JP7360672B2 - 間葉系幹細胞からインスリン産生細胞を製造する方法、インスリン産生細胞、細胞構造体および医薬組成物 - Google Patents
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Description
<1> 間葉系幹細胞からインスリン産生細胞を製造する方法であって、
(a)複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の間葉系幹細胞とをインキュベートすることによって、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の間葉系幹細胞とを含み、複数個の上記間葉系幹細胞の隙間に、少なくとも1個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を製造する工程、
(b)工程(a)においてインキュベートする前の間葉系幹細胞、工程(a)においてインキュベートしている間葉系幹細胞、または工程(a)で製造した細胞構造体のいずれか一以上を、GLP-1受容体作動薬を含む培地中で培養する工程、および
(c)工程(a)または工程(b)で得られた細胞構造体を、水溶性ビタミンおよび肝細胞増殖因子を含む培地中で培養する工程、
を含む方法。
<3> 工程(c)を7~35日間行う、<1>または<2>に記載の方法。
<4> 上記GLP-1受容体作動薬がエキセンジン-4である、<1>から<3>の何れか一に記載の方法。
<5> 上記水溶性ビタミンがニコチンアミドである、<1>から<4>の何れか一に記載の方法。
<6> 工程(b)における培地が、さらにアクチビンAを含む、<1>から<5>の何れか一に記載の方法。
<7> 工程(c)における培地が、さらにヒストン脱アセチル化阻害剤を含む、<1>から<6>の何れか一に記載の方法。
<8> 上記ヒストン脱アセチル化阻害剤がバルプロ酸である、<7>に記載の方法。
<10> 上記間葉系幹細胞が脂肪由来幹細胞である、<1>から<9>の何れか一に記載の方法。
<11> 上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが10μm以上300μm以下である、<1>から<10>の何れか一に記載の方法。
<12> 上記細胞構造体の厚さまたは直径が150μm以上3cm以下である、<1>から<11>の何れか一に記載の方法。
<13> 上記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントペプチドからなる、<1>から<12>の何れか一に記載の方法。
<15> 上記リコンビナントペプチドが、
配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;または配列番号1に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;の何れかである、<13>または<14>に記載の方法。
<16> 上記生体親和性高分子ブロックにおいて、上記生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、<1>から<15>の何れか一に記載の方法。
<17> 上記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、<1>から<16>の何れか一に記載の方法。
<19> 5x105個のインスリン産生細胞を含む細胞構造体を20mmol/Lグルコース濃度下で2mLのKrebs-Ringer bicarbonateバッファー中で60分間培養した際の培地中のインスリン濃度を、上記細胞構造体を3mmol/Lグルコース濃度下で2mLのKrebs-Ringer bicarbonateバッファー中で60分間培養した際の培地中のインスリン濃度で除することにより得られるStimulation Indexが2.5以上である、<18>に記載の細胞。
<20> <1>から<17>の何れか一に記載の方法により製造されるインスリン産生細胞を含む細胞構造体。
<21> 5x105個のインスリン産生細胞を含む細胞構造体を20mmol/Lグルコース濃度下で2mLのKrebs-Ringer bicarbonateバッファー中で60分間培養した際の培地中のインスリン濃度を、上記細胞構造体を3mmol/Lグルコース濃度下で2mLのKrebs-Ringer bicarbonateバッファー中で60分間培養した際の培地中のインスリン濃度で除することにより得られるStimulation Indexが2.5以上である、<20>に記載の細胞構造体。
<22> <18>または<19>に記載のインスリン産生細胞あるいは<20>または<21>に記載の細胞構造体を含む、医薬組成物。
<23> 糖尿病治療剤である、<22>に記載の医薬組成物。
本発明における細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊(モザイク状になっている細胞塊)と称する場合もある。また本明細書において「~」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
(a)複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の間葉系幹細胞とをインキュベートすることによって、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の間葉系幹細胞とを含み、複数個の上記間葉系幹細胞の隙間に、少なくとも1個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を製造する工程、
(b)工程(a)においてインキュベートする前の間葉系幹細胞、工程(a)においてインキュベートしている間葉系幹細胞、または工程(a)で製造した細胞構造体のいずれか一以上を、GLP-1受容体作動薬を含む培地中で培養する工程、および
(c)工程(a)または工程(b)で得られた細胞構造体を、水溶性ビタミンおよび肝細胞増殖因子を含む培地中で培養する工程、
を含む方法に関する。
工程(a)は、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の間葉系幹細胞とをインキュベートすることによって、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の間葉系幹細胞とを含み、複数個の上記間葉系幹細胞の隙間に、少なくとも1個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を製造する工程である。
