CN116218881A - 一种治疗或者预防乙肝病毒的疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种治疗或者预防乙肝病毒的疫苗。其mRNA包括I)～IV)中至少一种：I)、具有如SEQ ID NO.1～3任一所示核苷酸序列的核酸；II)、在I)所述核酸的序列中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；III)、与I)所述核酸的序列具有至少70％同源性的序列且编码乙肝病毒表面抗原的核酸；IV)、与I)～III)中任一项部分互补或完全互补的核酸。本发明提供的疫苗能够起到***的效果，实现乙肝的功能性治愈；同时可以起到预防乙肝的作用，克服目前传统乙肝疫苗对成人免疫应答低的难题。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种治疗或者预防乙肝病毒的疫苗。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
治疗性乙肝疫苗旨在增强患者自身的免疫***，通过不同途径呈递乙肝抗原，打破机体的免疫耐受，有效诱导强有力的CD4+T细胞、CD8+T细胞应答和体液免疫应答，从而根除HBV抗原或产生抗体，是实现慢性HBV病毒学控制、完全或功能性治愈的新型有效治疗策略。在研的治疗性乙肝疫苗主要分为重组蛋白疫苗、DNA疫苗、DC疫苗等。然而由于缺乏理想的佐剂和抗原递送***，使得HBV治疗性疫苗的研究面临重大挑战。由脂质纳米粒(LNPs)包裹的体外转录的mRNAs组成的核酸疫苗，可以将体外转录的mRNA递送至细胞，翻译产生蛋白，进而激发机体的特异性的体液免疫和细胞免疫反应。LNP可以保护mRNA不受细胞外RNA酶的影响，并促进靶细胞对mRNA的有效摄取和细胞内释放。不同于其他的核酸疫苗，mRNA不进入细胞核内部，只需要在细胞质内表达目的蛋白；同时，mRNA本身不具备感染性，亦能通过正常细胞途径降解，并不存在感染或***突变的风险。目前尚未见治疗性乙肝病毒的mRNA疫苗的相关报道。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种治疗或者预防乙肝病毒的疫苗，本发明提供的疫苗能够起到***的效果，实现乙肝的功能性治愈；同时可以起到预防乙肝的作用，克服目前传统乙肝疫苗对成人免疫应答低的难题。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种mRNA，包括I)～IV)中至少一种：
I)、具有如SEQ ID NO.1～3任一所示核苷酸序列的核酸；
II)、在I)所述核酸的序列中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；
III)、与I)所述核酸的序列具有至少70％同源性的序列且编码乙肝病毒表面抗原的核酸；
IV)、与I)～III)中任一项部分互补或完全互补的核酸。
本发明拟RNA分子(mRNA、环状RNA或自复制RNA)作为疫苗，经过用于编码乙肝病毒优化的免疫原mRNA，所述的免疫原为乙肝病毒的表面抗原，所述的乙肝病毒的表面抗原为蛋白全长，提供了上述mRNA，上述mRNA均能够表达乙肝表面抗原(HBsAg)，不仅具有***的作用，而且具有预防乙肝的作用。
另一方面，一种上述mRNA在制备治疗或者预防乙肝病毒的药物中的应用。
第三方面，一种治疗或者预防乙肝病毒的疫苗，包括上述mRNA和脂质体纳米颗粒。
第四方面，一种联合药物，包括上述mRNA或治疗或者预防乙肝病毒的疫苗和免疫调节类药物。
本发明的有益效果为：
1.本发明提供的乙肝病毒的mRNA疫苗相对于传统乙肝蛋白疫苗生产方式，mRNA可进行体外转录制备，不依赖细胞的扩增，可轻松实现所有生产过程的监测和质控，而且节省了细胞培养、抗原提取和纯化等过程，进一步节省了时间和经济成本。
2.本发明提供的乙肝病毒的mRNA疫苗内源表达的蛋白抗原相较于异源制备的抗原，进入接种者体内的mRNA翻译成的蛋白具有空间结构、翻译后修饰如糖基化的高保真度，可引起有效针对相应病原体的免疫应答、提升疫苗保护效果
