CN111909920A - 一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法，所述的表达纯化方法包括：通过自诱导培养***诱导原核***表达人组织型纤溶酶原激活剂蛋白质分子；利用丝氨酸蛋白酶亲和层析柱纯化原核***表达的重组人组织型纤溶酶原激活剂；利用稀释透析技术对人组织型纤溶酶原激活剂蛋白质分子进行复性。本发明提供的重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法操作简单，成本低，蛋白质表达量大，蛋白产率高。

Description

一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法。
背景技术
组织型纤溶酶原激活剂又称组织型纤溶酶原激活物(tissue-typeplasminogenactivator，t-PA)或纤溶酶原激活因子(tissue plasminogen activator)，是体内纤溶***的生理性激动剂，在人体纤溶和凝血的平衡调节中发挥着关键性的作用。t-PA属于糖蛋白中的丝氨酸蛋白酶类，是人体特有的蛋白质，由527个氨基酸组成，其中包括35个半胱氨酸残基，它们参与形成17个二硫键，能够专一水解纤溶酶原，形成纤溶酶，激活纤溶***，对于清除血管内不溶性纤维蛋白，保证血液循环畅通起重要作用，药用t-PA能高效地预防和治疗急性心肌梗死等血栓性疾病。
目前对组织型纤溶酶原激活剂的研究多侧重于其突变体的研究，如CN103159860，CN 107177611，CN103509772等，且以真核表达居多，如CN 101717430，CN1468862。在现有技术中存在细胞株筛选困难，时间长，蛋白表达量低，成本高，耗时耗力等问题，不利于对t-PA本身结构与功能的研究。因此需要一种原核表达纯化t-PA的方法，具有操作简单、表达量高、成本较低的优势。
中国专利201410389379.X中公开了一种组织型纤溶酶原激活剂的构建、表达纯化方法。该发明涉及组织型纤溶酶原激活剂重组质粒的构建、原核表达及纯化技术，在含有人tPA全长基因质粒基础上在N端引入能去除载体上标签的3C序列，C端引入提高靶向性的RGDS序列，以PQE30为载体构建PQE30-rt-PA重组质粒，再通过自诱导方法诱导表达，采用超声法破菌处理后，用Ni2+亲和层析柱纯化r-tPA蛋白，然后再用PreScission蛋白酶切除融合蛋白上的3C短肽，从而去除His-Tag标签，再用分子筛进一步纯化，得到高纯度的r-tPA蛋白。但其纯化步骤较为复杂，容易造成制备蛋白产率低的问题，有待进一步改进。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种含有人组织型纤溶酶原激活剂t-PA的表达纯化方法，可用于心肌梗死等心脑血管疾病溶栓治疗的药物开发。
一方面，本发明提供了一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法。
所述的表达纯化方法包括：通过自诱导培养诱导原核***表达人组织型纤溶酶原激活剂蛋白质分子。
所述的表达纯化方法还包括：利用丝氨酸蛋白酶亲和层析柱纯化原核***表达的重组人组织型纤溶酶原激活剂。
所述的表达纯化方法还包括：利用稀释透析技术对人组织型纤溶酶原激活剂蛋白质分子进行复性。
进一步地，所述的原核***包括但不限于pET30a-tPA质粒。
进一步地，所述的自诱导培养***包括常规自诱导培养基。
优选地，所述的自诱导培养基为ZYM-5052自诱导培养基，所述的ZYM-5052自诱导培养基为中性培养基，包括以下成分：
氮源N-Z-amine(％) 1-2
酵母提取物(％) 0.5-1
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>(mM) 20-30
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(mM) 20-30
NH<sub>4</sub>Cl(mM) 4-60
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>(mM) 3-6
MgSO<sub>4</sub>(mM) 1-3
甘油(％) 0.4-0.8
葡萄糖(％) 0.04-0.06
乳糖(％) 0.1-0.4
