CN116236566A - 一种鲈鱼诺卡氏菌疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

一种鲈鱼诺卡氏菌疫苗及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116236566A
CN116236566A CN202310020564.0A CN202310020564A CN116236566A CN 116236566 A CN116236566 A CN 116236566A CN 202310020564 A CN202310020564 A CN 202310020564A CN 116236566 A CN116236566 A CN 116236566A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vaccine
nocardia
abp
weever
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310020564.0A
Other languages
English (en)
Inventor
王文博
焦铁军
金湛林
张中雨
卢静
马瑞
孟强
蔡畅敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Wankesen Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Wankesen Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Wankesen Biotechnology Co ltd filed Critical Shenzhen Wankesen Biotechnology Co ltd
Priority to CN202310020564.0A priority Critical patent/CN116236566A/zh
Publication of CN116236566A publication Critical patent/CN116236566A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/355—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Nocardia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供了一种鲈鱼诺卡氏菌疫苗及其制备方法与应用。所述鲈鱼诺卡氏菌疫苗以鰤诺卡氏菌膜蛋白上的ABC家族的ATP结合蛋白(ABP)作为候选抗原，根据ABP的基因序列设计引物，克隆到载体中，获得重组质粒制备得到。ABP的氨基酸序列如SEQ ID No：6所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。培养ABP含原核表达重组质粒的工程菌种，发酵、破碎、纯化获得重组蛋白疫苗；培养ABP含真核表达重组质粒的工程菌种，大量提取去内毒素的重组质粒获得DNA疫苗；将甘露糖化壳聚糖包裹的真核重组质粒作为靶向DNA疫苗。本发明制备的重组蛋白疫苗、DNA疫苗和靶向DNA疫苗对鲈鱼诺卡氏菌病均有较好的防治效果。

Description

一种鲈鱼诺卡氏菌疫苗及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及鱼类病害防治用疫苗，更具体地，涉及鲈鱼诺卡氏菌重组蛋白疫苗、DNA疫苗和靶向DNA疫苗及其制备与应用。
背景技术
加州鲈学名大口黑鲈(Micropterus salmoides)，属鲈形目，太阳鱼科，其肉质鲜美、抗病力强、生长迅速、易起捕、适温较广，是一种经济价值很高的淡水鱼类。加州鲈养殖业在我国迅速发展，然而，随着人工养殖规模的不断扩大，养殖集约化程度不断提高，加州鲈病害频繁发生，尤其是加州鲈诺卡氏菌病，已成为制约水产养殖业健康发展的瓶颈。
由于加州鲈诺卡氏菌病潜伏期长、发病率高、病情发展缓慢，常导致患病鱼大批死亡，给加州鲈养殖业造成了巨大的经济损失。治疗鱼类诺卡氏菌病的传统药物涉及多种敏感抗生素，疗效有限，存在严重的环境污染、微生物耐药性和药物残留问题。与传统药物相比，疫苗在水产养殖中具有安全、环保、长效保护等优点，接种疫苗可以说是目前防治鱼类诺卡氏菌病最经济有效且安全环保的方法。因此，开发针对该病原菌的疫苗，加强加州鲈诺卡氏菌的免疫防控研究具有重要意义。
目前，诺卡氏菌灭活疫苗虽然可以提高血清凝集抗体效价，但攻毒后几乎不提供任何免疫保护作用。诺卡氏菌弱毒疫苗尚存在安全性问题。可以说，诺卡氏菌灭活疫苗和弱毒疫苗的开发路线可能性较小，几乎不具有实用性。相比于传统疫苗，重组蛋白疫苗和DNA疫苗可能更加安全和高效。
