CN1162337A - 用具有提高的连接酶活性的微生物产生β-内酰胺类抗生素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及β-内酰胺类抗生素的生物合成。更具体地说，本发明涉及体内和体外产生β-内酰胺类抗生素的方法。本发明也涉及能够催化β-内酰胺类抗生素生物合成中所涉及的一些步骤的新酶。此外，本发明还涉及编码所述新酶的DNA构建体、包含所述DNA构建体的重组载体或转化载体、以及包含所述DNA构建体或重组载体的细胞。
Description
发明所属技术领域
本发明涉及β-内酰胺类抗生素的生物合成，更具体地说，本发明涉及产生β-内酰胺类抗生素的体内和体外方法。
本发明也涉及能够催化β-内酰胺类抗生素生物合成中所涉及的一些步骤的新酶。此外，本发明还涉及编码所述新酶的DNA构建体、包含所述DNA构建体的重组载体或转化载体、以及包含所述DNA构建体或重组载体的细胞。
发明背景青霉素的生物合成途径
青霉素的生物合成中的第一步涉及从L-α-氨基己二酸，L-半胱氨酸形成三肽δ-(L-氨基己二酰)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸(ACV)(Fawcett等，生物化学杂志，157，p.651-660，1976)。反应是由多功能酶δ-(L-氨基己二酰)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸合成酶(ACV合成酶)催化，其中以ATP和Mg为辅因子(Banko等，美国化学会杂志，109，p.2858-2860，1987)。
ACV合成酶(ACVS)已从Aspersillus nidulans(van Liempt等，生物化学杂志，264，p.3680-3684，1989)、顶头孢(Baldwin等，抗生素杂志，43，p.1055-1057，1990)和Streptomvces clavuligerus(Jensen等，细菌学杂志，172，p.7269-7271，1990，和Zhang等，Biotech-nol.Lett.，12，p.649-654，1990)纯化。还未从产黄青霉纯化出ACV合成酶。可是Diez等已从产黄青霉克隆ACV合成酶(生物化学杂志，265，p.16358-16365，1990)。
在异青霉素N合酶(也称作环化酶或者是异青霉素N合成酶(IPNS))、亚铁离子、氧和电子给体(例如抗坏血酸盐)存在下，线性三肽ACV转化成为异青霉素N(IPN)。Ramos等第一次从产黄青霉分离异青霉素N合酶(抗微生物剂和化疗，27，p.380-387，1985)，Carr等克隆了产黄青霉的异青霉素N合酶结构基因(基因，48，p.257-266，1986)。
在青霉素和头孢菌素产生真菌和细菌中，这些青霉素的生物合成的头两个步骤是普遍的。
在一些真菌(例如产黄青霉和A.nidulans)中，异青霉素N的α-氨基己二酰侧链可以被其它细胞内来源的侧链取代或由外源供给。这种交换被酰基转移酶(指酰基-辅酶A：6-氨基青霉烷酸酰基转移酶)催化。
尚非不清楚这种转化是否在体内通过两步反应进行，其中第一步反应除去6-氨基己二酰侧链，产生6-氨基青霉烷酸(6-APA)，其后为酰化步骤，或者转化是侧链的直接交换。从产黄青霉纯化的酰基转移酶具有异青霉素N-酰胺水解酶活性和酰基辅酶A：6-氨基青霉烷酸的酰基转移酶活性两者(AlvaFez等，抗微生物剂和化疗，31，p.1675-1682，1987)。
编码ACV合成酶(pcbAB)、异青霉素N合酶(pcbC)和酰基辅酶A：6-氨基青霉烷酸的酰基转移酶(penDE)的基因在产黄青霉和A.nidulans的相同族中发现(Diez等，生物化学杂志，265，p.16358-16365，1990，和Smith等，生物技术，8，p.39-41，1990)。
分别编码异青霉素N合酶(IPNS)和酰基转移酶(AT)的产黄青霉Wis54-1255的pcbC-penDE基因簇的扩增导致产率提高高达40％(Veenstra等，生物技术杂志17，p.81-90，1991)。也报道了在包含有多拷贝pcbAB(编码ACV合成酶(ACVS))和pcbC基因(编码异青霉素N合成酶(INPS))的A.nidulans转化体中的增加的抗生素产量(McCabe等，生物技术杂志，17，p.91-97，1991)。
EP200425(Eli Lilly)公开了编码异青霉素N合成酶(IPNS)的载体。所说载体使得在顶头孢和大肠杆菌中高水平表达IPNS。按照公开的内容，所说的头孢属载体对菌株改进来说是有用的，在发酵中增加青霉素和头孢菌素抗生素的效率和产量。所说载体也可以被修饰，产生在发酵中增加产黄青霉和Streptomyces clavuliserus等的产率和效率的载体。
EP357119(Gist Brocades)公开了编码IPNS、AT和ACVS簇集的抗生素生物合成基因，并有利地用于在微生物中改善抗生素产生和用于分离抗生素生物合成中涉及的其它基因。本发明用产黄青霉中青霉素增加的产生，用另外的簇集生物合成基因的分离和用簇集青霉素生物合成基因在枝顶孢霉中的表达。侧链的活化
为了在酰基转移酶催化反应中替代α-氨基己二酸的侧链，活化新侧链的羧基。这一活化作用是青霉素生物合成中最不清楚的部分之一。已提出了两种理论。
最广泛地可接受的理论是所说的酶在Mg2+存在下，经进行ATP(腺苷三磷酸)焦磷酸水解(pyrophosphorolysis)的两步机制催化羧酸酯化成辅酶A硫代酸酯，首先，羧酸(新的侧链)、腺苷三磷酸和酶形成复合物，导致产生酰基-AMP-酶复合物。其次，这一复合物与辅酶A进行反应以释放酰基辅酶A和AMP(腺苷一磷酸)。
其它的理论基于酰基-S-谷胱甘肽中间体的形成，其可以转化成相应的酰基辅酶A酯(Ferrero等，抗生素杂志，43，p.684-91，1990)。
得自产黄青霉的苯甲酰甲基：辅酶A连接酶在ATP、Mg2+，辅酶A和苯氧乙酸或者是苯乙酸存在下能够催化苯氧乙酰辅酶A和苯基乙酰辅酶A的合成，这一点由效率文献报道：Brunner，Rhr和Zinner(Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.，349，p.95-103，1968)，Brunner和Rhr(酶学方法，43，p.476-481，1975)；Kogekar和Deshpande，Ind.生物化学生物物理杂志，19，p.257-261，1982)，和Kurzatkowski，Med.Dosw.Mikrobiol.，33，p.15-29，1981)。按照Brunner等，所说的连接酶对苯乙酸、苯氧乙酸和乙酸显示出类似程度的活性。然而，酶未被纯化为均一的。
Martinez-Bianco等(生物化学杂志，267，p.5474 5481，1992)描述了得自产黄青霉Wis54-1255的乙酰辅酶A合成酶与Brunner等描述的连接酶一样，在相应酰基辅酶A酯的合成中不仅接受乙酸而且接受苯乙酸为底物。然而，Martinez-Bianc等没有描述对苯氧乙酸的活性。按照Martinez-Bianco等，乙酰辅酶A合成酶是一个同源二聚体(α2)，由凝胶过滤测定时具有139,000道尔顿的分子量，由SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)测定时具有70,000道尔顿的分子量，等电点在pH值5.6-6.0之间。
Martinez-Bianco等的编码乙酰辅酶A合成酶的基因已由Martinez-Bianco等确定了特征(基因，130，p.265-270，1993)。指定为acuA的基因包含五个内含子并编码669个氨基酸的多肽。这一多肽具有74,287的分子量。
Gouka等(应用微生物学生物技术，38，p.514-519，1993)和VanHartingsveldt等(WO92/07079)描述了得自产黄青霉的编码相应于分子量约为74,000道尔顿(采用各氨基酸110g/mol的平均分子量)的669个氨基酸之蛋白质的乙酰辅酶A合成酶(facA)基因的的分离和序列。Gouka等的facA基因和Martinez-Bianco等的acuA基因序列没有显示出不同。
Brunner等以及Kogekar和Deshpande描述的苯基酰基辅酶A连接酶的详尽的特征还没有出版。
在其活化形式中，用来在酰基转移酶催化反应中取代α-氨基己二酸酸侧链的新的侧链可以是辅酶A硫代酸酯或者是其它硫代酸酯的形式。因为其它硫代酸酯(例如酰基S-半胱氨酰-甘氨酸和酰基S-谷胱甘肽)被报道是酰基转移酶的底物。另一种可能性是，在它进入至酰基转移酶反应中之前，二肽(半胱氨酰-甘氨酸)在-非酶促反应中可以由CoASH替代(Ferrero等，生物化学杂志，265，p.7084-7090，1990)。
一旦形成，硫代酸酯的亚硫酰基就可以在-非酶促反应中迅速地与其它硫醇交换(例如巯基乙醇，1，4-二硫苏糖醇，ACV和辅酶A)。一般的连接酶
属于6.2.1.酶亚类的连接酶酸-硫醇连接酶(酶命名法，学院出版社，inc.，1992)也称作酰基辅酶A合成酶或者是酰基辅酶A硫激酶，在ATP和Mg2+存在下其催化从羧酸和辅酶A形成酰基辅酶A硫代酸酯。
