.,Ltd.，底面为U字型)上，通过台式微孔板离心机进行离心(600g，5分钟)，静放24小时，制作了由直径为1mm的球状的生物相容性高分子嵌段物和hBMSC细胞组成的镶嵌细胞块(每一个细胞，为0.001μg的嵌段)。另外，由于是在U字型的板中制作的，因此本细胞结构体为球状。
溶酶体贮积病相关酶的分泌量测定：
关于如上所述那样获得的细胞结构体，通过酶联免疫吸附法(ELISA)(GLA/ALPHAGalactosidase ELISA Kit。LifeSpan Biosciences。LS-F-10765-1)对培养48小时之后的上清中所包含的、溶酶体贮积病原因酶即αGalA进行了测定。另外，作为比较，对不形成细胞结构体且以相同的细胞数进行平面培养的情况下的上清也进行了测定。其结果已知，如图8所示，关于每一个细胞的αGalA(别名GLA)酶分泌量，平面培养时(只有细胞)为1.5×10-6ng/cell，相对于此，在细胞结构体中为3.6×10-5ng/cell，出乎意料地，源自细胞结构体的αGalA酶分泌量飞跃性地(24倍左右)变多。
[实施例2]细胞结构体(镶嵌细胞块)的制作
使源自小鼠脂肪的干细胞(mADSC)悬浮于含有10％FBS的D-MEM培养基中，向该培养基中添加在参考例3中制作的生物相容性高分子嵌段物(53-106μm)，最终将mADSC(1.2×108cells)和生物相容性高分子嵌段物(0.25mg)在悬浮于4mL的培养基中的状态下，接种于细胞非粘附性的35mm皿即EZSPHERE(注册商标)皿Type903(球体孔口径800μm，球体孔深度300μm，球体孔数约为1,200个孔。底面为具有凹部的培养面，具有竖立设置于培养面的周缘的侧外壁部。AGC TECHNO GLASS CO.,LTD.制造)。通过在CO2培养器中在37℃下静放48小时，获取了约1,200个均匀的细胞结构体。
[实施例3]使用法布里病小鼠进行的有效性试验
法布里病小鼠使用了6周龄的B6；129-Glawblo/GrsrJ(Charles RiverLaboratories International，Inc.)。上述小鼠中，已知LysoGb3作为病因物质贮积于肝脏中，其为法布里病的原因。作为有效性试验，注射被验物质，测定4周后的肝脏中的LysoGb3量是否减少，从而进行了评价。另外，以通过LC-MS/MS(液相色谱法-质谱/质谱法：liquidchromatography-mass spectrometry/mass spectrometry)进行LysoGb3的定量的总蛋白质量进行标准化，从而进行了评价。具体而言，如下。
通过门静脉经由或皮下给药或尾静脉内给药注射了在实施例2中制作的mADSC的细胞结构体。关于给药量，以每一只的细胞结构体成为400个(4.0×105cells的细胞+0.08mg的高分子嵌段物)的方式，作为细胞结构体进行了给药。通过LC-MS/MS对从给药4周后的肝脏中的LysoGb3量进行定量，由此评价了与未给药的法布里病小鼠相比LysoGb3是否减少。
在以下示出LC-MS/MS的测定条件。
试剂
作为内部标准物质，使用了N,N-二甲基-D-赤-神经鞘胺醇(N,N-Dimethyl-D-erythro-sphingosine)。从Matreya公司(Pleasant Gap，PA)采购了Lyso-Gb3及N,N-二甲基-D-赤-神经鞘胺醇。
从Wako Pure Chemical Industries，Ltd.采购了用于样品制备及LC-MS/MS中的甲醇(MeOH、LC-MS等级)以及甲酸(FA、LC-MS等级)。
蛋白质定量中使用了Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo FisherScientific Inc.，Waltham、MA、USA)。
样品制备
小鼠器官是从健康的小鼠、注射了mADSC的细胞结构体的法布里病小鼠以及未注射mADSC的细胞结构体的法布里病小鼠中采集，并在液态氮中进行了快速冷冻。冷冻器官使用Multi-Beads Shocker(Yasui Kikai Corporation)进行粉碎，添加组织重量的10倍的磷酸缓冲生理盐水(PBS)而作为器官悬浮液。首先，用甲醇对N,N-二甲基-D-赤-神经鞘胺醇进行稀释，以使终浓度成为0.5ng/mL，从而制作了IS溶液(内部标准溶液)。接着，制作了标准样品。具体而言，在健康的小鼠的器官悬浮液20μL中添加100μL的内部标准物质的甲醇溶液，并进一步添加5μL的Lyso-Gb3溶液，以使成为0nmol/L、2nmol/L、4nmol/L、20nmol/L、40nmol/L及200nmol/L的终浓度，从而制作了标准样品。将其混合之后进行离心，去除了蛋白质。另一方面，关于注射了mADSC的细胞结构体的法布里病小鼠及未注射mADSC的细胞结构体的法布里病小鼠的器官也同样地制作器官悬浮液，对该器官悬浮液20μL，添加100μL的内部标准物质的甲醇溶液，且添加5μL的甲醇并进行混合之后进行离心，去除了蛋白质。离心之后，在80μL的所获得的混合液的上清中添加0.1％甲酸水溶液80μL而进行了混合。对该混合液进行离心之后，用0.1％甲酸水溶液/50％甲醇对上清进行4倍稀释，将所获得的样品注入到UPLC(超高液相色谱：ultra performance liquid chromatography)-MS/MS***中。