(1-1)生体親和性高分子
生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、およびMPC(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的には、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドなどのポリペプチド(例えば、以下に説明するゼラチン等)、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー(PLGA)、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、およびキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質(フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン)や細胞接着配列(アミノ酸一文字表記で表される、RGD配列、LDV配列、REDV配列、YIGSR配列、PDSGR配列、RYVVLPR配列、LGTIPG配列、RNIAEIIKDI配列、IKVAV配列、LRE配列、DGEA配列、およびHAV配列)ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、または「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際および生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類(例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど)による架橋、縮合剤(カルボジイミド、シアナミドなど)による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、およびイオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、または酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列(XおよびYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す)の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に2配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176、米国特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質1分子中に好ましくは3~50個であり、さらに好ましくは4~30個であり、特に好ましくは5~20個であり、最も好ましくは12個である。
2,Editor Cox,P.J.Academic,London,Engl.参照)によって、1質量%ゼラチン溶液をカチオンおよびアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのpHを測定することで実施することができる。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;または
(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上(より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上)の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;の何れかである
%配列同一性=[(同一残基数)/(アラインメント長)]×100
2つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、BLAST((Basic Local Alignment Search Tool))プログラム(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)等を使用して決定することができる。
本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック(塊)を使用する。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状(顆粒)、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状およびシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状(顆粒)、粉状および多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状(顆粒)の下位概念の一例として不定形となる場合もある。
(式2)は、生体親和性高分子ブロック1g当たりのリジン量(モル等量)を示す。
(式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量(g)、wは生体親和性高分子ブロック質量(mg)を示す。)
(式3)は、1分子あたりの架橋数を示す。
吸水率=(w2-w1-w0)/w0
(式中、w0は、吸水前の材料の質量、w1は吸水後の空袋の質量、w2は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。)
生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を良好にすることができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子を含有する固形物(生体親和性高分子の多孔質体など)を、粉砕機(ニューパワーミルなど)を用いて粉砕することにより、生体親和性高分子ブロックを得ることができる。生体親和性高分子を含有する固形物(多孔質体など)は、例えば、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得ることができる。