优选地，所述的丝氨酸蛋白酶亲和层析柱为Benzamidine Sepharose 4FF亲和层析柱。
进一步地，所述的表达纯化方法包括以下步骤：
(1)从cDNA文库获得编码t-PA蛋白的基因，将其连接于原核表达载体pET30a，获得重组pET30a-tPA质粒；
(2)将上述重组质粒转化入E.coli Origami 2(该细胞株能够更加高效的在细胞质内生成二硫键，有助于含二硫键蛋白的形成)(DE3)细胞，将含有该重组质粒的Origami 2菌株于MDG培养基中活化，后在ZYM-5052自诱导培养基中经过扩大培养，IPTG通过自诱导表达得到含t-PA蛋白的包涵体；
(3)在变性条件下，以Benzamidine Sepharose 4FF亲和层析柱进行纯化，利用稀释透析技术复性后通过HPLC以C4反向色谱柱进一步得到正确折叠的t-PA蛋白质。
进一步地，所述的步骤(3)中稀释透析技术为根据t-PA分子的摩尔消光系数计算初步纯化的蛋白质浓度，以Buffer D(0.1M Tris，6M Urea，pH7.0)稀释为0.1-0.3mg/mL，装入干净的透析袋中并于室温下透析复性至少12小时。
另一方面，本发明提供了一种重组人组织型纤溶酶原激活剂。
所述的重组人组织型纤溶酶原激活剂通过前述的表达纯化方法制备。
再一方面，本发明提供了前述表达纯化方法在制备重组人组织型纤溶酶原激活剂中的应用。
又一方面，本发明提供了前述表达纯化方法在心肌梗死等心脑血管疾病溶栓治疗的药物开发中的应用。
又一方面，本发明提供了前述重组人组织型纤溶酶原激活剂在心肌梗死等心脑血管疾病溶栓治疗的药物开发中的应用。
又一方面，本发明提供了一种治疗心肌梗死等心脑血管疾病溶栓治疗的医学配制品。
所述的医学配制品中包括前述重组人组织型纤溶酶原激活剂。
本发明提供的重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法具有以下优点：原核表达技术操作简单，成本低，蛋白质表达量大，通过自诱导***可得到高于现有技术中IPTG诱导的高产量蛋白；稀释透析的复性技术不需要分子伴侣的参与，省略了除去分子伴侣的步骤，有利于提高产率；利用丝氨酸蛋白酶亲和层析柱纯化t-PA分子，不需要对t-PA进行改造，不需要添加标签，能够简化纯化步骤，提高产率。
附图说明
图1为乙腈梯度洗脱正确折叠的t-PA蛋白，乙腈浓度(25％-65％)随时间的梯度变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法
1、利用cDNA文库将t-PA基因进行PCR扩增，通用方法设计引物将t-PA基因连接至基因工程载体pET30a，构建pET30a-tPA质粒。
2、将构建好的pET30a-tPA质粒转化至E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含卡那霉素的LB培养基平板，LB培养基成分如下：
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
NaCl 10g/L
每升培养基补加200μL 10M NaOH调至pH为中性，高温高压灭菌。过夜培养后，挑选单菌落至含卡那霉素的ZYM-505液体培养基中培养，ZYM-505液体培养基成分如下：
氮源N-Z-amine(％) 1
酵母提取物(％) 0.5
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>(mM) 25
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(mM) 25
NH<sub>4</sub>Cl(mM) 50
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>(mM) 5
MgSO<sub>4</sub>(mM) 2
甘油(％) 0.5
葡萄糖(％) 0.05
培养基调至中性，高压高温灭菌。培养完成后提质粒测序并将测序正确的质粒转化至E.coli Origami 2细胞中，并在含卡那霉素的MDG培养基中进行活化培养，最后-80℃，25％甘油保存菌种。
(3)将含有pET30a-tPA质粒的Origami 2菌株接种于含100mg/L卡那霉素的MDG培养基中活化8-10小时，MDG培养基包括以下成分：
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>(mM) 25