3.本发明提供的乙肝病毒的mRNA疫苗可激活多种胞内病原相关模式受体(pathogen related receptors，PRR)，具有自身佐剂效应，无须额外加入疫苗佐剂，可以通过促进不同的固有免疫反应，进而诱导针对病原体的获得性免疫应答，并且不存在因减毒活疫苗接种导致潜在罹患带状疱疹的风险。
4.本发明提供的乙肝病毒的mRNA疫苗可以***病毒感染，实现临床乙肝治疗的功能性治愈，也能够预防乙肝病毒感染，尤其是对大周龄的小鼠有效，克服目前传统的rHBVvac成人免疫无反应的难题。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例的HBV mRNA制备电泳图。
图2为本发明实施例的HBV mRNA在293T细胞中蛋白表达量显示图。
图3为本发明实施例的HBV mRNA疫苗对HBV小鼠血清中HBsAg的抑制作用。
图4为本发明实施例的HBV mRNA疫苗在HBV小鼠中诱导的血清IgG抗体水平。
图5为本发明实施例的HBV mRNA疫苗免疫治疗的HBV小鼠抗原特异性的CD8+T细胞的功能分析。
图6为本发明实施例的HBV mRNA疫苗免疫治疗的HBV小鼠经HBV攻毒后血清中HBsAg的表达结果。
图7为本发明实施例的HBV mRNA疫苗免疫治疗的HBV小鼠经HBV攻毒后肝脏中HBV-3.5kb-RNA、HBV-total-RNA、HBV DNA以及HBV cccDNA的表达结果。
图8为本发明实施例的HBV mRNA疫苗免疫治疗的HBV小鼠经HBV攻毒后血清中anti-HBs的表达结果。
图9为本发明实施例的HBV mRNA疫苗免疫大周龄野生小鼠血清IgG抗体水平。
图10为本发明实施例的HBV mRNA疫苗免疫大周龄野生小鼠经HBV攻毒后血清中HBsAg以及anti-HBs的表达结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的目的是提供一种治疗性乙肝病毒的mRNA疫苗。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种mRNA，包括I)～IV)中至少一种：
I)、具有如SEQ ID NO.1～3任一所示核苷酸序列的核酸；
II)、在I)所述核酸的序列中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；
III)、与I)所述核酸的序列具有至少70％同源性的序列且编码乙肝病毒表面抗原的核酸；
IV)、与I)～III)中任一项部分互补或完全互补的核酸。
在一些实施例中，进行非翻译区修饰和核苷酸修饰。例如共转录法进行的5’加帽修饰，5’及3’端非翻译区序列引入、3’端多聚腺苷酸引入、假尿苷替换尿苷在内的核苷酸修饰，能够实现最佳免疫效果。
本发明的另一种实施方式，提供了一种上述mRNA在制备治疗或者预防乙肝病毒的药物中的应用。
本发明提供的mRNA具有如下优势：
(1)能够***病毒感染，实现临床乙肝治疗的功能性治愈；
(2)能够预防乙肝病毒感染，尤其是对大周龄的小鼠有效，克服目前传统的rHBVvac成人免疫无反应的难题；
(3)在施用对象体内诱导产生针对乙肝病毒的特异性免疫反应；
(4)免疫后的机体产生长时间的免疫记忆，能够保护机体防止HBV的再次感染。
在一些实施例中，所述药物为疫苗。
本发明的第三种实施方式，提供了一种治疗或者预防乙肝病毒的疫苗，包括上述mRNA和脂质体纳米颗粒。
在一些实施例中，所述脂质体纳米颗粒包括但不限于阳离子脂质、辅助磷脂、固醇类脂质、PEG修饰的脂质等。
在一种或多种实施例中，离子脂质为可离子化阳离子脂质。例如：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA)、N,N-二甲基-2,2-二-(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯-1-基-1,3-二氧戊环-4-乙胺(DLin-KC2-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)。
在一些实施例中，脂质体纳米颗粒平均粒径为10～500nm；优选为80～120nm。