(A)溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が2.5℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
(B)工程(A)で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、および
(C)工程(B)で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む方法を挙げることができるが、上記方法に限定されるわけではない。
本発明で使用する細胞は、間葉系幹細胞である。使用する間葉系幹細胞は1種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。
本発明で使用する間葉系幹細胞(MSC)は、未分化細胞としての複製能力を有し、かつ骨細胞、軟骨細胞、心筋細胞および脂肪細胞などへの分化能を有する細胞である。間葉系幹細胞の起源は特に限定されず、ヒト間葉系幹細胞でもよいし、マウス、ラット、ネコ、またはイヌ等の非ヒト動物由来の間葉系幹細胞でもよい。
本発明における細胞構造体は、上記した複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも1種類の複数個の間葉系幹細胞とを含み、複数個の上記間葉系幹細胞の隙間に、少なくとも1個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体である。本発明においては、生体親和性高分子ブロックと間葉系幹細胞とを用いて、複数個の細胞の隙間に複数個の高分子ブロックをモザイク状に3次元的に配置させることによって、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に3次元配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞3次元構造体が形成され、物質透過能を有することとなる。
細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、細胞構造体は、生体親和性高分子ブロック(生体親和性高分子からなる塊)と、細胞とを交互に配置することにより製造できる。なお、交互とは、完全な交互を意味するものではなく、例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞とが混合された状態を意味する。製造方法は特に限定されないが、好ましくは高分子ブロックを形成したのち、細胞を播種する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性高分子ブロックからなるモザイク状の配列形成を、促進、制御することが好ましい。
工程(b)は、工程(a)においてインキュベートする前の間葉系幹細胞、工程(a)においてインキュベートしている間葉系幹細胞、または工程(a)で製造した細胞構造体のいずれか一以上を、GLP-1受容体作動薬を含む培地中で培養する工程である。
GLP-1受容体作動薬としては、エキセンジン-4が好ましい。
工程(b)における培地がアルブミンを含む場合、培地におけるアルブミンの含有量は、好ましくは0.1質量%~10質量%であり、より好ましくは0.2質量%~5質量%であり、さらに好ましくは0.5質量%~2質量%である。
工程(b)における培地がB27-supplement(Gibco社)を含む場合、培地におけるB27-supplementの含有量は、好ましくは0.1質量%~10質量%であり、より好ましくは0.2質量%~5質量%であり、さらに好ましくは0.5質量%~2質量%である。
工程(b)における培地がN2-supplement(Gibco社)を含む場合、培地におけるN2-supplementの含有量は、好ましくは0.1質量%~10質量%であり、より好ましくは0.2質量%~5質量%であり、さらに好ましくは0.5質量%~2質量%である。
工程(b)における培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。37℃、5%CO2の条件などが例示される。培養中は適切な間隔(好ましくは1日から7日に1回、より好ましくは3日から4日に1回)で培地を交換することが好ましい。
工程(c)は、工程(a)または工程(b)で得られた細胞構造体を、水溶性ビタミンおよび肝細胞増殖因子(HGF)を含む培地中で培養する工程である。
工程(c)における培地がアルブミンを含む場合、培地におけるアルブミンの含有量は、好ましくは0.1質量%~10質量%であり、より好ましくは0.2質量%~5質量%であり、さらに好ましくは0.5質量%~2質量%である。
工程(c)における培地がB27-supplement(Gibco社)を含む場合、培地におけるB27-supplementの含有量は、好ましくは0.1質量%~10質量%であり、より好ましくは0.2質量%~5質量%であり、さらに好ましくは0.5質量%~2質量%である。
工程(c)における培地がN2-supplement(Gibco社)を含む場合、培地におけるN2-supplementの含有量は、好ましくは0.1質量%~10質量%であり、より好ましくは0.2質量%~5質量%であり、さらに好ましくは0.5質量%~2質量%である。
工程(c)における培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。37℃、5%CO2の条件などが例示される。培養中は適切な間隔(好ましくは1日から7日に1回、より好ましくは3日から4日に1回)で培地を交換することが好ましい。
本発明によれば、上記した工程(a)、工程(b)および工程(c)を含む、間葉系幹細胞からインスリン産生細胞を製造する方法により製造されるインスリン産生細胞、および上記インスリン産生細胞を含む細胞構造体が提供される。本発明によれば、上記インスリン産生細胞または上記細胞構造体を含む医薬組成物が提供される。
インスリン産生細胞および細胞構造体においては、5x105個のインスリン産生細胞を含む細胞構造体を20mmol/Lグルコース濃度下で2mLのKrebs-Ringer bicarbonateバッファー中で60分間培養した際の培地中のインスリン濃度を、上記細胞構造体を3mmol/Lグルコース濃度下で2mLのKrebs-Ringer bicarbonateバッファー中で60分間培養した際の培地中のインスリン濃度で除することにより得られるStimulation Indexが好ましくは2.0以上であり、より好ましくは2.5以上であり、さらに好ましくは3.0以上であり、特に好ましくは3.4以上である。