各种来源的若干连接酶或酰基辅酶A合成酶已被鉴别，例如乙酰辅酶A合成酶，丙酰辅酶A合成酶(Groot，生物化学生物物理学报，441，p.260-267，1976)；丁酰辅酶A合成酶(Wanders等，生物化学杂志，240，p.29-33，1965)；中长链、长链和特长链脂肪酰辅酶A合成酶(Waku，生物化学生物物理学报，1124，p.101-111，1992，综述)；得自假单胞菌的种的苯甲酰辅酶A连接酶(Auburger，应用微生物学生物技术，37，p.789-795，1992)和苯乙酰辅酶A连接酶(Martinez-Bianco等，生物化学杂志，265，p.7084-7090，1990；和Vitovski(FEMS微生物学通讯，108，p.16，1993)。它们中的大多数具有广泛的底物特性。
酰基辅酶A合成酶(连接酶)在脂肪酸和乙酸的初级代谢中和在芳族酸的降解的起始步骤中是总的关键性的酶，其中它们通过富含能量的形成硫酯键活化羧酸的酰基。β-内酰胺的体内产生
许多所谓的天然β-内酰胺(例如青霉素DF，异青霉素N，6-APA，头孢菌素C等)是不稳定的，难于从发酵液中纯化，具有有限的抗生素作用和/或以低产量产生。
用例如苯氧乙酸或者是苯乙酸代替天然β-内酰胺的侧链导致形成更稳定，易于分离和具有更高的抗生素活性的青霉素(分别为青霉素V和青霉素G)。
工业上有利益的仅有的直接发酵的青霉素是青霉素V和青霉素G，它们是通过分别添加苯氧乙酸或者是苯乙酸到发酵罐产生的。在产黄青霉的发酵期间添加其它其它前体(例如2-噻吩-乙酸或者是3-噻吩-乙酸)导致产生其它青霉素。在产生青霉素中使用乙酰转移酶底物之前，某些添加的前体(例如1-苯基-n-烷烃或1-苯氧基-n-烷烃)在产黄青霉细胞内可被部分代谢(Szarka，生物学进展，3，p.167-173，1980；Szarka等，US4,250,258；和Szarka等，US4,208,481)。在所谓的天然的青霉素(例如，青霉素DF，青霉素K，青霉素F和青霉素H)的生物合成中，侧链(己酸，辛酸，3-己烯酸和庚酸)很可能分别来源于初级代谢。
在某些情况下，苯氧乙酰或苯基乙酰侧链在发酵和回收β-内酰胺期间也充当保护基，因为分离的青霉素V或G被有机化学或酶促过程水解形成6-APA，它反过来是新的半-合成青霉素的基本的构成材料，所述半-合成青霉素与天然青霉素以及青霉素V或G相比具有改进的药理学性质。
同样地，在头孢菌素的产生中，天然头孢菌素类抗生素具有有限的药学价值，因为它们太难分离，并且仅具有低的抗生素作用。而且，它们难以转变成具有更高药学价值的新的头孢菌素类抗生素。
为了把所发酵的头孢菌素转变成所需的抗生素，采取了许多步骤，例如，在口服头孢菌素头孢力新和头孢羟氨苄的产生中，起点是青霉素V或G，通过一系列化学反应将它们转化成头孢菌素，保持苯氧乙酰或苯基乙酰侧链作为保护基。在环扩展后，分别形成V-DCA或G-DCA(V/G-脱乙酰氧基头孢菌酸)，用类似于青霉素V或G水解的方法由水解除去侧链。最后，经有机化学方法添加一新的侧链(例如，D-苯基甘氨酸或D-p-羟基苯基甘氨酸)。
在从头孢菌素C产生头孢菌素的过程中，D-α-氨基己二酸酸可以由化学水解或两步有机化学酶促过程除去。然后酰基所产生的7-ACA(7-氨基头孢菌酸)形成所需产物。
导致形成V-DCA、G-DCA和水解头孢菌素C成7-ACA的两种反应都以工业规模进行，但它们难以控制、昂贵，并且产量一般地低。
为了解决这些问题，已提出了若干替换性的方法，其中一些涉及用得自链霉菌属表异构酶和expandase转化产黄青霉，如C.Cantwell等，248，p.283 289，1992.所述。它们说明转化的产黄青霉能够产生脱乙酰氧基头孢菌酸。然而，没有发现V-DCA。为了改变接受青霉素V或G作为底物的底物特异性，Cantwell建议可以用基因工程修饰expandase。然后，可以直接由发酵产生V/G-DCA。
S.Gutiérrez等，Mol.Gen.Genet.，225，p.56 64，1991指出，转化的顶头孢具有产黄青霉的酰基转移酶，能够经转化的顶头孢检测青霉素G的形成，但是尚未证明G-DCA的存在。
EP532341(Merck公司)描述了采用由Streptomyces clavuliserus的expandase转化的产黄青霉的己二酰-7-ADCA(7-氨基脱乙酰氧基头孢菌酸)的发酵。然后，7-ADCA可以从发酵液中抽提出来，并由得自假单胞菌属的己二酰酰基转移酶水解。
ES2,016,476公开了苯基乙酰辅酶A和苄青霉素(青霉素G)的体外生物化学制备法。通过在10-45℃和pH值5-10下与ATP、苯乙酸和MgCl2一起温育得自恶臭假单胞菌的苯基-乙酰辅酶A连接酶10-180分钟制备苯基乙酰辅酶A。通过在10-40℃和pH值5.5-9下与6-氨基青霉烷酸和苯乙酸、ATP、辅酶A和MgCl2一起温育得自产黄青霉的苯基乙酰辅酶A连接酶和酰基辅酶A：6-氨基青霉烷酸的酰基转移酶30-180分钟制备苄青霉素。
ES2,033,590公开了衍生至苯基苄青霉素(青霉素G)的不同青霉素的体外产生方法。该方法包括温育包含恶臭假单胞菌的苯基乙酰辅酶A连接酶和产黄青霉的酰基辅酶A-氨基青霉烷酸酰基转移酶的酶系、底物(如6-氨基青霉烷酸)、腺苷三磷酸、辅酶A、MgCl2、二硫苏糖醇(DTT)和青霉素前体。
现有技术中公开了包括体外步骤的产生某些青霉素和头孢菌素的方法，这些方法通常难以控制、麻烦和/或昂贵。
发明概述
本发明的目的是克服以上所述的一些问题。通过提供产生β-内酰胺类抗生素的改进的方法达到了这一目的，这一方法是在与原始发酵条件下用原始微生物单独发酵时的连接酶活性相比，连接酶活性提高的情况下进行的。
本发明也涉及表现出连接酶活性的新的酶，这种酶具有对重要的β-内酰胺前体(如苯氧乙酸，苯乙酸和己二酸)的高的底物特异性和对乙酸的低的特异性。
按照本发明的酶可以得自丝状真菌产黄青霉、构巢曲霉或顶头孢。
所说的新酶可以用于各种β-内酰胺类抗生素的生物合成。
提供用于产生β-内酰胺类抗生素体外的方法也是本发明的目的。
本发明也包括编码所说的显示出连接酶活性新酶的DNA构建体。
此外，提供包含所说的DNA构建体重组载体或转化载体也是本发明的目的。
本发明也涉及包含所说的DNA构建或所说的重组载体的细胞。
附图简要描述
图1显示作为发酵期的函数的ACV和异青霉素N的浓度。
图2显示连接酶活性的最佳pH值。
图3显示连接酶活性的最适温度。
发明详述
β-内酰胺的产生中的一个重要的因素是经济地产生，导致增加的发酵产量的改进的方法和易于控制、不麻烦、因而不昂贵的方法是所需的。
本发明的目的是提供这样的产生β-内酰胺类抗生素的改进的方法。
现在已令人惊奇地发现，在增加连接酶活性的存在下产生兴趣β-内酰胺类抗生素，就可以提供这样的改进的方法。
按照本发明，这样的改进的产生β-内酰胺类抗生素的方法包括：
(i)发酵能够产生所述β-内酰胺类抗生素的微生物，和
(ii)回收实质上纯化的形式的所述β-内酰胺类抗生素，其中所述的发酵是在与原始发酵条件下用原始微生物单独发酵时的连接酶活性相比，连接酶活性提高的情况下进行的。
增加的连接酶活性被定义为与未修饰的原始微生物和/或原始发酵条件相比，所研究的羧酸对相应酰基辅酶A酯的增加的转化。
在本发明的实施方案中，能够产生β-内酰胺所说的原始微生物缺乏或仅有低的连接酶活性。
增加的连接酶活性的表达可以用任何适合的方法完成。
按照本发明的作为例子的实施方案，可以通过调节发酵方法的物理的条件(如温度和pH值)增加连接酶活性，另一种可能性是使微生物接触化合物或者试剂，导致连接酶增加的表达。所述化合物或试剂的性质取决于例如，用于起始连接酶表达的启动子。此外，通过干扰控制连接酶表达的细胞控制机理，可以完成增加的连接酶活性的表达。
在本发明的实施方案中，通过修饰所说的微生物获得所说的连接酶活性或者增加的连接酶活性。
这可以由已知的方法完成，例如包括将至少一个DNA构建体或重组载体的拷贝引入到所述用于发酵的原始微生物中，所述DNA构建体或重组载体包含编码表现出连接酶活性的酶的基因。
在实施方案中，连接酶活性或者增加连接酶活性由随机或定向特异性诱变所说的微生物获得。
此外，导致增加的连接酶活性的所说的修饰可以由连接酶的氨基酸的取代、缺失或添加获得，如下所描述的。
另外，所说的连接酶活性或者增加的连接酶活性可以通过在的产生β-内酰胺抗生素期间添加显示出连接酶活性的酶获得。
在另一实施方案中，所说的DNA构建体来自不同于其被引入的微生物的物种。
可以用如下所述的已知的方法完成DNA的构建体或可以的转化载体的引入。
在一定的情况之下，理想的是移去整个β-内酰胺的生物合成能力，包括使另一个微生物表达显示出连接酶活性的酶，所述微生物自身不能产生所说的β-内酰胺。如果受体(宿主)微生物例如1)是更容易转化的，2)能够高水平地表达生物合成酶，3)有更好的生长特征或4)产生更少的干扰回收的杂质时，可以是这种情况。这样，可以获得更高的β-内酰胺的总产率。
有机体中的另外的新的生物合成路线可能是理想的。
按照本发明，以上所述的受体或宿主微生物来自包含以下微生物的组：青霉属、头孢属、曲霉属、诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属、Cerospora、小孢囊菌属、其它真细菌类、其它放线菌或丝状真菌。
在优选的实施方案中，所说的微生物属于下列物种：产黄青霉、点青霉、顶头孢、构巢曲霉、Nocardia lactamdurans和带小棒链霉菌。