甘露糖广泛存在于自然界中，其参与组成的糖类化合物在生物的体液与组织中大量存在，对生物安全无毒，摄入后能被机体代谢降解。D-甘露糖能被抗原细胞上的甘露糖受体识别结合，介导巨噬细胞的吞噬，利用甘露糖基来修饰疫苗***可以实现靶向抗肿瘤和抗病毒等功能。
发明内容
本发明的目的在于提供防治鱼类诺卡氏菌病的疫苗，该疫苗在防治鲈鱼诺卡氏菌病方面具有安全、环保、长效等优点。
诺卡氏菌的重组蛋白疫苗、DNA疫苗和靶向DNA疫苗以更好地防治鱼类诺卡氏菌病，本发明提供的疫苗。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：选取鰤诺卡氏菌膜蛋白上的ABC家族的ATP结合蛋白(缩写为ABP)作为候选抗原，根据所述候选抗原的基因序列设计引物，克隆到载体中，获得重组质粒，分别制备了重组蛋白疫苗、DNA疫苗和靶向DNA疫苗。
本发明提供了鲈鱼诺卡氏菌疫苗的制备方法，所述制备方法包括：根据ABP的基因序列设计引物，克隆到载体中，获得原核表达重组质粒和真核表达重组质粒，培养含原核表达重组质粒的工程菌种，发酵、破碎、纯化获得重组蛋白疫苗；培养含真核表达重组质粒的工程菌种，大量提取去内毒素的重组质粒获得DNA疫苗；将甘露糖化壳聚糖包裹的真核重组质粒作为靶向DNA疫苗。
所述ABP的氨基酸序列如SEQ ID No：6所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo：5所示。
本发明还提供了通过上述制备方法得到的鲈鱼诺卡氏菌病的重组蛋白疫苗、DNA疫苗和靶向DNA疫苗。
进一步地，本发明还提供了鲈鱼诺卡氏菌病的重组蛋白疫苗、DNA疫苗和靶向DNA疫苗在防治鲈鱼诺卡氏菌病中的应用。
通过实施本发明的技术方案，可以达到下述有益效果：本发明制备所得鲈鱼诺卡氏菌病的重组蛋白疫苗、DNA疫苗和靶向DNA疫苗对鲈鱼具有显著的免疫保护作用，能够有效地预防鲈鱼诺卡氏菌病的侵害。该疫苗操作简单、使用安全、保护效果显著，在防治鱼类诺卡氏菌病方面安全、环保、长效，具有较好的实际应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将本发明实施例中所涉及附图做简单的说明，显而易见地，所列出的附图仅仅是本发明实施例的一部分内容的呈现。
图1为使用特异性ABP基因引物扩增的鰤诺卡氏菌ABP结合蛋白基因E.coli BL21/pET32a-ABP重组菌PCR扩增电泳结果；其中，1泳道为重组质粒pMD19T-ABP的PCR扩增电泳结果，2泳道为重组菌E.coli BL21/pET32a-ABP的PCR扩增电泳结果。
图2为重组质粒pET32a-ABP双酶切产物凝胶电泳检测结果。
图3为使用特异性ABP基因引物扩增的鰤诺卡氏菌ABP结合蛋白基因E.coli DH5α/pcDNA-ABP重组菌PCR扩增电泳结果；其中，1泳道为重组质粒pMD19T-ABP的PCR扩增电泳结果，2泳道为重组菌E.coli DH5α/pcDNA-ABP的PCR扩增电泳结果。
图4为重组质粒pcDNA-ABP双酶切产物凝胶电泳检测结果。
图5为重组蛋白SDS-PAGE电泳检测结果，其中，2泳道为纯化后的ABP的电泳检测结果。
图6为效力检验-免疫攻毒保护试验中各组鲈鱼的生存情况，其中，横轴为感染后的时间，纵轴为存活比例。
图7为效力检验-血清学评价实验中各组鲈鱼血清中抗体的平均水平，其中，横轴为免疫后的天数，纵轴为OD450。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及技术效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明做进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。
本发明实施例中涉及的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售购买所得。
实施例1：重组大肠埃希菌株E.coli BL21/pET32a-ABP的构建和鉴定
1.ABP基因扩增
参照细菌基因组提取试剂盒(上海生物工程公司)说明书，以实验室培养的鰤诺卡氏菌液为材料，提取鰤诺卡氏菌基因组。用引物对扩增ABP结合蛋白基因，其中，
rABP-F：CCCAAGCTTCGATGACCGACCATGT(SEQ ID No：1)，
rABP-R：CCGCTCGAGTCATGCGGGATTCCGT(SEQ ID No：2)。