インスリン療法を必要とする対象の病態としては、
1型糖尿病、インスリン依存型の2型糖尿病、
糖尿病昏睡、
重症感染症の併発、中等度以上の外科手術の際、および糖尿病合併妊娠、
などを挙げることができるが、特に限定されない。
本発明の医薬組成物は好ましくは、糖尿病治療剤として使用することができる。
(A)本発明のインスリン産生細胞または本発明の細胞構造体を、インスリン療法を必要とする対象に投与することを含む、インスリン療法を必要とする病態(好ましくは、糖尿病)の治療方法。
(B)インスリン療法を必要とする病態(好ましくは、糖尿病)の治療において使用するための、本発明のインスリン産生細胞または本発明の細胞構造体。
(C)医薬組成物(好ましくは、糖尿病治療剤)の製造のための、本発明のインスリン産生細胞または本発明の細胞構造体の使用。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
リコンビナントペプチド(リコンビナントゼラチン)として以下のCBE3を用意した(国際公開WO2008/103041号公報に記載)。
CBE3:分子量:51.6kD構造: GAP[(GXY)63]3Gアミノ酸数:571個
RGD配列:12個イミノ酸含量:33%ほぼ100%のアミノ酸がGXYの繰り返し構造である。CBE3のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。CBE3はERGD配列を有している。
等電点:9.34
GRAVY値:-0.682
1/IOB値:0.323アミノ酸配列(配列表の配列番号1)(国際公開WO2008/103041号公報の配列番号3と同じ。但し末尾のXは「P」に修正)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
[PTFE厚・円筒形容器]
底面厚さ3mm、直径51mm、側面厚さ8mm、高さ25mmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は8mmのPTFEで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も3mmのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は43mmになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。
厚さ1mm、直径47mmのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は1mmのアルミで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も1mmのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚1mmのテフロン(登録商標)を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は45mmになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に2.2mmの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。
PTFE厚・円筒形容器またはアルミ硝子板・円筒形容器にCBE3水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機(TF5-85ATNNN:宝製作所)内で冷却棚板を用いて底面からCBE3水溶液を冷却した。この際の容器、CBE3水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。
PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量4mL。棚板温度の設定は、-10℃になるまで冷却し、-10℃で1時間、その後-20℃で2時間、さらに-40℃で3時間、最後に-50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を-20℃設定に戻してから-20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
アルミ・硝子板・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量4mL。棚板温度の設定は、-10℃になるまで冷却し、-10℃で1時間、その後-20℃で2時間、さらに-40℃で3時間、最後に-50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を-20℃設定に戻してから-20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量10mL。棚板温度の設定は、-10℃になるまで冷却し、-10℃で1時間、その後-20℃で2時間、さらに-40℃で3時間、最後に-50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を-20℃設定に戻してから-20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
条件A~条件Cのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温(非冷却面液温)として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温(冷却面液温)として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図1~図3の通りとなった。
参考例2で得られた条件Aおよび条件BのCBE3多孔質体をニューパワーミル(大阪ケミカル、ニューパワーミルPM-2005)で粉砕した。粉砕は、最大回転数で1分間×5回、計5分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、25~53μm、53~106μm、106~180μmの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下160℃で熱架橋(架橋時間は8時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間の6種類を実施した)を施して、生体親和性高分子ブロック(CBE3ブロック)を得た。
