CN116196251B - 一种羌活提取物的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种羌活提取物的制备方法及其应用，所述制备方法包括如下步骤：（1）取羌活用75‑90%乙醇水溶液进行回流提取，过滤，浓缩，得粗浸膏；（2）将粗浸膏上样至吸附树脂，依次进行水洗脱和75‑90%乙醇水溶液洗脱，浓缩，得到所述羌活提取物。该制备方法能够较大程度地同时富集羌活中羌活醇和异欧前胡素两种活性成分，且该制备方法仅采用的溶剂为醇和水，不具有光毒性、成本低、绿色环保，工艺简单易于操作，工艺耗时短，适用于工业化生产。

Description

一种羌活提取物的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于植物提取物制备工艺技术领域，涉及一种羌活提取物的制备方法及其应用，具体涉及一种羌活提取物的制备方法及其应用、一种羌活提取物分散液及其应用。
背景技术
羌活Notopterygium incisum为伞形科羌活属植物，广泛分布于我国陕西、四川、甘肃、青海、西藏等地区，是中、藏、羌医药体系中常用的中药，常用于解表散寒，祛风除湿，止痛。现代药理研究表明，羌活具有抗炎、镇痛、免疫抑制等作用。
目前市场上羌活提取物主要应用于医药技术领域。例如CN105193885A公开了一种羌活提取物及其制备方法和应用，将羌活粉碎，乙醇提取后，调节提取液pH值为2，浓缩后得粗提物，乙醇复溶后经大孔树脂纯化，收集60%醇洗液，浓缩，乙酸乙酯溶解，过滤，干燥后得到羌活提取物，并应用于保护肾损伤细胞的药物中。例如CN102366429A公开了中草药羌活提取物在制备减肥降脂药物或制备脂肪酶活性抑制作用的药物中的应用。而对于羌活提取物在日化产品中的应用还比较鲜少。
同时关于羌活现有报道的制备工艺，存在以下弊端：1、多采用***或甲醇等有机溶剂作为提取溶剂，将其应用于日化领域，存在安全风险；2、对提取或分离设备要求较高，可工业化生产的操作性不高；3、关注成分较为单一，只单项针对羌活醇或单项针对异欧前胡素；4、羌活中活性成分极性较小，在水溶液中溶解度较低，应用较困难。基于此，开发一种能够同时富集羌活醇和异欧前胡素两个活性物，并且绿色环保、工艺简单可操作性强的羌活提取物的制备方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种羌活提取物的制备方法及其应用，具体提供一种羌活提取物的制备方法及其应用、一种羌活提取物分散液及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种羌活提取物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
（1）取羌活用75-90%乙醇水溶液进行回流提取，过滤，浓缩，得粗浸膏；
（2）将粗浸膏上样至吸附树脂，依次进行水洗脱和75-90%乙醇水溶液洗脱，浓缩，得到所述羌活提取物；所述吸附树脂选自HPD100、DM130或X-5中的任意一种或至少两种的组合；所述吸附树脂的体积与羌活干重的比例为(0.5-3)L:1kg；
所述水洗脱的用量为0.5-2 BV，水洗脱的流速为2-5 BV/h；
所述乙醇水溶液洗脱的用量为3-8 BV，乙醇水溶液洗脱的流速为2-5 BV/h。
本发明中，所述羌活是指中药材羌活，为伞形科植物羌活或宽叶羌活的干燥根茎和根。
所述75-90%乙醇水溶液是指乙醇水溶液的浓度可以选择为75%、77%、78%、80%、82%、84%、85%、86%、88%、90%等；所述75-90%乙醇水溶液是指乙醇水溶液的浓度可以选择为75%、77%、78%、80%、82%、84%、85%、86%、88%、90%等；上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明通过控制提取溶剂乙醇水溶液的浓度以及选择特定的洗脱程序，能够较大程度地同时富集羌活中羌活醇和异欧前胡素两种活性成分，为进一步制备羌活醇和异欧前胡素两种衍生产物提供了较好的策略，且该制备方法仅采用的溶剂为醇和水，毒性低、成本低、绿色环保，工艺简单易于操作，工艺耗时短，适用于工业化生产。