在一些实施例中，mRNA和脂质体纳米颗粒复合形成复合颗粒。
在一种或多种实施例中，复合颗粒的直径为80～120nm。
在一些实施例中，剂型为注射剂。施用方式为肌肉注射。
本发明的第四种实施方式，提供了一种联合药物，包括上述mRNA或治疗或者预防乙肝病毒的疫苗和免疫调节类药物。
在一些实施例中，免疫调节类药物包括但不限于PD-1、TIGIT单抗、TCR-T、CAR-T细胞、IL-2细胞因子、IL-12细胞因子、IL-15细胞因子、siRNA、shRNA、ASO RNA等。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
1、乙肝病毒的mRNA疫苗序列设计
mRNA候选序列设计：
乙肝病毒抗原包括PreS1抗原、PreS2抗原、HBsAg、HBcAg和HBeAg。慢性HBV感染中，HBV相关抗原的负载是导致肝脏中T细胞耗竭的主要因素。研究证实，HBV感染患者体内HBsAg的水平高达400ng/mL(占总血清蛋白的0.4％)，在抑制HBV特异性免疫应答中发挥重要的作用。HBsAg可以直接作用于树突状细胞，抑制其产生细胞因子。通过用HBsAg中和抗体预处理AAV/HBV感染的耐受小鼠，可以有效地清除循环中的HBsAg，恢复对目前用于临床的预防性HBV疫苗的应答。通过使用HBsAg蛋白疫苗疫苗或者清除抗体，可以迅速清除HBV病毒颗粒，为宿主对HBsAg疫苗的应答提供了一个有效的策略。因此，可以通过干扰HBV相关抗原的产生或者清除HBV相关抗原来实现抗HBV的目的。针对HBsAg的研究最为广泛。因而，我们抗原设计为编码病毒HBsAg全长氨基酸序列的基因(GeneID:944569)。
由于病毒蛋白在哺乳动物体内表达量较低，因而采用密码子优化来提高其表达量。优化方案主要基于两个参数，分别是密码子适应指数(Codon Adaption Index，CAI)和最小自由能(Minimum Free Energy，MFE)。CAI参数与密码子偏好性相关。生物体中任一氨基酸对应多个不同密码子，但在翻译过程中往往有一个密码子的使用频率占主导地位。当以CAI为参数进行序列优化时，将尽可能使用偏好密码子，从而提高翻译速率，加快蛋白合成。MFE参数与mRNA二级结构稳定性有关，MFE越低，mRNA分子的二级结构越稳定，半衰期也越长。基于MFE对密码子进行优化，将提高mRNA分子的体内稳定性，保证抗原的相对长期持续表达。HBsAg mRNA序列经过优化共得到3条序列如下所示：
1：
ATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACAACCAGCACGGGACCATGCCGGACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAA，见SEQ ID NO.1。
2：
ATGGAGAATATCACCAGCGGGTTCCTGGGGCCCCTGCTGGTGCTCCAGGCAGGCTTCTTCCTGCTGACCAGGATTCTGACCATCCCTCAGAGCCTGGACAGCTGGTGGACCTCCCTGAACTTTCTGGGAGGTACCACCGTCTGCCTGGGGCAGAACAGTCAGAGCCCCACATCCAACCATAGCCCGACAAGTTGCCCCCCAACTTGTCCGGGCTACCGTTGGATGTGCCTGAGGAGGTTCATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTCTGTCTGATCTTCCTGCTGGTGCTGCTGGACTATCAGGGGATGCTGCCCGTGTGTCCCCTGATCCCCGGCAGCAGCACAACCAGCACGGGGCCCTGCAGGACCTGCATGACCACTGCACAGGGCACCAGCATGTACCCCAGCTGCTGCTGCACCAAGCCCTCGGATGGGAACTGCACCTGCATTCCCATCCCCAGCAGCTGGGCCTTCGGGAAGTTCCTGTGGGAGTGGGCCTCAGCCAGGTTCTCCTGGCTGAGCCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAGTGGTTTGTGGGGCTGAGCCCCACAGTGTGGCTGAGCGTGATTTGGATGATGTGGTACTGGGGACCCTCCCTGTACAGCATCCTGAGTCCGTTCCTGCCACTGCTGCCCATATTCTTCTGTCTGTGGGTGTACATCTAA，见SEQ ID NO.2。