机器及定量方法
作为UPLC***，LC使用了ACQUITY UPLC(Waters、Milford、MA、USA)。样品注入量使用了5μL，且柱使用了ACQUITY UPLC BEH Phenyl Column、
Figure BDA0004060541490000311
(埃)、1.7μm，2.1mm×50mm(Waters)。溶剂A使用0.1％甲酸水溶液，溶剂B用0.1％甲酸甲醇溶液，使用了4.5分钟的梯度(0分钟、50％溶剂B；0.5分钟、70％溶剂B；1分钟、90％溶剂B；2.5分钟、100％溶剂B；3.5分钟、100％溶剂B；3.51分钟、50％溶剂B；4.5分钟、50％溶剂B)。流速设为0.4μL/分钟。MS使用了Triple Quad5500(AB SCIEX Framingham、MA、US)。以MRM(多重反应监测)模式实施了Lyso-Gb3的定量。关于作为目标物的质量，对于Lyso-Gb3设为m/z786.336，对于Lyso-Gb3-IS设为m/z328.190。为了定量，使用了源自神经鞘胺醇的强度较强的峰值。对于Lyso-Gb3设为m/z282.400，对于Lyso-Gb3-IS设为m/z110.000。
蛋白质定量方法
作为蛋白质定量，校准曲线用BSA使用试剂盒中所添加的Albumin StandardAmpules、2mg/mL，在与注入到LC-MS/MS中的样品相同组成的溶剂中进行稀释而制作，以使终浓度成为2000、1500、1000、750、500、250、125、25及0μg/mL。检测时使用TECAN infiniteF200，测定了550nm的吸光度。
根据基于上述LC-MS/MS***的分析结果及基于BCAAssay的蛋白质定量结果，计算了健康的小鼠、注射了mADSC的细胞结构体的法布里病小鼠以及未注射mADSC的细胞结构体的法布里病小鼠的器官中的Lyso-Gb3的浓度。即，将基于LC-MS/MS的Lyso-Gb3量设为x(nmol/mL)，将基于BCA Assay的蛋白质量设为y(mg/mL)，Lyso-Gb3量由x/y(nmol/mg蛋白质(nmol/mg protein))表示。
其结果已知，如表2及图9所示，将细胞结构体注射于门静脉内的群组中，与未给药的个体(69nmol/mg蛋白质)相比，在给药后1周中，肝脏中的LysoGb3明显减少(52nmol/mg蛋白质)，给药后4周中进一步明显减少(30nmol/mg蛋白质)。
本说明书中，Fabry小鼠是指法布里病小鼠。
[表2]
Figure BDA0004060541490000321
并且，关于适用于尾静脉内的个体，也已知在给药后1周中显示明显减少(24nmol/mg蛋白质)，给药后4周中也显示明显减少(27nmol/mg蛋白质)。其结果，皮下给药也存在相同的倾向。
在表3及图10中显示了肾脏中的Lyso-Gb3量，且在表4及图11中显示了心脏中的Lyso-Gb3量。关于表4及图11的心脏中的Lyso-Gb3量，已知与肝脏同样地，与未注射细胞结构体的群组相比，注射了细胞结构体的群组中，Lyso-Gb3量明显减少。
[表3]
Figure BDA0004060541490000331
[表4]
Figure BDA0004060541490000332
而且同时还确认到，为了比较，在只将mADSC以相同的细胞数(4.0×105cells/只)注射于门静脉内或尾静脉内的情况下，与给药后4周的肝脏中的LysoGb3(门静脉给药：53nmol/mg蛋白质，尾静脉内给药：36nmol/mg蛋白质)相比，注射细胞结构体4周后(门静脉给药：30nmol/mg蛋白质，尾静脉内给药：27nmol/mg蛋白质)的减少明显较高。将结果示于图12中。
[表5]
Figure BDA0004060541490000341
因此明确了，当注射细胞来作为细胞结构体的情况下，出乎意料地发现对法布里病小鼠具有较高的有效性。
[实施例4]细胞结构体(镶嵌细胞块)的制作