本发明还创造性地发现在该制备方法中选择上述特定类型的吸附树脂对羌活提取物进行纯化处理，相较于其他类型的吸附树脂具有明显的优势，得到的羌活提取物中羌活醇和异欧前胡素的含量更高。
所述吸附树脂的体积与羌活干重的比例为(0.5-3)L:1kg，例如0.5L:1kg、1L:1kg、1.5L:1kg、2L:1kg、2.5L:1kg、3L:1kg等，更优选(1-2)L:1kg。
所述水洗脱的用量为0.5-2 BV，例如0.5 BV、1 BV、1.2 BV、1.5 BV、2 BV等；水洗脱的流速为2-5 BV/h，例如2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h、5 BV/h等；上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述乙醇水溶液洗脱的用量为3-8 BV，例如3 BV、4 BV、5 BV、6 BV、7 BV、8 BV等；乙醇水溶液洗脱的流速为2-5 BV/h，例如2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h、5 BV/h等；上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明还创造性地发现在该制备方法中选择上述特定的两阶段洗脱程序即先用水洗脱再用75-90%的乙醇水溶液洗脱，相较于其他方式的洗脱具有明显的优势，得到的羌活提取物中羌活醇和异欧前胡素的含量更高。
优选地，所述回流提取的次数为1-3次，例如1次、2次或3次。
以2次为例，具体操作为：将羌活进行第一次醇提后第一次固液分离，分别得到第一醇提液和残渣；将所述残渣进行第二次醇提后第二次固液分离，得到第二醇提液；将所述第一醇提液和第二醇提液合并，得到醇提液。
优选地，所述羌活的干重与单次乙醇水溶液的比例为1kg:(6-12)L，例如1kg:6L、1kg:7L、1kg:8L、1kg:9L、1kg:10L、1kg:11L、1kg:12L等，更优选1kg:(8-10)L。该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤（1）所述浓缩的温度为60-80℃，例如60℃、65℃、70℃、75℃、80℃等；压力为-0.05~-0.07 MPa，例如-0.05 MPa、-0.06 MPa、-0.07 MPa等；上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤（1）所述浓缩的终点至粗浸膏质量为羌活干重的0.5-3倍，例如0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍等，更优选1-2倍。该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤（2）所述浓缩的温度为60-80℃，例如60℃、65℃、70℃、75℃、80℃等；压力为-0.05~-0.07 MPa，例如-0.05 MPa、-0.06 MPa、-0.07 MPa等。
优选地，步骤（2）所述浓缩的终点至羌活提取物的固含量为20-45wt%，例如20wt%、25wt%、30wt%、35wt%、40wt%、45wt%等。更优选固含量为30-40wt%。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第二方面，本发明提供一种由第一方面所述的制备方法制得的羌活提取物。
本发明所制得的羌活提取物无光毒性，且含有高含量的羌活醇和异欧前胡素两种活性成分。
第三方面，本发明提供一种羌活提取物分散液，所述羌活提取物分散液包括羌活提取物、醇类分散剂、增溶剂和水，所述羌活提取物由第一方面所述的制备方法制得。