在本发明的实施方案中，所述的连接酶活性的表达同步于其它属于β-内酰胺生物合成途径的基因的表达。所述基因可以是pcbAB、pcbC和/或penDE基因。
以上提及的β-内酰胺抗生素选自包含青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、mono-bactams、和诺卡杀菌素类的组。
优选的所述抗生素是一种头孢菌素或一种青霉素，优选的是青霉素V、青霉素G、V-DCA、G-DCA、7-(L-a-5-氨基-羧基戊酰氨基)-头孢菌酸(异头孢子菌素C)、7-ADCA、或者是7-ACA。
在本发明的一个实施方案中，在诱导所述DNA构建体表达的条件下培养所述的微生物，由此导致产生活化的侧链辅酶A硫代酸酯，在酰基转移酶(AT)存在下，依次导致形成包含所述侧链的β-内酰胺。
在诱导所述DNA构建体表达的条件下培养所述的修饰过的微生物，由此导致产生增加量的相应于所需β-内酰胺类抗生素侧链的羧酸的辅酶A硫代酸酯。其反过来通过β-内酰胺生物合成步骤使得可以产生增加的通量(flux)，其中β-内酰胺侧链被引入进β-内酰胺核。
此外，也可以在诱导所说连接酶表达的条件(依据启动子)下培养所说的微生物。
在产生青霉素V或青霉素G的特定的情况，经例如基因工程产生的增加的连接酶活性，将经生物合成中的最后步骤导致增加的代谢流量(flow)。
按照本发明的方法的优点是，第一，它可以产生明显增加的累积量的目的β-内酰胺类抗生素。
其次，因为形成较少的的废产物，有利于以实质上纯化的形式回收和纯化β-内酰胺类抗生素。
第三，本发明使得可以产生兴趣β-内酰胺类抗生素，不产生大量的废物。因而由于对合成目的产物而言可以获得更多的能量，其使过程更有效。此外，废物-产物可以逆向干涉生物合成途径。
第四，与采用缺乏和具有较低活性的所述连接酶的微生物的发酵方法相比，在发酵过程的任何时期，目的β-内酰胺类抗生素的产率是明显提高的。在本文中所述的产率可以是总产率或某一期间的产率。
所有以上提及的优点使得所述的方法可以廉价地制造工业重要的β-内酰胺类抗生素。
在产生青霉素V和青霉素G的情况下，发酵期间观察到ACV和异青霉素N的积累，按照本发明，当异青霉素N转化成青霉素V是″瓶颈″步骤时，增加的连接酶活性将导致所说中间体积累的降低。
按照本发明，缺乏和具有较低活性的所述连接酶的微生物中的连接酶活性的表达或仅仅是连接酶活性的增加可以使得非酶促除去在产生例如青霉素和头孢菌素中多余的β-内酰胺类抗生素中间体的侧链。
此外，如果所谓的天然β-内酰胺的侧链被疏水侧链取代，则可以有利于发酵的β-内酰胺的回收和后续的酶促水解，所说的疏水侧链例如苯氧乙酸或苯乙酸，其易于被采用青霉素V酰基转移酶或青霉素G酰基转移酶(在6-APA产生的β-内酰胺工业中是公知的)的酶促水解除去。
因而，这一方法开创了体内产生某些工业重要β-内酰胺抗生素中间体(如V-DCA或G-DCA)的可能性。
按照本发明，以发现完全用酶促催化过程(而不产生任何化学过程)产生某些β-内酰胺类抗生素是可能的。
在本发明的实施方案中，通过诱导宿主微生物表达按照本发明的增加的连接酶活性，用体内酶促方法完全产生了V-DCA或G-DCA，另外存在的酶是酰基转移酶(AT)(例如产黄青霉的酰基辅酶A：异青霉素N酰基转移酶)和能够把青霉素转变成为头孢菌素的酶(例如，S.clavuliserus的expandase)。
本发明也涉及按照本发明可以使用的新酶。
最近已获得了一种表现出连接酶活性的合适的新酶，并确定了其特征。
按照本发明，这一新酶是酰基-辅酶A合成酶(连接酶)，当产生β-内酰胺类抗生素时，其导致针对目标产物的增加的流量。
按照本发明，所述酶的一个特征是它具有对某些重要的工业β-内酰胺类抗生素前体的高的特异性。
由于本发明的连接酶对乙酸没有明显的活性，连接酶活性的增加的表达不太可能干涉乙酰辅酶A的胞内可获得性(初级代谢中的关键的代谢物)。因此，与一些操作(例如遗传的或化学的)比较，降低了逆向干扰初级代谢的危险性，导致对乙酸和苯乙酸和/或苯氧乙酸和/或己二酸具有活性的连接酶的增加的表达。
更具体地说，按照本发明的酶对苯氧乙酸比对乙酸的底物特异性高至少10-100倍，优选的是103倍，更优选的是104和105倍。
此外，本发明的酶是如上所提到的酰基辅酶A合成酶，更具体地说是苯氧乙酰辅酶A合成酶，以下称作″连接酶(ligase)″。
所述连接酶的催化活性形式的表观分子量用凝胶过滤测定时在40,000到60,000道尔顿范围内。特别是约50,000道尔顿。
在pH值7.0至9.0的范围中，特别是在pH值8.0至8.5的范围内，所说的连接酶具有最佳的表观活性(apparent activity)。在pH值7.5或更低时，所述的酶体外仅表现出低的活性，很可能是由于保持在pH值低于7.5时，所述连接酶的低的稳定性。
连接酶活性的最适温度在35℃和45℃之间，在约40℃时具有最高的活性。
所述连接酶的等电点似乎高于pH7.25，很可能高于9，并在pH12以下。
所述的酶可以从产黄青霉的细胞提取物纯化，方法是经硫酸铵沉淀和经用从填充有各种凝胶(例如，Phenylsepharose，Cibacron blue和SephacrylS-200)的柱洗脱。这种连接酶纯化的例子在以下给出。然而，可以使用用于纯化蛋白质的其它已知的方法，例如可以使用其它柱材料，例如Reactive Red、SepharoseQ FF和琼脂糖凝胶S FF。
本发明已显示，所述的连接酶可以从Mg+、腺苷三磷酸CoASH和苯氧乙酸，苯乙酸，己二酸或己酸分别催化形成苯氧乙酰辅酶A、苯基乙酰辅酶A、己二酰辅酶A和己酰辅酶A。在相同的***(例如，在以下实施例中所描述的)中测定时，所说的连接酶不显示出对乙酸的任何明显的活性。
所述酶体外不稳定，但是在纯化和存储期间添加腺苷三磷酸、Mg2+、巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)、抗坏血酸或者其它还原剂明显稳定所述的活性。高浓度的硫酸铵或甘油的存在也稳定所说的酶。
在以下实施例6中所描述的条件下，基于测定中CoASH的消耗，对苯乙酸活性大约是对苯氧乙酸活性的80％。
仅当在不存在其它硫醇(例如，巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT))时，观察到直接的苯氧乙酰辅酶A合成活性。然而，连接酶与腺苷三磷酸、Mg2+、CoASH，苯氧乙酸和例如巯基乙醇一起的温育导致形成一种化合物，该化合物具有与苯氧乙酸和巯基乙醇的硫代酸酯和苯氧乙酰-S-CH2-CH3(其也可以作为酰基转移酶的底物)相同UV谱。
在本发明的实施方案中，所说的酶与抗所说的纯化的产黄青霉菌株B10之连接酶的抗体是免疫学反应性的。
可以经交叉反应等同性试验免疫测定所述酶的免疫化学性质。所述的等同性试验可以按照N.H.Axelsen：凝胶免疫沉淀技术手册；Blackwell科学出版物，第5和14章，1983，经公知的Ouchterlony双向免疫扩散方法或者经串联交叉免疫电泳完成。在本书的第5、19和20章描述了“抗原等同性”和“部分抗原等同性”。
按照本发明的酶是一种多肽。
按照本发明的酶包括成熟蛋白质或其前体形式和其基本上具有全长多肽活性的功能性片段。
本发明还包括所述酶的同系物，这些同系物包括表现出与按照本发明的酶的氨基酸序列具有至少50％-70％，较好的是70％-80％，更好的是多达100％的等同性的氨基酸序列。
也抗原经常规方法确定等同性的程度，参见例如：Aitshul等.Bull.Math.Bio.，48，p.603-616，1986，和ttenikoff和Henikoff，美国科学院学报，89，p.100915-10919，1992；简言之，排列两个氨基酸序列，以优化序列排列得分，用凹节开口障碍(gab opening penalty)为10，缺口延伸障碍(gap extension penalty)为1，以及Henikoff和Henikoff的(同上)的″blosum 62″评分基准。
另外，按照本发明的酶的同系物也可以由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与基于表现出连接酶活性的所述酶的核苷酸序列制备的寡核苷酸探针杂交。
用标准的检测方法(例如，Southern印迹法)检测在这些条件下寡核苷酸探针可杂交到其上的分子。
所述的多肽的同系物可以具有一个或多个氨基的酸取代，缺失或者添加。这些变化优选地是小的性质上的变化，即不影响蛋白质的折叠或活性的保守氨基酸取代；小的缺失(典型地是1到约30个氨基酸的缺失)；小的氨基-或羧基末端延伸，如氨基-末端甲硫氨酸残基，至大约20-25个残基的小的接头肽，或有利于纯化的延伸，如多-组氨酸片段，抗原表位或结合域。一般性的情况参见Ford等，蛋白质表达和纯化，2，p.95-107，1991。保守取代的实例在下组氨基酸内：碱性氨基酸(如精氨酸，赖氨酸，组氨酸)，酸性的氨基酸(如谷氨酸的和天冬氨酸)，极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(如亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸)，芳族氨基酸(如苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸)。