3：
ATGGAGAACATCACCAGCGGCTTCCTGGGGCCTCTGCTGGTGCTGCAGGCTGGGTTCTTCCTGCTGACCAGGATTCTGACCATCCCTCAGAGCCTGGACAGCTGGTGGACCTCCCTGAACTTTCTGGGAGGTACCACCGTGTGCCTGGGACAGAACTCCCAGAGCCCCACCAGTAACCACTCACCCACTTCATGCCCACCCACATGCCCCGGGTACAGGTGGATGTGCCTGAGGAGGTTCATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTCCTGTGCCTGATCTTCCTGCTGGTGCTGCTGGACTATCAGGGGATGCTGCCCGTGTGTCCCCTGATCCCCGGGTCCAGCACCACCAGCACAGGACCATGCAGGACCTGCATGACCACTGCACAGGGCACCAGCATGTACCCCAGTTGCTGTTGCACCAAGCCCAGCGACGGCAACTGCACGTGCATCCCCATTCCCAGCAGCTGGGCCTTTGGCAAGTTCCTCTGGGAGTGGGCCTCAGCCAGGTTCTCCTGGCTGAGCCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAGTGGTTCGTGGGGCTGAGCCCCACCGTGTGGCTGAGCGTGATCTGGATGATGTGGTACTGGGGACCCAGCCTGTACAGCATCCTGAGCCCCTTCCTGCCGCTGCTGCCCATCTTCTTCTGTCTGTGGGTGTACATCTAA，见SEQ ID NO.3。
2、mRNA制备：
2.1模板质粒的全基因合成：将抗原的ORF(open reading frame)序列与T7启动子序列，5’UTR序列，3’UTR序列和polyA序列串联后以Puc57为载体进行全基因合成，即可获得模板质粒。
2.2 PCR获得转录模板DNA序列：以线性化后的模板质粒为模板，使用polyT长引物，高保真DNA聚合酶(购自Thermo Scientific Phusion)，dNTP等原料，于PCR仪上使用合适的程序即可获得转录模板DNA。
2.3体外转录反应制备mRNA(以40μL反应体系为例)：将制备的IVT模板与T7 RNA聚合酶(购自NEB)，rNTPs单核苷酸，等原料按照说明书建议配比混合，采用共转录加帽法，于37℃进行2小时转录反应。转录反应结束后，使用DNA酶(购自诺唯赞)消化IVT模板，以降低残余DNA模板带来的风险。
2.4纯化：使用RNA纯化试剂盒(购自NEB)对IVT反应结束的mRNA进行纯化。纯化后的mRNA溶解于TE缓冲液中，即可用于后续制剂包被。电泳结果(图1)显示，mRNA纯度良好。
3、mRNA序列转染HEK-293T细胞验证HBsAg蛋白表达水平：
将293T细胞复苏，待其达到80-100％密度时，接种细胞于12孔板中；待12小时后细胞长到70％的密度，将培养基换成无血清的培养基通过转染试剂盒Lipofectamine转染mRNA到293T细胞中，未转染的细胞作为阴性对照，转染24小时后开始收取细胞。转染后24小时后，收集细胞，加入适量裂解液，轻轻吹打混匀，冰浴30分钟，15000rpm离心15分钟，收集上清；将上清加入乙肝病毒表面抗原定量检测试剂盒的包被孔中，每孔分别加入酶结合物50μL，振荡混匀；37℃孵育60分钟后，甩净孔内液体，然后加入洗液洗板5次；每孔加入混合后的发光底物50μL，振荡10s后，室温避光反应10分钟，利用Synergy 2多功能酶标仪检测发光强度，以测定目的蛋白HBsAg的丰度。
试验结果：