ABP编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件：120V电压30分钟。电泳产物切胶、回收、经凝胶回收试剂盒(碧云天生物技术研究所)纯化DNA产物，纯化产物与pMD19-T载体连接，反应条件为：16℃水浴0.5h，将重组产物命名为pMD19T-ABP。将重组质粒pMD19T-ABP转化至大肠埃希菌BL21感受态中，并提取质粒进行PCR扩增检测及测序鉴定，测序结果如SEQ ID No：5所示。PCR扩增电泳结果如图1的1泳道所示。目的条带大小800多bp，与预期的ABP基因822bp相符。
2.表达ABP的重组大肠埃希氏菌(E.coli BL21/pET32a-ABP)的构建
原核表达载体pET32a-ABP的构建：将重组pMD19T-ABP质粒进行双酶切，即HindIII和Xho I核酸内切酶(宝生物工程(大连)有限公司)之间，并克隆至pET-32a表达载体上相应的酶切位点，获得重组质粒pET32a-ABP。
重组质粒pET32a-ABP的转化与筛选：分别将重组质粒pET32a-ABP转化至E.coliBL21(DE3)中，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。然后挑取单菌落针对含ABP基因的菌落进行PCR检测鉴定。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像仪下观察扩增产物目的条带大小，如图1中2泳道所示，与预期的ABP基因822bp相符的菌落为重组菌E.coli BL21/pET32a-ABP。
3.重组质粒pET32a-ABP的鉴定
将菌落PCR阳性，即含pET32a-ABP重组质粒的菌落接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，于37℃、180r/min条件下培养12～16小时，按Omega质粒提取试剂盒操作说明进行质粒的提取，测定质粒的浓度后，取8μL质粒溶液、1μL 10×酶切Buffer和各0.5μL限制性内切酶，混匀，37℃酶切5分钟。将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。重组质粒被酶切成为两部分，其中一部分的大小为800多bp，与预期的ABP基因822bp相符。
实施例2：重组大肠埃希氏菌株E.coli DH5α/pcDNA-ABP的构建和鉴定
1.ABP基因扩增
参照细菌基因组提取试剂盒说明书，以实验室培养的鰤诺卡氏菌液为材料，提取鰤诺卡氏菌基因组。用引物对扩增ABP结合蛋白基因，其中
rABP-F：CCCAAGCTTATGACCGACCATGT(SEQ ID No：3)，
rABP-R：CCGCTCGAGTCATGCGGGATTCCGT(SEQ ID No：4)。
ABP结合蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件：120V电压30分钟。电泳产物切胶、回收、经凝胶回收试剂盒纯化DNA产物，纯化产物与pMD19-T载体连接，将重组产物命名为pMD19T-ABP。将转化子转化至大肠埃希菌DH5α感受态中，并提取质粒进行PCR扩增检测及测序鉴定，结果如SEQ ID No：5所示。PCR扩增电泳结果如图3中的1泳道所示。目的条带大小800多bp，与预期的ABP基因822bp相符。
2.表达ABP结合蛋白的重组大肠埃希氏菌(E.coli DH5α/pcDNA-ABP)的构建
真核表达载体pcDNA-ABP的构建：将重组pMD19T-ABP质粒进行双酶切，所用内切酶为Hind III和Xho I核酸内切酶(宝生物工程(大连)有限公司)，酶切条件为37℃水浴，0.5h，并克隆至pcDNA真核表达载体上相应的酶切位点之间(Hind III和Xho I)，获得重组质粒pcDNA-ABP。
重组质粒pcDNA-ABP的转化与筛选：分别将重组质粒pcDNA-ABP转化至E.coli DH5α中，涂布含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。然后挑取单菌落进行菌液PCR检测鉴定。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像仪下观察扩增产物目的条带大小，如图3中的2泳道所示，目的条带大小800多bp，与预期的ABP基因822bp相符的菌落为重组菌E.coli DH5α/pcDNA-ABP。
3.重组质粒pcDNA-ABP的鉴定
将含pcDNA-ABP重组质粒的E.coli DH5α接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，于37℃、以180r/min培养12～16小时，按Omega质粒提取试剂盒操作说明进行质粒的提取，测定质粒的浓度后，取8μL质粒溶液、1μL 10×酶切Buffer和各0.5μL限制性内切酶，混匀，37℃酶切5分钟。将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。酶切结果与预期822bp相符。