本领域技术人员清楚，这种取代可以发生在分子的关键的功能区之外，但仍然产生活性酶。可以按照本领域已知的方法鉴别对本发明的酶的活性所必需的氨基酸，所述方法例如定向诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学，244，p.1081 1085，1989)。在后一技术中在分子的各残基引入诱变，并试验所形成的突变分子的生物学活性(如连接酶活性)，以鉴别对所述分子的活性关键性的氨基酸残基。也可以通过分析晶体结构(如由例如核磁共振、结晶学或光亲和(photoaffinity)标记之类的技术测定)确定配体-受体相互作用位点。参见，例如，Vos等，科学，255，p.306-312，1992；Smit al.，分子生物学杂志，224，p.899-904，1992；Wlodaver等，FEBS Lett.，309，p.59-64，1992。
所说的同系物可以是等位变体，例如经突变产生的基因的另一种形式，或者由突变基因编码的改变的酶，其具有与本发明的酶相同的活性。因此突变可以是沉默的(所编码的酶无改变)或者可以编码具有改变的氨基酸序列的酶。
所述的酶的同系物也可以是一种物种同系物，即，得自另一物种的具有类似活性的酶。
可以经制备所述物种细胞的基因组或cDNA文库，并采用按照标准技术(例如，由Sambrook等分子扩增：实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989所描述的)的合成寡核苷酸探针筛选编码全部或部分类似物的DNA序列，或者可以经采用Sambrook等(同上)所描述的特异性引物的聚合酶链反应的方法来分离所述酶的同系物。
此外，本发明的酶的同系物是与抗本发明的酶的抗体有免疫学交叉反应的那些。
本发明的另一个目的是提供编码所说的显示出连接酶活性的酶的DNA构建体。
本文使用的术语″DNA构建体″意指任何cDNA、基因组DNA、合成的DNA或者RNA源的核酸分子。术语″构建体″意指核酸片断，其可以是单链或双链，并且可以基于编码目标多肽的全部或部分天然产生的核苷酸序列。所述的构建体可以包含可以不包含其它核酸片段。
编码本发明的多肽的本发明的DNA构建体适合的可以是基因组的或者cDNA源的，例如通过以下方法获得的，所述方法即制备基因组或cDNA文库，经采用按照标准技术(例如，由Sambrook等分子扩增：实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989所描述的)的合成寡核苷酸探针杂交筛选编码全部或部分多肽的DNA序列。
编码本发明的多肽的本发明的DNA构建体也可以经已建立的标准方法通过合成制备，所说的方法例如Beaucage和Carurs，四面体通讯，22，p.1859-1869，1981所描述的phosphoamidite法或Mats等，EMBO杂志，3，p.801-805，1984所描述的方法。按照phosphoamidite方法，在例如自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化、退火、连接并在合适的载体中克隆。
此外，DNA构建体可以是混合的合成的和基因组的，混合的合成的和cDNA的或混合的基因组的和cDNA源的，其是按照标准的技术经连接合成的、基因组的或者cDNA源的(适当时)片段制备的，所述片段相应于完整核酸构建体的各部分。
可以用例如US4,683,202或Saiki等，科学，239，p.487-491，1988中的描述，用特异性引物经聚合酶链反应制备DNA酸构建体。在本发明的一个优选的实施方案中，所说的DNA序列得自曲霉属、青霉属或头孢属的丝状真菌，优选的得自产黄青霉、顶头孢、或构巢曲霉的菌株，特别是产黄青霉菌株B10。
另一方面，本发明涉及重组载体或转化载体，其包含编码显示出连接酶活性的所述酶的本发明的所述DNA构建体。***了本发明的DNA构建体的重组体载体可以是易于进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择通常取决于要引入构建体的宿主细胞。这样，载体可以是自主复制载体，即以染色体外因子存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如，质粒。另外，载体可以是这样一种载体，当引入进宿主细胞时，其整合进宿主细胞基因组，并且与整合了该载体的染色体一起复制。
所述载体优选的是表达载体，其中编码本发明的多肽DNA序列可操作地连接到DNA转录所需的附加片断上。一般来说，所述的表达载体来自质粒或病毒DNA，或可以包含它们的成分。术语″可操作连接″之片段被排列得能够使其发挥预期的功能，例如转录由启动子开始，并通过编码多肽的DNA序列进行。
所述启动子可以是任何DNA序列，其在选择的宿主细胞中显示出转录活性，并且可以得自编码蛋白质的对宿主细胞同源的或异源的基因。
用于丝状真菌宿主细胞的合适的启动子的例子，例如，ADH3启动子(McKnight等，EMBO杂志，4，p.2093-2099，1985)或tpiA启动子。其它有用的启动子的例子是那些来自编码下列酶的基因：米曲霉FAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gluA)、Rhizomucormiehei脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶。优选的是TAKA-淀粉酶和gluA启动子。
为了获得同步地产生β-内酰胺抗生素合成中涉及的中间体，采用相同的或类似的启动子调节两个或多个生物合成基因常常是有利的。如果中间体的产生不同步，就可以出现中间体的积累(瓶颈)。由此，β-内酰胺的产生可以被保持。
在本发明的实施方案中，所述连接酶基因的启动子被来源于β-内酰胺的生物合成中涉及的另一基因的启动子替代。
适合启动子的一个例子AT启动子，在未出版的丹麦专利申请1118/94中描述。
用于细菌宿主细胞的合适的启动子的例子包括下列基因的启动子：Bacillus stearormophilus麦芽淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因、液解化淀粉杆菌BAN淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因、或短小芽孢杆菌木糖苷酶基因，或噬菌体λPR或PL启动子或大肠杆菌lac、trp或tac启动子，
编码本发明的酶的DNA序列(如果必要)也可以是可操作连接到合适的终止子上的。
本发明的重组体载体有利地可以包括使载体能够在所研究的宿主细胞中复制的DNA序列。
重组载体也可以包括一个选择性标记，例如，其产物补充宿主细胞缺陷的基因，如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖酵母TPI基因(由P.R.Russell，基因，40，p.125-130，1985描述)，或赋予药物抗性的基因，所述药物例如，氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、腐草霉素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤。对于丝状真菌，可选择的标记包括amdS、PvrG、arqB、niaD、和sC。
为了使本发明的连接酶到宿主细胞或发酵介质的合适位置，在重组载体中可以分别提供导向信号或分泌信号序列(也称作前导序列、原序列或前序列)。在正确的读框中导向信号或分泌信号序列连接至编码酶的DNA序列上，分泌序列一般被置于编码酶的DNA序列的5’端，而导向信号序列一般被置于配置于所述DNA序列的3’端。导向信号或分泌信号序列可以是通常与所述的酶相关的那些或者可以来源于具有所需信号序列的编码另一种蛋白质的基因。
为用于丝状真菌中，所说的信号肽可以方便地从以下基因衍生：编码曲霉属淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因、编码Rhizomucor miehei脂酶或蛋白酶和Humicola lanusinosa脂酶等的基因。所述的信号肽优选地衍生至编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸-稳定性淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因。
按照本发明，所述的导向序列优选地是能够指导连接酶活性至细胞内所需位置(例如至微体)的导向信号。保持潜在的靶信号常常是合乎需要的。然而，导向信号可以由其它具有相同功能的信号代替。而且，如果***连接酶编码序列(缺乏合适的连接酶导向信号)到有机体，其可被添加以便在宿主细胞所需位点具有连接酶表达。
对丝状真菌中的使用，Keller等，细胞生物学杂志，114，p.893-904，1991)描述了过氧物酶体导向信号(PTS)的例子，其具有在例如粗糙脉孢菌中向(被分类为微体)过氧物酶体转移胞质过客蛋白质的能力。
用于分别连接编码所述酶的DNA序列、启动子和可有可无的终止子和/或分泌信号序列或导向信号序列的方法和将它们***到包含复制所需的信息之合适的载体中的方法是本领域技术人员熟知的(参见Sambrook等分子扩增：实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)