鉴于羌活提取物的极性较小，在水溶液中溶解度较低，使得其应用并不方便的弊端，本发明还创造性地开发了一种羌活提取物分散液，通过使用增溶剂和醇类分散剂，将富集得到的含羌活醇和异欧前胡素等极性小、难溶于水的羌活提取物制备成澄清透明、易于使用且能稳定保存的羌活提取液，极大程度地改善了其在应用方面的困难。
优选地，所述羌活提取物分散液以质量百分含量计包含羌活提取物2-20%、醇类分散剂70-90%、增溶剂1-10%，余量为水。
当各组分以上述特定的质量配比进行组合时，更能兼顾羌活提取液澄清透明和能持久稳定保存的特点。
所述羌活提取物的质量百分含量可以选择为2%、5%、8%、10%、11%、12%、15%、17%、20%等，更优选8-12%。
所述醇类分散剂的质量百分含量可以选择为70%、73%、75%、78%、80%、82%、85%、90%等，更优选70-85%。
所述增溶剂的质量百分含量可以选择为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%等，更优选2-5%。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述醇类分散剂包括1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3 丁二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述增溶剂包括PEG40-氢化蓖麻油和/或PEG-7甘油椰油酸酯。
第四方面，本发明提供第一方面所述的制备方法制得的羌活提取物和/或第三方面所述的羌活提取物分散液在制备促进细胞划痕愈合的产品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明通过控制提取溶剂乙醇水溶液的浓度以及选择特定的洗脱程序，能够较大程度地同时富集羌活中羌活醇和异欧前胡素两种活性成分，为进一步制备羌活醇和异欧前胡素两种衍生产物提供了较好的策略，且该制备方法仅采用的溶剂为醇和水，毒性低、成本低、绿色环保，工艺简单易于操作，工艺耗时短，适用于工业化生产。
附图说明
图1是羌活提取物对LPS致巨噬细胞Raw264.7细胞分泌的TNF-α的抑制效果结果图；
图2是羌活提取物对LPS致巨噬细胞Raw264.7细胞分泌的IL-6的抑制效果结果图；
图3是羌活提取物对细胞划痕修复效果结果图；
图4是羌活提取物对细胞划痕试验中细胞迁移率统计结果图；
图5是应用例1-4和对比应用例1-4制得的羌活提取物分散液的外观对比图；
图6是应用例1和应用例4制得的羌活提取物分散液放置30天后的外观对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
羌活药材含量测定：
测试方法：参照《中国药典》（2020版）中羌活含量测定的方法（高效液相色谱法）进行活性成分含量的测定。
色谱条件：色谱柱为Hypersil BDS C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈-水溶液(44:56)；检测波长为310 nm；流速为1 mL/min；进样量5 μL，柱温30℃；
对照品制备：分别称取羌活醇（规格HPLC≥98%，上海源叶生物技术有限公司）和异欧前胡素（规格HPLC≥98%，上海源叶生物技术有限公司）适量，精密称定，加入甲醇配制成每1mL含羌活醇60μg、异欧前胡素30μg的混合溶液，即得。
供试品制备：取羌活，粉碎，过40目筛网，取0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率250w，频率50kHz）30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，即得。
检测结果如表1所示：
表1
由表1数据可知：该羌活原料为合格药材，后续的实验均使用该原料。
实施例2
本实施例提供一种羌活提取物，其制备方法如下：
（1）取实施例1中羌活原料100g，加入1000mL浓度为85%的乙醇水溶液进行回流提取2 h，过滤，提取2次后合并，将所得提取液在60℃、-0.06 MPa条件下减压浓缩至100g，得到粗浸膏；