HBsAg-mRNA-1，2，3序列转染HEK-293T细胞后均可以在胞内检测到高水平的HBsAg的表达,其中HBsAg-2-Ψ修饰组胞内HBsAg的丰度最高(图2)，因此，我们选择HBsAg-2-Ψ序列进行后续的实验。
4、脂质体纳米颗粒包裹mRNA及其粒径检测：
脂质溶液的制备：按摩尔比例50∶10：38.5：1.5将MC3：DSPC：胆固醇：mPEG2000-DMG溶解于乙醇溶液；
mRNA溶液制备：将一定质量乙肝mRNA溶解于pH＝4.0的20mM柠檬酸缓冲溶液中；
脂质纳米颗粒的制备：用注射器分别吸取1mL的乙肝mRNA和3mL脂质溶液，***微流控芯片中，设置参数为：Volume：4.0mL；Flowrate ratio:3:1，Total flow rate：18mL/min，混合得到脂质纳米颗粒溶液；
溶液置换：脂质纳米颗粒溶液加入到超滤管中进行离心超滤，磷酸盐缓冲液进行多次置换，制得成品。
5、HBV-carrier小鼠模型的构建以及疫苗免疫策略：
5.1HBV-carrier小鼠模型构建
pAAV/HBV 1.2小鼠模型的构建：取正常成年的5-6w的C57BL/6J小鼠，将pAAV/HBV1.2质粒溶于无菌的生理盐水中，通过尾静脉高压注射的方式，在5-8s内给每只小鼠注射8μg的质粒，注射体积为小鼠质量的10％。6w后，收集小鼠血清。血清HBsAg浓度大于500ng/ml的小鼠默认为HBV-carrier小鼠。
5.2疫苗免疫策略
实验组肌肉注射不同剂量的HBV mRNA疫苗，分为10μg剂量组和5μg剂量组，空白对照组注射相同体积的PBS，以一周的时间间隔，免疫3次(Prime-boost)。
6、HBV mRNA疫苗免疫可以安全有效地清除CHB小鼠中的HBV，并且免疫后的机体产生HBsAg的血清学转换
6.1试验方法：
实验组肌肉注射不同剂量的HBV mRNA疫苗，分为10μg剂量组和5μg剂量组，空白对照组注射相同体积的PBS，以一周的时间间隔，免疫3次(Prime-boost)。通过检测外周血HBsAg及anti-HBs的水平以评价HBV mRNA疫苗的抗HBV效果。
6.2试验结果：
与未治疗组相比，HBV mRNA疫苗组可以降低CHB小鼠外周血血清中HBsAg的水平，基本检测不到HBsAg的表达(图3)；并且，全部实现HBsAg的血清学转换(图4)。综合以上结果可以看出，HBV mRNA疫苗免疫可以安全有效地清除CHB小鼠中的HBV。
7、HBV mRNA疫苗免疫可以增强HBV-carrier小鼠中抗原特异性的CD8+T细胞的功能，逆转其耗竭状态
7.1试验方法：
实验组肌肉注射不同剂量的HBV mRNA疫苗，分为10μg剂量组和5μg剂量组，空白对照组注射相同体积的PBS，以一周的时间间隔，免疫3次(Prime-boost)。三次免疫后，分离小鼠肝脏单个核细胞，通过流式细胞术检测HBV特异性的CD11ahi CD8αlo细胞的比例的差异；通过流式细胞术检测HBV特异性的CD11ahi CD8αlo细胞上细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α的分泌水平。
7.2试验结果：
研究发现，抗原特异性的CD11ahi CD8αlo细胞的比例在治疗后小鼠的肝脏有明显的增加(图5A)。此外，HBV mRNA疫苗免疫可以恢复其细胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-2的表达(图5B)，逆转慢性HBV感染导致的免疫耗竭状态。综合以上结果可以看出，HBV mRNA疫苗免疫可以增强HBV-carrier小鼠中抗原特异性的CD8+T细胞的功能，逆转其耗竭状态。
8、HBV mRNA疫苗免疫可以诱导机体产生长时间的免疫记忆，能够保护机体防止HBV的再次感染
8.1试验方法：
实验组肌肉注射不同剂量的HBV mRNA疫苗，分为10μg剂量组和5μg剂量组，空白对照组注射相同体积的PBS，以一周的时间间隔，免疫3次(Prime-boost)。三次免疫后，在第60d尾静脉再次注射8μg的pAAV/HBV1.2质粒进行HBV的攻毒，通过检测外周血血清中HBsAg、anti-HBs、肝脏HBV DNA及RNA以评价疫苗能否形成长期的免疫保护。
8.2试验结果：