本发明的另一个目的是提供包含按照本发明的DNA构建体或重组体载体的细胞。
引入宿主细胞的编码本发明的多肽的DNA序列对所研究的宿主可以是同源的或异源的。如果同源于宿主细胞，例如由宿主细胞天然产生的，其可以可操作连接到另一启动子序列或(如果使用时)另一分泌信号序列和/或终止子序列上而不是其自然环境。术语″同源″包括cDNA、半合成或合成产生的DNA、编码所研究的宿主微生物天然多肽的序列。术语“异源”包括所述宿主天然不表达的DNA序列，其可以是来源于另一生物体的DNA序列，或者可以是合成序列。引入本发明的DNA构建体或重组体载体的宿主细胞可以是使得能够产生本发明的多肽(酶)的任何细胞，并且优选地包括丝状真菌和细菌细胞。
培养时能够产生本发明的酶的细菌宿主细胞的例子是革兰氏-阳性细菌(例如芽孢杆菌属的菌株，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、Bacillus alkalophilus、液解化淀粉杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌菌株，或者链霉菌属的菌株，如浅青紫链霉菌、鼠灰链霉菌或带小棒链霉菌)或革兰氏-阴性细菌如大肠杆菌。通过原生质体转化或通过本领域已知的感受态细胞进行细菌的转化(参见Sambrook等，同上)。
当在细菌(如大肠杆菌)中表达所述酶时，所述的酶可以保持在细胞质中(典型地是以不溶性颗粒(称作包含体))，或者可以被细菌分泌序列导引到周质空间。在前一情况下，裂解细胞，回收和变性所说颗粒，此后，通过稀释变性剂重折叠多肽。在后一情况下，可以通过破碎细胞(例如，经声处理或渗压震扰)，释放周质空间内含物和回收酶来从所说的周质空间回收所说的酶。
丝状真菌细胞的例子是例如，青霉属、曲霉属、脉孢菌属、镰刀菌属、木霉属或头孢属的种的细胞，特别是产黄青霉、点青霉、米曲霉、构巢曲霉或顶头孢的菌株。真菌细胞可由涉及本领域已知的原生质体形成和原生质体转化接着细胞壁再生的方法转化。在例如EP272277、EP238023和EP184438中描述了曲霉属的种在表达蛋白质上的用途。可以用例如Malardier等，1989，基因，78，p.147-156的描述进行F.oxysporum的转化。当丝状真菌用作宿主细胞时，其可以由本发明的DNA构建体转化，方便地是DNA构建体整合进宿主染色体中获得重组宿主细胞。这一整合一般被认为是有利的，因为DNA序列很可能在细胞中稳定保持。可以按照常规方法(例如，同源或异源重组)完成DNA构建体整合进宿主染色体。
然后，在允许表达所说酶的条件下，在合适的营养培养基中培养转化或者转染的宿主细胞，此后从培养物回收所形成的酶。
用于培养细胞的培养基可以是任何常规的适于培养宿主细胞的培养基。例如基本培养基或包含合适补充物的复合培养基。合适的培养基是可以通过商业途径获得的，或者是可以按照已出版的配方(例如，美国典型培养物保藏中心目录)制备的。
然后，用常规方法从培养基回收细胞产生的酶，所说的方法包括经离心或过滤从培养基分离宿主细胞，经盐(例如硫酸铵)法沉淀上清液或滤液的蛋白质组分，经各种色谱法和/或电泳法(例如离子交换色谱，凝胶过滤色谱，等电聚焦，亲和色谱等)纯化，取决于所研究的多肽的类型。
在所说酶存在于宿主细胞胞外时，首先经离心或过滤从发酵培养基回收细胞。然后将细胞匀浆以打开细胞，然后用以上提到的盐法沉淀上清液或滤液的蛋白质组分。最后如上所述纯化所说的酶。
在本发明的实施方案中，所说的宿主细胞(其中细菌细胞是革兰氏-阳性细菌的细胞(例如，芽孢杆菌属或链霉菌属的细胞)或者革兰氏-阴性细菌细胞(例如埃希氏杆菌属的细胞)和丝状真菌细胞(例如曲霉属、头孢属或青霉属的细胞)。
在一更为优选的实施方案中，所说的宿主细胞是产黄青霉和顶头孢。方法和材料菌株：B10：产黄青霉菌株(可从Panlabs，11804 North Creek Parkway South，Bothell WA 98011-8805，美国获得)。P8：产黄青霉菌株(可从Panlabs获得)。材料：LCS琼脂斜面：(J.Lein，“Panlabs青霉素菌株改进的程序”p.105-139，Vanek，Z.和Hostálek，Z.(编者)微生物代谢物的超量产生，菌株改进和过程控制策略。Butterworth，波士顿(1986))。LCS培养基：乳糖一水合物1.5％，玉米浆0.5％，胨0.5％，NaCl0.4％，MgSO47H2O 0.05％，KH2PO4，0.06％，FeCl36H2O，0.0005％。Tween-80：Merck Art.822187P-1种子培养基：(J.Lein，同上，(1986))P-2发酵培养基：(J.Lein，同上，(1986))载体：pUC19：2.6kb，Asp719-SalI片段转化选择性标记：由米曲霉TPI(磷酸丙糖异构酶)启动子和黑曲霉AMG(淀粉葡糖苷酶)终止子表达的大肠杆菌Tn5腐草霉素抗性基因。设备：SepharoseS FF柱(Pharmacia Biotech)苯基-琼脂糖凝胶CL 4B柱(150ml)(Pharmacia Biotech)PD10柱(Pharmacia Biotech)Supelcosil RP C-18DB柱(250×4.6mm)supelguard(Supelco)Flow-one/βserie100放射性检测器(Radiomatic)钇硅酸盐流池(cell)(Radiomatic)Sephacryl S-200柱(181ml)(Pharmacia Biotech)色谱聚焦(Chromatofocussing)pBETM 94柱(20ml)(Pharmacia Biotech)Pharmacia LKB PhastSystem(Pharmacia Biotech)Cibacron蓝3GA柱(西格马)ABI 1000S光电二极管排列HPLC-检测器(应用生物***)HPLC(Waters)应用生物***394DNA/RNA合成仪应用生物***473氨基酸测序仪WatersTM 991光电二极管排列检测器参照酶和化合物：乙酰辅酶A(西格马)乙酰辅酶A合成酶(西格马)牛血清清蛋白(″BSA″)(西格马A7638)Gelfiltration校准试剂盒(Pharmacia Biotech)苯氧乙酸辅酶A酯(M.J.Alonso等，抗生素杂志，41，P.1074-1084，1988)苯乙酸辅酶A酯(西格马)己二酸辅酶A酯的制备如下：在氮氛围下，将己二酰氯化物(0.14ml；Aldrich)添加到孔-搅拌和冰-水冷却的在丙酮(中的西格马60ml；MerckPA)+水(0.6ml)0.2M KHCO3(提高pH值至＞7)中的辅酶A-钠悬液(400毫克；5.152×10～4mmol；)中。将反应的pH值调至大约7.7，然后，在相同的温度下进一步 搅拌大约60分钟。此后在降压下部分除去丙酮，将形成的产物溶解在冷水中，并冷冻干燥。产生0.0890克。将最后的产物进行超滤。缓冲液：缓冲液A：50mMTris/HCl，pH 8.5，1.36M硫酸铵，4mM乙二胺四乙酸，5mM腺苷三磷酸，5mM抗坏血酸，1mM PMSF(苯基-甲基-磺酰-氟化物)。缓冲液B：50mMTris/HCl，pH值8.5，0.68M硫酸铵，4mM乙二胺四乙酸，5mM腺苷三磷酸，5mM抗坏血酸，1mM PMSF。缓冲液C：50mMTris/HCl，pH值8.5，20％甘油，4mM乙二胺四乙酸，5mM腺苷三磷酸，5mMMgCl2，5m抗坏血酸，1mMPMSF。缓冲液D：如缓冲液C，150mMKCl。缓冲液E：10mMTris/HCl，20％甘油，4mM乙二胺四乙酸，5mMMgCl2，5mM腺苷三磷酸，5mM抗坏血酸，和1mMPMSF，pH值8.2。缓冲液F：50mMTris/HCl，20％甘油，4mM乙二胺四乙酸，5mMMgCl2，5mM腺苷三磷酸，和5mM抗坏血酸，pH值7.5。溶液：溶液A：50mMTris/HCl，pH值8.5；35％硫酸铵，4mM乙二胺四乙酸，5mM腺苷三磷酸，1mM PMSF，5mM巯基-乙醇。溶液B：10微升0.25MMgCl2，50微升0.1M腺苷三磷酸(在50
mMTris/HCl，pH值8.0中)，50微升20mMCoASH(在50
mMTris/HCl，pH值8.0中)，和30微升0.2M苯氧乙酸或苯乙酸或己二酸或己酸(在50mM Tris/HCl，pH值8.0中)混合，并在25℃平衡5分钟。溶液C：50mMTris/HCl，pH值8.5，硫酸铵(20％饱和)，4mM乙二胺四乙酸，5mM腺苷三磷酸，5mM抗坏血酸，1mMPMSF，4mMMgCl2。溶液D：5ml包含1.2MMgSO4，10mMNaH2PO4，pH值5.8，150毫克Novozym234(#1199批)，100微升壳多糖酶(西格马4U/毫升)的溶液。溶液E：0.6M山梨醇，100mMTris-HCl，pH值7.0溶液F：1.2M山梨醇，10mMTris-HCl，pH值7.5，10mM CaCl2。溶液G：60％PEG4000(BDH#29576)，10mMTris-HCl，pH值7.5，10mM CaCl2。溶剂H：20％(V/V)乙腈(在25mM磷酸钠缓冲液，pH值6.5中)。溶剂I：13％甲醇(在20mM磷酸钠，pH值2.5中)。底物溶液A：100微升0.25MMgCl2，500微升0.1MATP(在50mMTris/HCl中)，500微升20mMCoASH(在50mMTris/HCl中)，和300微升0.067M乙酸钾(在50mMTris/HCl中)。溶剂A：15％(V/V)乙腈(在25mM磷酸钠缓冲液，pH值6.5中)。溶剂B：5％(V/V)乙腈(在25mM磷酸钠缓冲液，pH值6.5中)。方法：A)从产黄青霉克隆苯氧乙酰辅酶A合成酶