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(mM) 25
NH<sub>4</sub>Cl(mM) 50
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>(mM) 5
MgSO<sub>4</sub>(mM) 2
葡萄糖(％) 0.5
天门冬氨酸(％) 0.25
将1mL活化的菌液转接至250mL含100mg/L卡那霉素的ZYM-5052自诱导培养基(比ZYM-505液体培养基多添加了0.2％的乳糖)中自诱导表达8-12小时，以上培养条件均为37℃，220rpm；
4、使用冷冻离心机于4℃收集菌体，弃上清，菌体以Buffer A(20mM Tris，150mMNaCl，2mM EDTA，0.1％Triton X-100，pH 7.0)重悬，冰水浴超声裂解细菌，4℃17000g离心收集包涵体，弃上清；
5、依次用以下缓冲液洗涤包涵体：Buffer B1(20mM Tris，20mM NaCl，0.5％(v/v)Triton X-100，pH7.0)、Buffer B2(20mM Tris，2M NaCl，pH 7.0)、Buffer B3(20mM Tris，150mM NaCl，2M Urea，pH 7.0)，离心弃上清，使用Buffer C(8M Urea，100mM Na2HPO4,10mMTris,1mMβ-巯基乙醇，pH 8.0)重悬包涵体沉淀，置于层析柜溶解过夜；
6、Benzamidine Sepharose 4FF亲和层析柱以Buffer C(8M Urea，100mM Na2HPO4,10mM Tris,1mMβ-巯基乙醇，pH 8.0)平衡，溶解的包涵体以17000g，4℃离心1h，保留上清弃去沉淀，上清经0.45μm滤膜过滤(若粘稠可以超声3次)后上样于层析柱，流速1mL/min，再以约5倍柱体积的Buffer C洗去未结合的杂蛋白，最后使用含10mMβ-巯基乙醇的洗脱缓冲液(8M Urea，100mM Na2HPO4,10mM Tris,10mMβ-巯基乙醇，pH 4.0)通过线性洗脱获得目的蛋白；
7、C4柱预先以含0.1％三氟乙酸的超纯水平衡，将复性好的t-PA蛋白与含0.1％三氟乙酸的超纯水以1:3的比例稀释，然后使用0.45μm滤膜过滤并上样于C4柱，上样速度5mL/min，再以含0.1％的超纯水洗去尿素及未结合杂蛋白，最后用含0.1％三氟乙酸的乙腈梯度洗脱正确折叠的t-PA蛋白，乙腈浓度(25％-65％)随时间的梯度变化如图1所示，总流速均为5mL/min，根据蛋白质疏水性不同其洗脱峰大致位于50min左右，收集洗脱液透析除去溶液中的乙腈。
8、根据t-PA分子的摩尔消光系数计算初步纯化的蛋白质浓度，以Buffer D(0.1MTris，6M Urea，pH7.0)稀释为0.1-0.3mg/mL，装入干净的透析袋中并于室温下透析复性至少12小时，复性好的t-PA蛋白质经HPLC过C4反向色谱柱进一步纯化分离，对产物进行检测。
9、圆二色光谱法检测高级结构：产物以20mM NaAc，pH 5.0缓冲液复溶，测量浓度并稀释至10μM。将待测样品加入比色皿(约600μL)，使用圆二色光谱仪进行测量，扣除以缓冲液对照设置的基线。测量范围：远紫外260nm至190nm以及近紫外350nm至250nm；取点间隔：0.5nm；扫描速度：200nm/min；狭缝宽度：1nm；测量温度：25℃；测量次数：5次。根据图谱数据分析比较重组t-PA蛋白与标准品的二级结构和三级结构的异同。
本实施例获得的t-PA蛋白纯度可达95％。
对本实施例获得的t-PA蛋白进行溶栓性能的检测，检测方法为纤维蛋白平板溶圈法，具体步骤如下：
重组t-PA蛋白加生理盐水复溶并稀释至约每l mL含1μg。称取琼脂糖125mg，加生理盐水23mL，煮沸使之溶胀，置55～60℃水浴中平衡，加14μL人凝血酶溶液(100IU/mL)，280μL人纤溶酶原溶液(0.5mg/mL)，边加边摇匀，加2.2mL人纤维蛋白原溶(6mg/mL)，摇至浑浊后立即倒入直径8cm的平皿中，水平放置充分凝固后，4℃放置至少30分钟待用。在含纤维蛋白平皿内打孔径2mm的小孔，在孔内分别加入重组t-PA蛋白溶液和标准品溶液，每孔10μL，每个稀释度做2孔，37℃湿盒水平放置24小时。纵向和横向量取溶圈直径，各2次，取平均值。以标准品溶液各个稀释度的生物学活性的对数对其相应的溶圈直径的对数作直线回归，求得直线回归方程，根据待测样品的溶圈直径的对数求得其生物学活性。
