CN1161973A - 重组人组织型纤溶酶原激活剂两步纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种重组人组织型纤溶酶原激活剂(tr-PA)的两步纯化法，此方法是利用微孔高硅玻璃珠(MPG)吸附层析柱内的MPG能非特异性地与rt-PA大量结合的特点，把MPG作为纯化含tr-PA的有血清细胞培养上清的第一步骤；根据tr-PA分子中存在赖氨酸结合位点，能与赖氨酸(Lys-Sepharose 4B)亲和层析柱上的赖氨酸特异性结合的特点，把Lys-Sepharose 4B亲和层析作为纯化tr-PA的第二步骤，此纯化方法简便、高效，适用于tr-PA放大生产。
Description
发明涉及一种纯化重组人组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue-typeplasminogen activator，rt-PA)的两步纯化方法，属于生物工程技术。
组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator，t-PA)是血液内纤溶***的生理性激活剂。它与血栓基质纤维蛋白有较强的特异亲和力，能在血栓局部高效激活纤溶***，是一种高效特异的溶血栓药。由于t-PA的半衰期短，临床用量大，通过人体组织细胞培养生产的t-PA远不能满足临床的需要，利用基因重组技术在原核表达***中生产的rt-PA不能有效地进行翻译后修饰，难于形成与天然rt-PA一致的构型，因而用真核表达***生产rt-PA是目前普遍采用的途径。在大量生产人rt-PA过程中产品的纯化工艺是一个重要环节。
目前国外所用的t-PA纯化技术如：
1. Rijken和Collen采用：1).锌螯合物亲和层析；2).刀豆球蛋白亲和层析；3).Sephadex G-150凝胶过滤等三步法纯化人黑色素瘤细胞(Bowes)无血清培养上清中的t-PA。
2. Einarsson用免疫亲和层析、精氨酸亲和层析和Sephadex G-150凝胶过滤等三步法，对重组人黑色素瘤细胞无血清培养分泌的rt-PA进行的纯化。
3.欧洲专利(申请号：87308392)记载，采用抗体亲和层析、盐析和离子交换层析法对产rt-PA重组CHO细胞生产的rt-PA进行的纯化等。
鉴于上述诸纯化方法均由三步纯化步骤组成，步骤繁多，纯化过程中包含了脱盐或凝胶过滤层析，规模不易放大，t-PA的回收率和比活性均低(回收率低于75％，比活性约为2.0×105IU/mg·蛋白)；采用抗体亲和层析，在纯化过程中因异源性抗体自固定相脱落，混于t-PA产品中，致使产品质量难于控制；此外，以上纯化方法都只限于无血清细胞培养物中t-PA的纯化，不能用于有血清的细胞培养上清中t-PA的纯化。
本发明提供的两步纯化rt-PA方法的技术要点是采用微孔高硅玻璃珠(Micropore Glass，MPG)吸附层析作为本纯化方法的第一步，然后用赖氨酸(Lys-Sepharose 4B)亲和层析作进一步纯化，两者结合形成的两步纯化方法。此法适用于纯化含小牛血清培基培养产rt-PA CHO工程细胞(N4B3)生产的rt-PA，可用于rt-PA的工业化放大生产，其目的在于克服已有纯化方法难于适应工业规模放大生产的缺陷。
以下的技术方案能实现本发明的目的：
1.本发明所以采用微孔玻璃珠是因其表面含有丰富的硅羟基，属于微孔或称多孔高硅玻璃珠，在层析柱内能非特异性地大量吸附细胞培养上清中的rt-PA。
2.由于rt-PA分子中含有赖氨酸结合位点，能与赖氨酸亲和层析柱上的赖氨酸特异性地结合，把赖氨酸亲和层析作为本两步法中的第二步纯化，可分离到具有与天然rt-PA相同构型和生物活性的高纯度的rt-PA。
实施例：
例1.