按照Schwarz-Sommer等的方法(EMBO杂志，3，p.1021-1028，1984)分离产黄青霉基因组DNA，并用Sau3A部分消化，分离15-23kb大小片段，连接到λEMBL3 BamHI臂(Promega)上。
当纯化至均质时，经采用应用生物***473氨基酸测序仪用对连接酶或其片段的Edman降解可以测定苯氧乙酰辅酶A合成酶的部分氨基酸序列。从所产生的氨基酸序列，可以按照Beaucage和Carurs，四面体通讯，22，p.1859-1869，1981所描述的phosphoamidite法用应用生物***394DNA/RNA合成仪制备引物。
通过筛选产黄青霉DNA的基因组文库(其是在λEMBL3中由噬斑杂交方法(Maniatis等，1982，分子扩增：实验室手册，冷泉港实验室，纽约)制备的)可以分离到一个克隆，其与产生的对苯氧乙酰辅酶A合成酶基因特异性的产生的引物杂交。
将包含功能苯氧基-乙酰辅酶A合成酶基因的λ克隆的区与Tn5腐草霉素抗性基因一起亚克隆进pUC19载体，所形成的质粒可以用于转化例如产黄青霉。B)产黄青霉的转化100ml LCS培养基培养瓶中培养产黄青霉菌株B10(高产菌株)36小时。在Myra布上收集菌丝体，用500ml 0.6M MgSO4充分洗涤，然后将菌丝体置于塑料管中，并悬浮在5毫升溶液D中和置于冰上5分钟。将750微升BSA(12mg/ml)添加到菌丝体悬液中，在轻轻搅拌下于30℃继续培养1至2小时。用光学显微镜控制原生质体的形成。
在Myra-布上收集原生质体，小心在5毫升溶液E上分层。在离心缓慢达2000rpm 15分钟后，用吸管取出位于溶液E和溶液D之间的原生质体，添加2体积的溶液F稀释，再在2500rpm下离心5分钟。用溶液F洗涤原生质体沉淀两次，分离原生质体，经添加溶液F稀释获得1-2×10细胞/ml。将100微升原生质体用于转化。
将CsCl密度梯度(Maniatis等，1982，supra)制备的10微克DNA添加到原生质体中，置于室温下20分钟。然后添加200微升溶液G，置于室温下20分钟。然后添加3体积的1.2M山梨醇，将原生质体DNA聚集体在2500rpm下离心10分钟。然后经添加300微升1.2M山梨醇重悬沉淀，平板接种到3块在LCS琼脂斜面上含有50微克/毫升腐草霉素的选择平板上。将平板在26℃培养直到转化体出现。
然后可以分离转化体，并通过在摇瓶中发酵试验它们产生青霉素的能力。C)产黄青霉的发酵
在悬浮于含有0.1％(V/V)Tween-80的蒸馏水中后，产黄青霉菌株B10或P8(Panlabs)的冻干孢子在10毫升LCS琼脂斜面上培养。与25℃培养10天后，各斜面表面的孢子悬浮到10毫升0.1％Tween-80中，5毫升这种悬液用于接种300毫升锥形瓶中的50毫升P-1种子培养基。种子培养物于25℃在290rpm的旋转摇床上培养。48小时后，2毫升种子培养物用于接种P-2发酵培养基(35毫升，在300毫升锥形瓶中，由橄榄油代替猪油)，于25℃在290rpm下培养培养物直到收获。D)收获，抽提和沉淀
经过滤分离培养3天的产黄青霉细胞，用5体积的0.9％氯化钠快速洗涤。在液氮中冷冻细胞，并且在研钵中匀化。经溶液A中的悬液提取酶。细胞碎片由离心除去。使提取物达到50％硫酸铵饱和，离心除去沉淀。经体积硫酸铵至70％饱和使酶沉淀。离心后将离心沉淀溶解到溶液C中。E)苯基-琼脂糖凝胶CL4B柱色谱
将2280毫克(95毫升)蛋白质(来源于以上部分)用于苯基-琼脂糖凝胶CL4B柱(150毫升)，在缓冲液中平衡，流速：每小时60毫升。用500毫升缓冲液A，接着用从100％缓冲液B到100％缓冲液C的梯度液(总体积1800毫升)洗涤，以8毫升一份收集。
分析所有组分的苯氧乙酰辅酶A合成酶活性和乙酰辅酶A合成酶活性。在组分115-277间洗脱苯氧乙酰辅酶A合成酶活性，在组分175中显示峰值活性。在组分108-157间洗脱乙酰辅酶A合成酶活性，在组分118中显示峰值活性。F)Cibacron蓝柱色谱
收集苯基-琼脂糖凝胶色谱柱的组分143-225，经添加硫酸铵至65％饱和沉淀蛋白质。沉淀重悬于10毫升缓冲液C中，用PD10柱脱盐。最后样品体积：16毫升。
将样品用于以缓冲液平衡的装有20毫升Cibacron蓝的柱上。用10倍柱体积的缓冲液C洗涤柱，并用KCl梯度(0-0.25M KCl)洗脱，流速每小时25毫升。以8.3毫升一份收集洗脱物。苯氧乙酰辅酶A合成酶活性在组分36和65之间洗脱，最大值在组分45中。G)凝胶过滤S-200(超级精制的)
收集Cibacron蓝柱色谱的组分36-56，经超滤浓缩(切下10.000)，在PD10柱上脱盐至缓冲液D，将7毫克蛋白质(3.3毫升)用于以相同的缓冲液平衡的Sephacryl S-200柱(181毫升)。用缓冲液D洗脱柱(流速每小时10毫升)，收集1毫升样品用于试验。苯氧乙酰辅酶A合成酶活性在72至118组分中洗脱，在87组分中显示峰值活性。H)色谱聚焦pBETU 94
收集组分79-107，经超滤浓缩(切下10.000)，在PD10柱上用缓冲液E脱盐。最后样品体积：3.0毫升。
将样品用于由缓冲液E平衡的20毫升PBETM94柱上。用缓冲液E洗脱，流速每小时30毫升，以1.5毫升收集各组分，苯氧乙酰辅酶A合成酶活性在11-40中洗脱，在组分17中获得峰值活性。I)琼脂糖凝胶SFF柱色谱
通过添加硫酸铵至65％饱和沉淀在苯基-琼脂糖凝胶色谱(参见上述)中收集的143-225组分样品中的蛋白质。将沉淀悬浮在缓冲液F中，用PD10柱脱盐。最终样品体积：28毫升。
将样品用于以缓冲液F平衡过的50毫升琼脂糖凝胶SFF柱。上样后，用150毫升缓冲液F洗涤柱，并用KCl梯度(0-0.3M KCl)洗脱。流速为每小时50毫升，在所有步骤中采用5毫升组分。在组分45和120之间洗脱苯氧乙酰辅酶A合成酶活性，在组分48具有最大值。而在组分16中出现最大蛋白质峰值。J)直接测定苯氧乙酰辅酶A合成酶和苯基乙酰辅酶A合成酶活性
通过将100微升酶溶液添加到包含苯氧乙酸(或苯乙酸)和CoASH的溶液B中开始反应。在于25℃温育30分钟后，添加240微升0.5％三氟乙酸终止反应。经离心除去所形成的沉淀，经HPLC分析形成的苯氧乙酸的辅酶A酯(或苯乙酸辅酶A酯)的量。
经HPLC检测苯氧乙酸的辅酶A酯或苯乙酸辅酶A酯：柱：Supelcosil RPC-18 DB，具有Supelguard。检测：在260毫微米检测。溶剂A：15％(V/V)乙腈，在25mM pH值6.5磷酸钠缓冲液中。流速：1毫升/分钟
苯氧乙酸辅酶A酯的保留时间：9.7分钟，苯乙酸辅酶A酯9.0分钟。相对与标准定量苯氧乙酸辅酶A酯和苯基乙酰辅酶A酯。K)直接测定己二酰辅酶A合成酶
通过将1体积的酶添加到1.4体积的包含己二酸的溶液B中开始反应，调节pH8.5。典型地温育混合物包含250微升酶和350微升溶液B。温育在30℃下进行。在有规律的时间间隔从温育混合物取出样品，并与等量的0.5％三氟乙酸混合。经离心除去形成的沉淀。经HPLC测定形成的己二酰辅酶A酯的量。经HPLC检测己二酰辅酶A酯：柱：Supelcosil RP C-18-DB检测：在257毫微米检测洗脱剂：5％乙腈，在25mM磷酸钠缓冲液(pH值5.6)中流速：1毫升/分钟
己二酰辅酶A酯的保留时间：11.4分钟。己二酰辅酶A酯用作参照。L)直接测定己酰辅酶A合成酶
通过将1体积的酶加到1.4体积的包含己酸的溶液B中开始反应。调节pH值8.5。典型的温育混合物含有250微升酶和350微升溶液B。温育在30℃下进行。在有规律的时间间隔从温育混合物取出样品，并与等量的0.5％三氟乙酸混合。经离心除去形成的沉淀。经HPLC测定形成的己酰辅酶A酯的量。经HPLC检测己酰辅酶A酯：柱：Supelcosil RP C-18-DB检测：在257毫微米检测洗脱剂：15％乙腈，在25mM磷酸钠缓冲液(pH值6.5)中流速：1毫升/分钟
己酰辅酶A酯的保留时间：20.4分针。M)直接测定乙酰辅酶A合成酶
将底物溶液A混合，用4M KOH pH值调节至8.0。添加40微升乙酸-1-14C，盐钠，(41.8mCi/mmol，1.0mCi/毫升)，在35℃平衡混合物。测定：将25微升酶和35微升底物溶液混合，于35℃温育30分钟。添加60微升0.5％三氟乙酸终止反应。经离心除去任何形成的沉淀。用具有放射性检测器的HPLC分析所形成的乙酰辅酶A酯的量。用Radiomatic检测器在210毫微米经UV检测系列测定非放射性化合物。
经HPLC检测乙酰辅酶A酯：柱：具有Supelguard的Supelcosil RP C-18DB柱检测：用装备有钇硅酸盐流池(cell)的Flow-one/βserie100放射性检测器(Radiomatic)检测放射性化合物。溶剂B：5％(V/V)乙腈，在25mM磷酸钠缓冲液(pH值6.5)中。流速：1毫升/分钟乙酰辅酶A酯的保留时间：6.9分钟。作为标准，使用乙酰辅酶A(西格马)，并温育具有乙酰辅酶A合成酶(西格马)的底物混合物A，接着经HPLC分析形成的14C-乙酰辅酶A。N)经HPLC检测青霉素V和青霉素G