实施例3：重组蛋白疫苗的制备
1.重组菌E.coli BL21/pET32a-ABP的诱导表达
将生产菌种E.coli BL21用接种环挑取少量的菌液，划线接种于LB固体培养基平皿，37℃静置培养12～16小时后，挑单菌落接种于LB液体培养基中，置于37℃、以180r/min培养12～16小时作为一级种子；将一级种子以体积比1％接种于LB液体培养基中，置于37℃、以180r/min培养12～16小时作为二级种子。将二级种子以体积比1％接种至改良LB培养基，同时加入氨苄青霉素至其终浓度100μg/mL。37℃通气发酵培养5～7小时，溶氧30％～40％，至菌液的OD600值为1.1～1.3时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至其终浓度为0.001mo1/L，37℃诱导培养6小时，停止发酵。
2.菌液处理与超声破碎
发酵产物经管式离心机12000r/min室温离心，收集菌体﹐用浓度0.015mol/L，pH为7.2的PBS溶液洗涤2次，将收集的菌体按湿菌和浓度0.015mol/L，pH为7.2的PBS溶液1：9的质量体积比进行重悬，2～8℃高压均质机破碎细菌，细菌连续通过均质机两次以后，将破碎的菌液涂片，使用0.1％结晶紫溶液染色0.5分钟，显微镜下取3～5个视野进行观察，破碎完全时视野内全为细胞碎片而看不到完整的菌体，破碎菌液至细菌的破碎率不再发生变化为止。管式离心机12000r/min室温离心，收集破碎后的菌体沉淀。
3.蛋白的纯化
按每克蛋白沉淀用10mL溶解液(5mmo1/L咪唑、0.5mmo1/L氯化钠、8mo1/L尿素、20mmol/LTirs-HCl，pH7.9)的比例进行溶解，室温下200r/min振荡溶解2小时后，4℃下10000r/min离心30分钟，收集上清。用平衡缓冲液(5mmol/L咪唑、0.5mmol/L氯化钠、8mo1/L尿素、20mmo1/LTirs-HCl，pH7.9)充分平衡金属镍Ni整合亲和层析柱后，按2倍柱体积上样，再用平衡缓冲液平衡，然后用洗脱缓冲液(0.5mol/L咪唑、0.5mmol/L氯化钠、8mo1/L尿素、20mmol/LTirs-HCl，pH7.9)洗脱，收集蛋白。将纯化好的200mL蛋白(液体状态)置于SnakeSkin T透析袋(10K MWCO)，直接完全浸入到10L的复性液中(150mM NaCl、2.5mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、1％吐温-20、10mMβ-环糊精、1M-半胱氨酸、3mM还原型谷胱甘肽和1mM氧化型谷胱甘肽，pH7.9)中，4℃透析12h，期间，每6h换液一次，透析结束后，收集透析后的蛋白液4℃保存备用。
4.内毒素去除
向透析后的蛋白液中，加入Triton X-114至终浓度l.5％(是指Triton X-114的浓度)，4℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，高速离心机17000r/min，离心去除沉淀，收集上清液。上清液按上述去除内毒素的方法重复处理三次。
5.重组蛋白的检测
SDS-PAGE：超声破碎菌液后，取破碎后的溶液加入等体积的2×凝胶上样缓冲液(SDS-PAGE蛋白上样缓冲液)；另取纯化后ABP，直接加入等体积的2×凝胶上样缓冲液。将上述两种混合物煮沸10分钟，SDS-PAGE电泳检测，分离胶的丙烯酰胺浓度为15％。考马斯亮蓝染色，脱色液脱色至条带清晰为止。结果如图5所示，2泳道为纯化后的ABP，表达的目的蛋白的大小40多kDa，与预期相符。
6.蛋白浓度的测定
将纯化后的ABP溶于PBS溶液中，通过BCA试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定蛋白浓度，稀释至1mg/mL，用于后续鱼类诺卡氏菌病的防治。
实施例4：DNA疫苗的制备
将真核重组表达载体菌pcDNA-ABP/DH5α(即E.coli DH5α/pcDNA-ABP)和空质粒菌pcDNA/DH5α分别接种于含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床200r/min振荡培养8-10h，待菌液浓度OD600达1.5-2.0时，停止振荡。将菌液加入50mL离心管中，离心机8000r/min离心5min收集菌体(离心操作重复操作一次)。使用E.Z.N.A@Fastfiler Endo-free Plasmid Maxiprep试剂盒大量提取无内毒素真核表达重组质粒，具体操作参照试剂盒说明书。将无内毒素质粒稀释成浓度为600μg/mL，用于后续鱼类诺卡氏菌病的防治。