使源自小鼠胚胎的成纤维细胞(MEF)悬浮于含有10％FBS的D-MEM培养基中，并调整为10万cells/mL，添加在参考例3中所制作的生物相容性高分子嵌段物53-106μm以使成为0.1mg/mL，然后将200μL接种于Sumilon Celltight X96U板(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.，底面为U字型)上，通过台式微孔板离心机进行离心(600g，5分钟)，静放24小时，制作了由直径为1mm的球状的生物相容性高分子嵌段物和包含MEF细胞的镶嵌细胞块(每一个细胞，为0.001μg的嵌段)。另外，由于是在U字型的平板中制作的，因此本细胞结构体为球状。
然后，用吸管将与100孔(well)对应的量的内容物全部移到30mL单一使用的生物反应器(商品名称)(ABLE Corporation，BWV-S03A)(具备搅拌机构的第二培养容器)，经7天在培养基30mL中实施搅拌培养，从而获取了细胞结构体。其结果，细胞结构体为100个。
[实施例5]使用法布里病小鼠进行的有效性试验
与实施例3同样地评价了通过对法布里病小鼠的给药,肝脏中的LysoGb3是否减少。在肾包膜下移植了20个或者40个实施例4中所制作的MEF的细胞结构体。另外，在移植20个时，每一只注射了4.0×105cells的细胞数及0.4mg的高分子嵌段物，在移植40个时，每一只注射了8.0×105cells的细胞数及0.8mg的高分子嵌段物。试验的流程如图13所示。
其结果，如表6及图14所示，将细胞结构体移植到肾包膜下的群组(无论是20个移植群组，还是40个移植群组)中，与未给药的个体(56nmol/mg蛋白质)相比，给药后4周中，肝脏中的LysoGb3明显减少。并且，确认到与20个移植群组(43nmol/mg蛋白质)相比，40个移植群组(39nmol/mg蛋白质)中的LysoGb3明显减少。
[表6]
Figure BDA0004060541490000351
并且，制作移植4周后的移植部位的组织切片，实施组织学评价的结果，如图15所示，移植4周后也确认到细胞和高分子嵌段物，还确认到血管在细胞结构体内部衍生。由于从血管向细胞结构体内的细胞供给营养、氧分，因此可预料到本效果在今后也会一直持续下去。

Claims (12)

1.下述细胞结构体在制造溶酶体贮积病处置剂中的用途，所述细胞结构体包含多个生物相容性高分子嵌段物和至少1种多个细胞，且在多个所述细胞的间隙至少配置有1个所述高分子嵌段物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，
所述细胞至少包含间充质干细胞或成纤维细胞。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，
所述细胞结构体的每一个细胞包含0.0000001μg以上且1μg以下的生物相容性高分子嵌段物。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中，
1个所述生物相容性高分子嵌段物的大小为10μm以上且300μm以下。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中，
所述细胞结构体的厚度或直径为100μm以上且3cm以下。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物由重组肽组成。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，
所述重组肽由下述式表示，
式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数，另外，n个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。
8.根据权利要求6所述的用途，其中，
所述重组肽为如下肽中的任一种：
由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
由在序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或加成一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
9.根据权利要求1或2所述的用途，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物中，所述生物相容性高分子通过热、紫外线或酶进行交联。
10.根据权利要求1或2所述的用途，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物处于通过对生物相容性高分子的多孔体进行粉碎而获得的颗粒的形态。
11.根据权利要求1或2所述的用途，其中，
溶酶体贮积病为法布里病。
12.根据权利要求11所述的用途，其中，
通过在生物体内分泌α-半乳糖苷酶A来降低生物体内的神经酰胺三己糖苷。
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