温育后，药剂瓶放置在冰上面10分钟。在离心之后，在下列条件下经HPLC分析上清液中的青霉素V或青霉素G：柱：具有Supelcoguard的Supelcosil LC C-18DB柱(250×4.6mm)检测：在215毫微米的UV-检测。溶剂：溶剂H流速：1毫升/分钟注射体积：10微升青霉素V的保留时间(RT)是13.3分钟，青霉素G的是8.7分钟。O)供HPLC测定的ACV和IPNS样品制备
从摇瓶取出2毫升样品，迅速冷却至0-4℃，用25mM磷酸钠(pH值6.5)稀释25倍，超滤(切下10,000)。将二硫苏糖醇(DTT)添加至滤液中至终浓度5mM，样品经HPLC分析。柱：具有Supelcoguard的Supelcosil LC-18DB柱(250×4.6mm)检测：在210毫微米的UV-检测。溶剂：溶剂I流速：2毫升/分钟温度：35℃注射体积：10微升异青霉素N和ACV的保留时间(RT)分别是5.7和17分钟。P)从产黄青霉抽提酰基辅酶A按照Barbera E.Corkey和Jude T.Deeney″酰基辅酶A代谢调节和信号转导″临床和生物学研究进展，321，p.217-232，1990的方法抽提产黄青霉的酰基辅酶A化合物。
如“A)产黄青霉的发酵”部分所述的方法在摇瓶中培养产黄青霉(菌株B10或菌株P8)。在P-2培养基(pH值6.1)中培养4天后，将细胞在盐-冰浴中迅速冷却，并在在22000gav下离心30秒钟，在收获细胞后3分钟内在液氮中冷冻离心沉淀。在添加2体积的0.6N三氟乙酸后解冻细胞。在声处理30秒钟之后，经离心(12000gav30秒)分离细胞提取物。用***抽提除去三氟乙酸直到水相的pH是6。冻干水相(含有乙酰辅酶A化合物)，最终将样品溶解在25mM磷酸钠缓冲液(pH值6.5)中，采用在″苯氧乙酸辅酶A的检测″部分给出的条件经HPLC分析。Q)标记产黄青霉中的苯氧乙酸代谢物
如″产黄青霉的发酵″部分中所述在样品中培养产黄青霉(B10或P8)作，在P-2培养基(pH值6.1)中培养4天之后，将10毫升细胞转移至50毫升含有250微升〔I-14C〕-苯氧乙酸(72μCi/毫升9.7μCi/μmole)的锥形瓶中。任何在振荡下于26℃培养锥形瓶。
在1、15、30、60、120、240和360分钟之后，移去1毫升细胞，立即冷却至0℃，在22000gav下离心1分钟。将离心沉淀悬浮在500微升5％磷酸和500微升甲醇中，混合物声处理1分钟。在离心之后，上清液由HPLC分析，采用放射性检测器鉴别标记的代谢物。HPLC条件：柱：具有Supelguard的Supelcosil LC-18DB柱(250×4.6mm)检测：具有钇硅酸盐流池(cell)的RadiomaticA-140溶剂1：25mM磷酸钠，pH值6.5溶剂2：乙腈梯度：时间(分钟) 溶剂1(％) 溶剂2(％)
0 100 0
40 70 30
45 70 30
46 100 0
60 100 0流速：1毫升/分钟
在色谱图中仅经有的峰相应于苯氧乙酸(RT：14.5分钟)，β-羟基-苯氧乙酸RT：8.4分钟)和青霉素V(RT：34分钟。)。β-羟基-苯氧乙酸和青霉素V的峰仅在培养60分钟后才可检测。
实施例实施例1 在高产和低产产黄青霉菌株中的连接酶活性
通常认为产黄青霉P8是中间体的低产菌株，而产黄青霉B10是高产菌株。
如″产黄青霉的发酵″部分所述培养产黄青霉菌株(B10和P8)，收获细胞，如″B)收获、抽提和沉淀″部分所述抽提苯氧乙酰辅酶A合成酶，如″直接测定苯氧乙酰辅酶A合成酶和苯基乙酰辅酶A合成酶″所述测定在两种抽提物中的苯氧乙酰辅酶A合成酶(连接酶)的活性。苯氧乙酰辅酶A合成酶活性测定的结果示于以下表中。表1
| 产黄青霉菌株 | 相对苯氧乙酰辅酶A合成酶活性(％) | 相对产生的青霉素V(％) |
| P8 | 27.5 | 40 |
| B10 | 100 | 100 |
这一例子表明苯氧乙酰辅酶A合成酶活性与菌株的青霉素产生量有关。实施例2 中间代谢物的累积
如″产黄青霉的发酵″部分所述培养产黄青霉菌株(B10)，在接种到发酵培养基P-2中后，ACV和异青霉素N在培养基中的浓度用以上所述的方法经HPLC每天测定一次，共7天。
作为发酵时间的函数的ACV和异青霉素N的浓度在图1中给出。
图1清楚地说明在产黄青霉的发酵中培养基中积累的ACV和异青霉素N。实施例3 青霉素V和青霉素G的体外合成
于30℃在10微升苯氧乙酰辅酶A合成酶(来源于以上所述的色谱聚焦PBETM94色谱的收集组分11-40)和10微升酰基辅酶A：6-氨基青霉烷酸的酰基转移酶(如Emilio Alvarez等在″产黄青霉酰基辅酶A：6-氨基青霉烷酸的酰基转移酶纯化至均质和特征确定″抗微生物剂和化疗，31(11)，p.1675-1682，1987中所述从产黄青霉纯化)存在下温育25微升60mM苯氧乙酸*、25微升40mM腺苷三磷酸*、25微升6mM辅酶A*和10微升6mM6-氨基青霉烷酸*的混合物。(*：在50mMTris/HCl(pH值7.8)，10mMMgCl2，和5mM抗坏血酸中溶解)
对于青霉素G的体外合成，苯氧基乙的酸由25微升60mM苯乙酸代替。
在温育15分钟之后，加入100微升甲醇终止反应，将试剂瓶置于冰上10分钟。在离心之后，如上所述，经HPLC分析上清液中的青霉素V或青霉素G。青霉素V或青霉素G的鉴别
在色谱图中识别的青霉素V或青霉素G峰由以下方法证实：通过分别掺加青霉素V和青霉素G标准溶液，和通过采用以上所述的ABI1000S光电二极管排列HPLC-检测器比较峰转折点和尖端的UV谱与两种青霉素标准的谱。
当反应混合物省去辅酶A、6-氨基青霉烷酸、ATP或苯氧乙酸和苯乙酸时，物青霉素V或G合成。
这证实所述的分离的酶显示出苯氧乙酰辅酶A活性和苯乙酸辅酶A活性(连接酶活性)。实施例4V-DCA的体外合成
于30℃在10微升苯氧乙酰辅酶A合成酶(来源于以上所述的色谱聚焦PBETM94色谱的收集组分11-40)和10微升酰基辅酶A：6-氨基青霉烷酸的酰基转移酶(如Emilio Alvarez等在″产黄青霉酰基辅酶A：6-氨基青霉烷酸的酰基转移酶纯化至均质和特征确定″抗微生物剂和化疗，31(11)，p.1675-1682，1987中所述从产黄青霉纯化)存在下温育25微升苯氧乙酸*、25微升40mM腺苷三磷酸*、25微升6mM辅酶A*和10微升7-氨基脱氧头孢菌酸*的混合物。(*：在50mMTris/HCl(pH值7.8)，10mMMgCl2，和5mM抗坏血酸中溶解)
温育15分钟之后，加入1000.5％三氟乙酸终止反应，将试剂瓶置于冰上10分钟。在离心之后，采用如上“O)标记产黄青霉中苯氧乙酸代谢物”中所述的色谱条件，经HPLC分析V-DCA。V-DCA的保留时间：32分钟。V-DCA的鉴别
在色谱图中识别的V-DCA峰由以下方法证实：通过分别掺加V-DCA标准溶液，和通过采用WatersTM991光电二极管排列HPLC-检测器比较峰尖端的UV谱与V-DCA标准的谱。实施例5 经凝胶过滤测定分子量
通过比较“凝胶过滤S-200(超级精制)”部分中描述的凝胶过滤的流出体积和以上所述的相同柱上的相同的条件下的凝胶过滤校准试剂盒(核糖核酸酶A(13,700道尔顿)，胰凝乳蛋白酶原(25,000道尔顿)，卵清蛋白(43,000道尔顿)，牛血清清蛋白(67,000道尔顿)和醛缩酶(158,000道尔顿))的使用标准的流出体积测定苯氧乙酰辅酶A合成酶(连接酶)的分子量，实施例6 等电点(pI)
通过改变用于琼脂糖凝胶SFF柱色谱法(以上所述的)的缓冲液F的pH值(pH值7，5)至8.5估计等电点(pI)。保持其它参数恒定，在用缓冲液F(pH值调整至8.5)洗脱期间，发现苯氧乙酰辅酶A合成酶(连接酶)不保持在柱上。
这表明酶的净电荷是零时的pH值(即等电点)高于7.25。实施例7 在抽提物中的苯氧乙酰辅酶A
为了得到苯氧乙酰辅酶A合成酶(连接酶)活性存在的指示，如″从产黄青霉抽提酰基辅酶A″部分所述抽提酰基辅酶A，并经HPLC分析。
尽管HPLC-测定中的检测限低于50pmol，但是细胞抽提物中未鉴别出苯氧乙酸的辅酶A。标记苯氧乙酸代谢物的抽提(如“标记产黄青霉中苯氧乙酸代谢物”部分所述)在细胞抽提物中也不显示出可检测的辅酶A。实施例8 确定特征
来源于纯化步骤(以上所述)的苯氧乙酰辅酶A合成酶(连接酶)用于进一步确定酶的特征。最佳温度和pH值
如″苯氧基-辅酶A合成酶的直接测定″部分所述测定苯氧乙酰辅酶A合成酶，采用的温度从15-50℃，测定中pH值从6.5至9.0变化。
如图2所示，在pH值在8-8.5周围时，苯氧乙酰辅酶A合成酶活性达到最大，如图3所示，最适温度约40℃。底物特异性
采用″苯氧乙酰辅酶A合成酶的直接测定″部分、″乙酰辅酶A合成酶的直接测定″部分、″己二酰辅酶A合成酶的直接测定″部分和″己酰辅酶A合成酶的直接测定″部分给出的测定条件，将苯氧乙酰辅酶A合成酶与苯氧乙酸、苯乙酸、己二酸、己酸和乙酸一起温育。获得下列结果：
底物 相对活性
苯氧乙酸的 100
苯乙酸 80
己二酸 19
己酸 320