实施例5：靶向DNA疫苗的制备
将真核重组质粒(pcDNA-ABP)溶解在5mM Na2SO4中，使其浓度为1200μg/mL，将实验室自制甘露糖化壳聚糖(MCS)(制备过程：将1.9g壳聚糖溶于475ml水中，然后加入1％的冰醋酸(1ml醋酸)，后面的氢氧化钠5g，250ml，氢氧化钠将ph调至6.2后，加入0.5g甘露糖，搅拌24h。后进行离心洗涤，透析，开始冻干。)溶解在5mM NaAC-HAc中，使MCS的浓度为0.02％。将浓度为1200μg/mL的真核重组质粒、浓度为0.02％MCS的混合溶液在55℃水浴环境下剧烈震荡混合30秒，得到靶向DNA疫苗。
实施例6：疫苗免疫保护效力评价
1.效力检验-免疫攻毒保护
取60日龄以上体重范围1.0-1.2g的健康鲈鱼300尾，分为5组，60尾每组，分别为PBS对照组(PBS)、pcDNA对照组(pcDNA)、重组蛋白疫苗组(ABP)、DNA疫苗组(pcDNA-ABP)和靶向DNA疫苗组(MCS-pcDNA-ABP)。重组蛋白疫苗、DNA疫苗和靶向DNA疫苗分别选用实施例3、4、5制备所得。重组蛋白疫苗组的疫苗剂量为10μg/尾，DNA疫苗组和靶向DNA疫苗组的疫苗剂量为20μg/尾，分别设置对照组，重组蛋白疫苗组的对照组是PBS对照组，DNA疫苗组的对照组是pcDNA对照组，对照组使用相同剂量的对照试剂处理，PBS对照组和重组蛋白疫苗组的免疫方式为腹腔注射，pcDNA对照组、DNA疫苗组和靶向DNA疫苗组的免疫方式为背鳍肌肉注射。连续观察28天后，分别以诺卡氏菌液进行腹腔注射攻毒，100μL(7500CFU/mL)/尾。攻毒后连续观察14日，定时检查、记录发病情况，死亡鲈鱼及时剖检，各组鲈鱼的生存情况见图6。
由图6可知，ABP组、pcDNA-ABP组、MCS-pcDNA-ABP组注射攻毒14天时鲈鱼的存活比例均大于50％，且显著优于PBS组和pcDNA组，证明三种疫苗均能够使鲈鱼对诺卡氏菌有较好的免疫能力。
2.效力检验-血清学评价
取健康鲈鱼250尾，随机分成5组，分别为PBS对照组(PBS)、pcDNA对照组(pcDNA)、重组蛋白疫苗组(ABP)、DNA疫苗组(pcDNA-ABP)和靶向DNA疫苗组(MCS-pcDNA-ABP)，所有鲈鱼均通过注射免疫(PBS对照组和重组蛋白疫苗组的免疫方式为腹腔注射，pcDNA对照组、DNA疫苗组和靶向DNA疫苗组的免疫方式为背鳍肌肉注射。)。随后接种疫苗的鲈鱼被转移到不同的水缸中，并每天进行检测。在每一组中，每一周一次随机选择三条鱼进行取样测试和制备血浆，持续到第四周(28天)，血浆储存在-20℃，以含3％脱脂牛奶的PBS稀释的血清为一级抗体，37℃孵育1.5小时。以纯化的ABP结合蛋白(含his-tag)作为抗原，用1:1500稀释的小鼠抗6×His标记抗体和山羊-小鼠IgG抗体，以TMB为比色底物，测定OD450，分析血清中抗体的平均水平。具体结果如图7所示。
由图7可知，ABP组、pcDNA-ABP组、MCS-pcDNA-ABP组接种免疫后28天时的OD450值均大于0.5，且显著优于PBS组和pcDNA组，证明三种疫苗均使鲈鱼血清中产生了抗体且保持在较高水平。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
序列表
SEQ ID No：1CCCAAGCTTCGATGACCGACCATGT
SEQ ID No：2CCGCTCGAGTCATGCGGGATTCCGT
SEQ ID No：3CCCAAGCTTATGACCGACCATGT
SEQ ID No：4CCGCTCGAGTCATGCGGGATTCCGT
SEQ ID No：5
tcatgcgggattccgttccg gttcacgttc acgttccagatcccgcagca cctgcgccac60gtgatcaccc gcctccgggc cctcgtaggc tcgcacgact tcctctattc caccgtgcat120ccgcacgttg ccgtggtcgatccagagagc ggaatcacac aattgcgcca ggaactcatt180ggaatgcgag gcgaacacca gcagaccgga gcgggacacc aattcctgca accgggttcg240cgccttcttc atgaactccg cgtcgaccgc gccgatgccc tcgtcgagca gcaggatctc300cggatcgatg gaggtcacca cgcccatggc cagccgcacc