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であると言える。タップ密度は、以下のように測定した。まず、ロートの先にキャップ(直径6mm、長さ21.8mmの円筒状:容量0.616cm3)が付いたものを用意し、キャップのみの質量を測定した。その後、ロートにキャップを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込んだ。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を200回、机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにした。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定した。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めた。
その結果、参考例3の生体親和性高分子ブロックのタップ密度は98mg/cm3であった。
参考例3で架橋したブロックの架橋度(1分子当たりの架橋数)を算出した。測定はTNBS(2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸)法を用いた。
<サンプル調製>
ガラスバイアルに、サンプル(約10mg)、4質量%NaHCO3水溶液(1mL)および1質量%のTNBS水溶液(2mL)を添加し、混合物を37℃で3時間振とうさせた。その後、37質量%塩酸(10mL)および純水(5mL)を加えた後、混合物を37℃で16時間以上静置し、サンプルとした。
ガラスバイアルに、サンプル(約10mg)、4質量%NaHCO3水溶液(1mL)および1質量%TNBS水溶液(2mL)を添加し、直後に37質量%塩酸(3mL)を加え、混合物を37℃で3時間振とうした。その後、37質量%塩酸(7mL)および純水(5mL)を加えた後、混合物を37℃で16時間以上静置し、ブランクとした。
純水で10倍希釈したサンプル、および、ブランクの吸光度(波長345nm)を測定し、以下の(式2)、および(式3)から架橋度(1分子当たりの架橋数)を算出した。
(式2)は、リコンビナントペプチド1g当たりのリジン量(モル当量)を示す。
(式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量(g)、wはリコンビナントペプチド質量(mg)を示す。)
(式3)は、1分子あたりの架橋数を示す。
参考例3で作製した生体親和性高分子ブロックの吸水率を算出した。
25℃において、3cm×3cmのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約15mgを充填し、2時間イオン交換水中で膨潤させた後、10分風乾させた。それぞれの段階において質量を測定し、(式4)に従って、吸水率を求めた。
吸水率=(w2-w1-w0)/w0
(式中、w0は、吸水前の材料の質量、w1は吸水後の空袋の質量、w2は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。)
以下の比較例1、参考例7、実施例1および実施例2における細胞の培養は全て、37℃、5%CO2にて行った。
市販のヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hADSC:Lonza)を解凍し、5継代を経るまで継代した。この段階の継代数としては8継代でも結果が変わらなかった。
その後、上記細胞を12wellに5×105個/wellを播種し、Step1として、以下のメディウムおよびコンパウンドにて7日間培養した。
DMEM/F12;Gibco,1質量%B27-supplement;Invitrogen,1質量%N2-supplement;Invitrogen,50ng/mL activin A;Peprotech,10nmol/L exendin-4;Sigma,1質量%human-Alubmin。
なお、この段階の培養数としては9日間でも結果は変わらなかった。
DMEM/F12;Gibco,1質量%B27-supplement;Invitrogen,1質量%N2-supplement;Invitrogen,50ng/mL activin A;Peprotech,10nmol/L exendin-4;Sigma,1質量%human-Alubmin,10mmol/L nicotinamide;Sigma,50ng/mL hepatocyte growth factor;Peprotech。
なお、この段階の培養数は28日間でも結果は変わらなかった。
市販のヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hADSC:Lonza)を解凍し、5継代を経るまで継代した。この段階の継代数としては8継代でも結果が変わらなかった。
その後、上記細胞を12wellに5×105個/wellを播種し、Step1として、以下のメディウムおよびコンパウンドにて7日間培養した。
DMEM/F12;Gibco,1質量%B27-supplement;Invitrogen,1質量%N2-supplement;Invitrogen,50ng/mL activin A;Peprotech,10nmol/L exendin-4;Sigma,1質量%human-Alubmin。
なお、この段階の培養数としては9日間でも結果は変わらなかった。
DMEM/F12;Gibco,1質量%B27-supplement;Invitrogen,1質量%N2-supplement;Invitrogen,50ng/mL activin A;Peprotech,10nmol/L exendin-4;Sigma,1質量%human-Alubmin,10mmol/L nicotinamide;Sigma,50ng/mL hepatocyte growth factor;Peprotech, 1mmol/L Valproic acid。
なお、この段階の培養数は28日間でも結果は変わらなかった。