（2）将得到的粗浸膏上样于DM130大孔吸附树脂柱中（树脂的体积与粗浸膏质量的比例为2mL:1g），进行水洗脱（水洗流速4BV/h，水洗脱量2BV），然后用85wt%乙醇溶液进行解吸（解吸流速2 BV/h，解吸洗脱量为3BV），分别收集水洗液和解吸液。
实施例2’
本实施例提供一种羌活提取物，其制备方法如下：
（1）取实施例1中羌活原料100g，加入1000mL浓度为85%的乙醇水溶液进行回流提取2 h，过滤，提取2次后合并，将所得提取液在70℃、-0.07 MPa条件下减压浓缩至100g，得到粗浸膏；
（2）将得到的粗浸膏上样于DM130大孔吸附树脂柱中（树脂的体积与粗浸膏质量的比例为1mL:1g），进行水洗脱（水洗流速3BV/h，水洗脱量2BV），然后用80wt%乙醇溶液进行解吸（解吸流速4 BV/h，解吸洗脱量为4BV），分别收集水洗液和解吸液。
实施例2’’
本实施例提供一种羌活提取物，其制备方法如下：
（1）取实施例1中羌活原料100g，加入1000mL浓度为85%的乙醇水溶液进行回流提取2 h，过滤，提取2次后合并，将所得提取液在60℃、-0.06 MPa条件下减压浓缩至100g，得到粗浸膏；
（2）将得到的粗浸膏上样于DM130大孔吸附树脂柱中（树脂的体积与粗浸膏质量的比例为3mL:1g），进行水洗脱（水洗流速5BV/h，水洗脱量1BV），然后用90wt%乙醇溶液进行解吸（解吸流速3 BV/h，解吸洗脱量为6BV），分别收集水洗液和解吸液。
实施例3-6
本实施例提供四种羌活提取物，其制备方法与实施例2的区别仅在于步骤（1）中乙醇水溶液的浓度由85%依次替换为60%、75%、90%、95%，其他条件均保持不变。
实施例7-11
本实施例提供五种羌活提取物，其制备方法与实施例2的区别仅在于步骤（2）中将DM130大孔吸附树脂依次替换为HPD100、X-5、HPD600、AB-8、D101大孔吸附树脂，其他条件均保持不变。
对比例1
本对比例提供一种羌活提取物，其制备方法与实施例2的区别仅在于步骤（2）的洗脱方式不同，为先进行水洗脱（水洗流速4BV/h，水洗脱量2BV），然后用50wt%乙醇溶液进行解吸（解吸流速2 BV/h，解吸洗脱量为2BV），最后用85wt%乙醇溶液进行解吸（解吸流速2BV/h，解吸洗脱量为3BV），其他条件均保持不变。
测试例1
用实施例1中相同的HPLC法测定实施例2-11、实施例2’、实施例2’’和对比例1得到的醇洗液中羌活醇和异欧前胡素的含量。结果如表2所示。
表2
由表2数据可知：本发明所涉及的制备方法能够较高效率地将羌活提取物中的羌活醇和异欧前胡素提取出来，且提取溶剂类型、大孔吸附树脂类型、洗脱方式会影响提取效果。
测试例2
羌活提取物的3T3中性红摄取光毒性测试：
测试样本：由实施例2制备的解析液，浓缩至浸膏与药材质量之比为1:1。
（1）实验试剂
DMEM改良基础培养基（CELLCOOK）、完全培养基(90%DMEM改良基础培养基+10%新生牛血清)、新生牛血清（BI）、0.25%胰蛋白酶、中性红试剂（索莱宝）、PBS（PH7.4，BI）、盐酸氯丙嗪（索莱宝）、无水乙醇、乙酸等。
（2）实验耗材
移液器枪头（1000μL，200μL，10μL,NEST），96孔板（NEST），无菌离心管（1.5 mL ,2mL,5 mL,50 mL），一次性无菌针头过滤器(0.22μm），一次性无菌注射器（1mL ,20mL）等，无菌培养皿（100x100mm，NEST）等。
（3）仪器设备
移液器（1000μL，200μL，10μL，艾本德），酶标仪（BioTek,SYNERGY HTX），倒置显微镜（尼康），超净工作台（上海***），CO2恒温培养箱（美墨尔特），超低温冷冻储存箱（美菱生物）等。
（4）实验过程
细胞铺板：根据细胞计数的结果配制浓度为2×105 cell/mL的细胞悬液，按照每孔100μL接种于96孔板中，板周围一圈加PBS防止边缘效应，然后放回培养箱（37℃，5%CO2）培养。
配液：