cgcatgccgg tggaataggt360gcgcagcggc atttccaaat agtcgccgag ctcggtgaat tcagcgatctcatcgatcgt420ggcgagcatc tgcttgcggg tctgcccgag gaacagaccg cgaatgatgatgttgtcgta480gccggagatc tccggatccatgccgacacc gagatcgaag accggcgcga cgcgtccgcg540aatccgcgcg ctgccgcggg tgggttcgta aatgcccgaa agcaggcgca gcagtgtcga600tttgcccgcg ccattgtggc cgaccaggcc gacccgatcg ccttccttga gcgacagatt660gatgtcgcgc agcgcctcga ccaccaccac gtcggattgg ttgcggccgatggcaccgcc720cgccttgccc atgaacgcct tcttcagcga acgggacttg gcgtcgaagatcgggaactc780cacccacgcg ttctgggttt cgatactcac atggtcggtc at 822
SEQ ID No：6
Met ThrAsp His Val Ser Ile Glu Thr Gln Asn AlaTrp Val GluPhe Pro IlePhe Asp AlaLys SerArg Ser Leu Lys Lys AlaPhe Met Gly Lys Ala Gly Gly Ala IleGlyArg Asn Gln SerAsp Val Val Val Val Glu AlaLeu Arg Asp Ile Asn Leu Ser LeuLy sGlu GlyAsp ArgVal Gly Leu Val GlyHis Asn Gly Ala Gly Lys Ser Thr LeuLeuArg Leu Leu Ser Gly Ile Tyr GluPro ThrArg Gly SerAlaArg Ile Arg GlyArgValAlaPro Val Phe Asp Leu Gly Val Gly Met Asp Pro Glu Ile Ser Gly Tyr Asp AsnIle Ile Ile Arg Gly Leu Phe Leu Gly Gln ThrArg Lys GlnMet Leu Ala Thr Ile AspGlu Ile Ala GluPhe Thr Glu Leu Gly Asp Tyr Leu GluMetPro LeuArg Thr Tyr SerThr Gly MetArg Val Arg Leu AlaMet Gly Val Val Thr Ser Ile Asp Pro Glu Ile LeuLeu Leu Asp Glu Gly Ile Gly AlaVal Asp Ala GluPhe Met Lys Lys AlaArg Thr ArgLeu Gln Glu LeuVal SerArg Ser Gly Leu LeuVal Phe Ala SerHis SerAsn Glu PheLeu AlaGln Leu Cys Asp Ser AlaLeu Trp Ile Asp His GlyAsnVal Arg MetHis GlyGly Ile Glu GluVal Val Arg Ala Tyr Glu GlyPro Glu AlaGly Asp His Val Ala GlnVal Leu Arg Asp Leu Glu Arg Glu Arg Glu Pro Glu Arg Asn Pro Ala。

Claims (7)

1.一种鲈鱼诺卡氏菌疫苗的制备方法，其特征在于，所述鲈鱼诺卡氏菌疫苗以鰤诺卡氏菌膜蛋白上的ABC家族的ATP结合蛋白作为候选抗原，根据所述候选抗原的基因序列设计引物，克隆到载体中，获得重组质粒制备得到。
2.根据权利要求1所述的鲈鱼诺卡氏菌疫苗的制备方法，其特征在于，所述鰤诺卡氏菌膜蛋白上的ABC家族的ATP结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：6所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。
3.根据权利要求1所述的鲈鱼诺卡氏菌疫苗的制备方法，其特征在于，所述质粒为原核表达重组质粒，培养含所述质粒的工程菌种，获得鲈鱼诺卡氏菌重组蛋白疫苗。
4.根据权利要求1所述的鲈鱼诺卡氏菌疫苗的制备方法，其特征在于，所述质粒为真核表达重组质粒，提取所述质粒，获得鲈鱼诺卡氏菌DNA疫苗。