市販のヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hADSC:Lonza)を解凍し、5継代を経るまで継代した。この段階の継代数としては8継代でも結果が変わらなかった。
その後、上記細胞を12wellに5×105個/wellと、参考例3で作製した生体親和性高分子ブロック(53-106μm)0.5mgを播種し、Step1として、以下のメディウムおよびコンパウンドにて7日間培養した。
DMEM/F12;Gibco,1質量%B27-supplement;Invitrogen,1質量%N2-supplement;Invitrogen,50ng/mL activin A;Peprotech,10nmol/L exendin-4;Sigma,1質量%human-Alubmin。
なお、この段階の培養期間は9日間でも結果は変わらなかった。
DMEM/F12;Gibco,1質量%B27-supplement;Invitrogen,1質量%N2-supplement;Invitrogen,50ng/mL activin A;Peprotech,10nmol/L exendin-4;Sigma,1質量%human-Alubmin,10mmol/L nicotinamide;Sigma,50ng/mL hepatocyte growth factor;Peprotech。
なお、この段階の培養期間は28日間でも結果は変わらなかった。
市販のヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hADSC:Lonza)を解凍し、5継代を経るまで継代した。この段階の継代数としては8継代でも結果が変わらなかった。
その後、上記細胞を12wellに5×105個/wellと、参考例3で作製した生体親和性高分子ブロック(53-106μm)0.5mgを播種し、Step1として、以下のメディウムおよびコンパウンドにて7日間培養した。
DMEM/F12;Gibco,1質量%B27-supplement;Invitrogen,1質量%N2-supplement;Invitrogen,50ng/mL activin A;Peprotech,10nmol/L exendin-4;Sigma,1質量%human-Alubmin。
尚、この段階の培養数としては9日間でも結果は変わらなかった。
MEM/F12;Gibco,1質量%B27-supplement;Invitrogen,1質量%N2-supplement;Invitrogen,50ng/mL
activin A;Peprotech,10nmol/L exendin-4;Sigma,1質量%human-Alubmin,10mmol/L nicotinamide;Sigma,50ng/mL hepatocyte growth factor;Peprotech, 1mmol/L Valproic acid。
なお、この段階の培養数は28日間でも結果は変わらなかった。
比較例1、参考例7、実施例1および実施例2で得られたインスリン産生細胞(IPCs)は濃度2μg/mlのジチゾン(Dithizone)染色によって確認を行った。その結果、図4に示すように、実施例1および実施例2で得られたインスリン産生細胞はジチゾン染色で赤く良く染色されており、インスリン産生細胞が多いと考えられた。図4において、細胞のみ(VPA-)は比較例1を示し、細胞のみ(VPA+)は参考例7を示し、細胞構造体(VPA-)は実施例1を示し、細胞構造体(VPA+)は実施例2を示す。
また、確認の為、細胞のみと細胞構造体の結果について、再現性確認の実験を5回繰り返した。結果、図6のように細胞のみの場合はSIが平均1.5程度。一方、細胞構造体の場合はSIが3.9となり、有意な差が生じていることも確認された。なお、細胞構造体の場合はSIが最大で4.9を示した。ちなみに正常な生体由来膵島ではSIは2.0以上であることとされている。
次に分化誘導した細胞構造体を糖尿病モデルマウスに移植し、血糖値を制御可能であるかを評価した。なお、糖尿病モデルマウスは、ヌードマウス(BALB/cAJcl-nu/nu)に200mg/kgでストレプトゾトシンを投与し、血糖値が250mg/dlを2度超えた個体、あるいは血糖値が300mg/dlを1度超えた個体を糖尿病モデルマウスとして使用した。
移植にあたっては、実施例2で作った分化誘導した細胞構造体を150個(150IE)あるいは300個(300IE)移植した。なお、移植部位は腎被膜下に移植した。評価にあたっては、血糖値を測定した。
結果、図7に示すように、細胞構造体を150個移植した場合は、移植後の血糖値は200mg/dlを下回って正常範囲(200mg/dl以下)を示す個体と、移植後の血糖値が変わらず400mg/dl程度を推移する個体が存在した。一方、細胞構造体を300個移植した場合は、移植後1日目から血糖値が200mg/dl以下となり、確実に血糖値が制御されていた。参考までに、参考例7で用意した細胞のみ(VPA-)についても150個移植を行ってみたが、移植後、血糖値は下がらず、上昇したままとなることが確認された。
また、血糖値を200mg/dl以下にできなかった細胞構造体150個移植個体と、血糖値を200mg/dl以下で制御出来た細胞構造体300個移植個体について、移植7日後に、マウスの血中でヒトインスリンが検出されるかをELISA法にて測定した。結果、図8に示すように、移植をしていないコントロール個体ではヒトインスリンはほとんど検出されず、また細胞構造体を150個移植した個体では、30mU/L程度という低い値のヒトインスリン濃度がマウス血中で測定された。一方、細胞構造体300個を移植した個体ではマウス血中のヒトインスリン濃度は200mU/Lを超える高い値として検出された。なお、ヒトでは空腹時は140-1,540mU/Lと言われており、細胞構造体300個を移植した場合、その範囲に入るヒトインスリンが血中で認められたということがわかる。加えて、ヒトインスリンとマウスインスリンでは交差が0.3%未満であることが分かっており、細胞構造体300個移植個体での高値の血中ヒトインスリンはマウス由来ではないと考えてよい。
これらのことから、分化誘導した細胞構造体はSIで2以上を示し、かつ動物試験において体内でインスリンを放出し、血糖値を制御する能力を有している、と考えられた。
Claims (20)
- 間葉系幹細胞からインスリン産生細胞を製造する方法であって、