1）阳性药-盐酸氯丙嗪（CPZ）：精确称取盐酸氯丙嗪粉末100mg于离心管中，加入1mL DMSO配制成100mg/mL母液，0.22μm滤膜过滤除菌后，储存在-20℃冰箱备用。将母液用PBS配制成两个不同浓度，分别作为光照处理组（+Irr）和无光照处理组（-Irr）的初始浓度，分别用PBS进行2倍梯度稀释，共配制8个浓度，备用。
2）待测样品-羌活提取物：用DMSO将实施例2羌活提取物样品配制成100mg/mL母液，0.22μm膜过滤除菌后，用PBS缓冲液稀释成1mg/mL溶液后，进行2倍梯度稀释，共配制8个浓度，备用。
3）按实验设计，用PBS缓冲液配置不同浓度的受试物：
4）加药：
取出96孔板，分别设置正常对照组（NC）、实验组和调零组；96孔板均按照下述方式进行加样，加样前在显微镜下拍照记录正常细胞状态。
①正常对照组（NC）：设置6个复孔，去除孔内培养基，每孔重新加入100μL PBS缓冲液；
②实验组：每个样品8个浓度，每个浓度设置6个复孔，去除孔内培养基，每孔加入100μL PBS缓冲液配制成的不同浓度样品；
③调零孔：选取边缘位置无细胞的孔，设置6个复孔，每孔加入100μL PBS缓冲液；
④将96孔板放回培养箱孵育1h。
5）光暴露：
将加入受试物的两块板随机选择，其中一块用于检测细胞毒性（无光照，-Irr），即对照板；另一块用于检测光细胞毒性（光照处理，+Irr），即处理板。处理板（+Irr）进行光暴露，以无细胞毒性的最高光剂量透过96孔板盖室温下进行辐照（UVA辐照条件：辐照度调到1.7 mW/cm2，约50min达到5J/cm2剂量）；对照板（-Irr），置于室温下用锡箔纸包裹后避光反应50min（与处理板相同时间）；
光照结束后，去除受试溶液，每孔加入100μL DMEM改良完全培养基在37℃，5%CO2条件下继续培养22h。
6）检测：
①试剂配制：中性红原液：取0.4g中性红染料，溶于100mL蒸馏水，即得。
中性红使用液：在79mL DMEM改良基础培养基中，加入1mL中性红原液，即为使用液。中性红终浓度为50μg/mL。
中性红解吸附溶液：将蒸馏水、乙醇、乙酸按照49:50:1的比例进行配制（现用现配，储存不超过1小时）。
②中性红染色：取出96孔板（+Irr、-Irr），将不同浓度下细胞状态进行拍照记录；将培养基去除，每孔加入100μL中性红工作液，置于37℃，5%CO2培养箱孵育3h；3h后，将染色后不同浓度下细胞状态进行拍照记录，将中性红染液去除，用PBS洗一次以去除细胞表面多余染液，每孔精确加入150μL中性红解吸附液（新鲜配制），于摇床振摇10min使形成均匀溶液。
③酶标仪测定：将96孔板置于酶标仪中，设置振板时间为15s，于540nm波长处测定吸光度，根据实验组、正常对照组、调零组的OD值计算各样品处理下细胞存活率。
④试验结果评价：以样品浓度为x轴、细胞存活率为y轴，拟合浓度-反应曲线并分别计算+Irr组与-Irr组的IC50，参考欧盟指令EU 67/548/EEC附录VB.41“体外3T3中性红摄取光毒性试验方法”光刺激因子(PIF)值：
如果在有光照(+Irr)和无光照(-Irr)两种情况下都得到完整的浓度响应曲线，通过下式计算PIF值：PIF=IC50(-Irr)/ IC50(+Irr)。
如果一个化合物只在有光照(+lrr)时有细胞毒性，而在无光照(-Irr)时无细胞毒性，即使试验结果表明其可能具有潜在光毒性，也无法计算 PIF。在这种情况下，如果用受试物最高浓度(Cmax)进行无光照(-Irr)下的细胞毒性实验，则可利用Cmax通过下式计算“>PIF”值：＞PIF=Cmax(-Irr)/ IC50(+Irr)。
如果受试物在达到允许的最高浓度值也不表现细胞毒性而使得IC50(+lrr)和IC50(-lrr)的值无法计算，这就表明该受试物无潜在光毒性。这时，“PIF=*1”描述结果。即PIF=*1×[Cmax(-Irr)/ Cmax(+Irr)]。
由预测模型得岀的数值，如下：
试验接受标准：依据 GB/T 21769-2008，试验接受标准如下表：
（5）实验结果分析