乙酸 180腺苷三磷酸、苯氧乙酸、辅酶A和MgCl2的表观KM的测定
如″苯氧乙酰辅酶A合成酶的直接测定″部分所述，在底物浓度变化下测定苯氧乙酰辅酶A合成酶的活性。如Nicholas C.Price&Lewis Stenens″基础酶学″，牛津大学出版社，p.123，1982所述，从Eadie-Hofstee、Hanes和Lineweaver-Burk曲线上确定表观KM值(在用于这种测定的条件下)。从曲线图清楚可见，就单个底物而言，苯氧乙酰辅酶A合成酶符合Michaelis-Mentens动力学。
结果示于下表2中。
表2
| 浓度(mM) | KM(mM) |
| 苯氧乙酸 | 0-40 | 3.2 |
| ATP | 0-10 | 0.22 |
| 辅酶A | 0-4.0 | 0.57 |
| MgCl2 | 0-15 | 1.6 |
KM是米氏(Michaelis)常数苯乙酸和乙酸对苯氧乙酰辅酶A合成酶的抑制作用
如″苯氧乙酰辅酶A合成酶的直接测定″部分所述，在各种苯氧乙酸时，在苯乙酸或乙酸变化的浓度时测定苯氧乙酰辅酶A合成酶的活性。
用于测定的苯氧乙酸的浓度是1.7；3.3；6.6；20和42mM，苯乙酸和乙酸的浓度是0；1.0；5.0；10和5mM。
Lineweaver-Burk曲线说明在所使用的条件下，苯乙酸是苯氧乙酰辅酶A合成酶的竞争性抑制剂起作用，而乙酸则不是苯氧乙酰辅酶A合成酶的竞争性抑制剂。
在以上所公开的内容指导下，本领域技术人员很清楚，在不背离本发明的精神或范围的情况下，实施本发明中许多改变以及修饰是可能的，因此，按照所附权利要求的内容构成了本发明的范围。
Claims (48)
1.一种产生β-内酰胺类抗生素的方法，该方法包括(i)发酵能够产生所述β-内酰胺类抗生素的微生物，和(ii)回收实质上纯化的形式的所述b-内酰胺类抗生素，其中所述的发酵是在与原始发酵条件下用原始微生物单独发酵时的连接酶活性相比，连接酶活性提高的情况下进行的。
2.按照权利要求1的方法，其中所述的原始微生物缺乏或者仅有较低的连接酶活性。
3.按照权利要求1或2的方法，其中所述的连接酶活性的表达通过调节发酵过程中的物理条件来提高。
4.按照权利要求3的方法，其中所述的连接酶活性的表达通过调节发酵过程的温度来提高。
5.按照权利要求4的方法，其中所述的连接酶活性的表达通过调节发酵过程的pH值来提高。
6.按照权利要求1至5任一之方法，其中所述的连接酶活性通过将微生物置于能诱导连接酶表达的化合物或者试剂中来提高。
7.按照权利要求1至6任一之方法，其中所述的连接酶活性通过干扰发酵微生物的细胞控制机制来提高。
8.按照权利要求1至7任一之方法，其中所述的连接酶活性通过对所述微生物进行修饰来提高。
9.按照权利要求8的方法，其中所述的连接酶活性或者提高的连接酶活性通过所述微生物的随机或特异性定向诱变来获得。
10.按照权利要求1至9任一之方法，其中连接酶活性的表达或连接酶活性的提高的表达的获得包括将至少一个DNA构建体或重组载体的拷贝引入到所述用于发酵的原始微生物中，所述DNA构建体或重组载体包含编码表现出连接酶活性的酶的基因或DNA序列。
11.按照权利要求8至10任一之方法，其中所述的修饰通过氨基酸的取代、缺失或添加来进行。
12.按照权利要求10的方法，其中所述的DNA构建体来源于不同于其被引入的微生物的物种。
13.按照权利要求1至12的方法，其中所述的原始微生物来源于青霉菌属、头孢霉属、曲霉属、诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属、Cerospora、小孢囊菌属、其它的真细菌类、其它的放线菌和丝状真菌。
14.按照权利要求13的方法，其中所述原始微生物属于下列物种：产黄青霉、点青霉、顶头孢、构巢曲霉、Nocardia lactamdurans和带小棒链霉菌。
15.按照权利要求1至14任一之方法，其中所述的连接酶活性的表达同步于β-内酰胺类抗生素合成途经的其它基因的表达。
16.按照权利要求15的方法，其中所述的连接酶活性的表达同步于pcbAB、pcbC和/或penDE基因的表达。
17.按照权利要求13或14的方法，其中所述的能够产生β-内酰胺类抗生素的原始微生物选自包含青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、mono-bactams、和诺卡杀菌素类的组。
18.按照权利要求17的方法，其中所述的抗生素是一种头孢菌素或一种青霉素，优选的是青霉素V、青霉素G、V-DCA、G-DCA、7-(L-a-5-氨基-羧基戊酰氨基)-头孢菌酸(异头孢子菌素C)、7-ADCA、或者是7-ACA。
19.按照权利要求8至18的方法，其中在诱导所述DNA构建体表达的条件下培养所述的修饰过的微生物，由此导致产生增加量的相应于所需β-内酰胺类抗生素侧链的羧酸的辅酶A硫代酸酯。
20.按照权利要求8至18的方法，其中在诱导所述DNA构建体表达的条件下培养所述的微生物，由此导致产生活化的侧链辅酶A硫代酸酯，在酰基转移酶(AT)存在下，依次导致形成包含所述侧链的β-内酰胺。
21.按照权利要求1至20的方法，其中所述的连接酶的特征是对苯氧乙酸和苯乙酸的活性比对乙酸的活性强至少10倍，并且具有由凝胶过滤测定的大约50,000道尔顿的表观分子量。
22.一种表现出连接酶活性的新酶，它对苯氧乙酸的活性比对乙酸的活性强至少10倍。
23.按照权利要求22酶，该酶对苯乙酸的活性比对乙酸的活性强至少10倍。
24.按照权利要求22或23的酶，该酶对己二酸的活性比对乙酸的活性强至少10倍。
25.按照权利要求22至24任一之酶，该酶对己酸的活性比对乙酸的活性强至少10倍。
26.按照权利要求22至25任一之酶，该酶的特征是具有由凝胶过滤测定的40,000至60,000，特别是约50,000道尔顿的表观分子量。
27.按照权利要求22至26任一之酶，该酶的特征是在pH7.0至9.0，尤其8.0至8.5范围内具有最佳表观活性。
28.按照权利要求22至27任一之酶，该酶的特征是在温度35-45℃，尤其在约40℃时具有最佳表观活性。
29.按照权利要求22至28任一之酶，该酶的特征是可以由属于曲霉属、青霉属或头孢霉属的丝状真菌产生，优选的是可由产黄青霉或顶头孢的菌株，特别是产黄青霉菌株B10产生。
30.按照权利要求22至29任一之酶，该酶的特征是其与抗所说的纯化的产黄青霉菌株B10之连接酶的抗体是免疫学反应性的。
31.一种DNA构建体，该构建体编码按照权利要求22至30任一之酶。
32.按照权利要求31的DNA构建体，其中的DNA序列来源于属于曲霉属、青霉属或头孢霉属的丝状真菌，优选的是来源于产黄青霉或顶头孢的菌株，特别是产黄青霉菌株B10。
33.一种重组载体或转化载体，其包含按照权利要求31和32任一之DNA构建体。
34.按照权利要求33的重组载体或转化载体，其中所述的DNA构建体可操作连接到启动子序列上，和可连接可不连接到终止子序列上。
35.按照权利要求33至35任一之重组载体，其中所述的连接酶基因的启动子由另一个有关β-内酰胺生物合成的基因的启动子代替。
36.按照权利要求33至35任一之重组载体或转化载体，其中所述的DNA构建体可操作地与编码导向信号或分泌信号的序列连接。
37.一种细胞，其含有按照权利要求31和32任一之DNA构建体或按照权利要求33至36任一之重组载体。
38.按照权利要求37的细胞，该细胞是一种微生物细胞。
39.按照权利要求38的细胞，该细胞是一种细菌细胞或真菌细胞。
40.按照权利要求39的细胞，其中所述的细菌细胞是***(例如芽孢杆菌属)的细胞或革兰氏-阴性细菌(例如链霉菌属)的细胞和丝状真菌(例如埃希氏杆菌属、头孢属或青霉属)的细胞。
41.一种产生β-内酰胺的方法，该方法包括温育羧酸、辅酶A、按照权利要求22至30的表现出连接酶活性的酶、酰基转移酶和β-内酰胺中间体。
42.按照权利要求41的方法，其中通过用在β-内酰胺的产生中表现出连接酶活性的酶产生所述的连接酶活性。
43.按照权利要求41和42的方法，其中所说的β-内酰胺中间体是异青霉素N(IPN)、6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基头孢菌酸(7-ACA)、7-氨基脱乙酰氧基头孢菌酸(7-ADCA)和7-氨基脱乙酰基头孢菌酸、7-(L-a-5-氨基-羧基戊酰氨基)-头孢菌酸(异头孢 菌素C)、己二酰-7-ADCA或己二酰-7-ACA。
44.按照权利要求41的方法，其中所说的羧酸是苯氧乙酸、苯乙酸、脂肪酸、己酸、2-噻吩乙酸或者是3-噻吩乙酸。
45.按照权利要求41至44的方法，其中所说的温育是在Mg2+和ATP存在下进行的。
46.按照权利要求41至45的方法，其中所说的温育是在还原剂(如二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、抗坏血酸或谷胱甘肽等)存在下进行的。
47.按照权利要求41至46的方法，其中所说的温育是在10℃至60℃之间，优选的在约15C至50℃之间，更优选的在20℃至45℃之间的温度下进行的。
48.按照权利要求41至46的方法，其中所说的温育是在5.5至9之间，优选的在约8的pH值下进行的。
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