(a)複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の間葉系幹細胞とをインキュベートすることによって、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の間葉系幹細胞とを含み、複数個の前記間葉系幹細胞の隙間に、少なくとも1個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を製造する工程、
(b)工程(a)においてインキュベートする前の間葉系幹細胞、工程(a)においてインキュベートしている間葉系幹細胞、または工程(a)で製造した細胞構造体の何れか一以上を、GLP-1受容体作動薬を含む培地中で培養する工程、および
(c)工程(a)または工程(b)で得られた細胞構造体を、水溶性ビタミンおよび肝細胞増殖因子を含む培地中で培養する工程、を含み、
前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが10μm以上300μm以下であり、
前記生体親和性高分子が、ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、およびキトサンから選ばれる少なくとも一種であり、
工程(c)における培地が、さらにGLP-1受容体作動薬、アクチビンA、アルブミン、B27-supplementまたはN2-supplementから選択される1種以上を含む、
方法。 - 工程(b)を3~14日間行う、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)を7~35日間行う、請求項1または2に記載の方法。
- 前記GLP-1受容体作動薬がエキセンジン-4である、請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- 前記水溶性ビタミンがニコチンアミドである、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 工程(b)における培地が、さらにアクチビンAを含む、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- 工程(c)における培地が、さらにヒストン脱アセチル化阻害剤を含む、請求項1から6の何れか一項に記載の方法。
- 前記ヒストン脱アセチル化阻害剤がバルプロ酸である、請求項7に記載の方法。
- 工程(c)における培地がさらにアルブミンを含み、培地におけるアルブミンの含有量が0.1質量%~10質量%である、請求項1から8の何れか一項に記載の方法。
- 前記工程(a)および前記工程(b)が、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の間葉系幹細胞とをGLP-1受容体作動薬を含む培地中でインキュベートすることによって、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の間葉系幹細胞とを含み、複数個の前記間葉系幹細胞の隙間に、少なくとも1個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を製造する工程である、請求項1から9の何れか一項に記載の方法。
- 前記間葉系幹細胞が脂肪由来幹細胞である、請求項1から10の何れか一項に記載の方法。
- 前記細胞構造体の厚さまたは直径が150μm以上3cm以下である、請求項1から11の何れか一項に記載の方法。
- 前記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントペプチドからなる、請求項1から12の何れか一項に記載の方法。
- 前記リコンビナントペプチドが、下記式で示される、請求項13に記載の方法。
式:A-[(Gly-X-Y)n]m-B式中、Aは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、nは3~100の整数を示し、mは2~10の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。 - 前記リコンビナントペプチドが、
配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;または配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;の何れかである、請求項13または14に記載の方法。 - 前記生体親和性高分子ブロックにおいて、前記生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、請求項1から15の何れか一項に記載の方法。
- 前記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、請求項1から16の何れか一項に記載の方法。
- 複数個の生体親和性高分子ブロック、および
細胞としては、請求項1から17の何れか一項に記載の方法により製造されるインスリン産生細胞のみを含む細胞構造体であって、
前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが10μm以上300μm以下であり、
前記生体親和性高分子が、ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、およびキトサンから選ばれる少なくとも一種であり、
複数個の前記インスリン産生細胞の隙間に、少なくとも1個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されており、
5×10 5 個のインスリン産生細胞を含む細胞構造体を20mmol/Lグルコース濃度下で2mLのKrebs-Ringer bicarbonateバッファー中で60分間培養した際の培地中のインスリン濃度を、前記細胞構造体を3mmol/Lグルコース濃度下で2mLのKrebs-Ringer bicarbonateバッファー中で60分間培養した際の培地中のインスリン濃度で除することにより得られるStimulation Indexが2.5以上である、細胞構造体。 - 請求項18に記載の細胞構造体を含む、医薬組成物。
- 糖尿病治療剤である、請求項19に記載の医薬組成物。
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