细胞存活率结果如表3和表4所示：
表3
表4
光毒性结果如表5所示：
表5
由表3-5结果可知，本次测试结果符合试验测试评价中的第3项，即受试物（羌活提取物）在达到允许的最高浓度（1000μg/mL）也不表现细胞毒性而使得 IC50(+lrr)和IC50(-lrr)的值无法计算，这就表明该受试物无潜在光毒性，表示为“PIF=*1”。综上所述，本发明所涉及的羌活提取物无光毒性。
测试例3
羌活提取物对LPS致小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌TNF-α的影响。
测试样本：由实施例2制备的解析液，浓缩至浸膏与药材质量之比为1:1。
测试原理：脂多糖(LPS)是细菌细胞壁的主要成分，可诱导体内巨噬细胞分泌及释放肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)等细胞炎症因子从而导致炎症反应。本实验通过LPS诱导的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)炎症模型，测定样品对TNF-α的抑制作用，从而反映样品抑制炎症的作用及其作用机制。
测试过程：
（1）分组：共分为四组，设置空白对照组、阴性対照组、阳性对照组和实验组，另设3个无细胞的孔作调零组，按照每组3个复孔进行布板；
（2）接种：当细胞密度≥70%时，弃除培养基，加入5 mLPBS清洗细胞后重新加入4mLDMEM基础培养基，移液枪吹打细胞至重悬，转移至2 mL离心管中，1000 rpm离心4 min，弃上清；重新加入1 mL完全培养基，吹打混匀后，稀释适当倍数并计数，根据计数的结果将细胞密度调整为1×105cell/mL，按照每孔200 μL 的体积接种细胞至96孔板中，放回培养箱孵育（37℃、5%CO2）；
（3）配液：将实验组样品分别稀释为0.22ppm和0.55ppm（通过MTT法测定的最大安全浓度），作为实验组的样品待测液；以***（100 μg/ mL）为阳性对照进行实验；以经LPS致炎的巨噬细胞Raw264.7为阴性对照组，以正常的Raw264.7巨噬细胞为空白对照组；
（4）给药：24 h后取出96孔板，弃除旧培养基，按照每组每个浓度3个复孔进行加样，调零孔、空白对照组、阴性对照组和实验组每组3个复孔，每孔加180 μL基础培养基，阳性对照组每孔加180 μL***（100 μg/mL），然后放回培养箱培养（37℃，5%CO2）；1 h后取出96孔板，调零孔、空白对照组每孔加20 μL基础培养基，阴性对照组、阳性对照组和实验组每孔加20 μL LPS（3 ng/mL），然后放回培养箱孵育（37℃，5%CO2）；
（5）细胞上清液收集：给药24 h后取出96孔板，分别收集各组对应的细胞上清液至离心管中，1000 rpm离心10 min，收集上清置于1.5 mL离心管中，-20℃储存备用；
（6）测试：利用ELISA 试剂盒测定细胞上清中TNF-α和IL-6浓度，测试前30 min取出试剂盒及待测溶液，放置于25℃后使用，测试操作严格按照试剂盒说明书操作。
（7）数据处理：
TNF-α抑制率(%)=(LPS刺激组炎症因子浓度（NC组）-待测物作用组炎症因子浓度（PC组或羌活组）)/(LPS刺激组炎症因子浓度（NC组）-未刺激组炎症因子浓度（BC组）)×100%。TNF-α抑制率越高，说明舒缓效果越好。
IL-6抑制率(%)=(LPS刺激组炎症因子浓度（NC组）-待测物作用组炎症因子浓度（PC组或羌活组）)/(LPS刺激组炎症因子浓度（NC组）-未刺激组炎症因子浓度（BC组）)×100%。IL-6抑制率越高，说明抗炎效果越好。
各组TNF-α浓度的测试结果统计如下表6和图1所示：
各组IL-6浓度的测试结果统计如下表7和图2所示：
表7
由上图和上表结果可知，本发明制备得到的羌活提取物在0.2ppm浓度下对LPS致巨噬细胞Raw264.7细胞分泌的TNF-α和IL-6均具有显著抑制作用。而0.05ppm浓度下的羌活提取物仅表现出对LPS致巨噬细胞Raw264.7细胞分泌的IL-6具有抑制作用，对TNF-α无抑制作用。表明羌活提取物对LPS致巨噬细胞Raw264.7细胞分泌的炎症因子TNF-α和IL-6的抑制效果与羌活提取物的浓度具有一定相关性。
测试例4
羌活提取物对细胞划痕损伤修复的影响
由实施例2制备的解析液，浓缩至浸膏与药材质量之比为1:1。
实验原理：当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”，在划痕的同时外加致炎物质脂多糖刺激，模拟皮肤损伤的过程。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合，模拟皮肤损伤修复的过程。本实验通过测试“划痕”愈合率，并以重组人表皮生长因子TGF-β1为阳性对照，评价样品对划痕损伤的修复作用。
测试过程：
（1）细胞铺板：
1）当细胞密度≥70%时，胰蛋白酶（0.25%）消化细胞并重悬，1000rpm离心4分钟，弃上清；重新加入1mL完全培养基，吹打混匀后，稀释适当倍数并计数，根据计数的结果将细胞密度调整为3.5×105cell/mL，待用；
2）取出6孔板，用记号笔在6孔板背面，用直尺比着均匀地划横线，大约每隔0.5cm一道，横穿过孔，每孔横穿过3条横线；
3）每孔2ml细胞悬液加入6孔板中，然后放回培养箱培养。
（2）细胞换液
24h后取出6孔板，弃除孔内培养基，每孔重新加入2mLMEM基础培养基
（3）细胞划痕及加药处理
1）细胞划痕
换液后24h，取出6孔板，弃除旧培养基，每孔重新加入1mlPBS，用200ul枪头垂直于背面的横线进行划痕，每孔3条划痕；用PBS冲洗细胞3次，将划下的细胞碎屑冲洗干净，然后显微镜拍照记录划痕。
2）加药处理及LPS刺激
空白对照组和阴性对照组每孔加入1.99mLMEM基础培养基和10μL浓度为200μg/mL的LPS，阳性对照组每孔加1.99mLMEM基础培养基配制的TGF-β1（100ng/mL）和10μL浓度为200μg/mL的LPS;实验组每孔加入1.99mL 0.039mg/ml浓度的待测溶液和10μL浓度为200μg/mL的LPS，每组每个浓度2个复孔。
3）划痕拍照
通过显微镜拍摄各组对应细胞划痕在加药后0h和24h的图片，记录划痕变化情况。
（4）数据处理
用Image Pro Plus对细胞划痕进行分析，记算0h和24h的细胞划痕面积，并按照公式计算划痕愈合率，比较各组间划痕愈合率的差异。
24h划痕愈合率%=(划痕0h-划痕24h)/划痕0h×100%
（5）实验结果整理分析
对各组划痕愈合率进行整理，用GraphPad prim进行作图，用T-Test进行统计分析，NC组与BC组相比，显著性以*表示，P值＜0.05表示为*P＜0.05；待测样品组与NC组相比，显著性以#表示，P值＜0.001表示为###P＜0.001。
各组样品划痕愈合率测试结果统计如下表8和图3、图4所示：
表8
由表8和图3、图4可知，羌活提取物在0.039%浓度下对LPS刺激合并划痕损伤角质形成细胞模型具有促进愈合的作用。
应用例1
本应用例提供一种羌活提取物分散液，其制备方法为：
取实施例2制得的羌活提取物10g，加入3g PEG-40氢化蓖麻油，80℃水浴保温搅拌至其均匀，再向体系中加入70g 1,3-丁二醇，搅拌至其均匀后，加入纯化水17g，混匀得到羌活提取物分散液。
应用例2
本应用例提供一种羌活提取物分散液，其制备方法为：
取实施例2制得的羌活提取物10g，加入5g PEG-7甘油椰油酸酯，80℃水浴保温搅拌至其均匀，再向体系中加入75g 1,3-丙二醇，搅拌至其均匀后，加入纯化水10g，混匀得到羌活提取物分散液。
应用例3
本应用例提供一种羌活提取物分散液，其制备方法为：
取实施例2制得的羌活提取物10g，加入5g PEG40-氢化蓖麻油，80℃水浴保温搅拌至其均匀，再向体系中加入72g 甘油，搅拌至其均匀后，加入纯化水13g，混匀得到羌活提取物分散液。
对比应用例1
本应用例提供一种羌活提取物分散液，其制备方法为：
取实施例2制得的羌活提取物10g，体系中加入70g 1,3-丁二醇，搅拌至其均匀后，加入纯化水20g，混匀得到羌活提取物分散液。
对比应用例2
本应用例提供一种羌活提取物分散液，其制备方法为：
取实施例2制得的羌活提取物10g，加入3g PEG-40氢化蓖麻油，80℃水浴保温搅拌至其均匀，再向体系中加入纯化水87g，混匀得到羌活提取物分散液。
对比应用例3
本应用例提供一种羌活提取物分散液，其制备方法为：
取实施例2制得的羌活提取物10g，体系中加入90g 1,3-丁二醇，搅拌至其均匀，得到羌活提取物分散液。
对比应用例4
本应用例提供一种羌活提取物分散液，其制备方法为：
取实施例2制得的羌活提取物10g，体系中加入90g 纯化水，搅拌至其均匀，得到羌活提取物分散液。
应用例4
本应用例提供一种羌活提取物分散液，其制备方法为：
取实施例2制得的羌活提取物10g，加入3g PEG-40氢化蓖麻油，80℃水浴保温搅拌至其均匀，再向体系中加入30g 1,3-丁二醇，搅拌至其均匀后，加入纯化水57g，混匀得到羌活提取物分散液。
测试例5
对应用例1-4和对比应用例1-4制得的羌活提取物分散液进行外观对比，结果如图5所示，由图5可知，本发明所涉及的羌活提取物分散液配方能够使羌活提取物充分地溶解，使体系均一稳定。
对外观澄清的应用例1和应用例4于25℃下进行常规储存30天，进行外观对比，结果如图6所示，由图6可知，本发明所涉及的羌活提取物分散液配方能够使羌活提取物长时间充分地溶解，使体系长时间均一稳定，更易于使用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种羌活提取物的制备方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (6)

1.一种羌活提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
（1）取羌活用75-90%乙醇水溶液进行回流提取，过滤，浓缩，得粗浸膏；
（2）将粗浸膏上样至吸附树脂，依次进行水洗脱和75-90%乙醇水溶液洗脱，浓缩，得到所述羌活提取物；所述吸附树脂选自HPD100、DM130或X-5中的任意一种或至少两种的组合；所述吸附树脂的体积与羌活干重的比例为(0.5-3)L:1kg；
所述水洗脱的用量为0.5-2 BV，水洗脱的流速为2-5 BV/h；
所述乙醇水溶液洗脱的用量为3-8 BV，乙醇水溶液洗脱的流速为2-5 BV/h。
2.根据权利要求1所述的羌活提取物的制备方法，其特征在于，所述回流提取的次数为1-3次；
所述羌活的干重与单次乙醇水溶液体积的比例为1kg:(6-12)L；
步骤（1）所述浓缩的温度为60-80℃，压力为-0.05~-0.07 MPa；
步骤（1）所述浓缩的终点至粗浸膏质量为羌活干重的0.5-3倍；
步骤（2）所述浓缩的温度为60-80℃，压力为-0.05~-0.07 MPa；
步骤（2）所述浓缩的终点至羌活提取物的固含量为20-45wt%。
3.一种羌活提取物分散液，其特征在于，所述羌活提取物分散液包括羌活提取物、醇类分散剂、增溶剂和水，所述羌活提取物由权利要求1-2中任一项所述的制备方法制得。
4.根据权利要求3所述的羌活提取物分散液，其特征在于，所述羌活提取物分散液以质量百分含量计包含羌活提取物2-20%、醇类分散剂70-90%、增溶剂1-10%，余量为水。
5.根据权利要求4所述的羌活提取物分散液，其特征在于，所述醇类分散剂包括1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3丁二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合；
所述增溶剂包括PEG40-氢化蓖麻油和/或PEG-7甘油椰油酸酯。
6.权利要求1-2中任一项所述的制备方法制得的羌活提取物和/或权利要求3-5中任一项所述的羌活提取物分散液在制备促进细胞划痕愈合的产品中的应用。
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