与未治疗组相比，HBV mRNA疫苗组小鼠在二次攻毒感染时外周血血清中基本检测不到HBsAg的表达(图6)。同时，肝脏中HBV-3.5kb-RNA、HBV-total-RNA、HBV DNA以及HBVcccDNA基本检测不到(图7)，且100％小鼠产生高水平的保护性的anti-HBs(图8)。综合以上结果可以看出，HBV mRNA疫苗可以诱导机体产生长时间的免疫记忆，能够保护机体防止HBV的再次感染。
9、HBV mRNA疫苗免疫大周龄野生小鼠可以诱导机体产生anti-HBs，保护机体防止HBV的感染
9.1试验方法：
选取15周龄的C57 BL6/J小鼠(大周龄，模拟成人)，实验组肌肉注射10μg HBVmRNA疫苗，阳性对照组注射市售rHBVvac预防疫苗，空白对照组注射相同体积的PBS，以一周的时间间隔，免疫2次(Prime-boost)。两次免疫后，在第45d尾静脉再次注射8μg的pAAV/HBV1.2质粒进行HBV的攻毒，通过检测外周血血清中HBsAg及anti-HBs以评价疫苗能否形成长期的免疫保护。
9.2试验结果：
与阳性对照组相比，HBV mRNA疫苗组小鼠在免疫后有更高水平的anti-HBs产生(图9)。同时，在接受HBV攻毒后，与阳性对照组相比，在第5天基本检测不到HBsAg的表达，同时HBV mRNA疫苗组小鼠有更高水平的anti-HBs(图10)。综合以上结果可以看出，与阳性对照rHBVvac预防疫苗组相比，HBV mRNA疫苗免疫大周龄小鼠可以诱导机体产生高水平的anti-HBs，在接受HBV感染后能够快速的清除HBV防止感染的发生。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种mRNA，其特征是，包括I)～IV)中至少一种：
I)、具有如SEQ ID NO.1～3任一所示核苷酸序列的核酸；
II)、在I)所述核酸的序列中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；
III)、与I)所述核酸的序列具有至少70％同源性的序列且编码乙肝病毒表面抗原的核酸；
IV)、与I)～III)中任一项部分互补或完全互补的核酸。
2.如权利要求1所述的mRNA，其特征是，进行非翻译区修饰和核苷酸修饰。
3.一种权利要求1或2所述的mRNA在制备治疗或者预防乙肝病毒的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征是，所述药物为疫苗。
5.一种治疗或者预防乙肝病毒的疫苗，其特征是，包括权利要求1或2所述的mRNA和脂质体纳米颗粒。
6.如权利要求5所述的治疗或者预防乙肝病毒的疫苗，其特征是，所述脂质体纳米颗粒为阳离子脂质、辅助磷脂、固醇类脂质或PEG修饰的脂质；
优选地，离子脂质为可离子化阳离子脂质；进一步优选地为：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯、N,N-二甲基-2,2-二-(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯-1-基-1,3-二氧戊环-4-乙胺、二((Z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯。
7.如权利要求5所述的治疗或者预防乙肝病毒的疫苗，其特征是，脂质体纳米颗粒平均粒径为10～500nm；优选为80～120nm。
8.如权利要求5所述的治疗或者预防乙肝病毒的疫苗，其特征是，mRNA和脂质体纳米颗粒复合形成复合颗粒；
优选地，复合颗粒的直径为80～120nm；
或，剂型为注射剂；优选地，施用方式为肌肉注射。
9.一种联合药物，其特征是，包括权利要求1或2所述的mRNA或治疗或者预防乙肝病毒的疫苗和免疫调节类药物。
10.如权利要求9所述的联合药物，其特征是，免疫调节类药物为PD-1、TIGIT单抗、TCR-T、CAR-T细胞、IL-2细胞因子、IL-12细胞因子、IL-15细胞因子、siRNA、shRNA或ASO RNA。
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