CN115282278A - 胆固醇调节剂作为抗原递呈促进剂在乙肝治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及胆固醇调节剂作为抗原递呈促进剂在乙肝治疗中的应用。本发明研究表明，采用胆固醇调节剂与rHBV疫苗的组合，通过初免‑加强(Prime‑boost)的疫苗接种策略，可以用于HBV的治疗，实现长期有效的病毒学控制。采用胆固醇调节剂与rHBV疫苗的组合应用于临床HBV治疗过程中，可以恢复慢性HBV感染导致的树突状细胞上的胆固醇及脂筏的形成障碍，增强其抗原递呈功能以及机体的细胞应答和体液应答，从而实现HBV的完全清除。更重要的是，采用胆固醇调节剂与rHBV疫苗的组合可以诱导机体形成长期的免疫记忆，保护机体防止HBV的再次感染，为临床慢性HBV的治疗提供了一个新的有效策略。

Description

胆固醇调节剂作为抗原递呈促进剂在乙肝治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及辛伐他汀、洛伐他汀等胆固醇调节剂作为抗原递呈促进剂的应用，还设计一种新型HBV疫苗及HBV治疗药物。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
慢性乙型肝炎(CHB)感染是全世界严重的公共卫生问题。目前临床治疗CHB的药物有核苷/核苷酸类似物和干扰素α两大类，但这两类药物对于治疗CHB都具有一定的局限性，不能实现长期的病毒学控制。因此，迫切需要开发新的策略来清除HBV并实现持久的免疫控制。CHB感染的形成是病毒复制与宿主免疫反应间相互作用的结果。病毒和宿主因素均对HBV的持续存在起作用。因此，了解HBV持续存在的机制对设计清除HBV的治疗策略有重要作用。
CHB难以治愈，主要是因为CHB患者的肝脏中形成了免疫抑制的微环境，具有高比例的调节性T细胞(Treg)、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)和功能失调的抗原呈递细胞(APC)。树突状细胞作为专职的抗原递呈细胞，是先天免疫应答和适应性免疫应答之间的桥梁。先前的研究报告证实，与健康志愿者相比，来自CHB患者的树突状细胞的抗原呈递和迁移能力受损。此外，CHB感染可诱导树突状细胞功能障碍，降低其共刺激分子的表达，促进HBV特异性T细胞的耗竭，主要表现为共抑制性受体如PD-1、CTLA-4、CD244(2B4)和Tim-3等表达显著增加，细胞毒性减弱，转录谱改变和代谢障碍，最终导致CHB患者持续感染和肝病进展。然而，CHB感染引起树突状细胞功能障碍的机制尚未完全阐明。
胆固醇是一种不可或缺的脂质分子，在多种生物过程中起着重要作用，包括脂筏、主要组织相容性复合物(MHC)分子、T细胞受体(TCR)、B细胞受体和Toll样受体的形成。免疫细胞中的胆固醇水平反映了生物合成、摄取、外排和酯化之间的动态平衡。胆固醇生物合成的关键调节因子包括甾醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)和两种限速酶[3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)和角鲨烯环氧化酶(SQLE)]。低密度脂蛋白受体(LDLR)是负责外周免疫细胞摄取循环中胆固醇的主导因素。LDLR通过内吞作用捕获循环LDL，之后LDL携带的胆固醇酯通过细胞内溶酶体***逐渐进展为游离胆固醇。胆固醇外排由ATP结合盒(ABC)转运蛋白介导，包括ABC亚家族A成员1(ABCA1)和ABC亚家族G成员1/5/8，有助于处理细胞中多余的胆固醇或将其储存为胆固醇酯。胆固醇的酯化可以通过酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT，包括ACAT1和ACAT2)将游离胆固醇转化为中性胆固醇酯，以储存在脂滴中或用作脂蛋白成分，以确保胆固醇稳态。先前的一项研究表明，抑制胆固醇酯化途径可以驱动酯化的胆固醇易位到质膜来减少中性脂滴的积累，而质膜中的游离胆固醇是形成脂筏的关键结构成分。脂筏作为富含胆固醇的微结构域，在信号转导以及调控免疫细胞表型和功能中起着至关重要的作用。例如，CD8+T细胞质膜中富集的游离胆固醇促进TCR聚集和免疫突触的形成，同时增强了T细胞增殖和功能效应。同时，胆固醇积累促进了自然杀伤(NK)细胞中脂筏的形成和免疫信号传导激活，这反过来又促进了NK细胞对肝癌细胞的杀伤。在巨噬细胞中，胆固醇积累诱导了含有NOD、LRR和pyrin结构域的蛋白质3(NLRP3)炎症小体和MyD88介导的信号通路的激活，加重了动脉粥样硬化进展。此外，富含胆固醇的脂筏促进APC上抗原肽-MHC II类复合物的积累，促进了T细胞的活化；而高胆固醇血症诱导的树突状细胞上胆固醇的增加可增强其抗原呈递和T细胞活化，并促进B细胞增生，从而增加自身免疫性疾病的风险。这些发现证实了胆固醇在调节免疫细胞活化中的重要作用；然而，目前尚不清楚CHB感染是否会影响DC的胆固醇水平以及随后DC介导的抗HBV免疫反应的功能障碍。
发明内容
本发明研究调查了胆固醇水平与CHB感染发展之间的关系。结果表明，CHB感染降低了DC上的游离胆固醇水平和脂筏形成，从而有助于HBV的持续存在。通过使用药物增加DC上胆固醇积累的策略可能会提高临床CHB治疗的功效。
本发明将rHBV疫苗与胆固醇调节剂如辛伐他汀或者洛伐他汀的组合应用于CHB感染模型，结果表明，胆固醇调节剂可以增加慢性HBV感染中DC上胆固醇积累，增强其抗原递呈功能，增加抗原特异性的CD8+T细胞的比例，逆转其耗竭状态，能够安全有效地清除HBV，诱导机体形成长期的免疫记忆，保护机体防止HBV的再次感染。因此，增加DC上胆固醇积累可以增强HBV治疗性疫苗的效果。
基于上述研究成果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供胆固醇调节剂作为抗原递呈促进剂的应用。
本发明的研究结果中，慢性HBV感染会导致机体中胆固醇代谢障碍，导致脂筏形成受损；具体表现为降低抗原递呈细胞上游离胆固醇(Filipin)、脂筏(CTxB)以及胆固醇转运蛋白LDLR的表达。本发明采用胆固醇调节类药物对上述过程加以干预，发现胆固醇调节剂如辛伐他汀(Sim)或者洛伐他汀(Lov)可以增加骨髓来源的树突状细胞(BMDC)上游离胆固醇以及脂筏的水平，促进胆固醇的合成及吸收；同时，胆固醇水平的提升能够促进上述BMDC细胞对外来抗原的摄取，增加其成熟分子MHC II和CD86的表达，增强其抗原递呈功能。
优选的，所述胆固醇调节剂为胆固醇吸收促进剂或者胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制剂；
进一步的，选自辛伐他汀、洛伐他汀、舒伐他汀或酰基辅酶A；本发明验证的实施例方式中，所述胆固醇调节剂为辛伐他汀或洛伐他汀。
因此，本发明优选的，提供辛伐他汀或洛伐他汀等胆固醇调节剂作为抗原递呈促进剂的应用。
本发明所述抗原递呈促进剂主要在于提升抗原递呈细胞抗原摄取、加工和递呈功能的活性制剂，所述作为抗原递呈促进剂的应用，其具体应用方式包括但不限于以下任意一种：
(1)辛伐他汀或洛伐他汀在制备免疫调节药物中的应用；
(2)辛伐他汀或洛伐他汀在制备乙型病毒肝炎治疗药物中的应用；
(3)辛伐他汀或洛伐他汀作为HBV病毒疫苗佐剂的应用；
(4)辛伐他汀或洛伐他汀在制备抗原递呈细胞培养试剂。
上述(1)方面的应用中，基于辛伐他汀或洛伐他汀对抗原递呈细胞的促进作用，上述活性成分有望应用于增强机体免疫应答，如用于改善自身免疫性疾病。
上述(2)、(3)方面的应用中，本发明将辛伐他汀或洛伐他汀与乙型肝炎病毒外壳蛋白抗原(HBsAg)共同注射，结果表明，上述活性成分能够快速降低外周血及肝脏中HBsAg的水平，增强机体对抗原的响应能力，清除机体中的HBV病毒，增强疫苗的治疗效果，并且上述抑制效果可以维持较长的时间。
上述(4)方面的应用中，本发明研究还证实了，辛伐他汀或洛伐他汀对HBV的清除作用依赖于树突状细胞的参与，因此，所述抗原递呈细胞优选为树突状细胞；辛伐他汀或洛伐他汀能够增强树突状细胞的抗原递呈活性，还可能应用于树突状细胞的体外培养。
本发明第二方面，提供一种HBV疫苗，所述疫苗中包括活性剂量的胆固醇调节剂。
优选的，所述胆固醇调节剂为辛伐他汀或洛伐他汀；进一步的，所述辛伐他汀或洛伐他汀的活性剂量，可依据疫苗中抗原的剂量、受试对象、施用目的等因素进行调整，所述活性剂量的获取可以采用本领域常规方法进行。
本发明提供的一种实施方式中，上述HBV疫苗中包括HBsAg及辛伐他汀或洛伐他汀，所述HBsAg及辛伐他汀或HBsAg及洛伐他汀的剂量比为2:90～110；进一步的，所述HBV疫苗中，还包括其他免疫佐剂，如氢氧化铝佐剂、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、多聚核苷酸、胞壁肽等。
一种具体的实例中，所述HBV疫苗每剂包括辛伐他汀或洛伐他汀100μg、HBsAg 2μg，氢氧化铝100μg。
优选的，所述HBV疫苗的免疫次数为2～3次。
本发明第三方面，提供一种HBV治疗药物，所述治疗药物中，包括第二方面所述HBV疫苗。
上述HBV疫苗可与PD-1、TIGIT等免疫检查点治疗，TCR-T、CAR-T等细胞治疗，IL-2、IL-12、IL-15等细胞因子治疗等其他临床治疗慢性HBV的免疫调节剂共同施用；因此，上述HBV治疗药物中还包括其他免疫调节类药物，包括但不限于PD-1、TIGIT单抗，或TCR-T、CAR-T细胞，或IL-2、IL-12、IL-15等细胞因子。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
(1)本发明通过临床CHB样本实验证实，慢性HBV感染会降低DC上游离胆固醇的表达，进而影响脂筏的形成，并且胆固醇的水平与脂筏的表达呈现明显的正相关性；进一步研究发现，慢性HBV感染影响了胆固醇代谢如合成、酯化等相关通路。HBV感染小鼠实验也证实，慢性HBV感染会降低DC(包括CD11b+DC以及CD103+DC)上游离胆固醇及脂筏的表达，并且胆固醇的水平与脂筏的表达呈现明显的正相关性，明确了HBV感染与胆固醇代谢障碍的相关机制。
而胆固醇调节剂如辛伐他汀或者洛伐他汀处理可以上调骨髓来源的树突状细胞(BMDC)上胆固醇的水平，促进脂筏的形成；同时，辛伐他汀或者洛伐他汀促进其对外源性胆固醇的摄取；进一步研究发现胆固醇调节剂如辛伐他汀或者洛伐他汀促进了BMDC上胆固醇合成相关基因的表达，抑制了酯化。此外，体外实验也证实，在胆固醇调节剂如辛伐他汀或者洛伐他汀刺激下，BMDC吞噬抗原的能力，共刺激分子CD86以及MHC-II分子的表达增加。
(2)本发明提供的HBV治疗药物，采用临床用的预防性rHBV疫苗和胆固醇调节剂如辛伐他汀或者洛伐他汀联合使用，安全、无毒。所得制剂安全、经济、制备方便，有利于免疫接种的展开。
经验证，上述HBV治疗药物(rHBV疫苗与胆固醇调节剂如辛伐他汀或者洛伐他汀的组合)免疫小鼠可以恢复HBV感染小鼠DC上胆固醇以及脂筏的水平，增强其抗原递呈功能，增加抗原特异性的CD8+T细胞的比例，逆转其耗竭状态。采用本发明HBV治疗药物免疫小鼠，可以降低血清中HBsAg、HBV DNA，肝脏中HBcAg、HBV DNA及RNA的水平，有效清除HBV感染小鼠体内的HBV，诱导机体产生长时间的免疫记忆，能够保护机体防止HBV的再次感染。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定；
图1：HBV-carrier小鼠模型的构建以及新型HBV治疗药物的治疗策略；
其中，(a)-(f)依次为实施例1中所述空白对照组(a),阴性对照组(b),实验组Sim-alone(c),实验组Lov-alone(d),实验组rHBV+Sim(e),实验组rHBV+Lov(f)；
图2：健康志愿者和临床CHB患者DC上胆固醇及脂筏的表达；
其中，图2A为健康志愿者与临床CHB患者外周血来源的DC上游离胆固醇、脂筏以及胆固醇转运蛋白LDLR的表达；
图2B为胆固醇、LDLR的水平与脂筏的相关性；
图2C为单个核细胞上胆固醇合成相关基因HMGCR、HMGCS1、SQLE，酯化相关蛋白LCAT1的表达；
图3：慢性HBV感染降低HBV-carrier小鼠来源DC上胆固醇及脂筏的表达；
其中，图3A为野生小鼠及CHB感染的小鼠肝脏、脾脏以及引流***中DC上游离胆固醇表达；
图3B为野生小鼠及CHB感染的小鼠肝脏、脾脏以及引流***中DC上游胆固醇转运蛋白LDLR的表达；
图3C为野生小鼠及CHB感染的小鼠肝脏、脾脏以及引流***中DC上脂筏的表达；
图3D为HBV-carrier小鼠脾脏中MHC-IIhi CD11c+的抗原递呈细胞上脂筏的表达结果；
图3E为HBV-carrier小鼠脾脏中MHC-Ihi CD11c+的抗原递呈细胞上脂筏的表达结果_；
图3F为HBV-carrier小鼠脾脏中MHC-IIhi CD11c+与MHC-Ihi CD11c+的抗原递呈细胞上胆固醇的水平与脂筏的相关性；
图3G为DC上脂筏与游离胆固醇的表达呈共定位；
图4：胆固醇调节剂对骨髓来源的树突状细胞(BMDC)上胆固醇、脂筏的促进作用；
其中，图4A为辛伐他汀或者洛伐他汀对骨髓来源的树突状细胞(BMDC)上游离胆固醇的调节作用；
图4B为辛伐他汀或者洛伐他汀对骨髓来源的树突状细胞(BMDC)上脂筏的调节作用；
图4C为BMDC上脂筏与游离胆固醇表达的正相关性；
图4D为辛伐他汀或者洛伐他汀对DC成熟与活化相关基因的影响；
图4E-4G为辛伐他汀或者洛伐他汀对胆固醇合成及外排等基因的影响；
图4H为辛伐他汀或者洛伐他汀对BMDC抗原递呈功能的调控作用。
图5：胆固醇调节剂恢复CHB感染小鼠来源的DC上胆固醇和脂筏的表达结果；
其中，图5A为辛伐他汀或洛伐他汀对CHB感染小鼠DC上游离胆固醇水平的调控；
图5B为辛伐他汀或洛伐他汀对胆固醇摄取相关分子LDLR表达的调控结果；
图5C为辛伐他汀或者洛伐他汀对DC上脂筏水平的调控；
图5D-5E为辛伐他汀或者洛伐他汀对DC细胞中PDL1、MHCI表达的调控作用；
图6：增加DC上胆固醇积累对HBV-carrier小鼠抗原特异性T细胞功能的增强作用；
其中，图6A为辛伐他汀或者洛伐他汀处理小鼠肝脏中HBV特异性的CD11ahi CD8αlo细胞的比例；
图6B为辛伐他汀或者洛伐他汀处理小鼠脾脏中HBV特异性的CD11ahi CD8αlo细胞上终末分化分子KLRG1的表达；
图6C为CD11ahi CD8αlo细胞上免疫抑制分子LAG-3、Tim-3、PD-1的表达；
图6D为CD11ahi CD8αlo细胞上TNF-α、IFN-γ、IL-2的表达；
图7：胆固醇调节剂对HBV-carrier小鼠中的HBV的清除作用；
其中，图7A为辛伐他汀或者洛伐他汀对小鼠血清中HBsAg的抑制作用；
图7B为辛伐他汀或洛伐他汀对外周血清中HBV DNA水平的调节作用；
图7C为肝脏中HBcAg+的肝细胞免疫组化染色结果；
图7D为辛伐他汀或洛伐他汀对肝脏中HBV-3.5kb-RNA、HBV-total-RNA、HBV DNA以及HBV cccDNA表达的抑制作用；
图7E为anti-HBs的血清学转换结果；
图7F为辛伐他汀和洛伐他汀抗HBV作用与DC的相关性；
图8：胆固醇调节剂对机体长期免疫记忆的诱导作用；
图8A为免疫治疗的小鼠经HBV攻毒后血清中HBsAg的表达结果；
图8B为免疫治疗的小鼠经HBV攻毒后anti-HBs的表达情况；
图8C为免疫治疗的小鼠经HBV攻毒后肝脏中HBV-3.5kb-RNA、HBV-total-RNA、HBVDNA以及HBV cccDNA的表达结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
以下实施例中HBV治疗药物的制备方法：
原料及来源：
rHBV疫苗为大连汉信生产的重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)产品，规格1ml：20μg。
辛伐他汀、洛伐他汀，购自invivogen公司。
所述HBV治疗药物每剂中各主成分的含量如下rHBV疫苗含HBsAg 2μg，辛伐他汀或者洛伐他汀各100μg。
以下实施例中，所述HBV治疗药物的制备方法：
取rHBV疫苗1ml于无菌的Ep管中，加入辛伐他汀或者洛伐他汀各1mg以及PBS或者生理盐水，混匀后即为2ml的疫苗溶液。所配制的HBV治疗药物每毫升含乙肝表面抗原10μg、辛伐他汀或者洛伐他汀各500μg。
1、HBV-carrier小鼠模型的构建以及新型HBV治疗药物的治疗策略
1.1HBV-carrier小鼠模型构建
pAAV/HBV 1.2小鼠模型的构建：取正常成年的5-6w的C57BL/6J小鼠，将pAAV/HBV1.2质粒溶于无菌的生理盐水中，通过尾静脉高压注射的方式，在5-8s内给每只小鼠注射8μg的质粒，注射体积为小鼠质量的10％。6w后，收集小鼠血清。血清HBsAg浓度大于500ng/ml的小鼠默认为HBV-carrier小鼠。
rAAV-HBV 1.3小鼠模型的构建：取正常成年的5-6w的C57BL/6J小鼠，将rAAV-HBV1.3病毒溶于无菌的生理盐水中，尾静脉注射入小鼠体内。6w后，收集小鼠血清。血清HBsAg浓度大于500ng/ml的小鼠默认为HBV-carrier小鼠。1.2新型HBV治疗药物的“初免-加强”(Prime-boost)的免疫策略
实验组皮下免疫rHBV疫苗(含HBsAg 2μg)+辛伐他汀(100μg)(简称“rHBV+Sim”)，rHBV疫苗(含HBsAg 2μg)+洛伐他汀(100μg)(简称“rHBV+Lov”)，阴性对照组免疫rHBV疫苗(含HBsAg 2μg)(简称“rHBV-alone”)，单独辛伐他汀(100μg)(简称“Sim-alone”)，单独洛伐他汀(100μg)(简称“Lov-alone”)，空白对照组注射相同体积的PBS，以一周的时间间隔，免疫3次(Prime-boost)，如图1所示。
2、临床CHB病人来源DC上胆固醇及脂筏的表达降低
2.1试验方法：
分离健康志愿者和临床CHB患者的外周血单个核细胞(PBMC)，通过流式细胞术检测树突状细胞(DC)上游离胆固醇(Filipin)、脂筏(CTxB)以及胆固醇转运蛋白LDLR的表达，通过qPCR检测外周血单个核细胞(PBMC)上胆固醇代谢相关基因的表达，以分析慢性HBV感染对DC上胆固醇代谢的影响。
2.2试验结果：
如图2A所示，与健康志愿者相比，临床CHB患者外周血来源的DC上游离胆固醇(Filipin)、脂筏(CTxB)以及胆固醇转运蛋白LDLR的表达降低(图2A)；同时，胆固醇以及LDLR的水平与脂筏呈现明显的正相关性(图2B)；进一步研究发现，CHB感染导致单个核细胞上胆固醇合成相关基因HMGCR、HMGCS1、SQLE表达降低(图2C)，酯化相关蛋白LCAT1的表达升高(图2D)。综合以上结果可以看出，慢性HBV感染可以引起DC上的胆固醇代谢障碍，导致脂筏形成受损。
3、慢性HBV感染降低HBV-carrier小鼠来源DC上胆固醇及脂筏的表达
3.1试验方法：
分离WT野生小鼠和CHB感染的小鼠肝脏、脾脏和***单个核细胞，临床CHB患者的外周血单个核细胞(PBMC)，通过流式细胞术检测树突状细胞(DC)上游离胆固醇(Filipin)、脂筏(CTxB)以及胆固醇转运蛋白LDLR的表达，通过共聚焦显微镜分析胆固醇和脂筏的共定位情况，以分析慢性HBV感染对DC上胆固醇代谢的影响。
3.2试验结果：
与WT野生小鼠相比，CHB感染的小鼠肝脏、脾脏以及引流***中DC上游离胆固醇(Filipin，图3A)、胆固醇转运蛋白LDLR(图3B)以及脂筏(CTxB，图3C)表达降低；同时，CHB降低HBV-carrier小鼠中MHC-IIhi CD11c+和MHC-Ihi CD11c+的抗原递呈细胞上脂筏的表达(图3D&E)；而且，MHC-IIhi CD11c+与MHC-Ihi CD11c+的抗原递呈细胞上胆固醇的水平与脂筏呈现明显的正相关性(图3F)。进一步研究发现，DC上脂筏与游离胆固醇的表达呈现明显的共定位(图3G)。综合以上结果可以看出，慢性HBV感染可以引起DC上的胆固醇代谢障碍，导致脂筏形成受损。
4、胆固醇调节剂如辛伐他汀或者洛伐他汀处理可以上调骨髓来源的树突状细胞(BMDC)上胆固醇的水平，促进脂筏的形成，增强其抗原递呈功能
4.1试验方法：
使用胆固醇调节剂如辛伐他汀或者洛伐他汀处理体外诱导的骨髓来源的树突状细胞(BMDC)，通过流式细胞术检测BMDC上游离胆固醇(Filipin)以及脂筏(CTxB)的表达以及胆固醇转运蛋白LDLR的表达，通过共聚焦显微镜分析胆固醇和脂筏的共定位情况，以分析慢性HBV感染对DC上胆固醇代谢的影响。
4.2试验结果：
胆固醇调节剂如辛伐他汀(Sim)或者洛伐他汀(Lov)可以增加骨髓来源的树突状细胞(BMDC)上游离胆固醇(Filipin，图4A)以及脂筏(CTxB，图4B)的水平，而且BMDC上脂筏与游离胆固醇的表达呈现明显的正相关性(图4C)。转录组测序发现，辛伐他汀(Sim)或者洛伐他汀(Sim)处理主要影响了DC成熟与活化相关的基因(图4D)，同时，影响了胆固醇的代谢，促进了胆固醇的合成和吸收，抑制了胆固醇的外排(图4E-G)。进一步研究发现，胆固醇水平的增加可以促进BMDC对外来抗原的摄取，增加其成熟分子MHCII和CD86的表达，增强其抗原递呈功能(图4H)。综合以上结果可以看出，胆固醇调节剂如辛伐他汀或者洛伐他汀处理可以上调骨髓来源的树突状细胞(BMDC)上胆固醇的水平，促进脂筏的形成，增强其抗原递呈功能。
5、胆固醇调节剂如辛伐他汀或者洛伐他汀处理可以恢复CHB感染小鼠来源的DC上胆固醇和脂筏的表达，促进其抗原递呈功能
5.1试验方法：
实验组皮下免疫rHBV疫苗(含HBsAg 2μg)+辛伐他汀(100μg)(简称“rHBV+Sim”)，rHBV疫苗(含HBsAg 2μg)+洛伐他汀(100μg)(简称“rHBV+Lov”)，空白对照组注射相同体积的PBS，以一周的时间间隔，免疫3次(Prime-boost)，分离小鼠肝脏、脾脏和***单个核细胞，通过流式细胞术检测DC上胆固醇(Filipin)、脂筏(CTxB)、胆固醇转运蛋白LDLR以及抗原递呈分子PDL1和MHCII的表达。
5.2试验结果：
辛伐他汀(Sim)或者洛伐他汀(Lov)可以恢复CHB感染小鼠DC上游离胆固醇的水平(图5A)，促进与胆固醇摄取相关分子LDLR的表达(图5B)。此外，辛伐他汀(Sim)或者洛伐他汀(Lov)增加DC上脂筏的水平(图5C)，增加其抗原递呈功能，高表达MHCI分子，低表达免疫抑制分子PDL1(图5D-E)。综合以上结果可以看出，胆固醇调节剂如辛伐他汀或者洛伐他汀处理可以恢复CHB感染小鼠来源的DC上胆固醇和脂筏的表达，促进其抗原递呈功能。
6、增加DC上胆固醇积累可以增强HBV-carrier小鼠中抗原特异性的CD8+T细胞的功能，逆转其耗竭状态
6.1试验方法：
实验组皮下免疫rHBV疫苗(含HBsAg 2μg)+辛伐他汀(100μg)(简称“rHBV+Sim”)，rHBV疫苗(含HBsAg 2μg)+洛伐他汀(100μg)(简称“rHBV+Lov”)，空白对照组注射相同体积的PBS，以一周的时间间隔，免疫3次(Prime-boost)，三次免疫后，分离小鼠肝脏和脾脏单个核细胞，通过流式细胞术检测HBV特异性的CD11ahi CD8αlo细胞的比例及其绝对数的差异；通过流式细胞术检测HBV特异性的CD11ahi CD8αlo细胞上终末分化分子KLRG1的表达；通过流式细胞术检测HBV特异性的CD11ahi CD8αlo细胞上免疫抑制分子LAG-3、Tim-3、PD-1的表达；通过流式细胞术检测HBV特异性的CD11ahi CD8αlo细胞上细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2的分泌水平。
6.2试验结果：
研究发现，抗原特异性的CD11ahi CD8αlo细胞的比例及其绝对数在治疗后小鼠的肝脏有明显的增加(图6A)。同时，辛伐他汀(Sim)或者洛伐他汀(Lov)可以促进HBV特异性的CD11ahi CD8αlo细胞上终末分化分子KLRG1的表达，促进其终末分化(图6B)。此外，辛伐他汀(Sim)或者洛伐他汀(Lov)处理可以降低HBV特异性的CD11ahi CD8αlo细胞上免疫抑制分子如LAG-3、Tim-3、PD-1的表达(图6C)，恢复其细胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-2的表达(图6D)，逆转慢性HBV感染导致的免疫耗竭状态。综合以上结果可以看出，增加DC上胆固醇积累可以增强HBV-carrier小鼠中抗原特异性的CD8+T细胞的功能，逆转其耗竭状态。
7、增加DC上胆固醇积累可以安全有效地清除CHB小鼠中的HBV，增强HBV治疗性疫苗的效果
7.1试验方法：
实验组皮下免疫rHBV疫苗(含HBsAg 2μg)+辛伐他汀(100μg)(简称“rHBV+Sim”)，rHBV疫苗(含HBsAg 2μg)+洛伐他汀(100μg)(简称“rHBV+Lov”)，空白对照组注射相同体积的PBS，以一周的时间间隔，免疫3次(Prime-boost)。通过检测外周血HBsAg、HBV DNA、肝脏HBcAg、肝脏HBV DNA及RNA、anti-HBs的水平以评价增加DC上胆固醇积累是否可以安全有效地清除CHB小鼠中的HBV。使用HBV-carrier-CD11c-DTR小鼠条件性缺失DC，观察DC缺失后，“rHBV+Sim”和“rHBV+Lov”处理能否有效的清除HBV，以评价DC的胆固醇恢复在抗HBV中的作用。
如图7A所示，与未治疗组相比，增加DC上胆固醇积累(“rHBV+Sim”和“rHBV+Lov”组)可以降低CHB小鼠外周血血清中HBsAg的水平，基本检测不到HBsAg的表达；并且，治疗效果可以维持较长时间。同时，如图7B所示，可以降低CHB小鼠外周血血清中HBV DNA水平，而且免疫组化染色显示肝脏HBcAg+的肝细胞在治疗后几乎消失(图7C)；增加DC上胆固醇积累(“rHBV+Sim”和“rHBV+Lov”组)降低肝脏中HBV-3.5kb-RNA、HBV-total-RNA、HBV DNA以及HBV cccDNA的表达(图7D)，部分实现anti-HBs的血清学转换(图7E)。此外，我们使用HBV-carrier-CD11c-DTR小鼠条件性缺失DC，研究发现，DC缺失后，再对其使用“rHBV+Sim”和“rHBV+Lov”的处理，其清除HBV的能力受损，表明辛伐他汀和洛伐他汀的抗HBV作用依赖于DC的参与(图7F)。综合以上结果可以看出，增加DC上胆固醇积累可以安全有效地清除CHB小鼠中的HBV，增强HBV治疗性疫苗的效果。
8、增加DC上胆固醇积累可以诱导机体产生长时间的免疫记忆，能够保护机体防止HBV的再次感染
8.1试验方法：
实验组皮下免疫rHBV疫苗(含HBsAg 2μg)+辛伐他汀(100μg)(简称“rHBV+Sim”)，rHBV疫苗(含HBsAg 2μg)+洛伐他汀(100μg)(简称“rHBV+Lov”)，空白对照组注射相同体积的PBS，以一周的时间间隔，免疫3次(Prime-boost)。三次免疫后，在第53d尾静脉再次注射8μg的pAAV/HBV1.2质粒进行HBV的攻毒，通过检测外周血血清中HBsAg、anti-HBs、肝脏HBVDNA及RNA以评价疫苗能否形成长期的免疫保护。
8.2试验结果：
与未治疗组相比，增加DC上胆固醇积累(“rHBV+Sim”和“rHBV+Lov”组)组小鼠在二次攻毒感染时外周血血清中基本检测不到HBsAg的表达(图8A)；75％以上的小鼠产生高水平的保护性的anti-HBs(图8B)，肝脏中HBV-3.5kb-RNA、HBV-total-RNA、HBV DNA以及HBVcccDNA基本检测不到(图8C)。综合以上结果可以看出，增加DC上胆固醇积累可以诱导机体产生长时间的免疫记忆，能够保护机体防止HBV的再次感染。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.胆固醇调节剂作为抗原递呈促进剂的应用。
2.如权利要求1所述胆固醇调节剂作为抗原递呈促进剂的应用，其特征在于，所述胆固醇调节剂为胆固醇吸收促进剂或者胆固醇酰基转移酶抑制剂；
进一步的，选自辛伐他汀、洛伐他汀、舒伐他汀或酰基辅酶A；
更进一步的，所述胆固醇调节剂为辛伐他汀或洛伐他汀。
3.如权利要求1所述胆固醇调节剂作为抗原递呈促进剂的应用，其特征在于，所述作为抗原递呈促进剂的应用，其具体应用方式包括但不限于以下任意一种：
(1)辛伐他汀或洛伐他汀在制备免疫调节药物中的应用；
(2)辛伐他汀或洛伐他汀在制备乙型病毒肝炎治疗药物中的应用；
(3)辛伐他汀或洛伐他汀作为HBV病毒疫苗佐剂的应用；
(4)辛伐他汀或洛伐他汀在制备抗原递呈细胞培养试剂。
4.如权利要求3所述胆固醇调节剂作为抗原递呈促进剂的应用，其特征在于，所述(1)方面的应用中，所述免疫调节药物应用于增强机体免疫应答；进一步的，用于改善自身免疫性疾病。
5.如权利要求3所述胆固醇调节剂作为抗原递呈促进剂的应用，其特征在于，所述(2)、(3)方面的应用，所述乙型病毒肝炎治疗药物或HBV病毒疫苗中，包括乙型肝炎病毒外壳蛋白抗原及辛伐他汀、洛伐他汀中的一种。
6.如权利要求3所述胆固醇调节剂作为抗原递呈促进剂的应用，其特征在于，所述(4)方面的应用中，所述抗原递呈细胞优选为树突状细胞。
7.一种HBV疫苗，其特征在于，所述疫苗中包括活性剂量的胆固醇调节剂。
8.如权利要求8所述HBV疫苗，其特征在于，所述胆固醇调节剂为辛伐他汀或洛伐他汀；
所述HBsAg及辛伐他汀或HBsAg及洛伐他汀的剂量比为2:90～110；
进一步的，所述HBV疫苗中，还包括其他免疫佐剂，包括但不限于氢氧化铝佐剂、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、多聚核苷酸或胞壁肽；
具体的，所述HBV疫苗每剂包括辛伐他汀或洛伐他汀100μg、HBsAg 2μg，氢氧化铝100μg；
优选的，所述HBV疫苗的免疫次数为2～3次。
9.一种HBV治疗药物，其特征在于，所述治疗药物中，包括权利要求7或8所述HBV疫苗。
10.如权利要求9所述HBV治疗药物，其特征在于，所述HBV治疗药物中还包括其他免疫调节类药物，包括但不限于PD-1、TIGIT单抗，或TCR-T、CAR-T细胞，或IL-2、IL-12、IL-15细胞因子。
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