(1)微孔高硅玻璃珠(MPG)层析柱的准备：选用粒径为75～125μm，微孔径为35nm的MPG，用蒸馏水反复漂洗后晾干。
(2)MPG的用量是按照每处理100～120ml细胞培养上清所需MPG1克的用量计算。
(3)MPG用PBS浸泡后装填层析柱。
(4)用0.8μm微孔滤膜过滤含rt-PA的N4B3有血清培养上清。
(5)过滤后的上清以200cm/h的流速通过MPG吸附层析柱。
(6)分别用0.02M PBS、pH7.4(E1)和0.02M Tris、0.5M NaCl、pH7.4(E2)洗脱杂蛋白。
(7)用0.02M Tris、0.5M NaCl、0.5M Arginine、pH7.4(E3)洗脱结合于MPG上的rt-PA，流速为100cm/h。
(8)收集富含rt-PA的E3洗脱组分。
例2：
(1)用去离子水将MPG吸附层析中富含rt-PA的E3洗脱组分稀释4～5倍。
(2)以100cm/h的流速通过Lys-Sepharose 4B亲和层析柱。
(3)用与MPG吸附层析中相同的E1和E2洗脱杂蛋白。
(4)用0.02MTris、0.15M NaCl、0.5M Arginine、pH7.4洗脱结合于Lys-Sepharose 4B亲和层析上的rt-PA。
(5)留样测定活性和蛋白浓度，用SDS-PAGE结合光吸收扫描鉴定rt-PA的纯度。
(6)MPG吸附层析和Lys-Sepharose 4B亲和层析纯化rt-PA的全过程在4～8℃下进行。
(7)所有洗脱液中均含0.01％Tween80，洗脱过程用波长为280nm的紫外光进行检测。
MPG吸附层析和Lys-Sepharose 4B亲和层析两步纯化法在实际应用中所产生的积极效果：
1.MPG吸附层析对rt-PA的纯化具有结合量大，流速快、浓缩和纯化的效果显著的优点。
2. rt-PA的回收率高(超过100％)，纯化效率高，rt-PA的纯度提高200～300倍，纯化后的rt-PA约占总蛋白量的98％，比活性达4.2×105IU/mg·蛋白。经两步纯化后rt-PA的浓度提高200倍左右。
3.操作简易，重复性好，可用于工业化放大生产。
Claims (9)
1.一种重组人组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)的两步纯化方法，由微孔高硅玻璃珠(MPG)吸附层析和赖氨酸(Lys-Sepharose 4B)亲和层析组成，其特征在于其中的MPG吸附层析法，
2.如权利要求1所述一种rt-PA的两步纯化方法，其特征在于(1)MPG的表面含有丰富的硅羟基；(2)MPG的粒径为75～125μm；(3)其微孔径为35nm，
3.如权利要求1所述一种rt-PA的两步纯化方法，其特征在于MPG对rt-PA的结合量是以100～120ml/g MPG来计算的，
4.如权利要求1所述一种rt-PA的两步纯化方法，其特征在于含rt-PA的有血清细胞培养上清通过MPG吸附层析柱的流速为200cm/h，
5.如权利要求1所述一种rt-PA的两步纯化方法，其特征在于MPG层析柱内未结合的蛋白用0.02MPBS、0.01％Tween80、pH7.4进行洗涤，
6.如权利要求1所述一种rt-PA的两步纯化方法，其特征在于部分结合于MPG上的杂蛋白用0.02MTris、0.5M NaCl.、0.01％Tween80、pH7.4进行洗脱，
7.如权利要求1所述一种rt-PA的两步纯化方法，其特征在于结合于MPG上的rt-PA用0.02MTris、0.5M NaCl、0.5M Arginine、0.01％Tween80、pH7.4进行洗脱，
8.如权利要求1所述一种rt-PA的两步纯化方法，其特征在于含rt-PA的0.02MTris、0.5M NaCl、0.5M Arginine、0.01％Twwen80、pH7.4洗脱组分用去离子水稀释4～5倍后，以100cm/h的流速通过Lys-Sepharose 4B亲和层析柱，
9.如权利要求1所述一种rt-PA的两步纯化方法，其特征在于MPG吸附层析和Lys-Sepharose 4B亲和层析纯化的全过程均在4～8℃下进行。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN1303207C (zh) * | 2004-01-08 | 2007-03-07 | 中国药科大学 | 组织型纤溶酶原激活剂突变体的复性分离纯化方法 |
| CN101942429A (zh) * | 2010-08-25 | 2011-01-12 | 广州铭康生物工程有限公司 | 重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体rhTNK-tPA的纯化方法 |
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1996
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