结果表明，相对于标准品，本实施例获得的t-PA蛋白溶栓比活性可达4×105IU/mg。

Claims (10)

1.一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法，其特征在于，所述的表达纯化方法包括：通过自诱导培养诱导原核***表达人组织型纤溶酶原激活剂蛋白质分子；
所述的表达纯化方法还包括：利用丝氨酸蛋白酶亲和层析柱纯化原核***表达的重组人组织型纤溶酶原激活剂；
所述的表达纯化方法还包括：利用稀释透析技术对人组织型纤溶酶原激活剂蛋白质分子进行复性。
2.根据权利要求1所述的重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法，其特征在于，所述的自诱导培养基为ZYM-5052自诱导培养基，所述的ZYM-5052自诱导培养基为中性培养基，包括以下成分：
氮源N-Z-amine(％) 1-2 酵母提取物(％) 0.5-1 Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>(mM) 20-30 KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(mM) 20-30 NH<sub>4</sub>Cl(mM) 4-60 Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>(mM) 3-6 MgSO<sub>4</sub>(mM) 1-3 甘油(％) 0.4-0.8 葡萄糖(％) 0.04-0.06 乳糖(％) 0.1-0.4
。
3.根据权利要求1所述的重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法，其特征在于，所述的丝氨酸蛋白酶亲和层析柱为Benzamidine Sepharose 4FF亲和层析柱。
4.根据权利要求1所述的重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法，其特征在于，所述的稀释透析技术为根据t-PA分子的摩尔消光系数计算初步纯化的蛋白质浓度，以Buffer D稀释为0.1-0.3mg/mL，装入干净的透析袋中并于室温下透析复性至少12小时；所述的Buffer D由0.1M Tris，6M Urea，pH7.0组成。
5.根据权利要求1所述的重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从cDNA文库获得编码t-PA蛋白的基因，将其连接于原核表达载体pET30a，获得重组pET30a-tPA质粒；
(2)将上述重组质粒转化入E.coli Origami 2细胞，将含有该重组质粒的Origami 2菌株于LB MDG培养基中活化，后在ZYM-5052自诱导培养基中经过扩大培养，IPTG通过自诱导表达得到含t-PA蛋白的包涵体；
(3)在变性条件下，以Benzamidine Sepharose 4FF亲和层析柱进行纯化，利用稀释透析技术复性后通过HPLC以C4反向色谱柱进一步得到正确折叠的t-PA蛋白质；
所述的步骤(3)中稀释透析技术为根据t-PA分子的摩尔消光系数计算初步纯化的蛋白质浓度，以Buffer D稀释为0.1-0.3mg/mL，装入干净的透析袋中并于室温下透析复性至少12小时；所述的Buffer D由0.1M Tris，6M Urea，pH7.0组成。
6.一种重组人组织型纤溶酶原激活剂，其特征在于，所述的重组人组织型纤溶酶原激活剂通过权利要求1-5任一项所述的表达纯化方法制备。
7.权利求1-5任一项所述的表达纯化方法在制备重组人组织型纤溶酶原激活剂中的应用。
8.权利求1-5任一项所述的表达纯化方法在心肌梗死等心脑血管疾病溶栓治疗的药物开发中的应用。
9.权利要求6所述的重组人组织型纤溶酶原激活剂在心肌梗死等心脑血管疾病溶栓治疗的药物开发中的应用。
10.一种治疗心肌梗死等心脑血管疾病溶栓治疗的医学配制品，其特征在于，所述的医学配制品中包括权利要求6所述的重组人组织型纤溶酶原激活剂。
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