5.根据权利要求4所述的鲈鱼诺卡氏菌疫苗的制备方法，其特征在于，用甘露糖化壳聚糖包裹所述真核重组质粒，获得鲈鱼诺卡氏菌靶向DNA疫苗。
6.一种鲈鱼诺卡氏菌疫苗，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的制备方法获得。
7.权利要求5所述的鲈鱼诺卡氏菌疫苗在防治鲈鱼诺卡氏菌病中的应用。
CN202310020564.0A 2023-01-06 2023-01-06 一种鲈鱼诺卡氏菌疫苗及其制备方法与应用 Pending CN116236566A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310020564.0A CN116236566A (zh) 2023-01-06 2023-01-06 一种鲈鱼诺卡氏菌疫苗及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310020564.0A CN116236566A (zh) 2023-01-06 2023-01-06 一种鲈鱼诺卡氏菌疫苗及其制备方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116236566A true CN116236566A (zh) 2023-06-09

Family

ID=86627052

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310020564.0A Pending CN116236566A (zh) 2023-01-06 2023-01-06 一种鲈鱼诺卡氏菌疫苗及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116236566A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113512096B (zh) 一种鲈鱼弹状病毒重组g2蛋白及其应用
CN113248574B (zh) 一种表达a型塞内卡病毒结构蛋白的方法
CN110408637B (zh) 一种草鱼出血病酵母口服疫苗及应用
CN113121704B (zh) 基于纳米颗粒的冠状病毒疫苗
JPS62501538A (ja) ａｒａＢプロモーターを含有する複製可能な発現ビヒクル
CN104593388B (zh) 一种鲫鱼疱疹病毒病jdorf25疫苗及制备方法和应用
CN110616227A (zh) 一种来源于黄粉虫的抗冻蛋白的基因、重组表达载体、工程菌株和应用
CN109395072B (zh) 一种腐败梭菌α毒素基因工程疫苗及其生产方法
CN112480227B (zh) 一种提高鲟鱼抵抗病原菌能力的蛋白及其制备方法与应用
CN109627316A (zh) 草鱼IFN-γ2基因及其编码的重组蛋白和应用
CN111773383B (zh) 一种o型***亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN110256570A (zh) 一种重组融合抗菌肽及应用
CN109997970B (zh) 一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用
CN113940993B (zh) 一种鲈鱼弹状病毒g2-2m亚单位疫苗及其制备方法
CN111875676A (zh) 非洲猪瘟病毒免疫原的p49突变蛋白、重组载体、大肠杆菌基因工程菌及制备方法和应用
CN116236566A (zh) 一种鲈鱼诺卡氏菌疫苗及其制备方法与应用
CN112679616B (zh) 一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗
CN105420174A (zh) 一种表达重组vegf融合蛋白的基因工程菌的构建
CN112159480B (zh) 一种鸡传染性法氏囊病病毒多抗原表位蛋白及其应用
CN111454336B (zh) 一种改造的鸭圆环病毒Cap蛋白及其制备方法和应用
CN107502616B (zh) 一种可溶性重组蛋白cta-cd154及其制备方法和应用
CN107827986B (zh) 猪O/Mya98和O/PanAsia型***基因工程灭活疫苗
CN109735477B (zh) 单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用
CN110257409B (zh) 一种红螯螯虾孵化酶基因及其应用
CN112076313A (zh) 一种***亚单位疫苗及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination