CN116194088A - 使用mdm2拮抗剂治疗癌症的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供SKP2作为使用MDM2拮抗剂预测癌症有效治疗的生物标志物。在癌症患者中鉴定该生物标志物可以确定患者的癌症是否可能使用MDM2拮抗剂成功治疗。因此，本发明总体上涉及用于MDM2拮抗剂治疗的伴随诊断。SKP2生物标志物可通过检测功能上位于SKP2上游或下游且其水平与SKP2生物标记物水平相关的分子(例如检测一种或多种SKP2底物)直接或间接测量。

Description

使用MDM2拮抗剂治疗癌症的生物标志物
技术领域
本发明涉及用于癌症治疗的生物标志物。具体而言，本发明提供了生物标志物，该标志物鉴定可能对MDM2拮抗剂敏感癌细胞。这些生物标志物可以整合到预测治疗反应的方法、***和试剂盒中，也可以并入到癌症的个体化治疗中。
背景技术
精准医疗或个体化医疗是一种新兴的疾病治疗和预防的方法，它考虑到每个患者的基因、环境和生活方式的个体差异。这即是常说的在正确的时间施用正确剂量的正确药物。
精准医疗的一个特别关注点是需要预测一位指定患者是否会对某一特定药物产生反应。能够预测一个特定药物是否能有效治疗一个个体患者的测试通常被称为伴随诊断。有效的伴随诊断是非常可取的，因为它们能够改善患者的治疗结果，同时还可以节省提供无效治疗的巨大经济花费。新的治疗试剂的有效伴随诊断也可以增加该治疗在正确人群中试验并最终获得批准的机会。
精准医疗和伴随诊断通常依赖于能够可靠地预测患者是否可能对特定治疗产生反应的生物标志物。为每种治疗和疾病鉴定可靠的生物标志物是一项非常重大的挑战。
Iorio等人(细胞，2016年7月28日；166(3)：740-75)“癌症中药物基因组相互作用的研究概况”报告了来自29个组织的11,289个肿瘤中鉴定的癌症驱动的改变(整合体细胞突变、拷贝数改变、DNA甲基化和基因表达)如何映射到1,001个分子注释的人类癌细胞系，并与对265种药物的敏感性相关联。虽然此类研究提供了将基因型与细胞表型联系起来并为选定的癌症亚群鉴定治疗选择的资源，但临床相关的分子靶向癌症治疗的开发仍然是一项艰巨的挑战。
仍然需要鉴定用于精准医疗的可靠生物标志物。
发明内容
本发明基于生物标志物的鉴定，该鉴定可用于使用MDM2拮抗剂预测有效癌症治疗。鉴定癌症患者中的一种或多种这些生物标志物能够允许确定使用MDM2拮抗剂患者的癌症是否可能被治疗，或可能被成功治疗。因此，在某些方面，本发明总体上涉及用于MDM2拮抗剂治疗的伴随诊断。
特别地，本发明中鉴定的生物标志物是SKP2。SKP2蛋白和编码它的基因是本领域已知的，具有Entrez基因ID 6502。如本文所用，SKP2被称为“本发明的生物标志物”。
特别地，在一个方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法中的MDM2拮抗剂，其中癌症表达低水平的SKP2。
可以通过减少的SKP2表达来鉴定对MDM2拮抗作用的敏感性。
对于SKP2，通常可以测量和/或蛋白质和/或核酸水平。蛋白质水平可以使用例如免疫组织化学(IHC)来实现。
SKP2核酸可以是DNA或RNA。可以检测到RNA，通常是SKP2 mRNA。因此，测量技术可以包括定量技术，如本领域已知的RT-PCR或纳米串(Nanostring)分析。
也可以测量DNA。在一些实施方式中，拷贝数变异(CNV)分析和/或突变分析(例如DNA测序)可用于检测SKP2状态。
生物标志物的测量有多种，包括基因的存在或缺失、基因的突变、基因表达水平和蛋白质表达水平。术语缺失可能意味着SKP2基因的丢失或完全丢失、SKP2基因突变和功能丧失，或者可能意味着低基因表达和蛋白质表达和功能水平低，这是由于基因的丢失或突变或其它原因造成的。所有这些缺失都包括在术语“缺失”中。
可以直接或间接检测SKP2。间接测量通常涉及检测功能上位于SKP2上游或下游的分子，其水平与生物标志物的水平相关。可以通过检测一种或多种SKP2底物来间接检测SKP2。因此，SKP2底物在本文中也称为本发明的生物标志物。如下所述，典型的SKP2底物是p27。在本发明的一个实施方式中，通过测量p27、p21、p57、E2F-1、MEF、P130、Tob1、cyclinD、cyclin E、Smad4、Myc、Mcb、RASSF1A、Foxo1、Orc1p、Cdt1、Rag2、Brca2、CDK9、MPK1和/或UBP43中的一种或多种，例如两种或多种、三种或多种、五种或多种或十种或多种的水平来评估SKP2水平。在一个实施方式中，通过鉴定p27、p21、p57、E2F-1、MEF、P130、Tob1、cyclinD、cyclin E、Smad4、Myc、Mcb、RASSF1A、Foxo1、Orc1p、Cdt1、Rag2、Brca2、CDK9、MPK1和/或UBP43中的一种或多种，例如两种或更多种、三种或更多、五种或更多或十种或更多的增加的或高水平来确定缺失的SKP2。在一些实施方式中，可检测蛋白质和核酸的组合。
高SKP2底物水平表示低SKP2。在一个实施方式中，本发明的生物标志物是p27、p21、p57、E2F-1、MEF、P130、Tob1、cyclin D、cyclin E、Smad4、Myc、Mcb、RASSF1A、Foxo1、Orclp、Cdt1、Rag2、Brca2、CDK9、MPK1和/或UBP43中的一种或多种，例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种的低SKP2或增加的或高水平。
以下实施例中的数据表明，SKP2的缺失例如丢失(也称为完全或完全丢失)可预测癌细胞对MDM2拮抗剂的敏感性。因此，低水平的SKP2可用于鉴定适合用MDM2拮抗剂治疗的癌症。
低SKP2表达表明癌细胞对MDM2拮抗剂的敏感性。相反，正常或高SKP2表达表明对MDM2拮抗剂具有抗性。当肿瘤具有正常或高SKP2并因此表明对MDM2拮抗作用不敏感时，可以使用诱导对MDM2拮抗剂敏感性的试剂。例如，这可以是降低肿瘤中SKP2水平的试剂。因此，提供了一种治疗患者癌症的方法，其中基于从所述患者获得的生物样品中具有正常或高水平的SKP2选择患者，并且向该患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂和诱导对MDM2拮抗剂敏感性的试剂，例如降低肿瘤中SKP2水平的试剂。
在一些实施方式中，本发明的生物标志物的表达是相对于非癌细胞确定的。这种癌症：非癌症比较可能对评估SKP2丢失特别有用。非癌细胞通常是与癌细胞类型相同的一种细胞。非癌细胞可以来自同一患者，或者可以来自不同的患者，或者可以是该类型非癌细胞的已知的值。这样，表达可以与在健康个体中确定的对照水平或与在正常非增殖组织中确定的对照水平进行比较。
在一些实施方式中，本发明的生物标志物的表达是相对于来自MDM2抑制剂非应答受试者的癌细胞样品或来自MDM2抑制物无反应受试者癌细胞样品确定的。在一些实施方式中，生物标志物相对于来自MDM2抑制剂无反应受试者的癌细胞样品或在来自MDM2抑制剂无反应受试者的癌细胞样品中降低。无反应性癌细胞通常是与被测试的癌细胞具有相同癌症类型的细胞。无反应性癌细胞通常来自不同患者或来自测试样品的患者，或者可以是该癌症类型的无反应性癌细胞的已知值。在一些实施方式中，患者可被鉴定为候选当SKP2的表达水平低于正常上限(ULN)时，使用MDM2拮抗剂进行治疗。因此，在一些实施方式中，当癌症中的SKP2表达低于正常上限(ULN)时，癌症被鉴定为可用MDM2抑制剂治疗。
任选地，该方法可以包括向患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂的步骤。
在本文所述的所有方面和实施方式中，癌症通常是p53-野生型癌症。
在一个实施方式中，本发明提供了用于癌症治疗，特别是p53野生型癌症的MDM2拮抗剂，其中癌症的特征在于从患者获得的生物样品中本发明的生物标志物。
根据本发明的另一个实施方式，提供了一种治疗患者癌症的方法，其中所述方法包括根据本发明的生物标志物的表达谱选择患者的步骤。在某些实施方式中，根据以下选择患者：
在从所述患者获得的生物样品中具有降低的SKP2表达；
然后任选地向所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂。
根据本发明的进一步的实施方式，提供了一种用于为患者治疗癌症的MDM2拮抗剂，其特征在于所述患者因具有以下条件而被选择：
从所述患者获得的生物样本中SKP2表达降低或为低表达；
在某些实施方式中，在治疗之前测试患者组织样本以确定癌症生物标志物表达谱。样本通常可以包括一种或多种癌细胞、癌症DNA或循环肿瘤DNA。样本可以是血液样本。样本可以是肿瘤样本，例如肿瘤活检。测试可以包括检测蛋白质、mRNA、DNA和/或ctDNA的测定。
在另一方面，本发明提供了在人类患者的癌细胞样品中SKP2的表达水平作为评估癌症是否易受MDM2拮抗剂治疗的生物标志物的用途。
在另一方面，本发明提供了一种用于预测或评估人类癌症患者对MDM2拮抗剂治疗的反应性的方法，包括评估来自癌症患者的样品中本发明生物标志物的表达水平，并确定所测试的表达水平是否表明癌症应该用MDM2拮抗药治疗。
在一些实施方式中，本发明的生物标志物表明癌症可能有效地凋亡。因此，在一些实施方式中，本发明能够鉴定那些治疗将会特别有效的患者。
在一些实施方式中，评估步骤包括体外测定以确定生物标志物或多个生物标志物的表达水平。
在一些实施方式中，评估步骤包括将表达水平与已知的与对用MDM2拮抗剂治疗的有反应或无反应相关的表达水平进行比较。在一些实施方式中，评估步骤包括将观察到的表达水平与以相同方式反映的与用MDM2拮抗剂治疗的敏感性相关的表达水平的阈值进行比较，以评估测定的表达水平是否表明癌症可以用MDM2拮抗剂治疗。
在一些实施方式中，根据生物标志物图谱将患者分入一组。这可能包括将患者分类为可能对MDM2拮抗剂治疗反应良好(或强烈)或不好。
在另一方面，本发明提供一种确定人类癌症患者是否适合用MDM2拮抗剂治疗的方法，包括
在来自患者的癌细胞样本中检测本发明的生物标志物的表达；和
根据样本中生物标志物的表达水平，评估患者的癌症是否可能用MDM2拮抗剂治疗。任选地，该方面的方法包括使用MDM2拮抗剂治疗患者癌症的进一步步骤。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种与抗癌化合物组合用于治疗患者癌症的MDM2拮抗剂，其特征在于，所述患者中的所述癌症是p53野生型癌症，该患者因具有本发明中的生物标志物而被选择。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种为患者治疗癌症的方法，其中所述患者的所述癌症任选地是p53野生型癌症，并且其中患者因具有本发明的生物标志物而被选择，其水平表明MDM2拮抗剂治疗将是有效的；向所选患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂和任选的另一种抗癌试剂。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种鉴定患有适合用MDM2拮抗剂治疗的癌症的患者的方法，其中所述方法包括检测和任选地定量SKP2的表达。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种选择患者(例如，患有癌症)的方法，其中所述方法包括通过检测和任选地定量SKP2的表达来选择患者的步骤。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种确定癌症患者将对MDM2拮抗剂治疗产生反应的可能性的方法，该方法包括：
获得来自患者的癌细胞样品中与相应的非癌细胞相比SKP2表达降低的测量值；
并根据该测量结果确定患者可能对MDM2拮抗剂治疗有反应。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种施用方法，包括：
确定本发明的一种或多种生物标志物
向具有本发明一种或多种生物标志物的患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂。
在又一方面，本发明提供了检测患有癌症的人类患者中SKP2表达的方法。该方法通常包括：
(a)从人类患者身上获取癌细胞样本；和
(b)通过将样本与一种或多种用于检测SKP2表达的试剂接触来检测SKP2是否在取样的癌细胞中表达。
在又一方面，本发明提供了一种试剂盒或装置，用于检测来自人类患者的样品中至少一种对MDM2拮抗作用的生物标志物的表达水平，所述试剂盒或装置包括用于检测本发明的生物标记的一种或多种检测试剂。
在另一方面，本发明在于一种用于评估一位人类癌症患者是否对MDM2拮抗剂治疗敏感的***，该***包括：
检测装置，其能够并适于在人类患者的样本中检测本发明的生物标志物。
处理器，其能够并适于从所确定的一个或多个生物标志物确定患者可用MDM2拮抗剂治疗可能性的指示。
该***可选地包括一种与一个界面的数据连接，特别是图形用户界面，能够呈现信息，优选地还能够输入诸如受试者年龄的信息，以及可选地诸如性别和/或病史信息的其它患者信息，所述界面是一个***或一个远程界面本身或其一部分。可选地，上述项目中的一项或多项，特别是处理器，能够“在云中”运行，即，不是在固定机器上，而是通过基于互联网的应用程序的方式。
本发明还提供了鉴定和筛选患者、药物组合和试剂盒的方法。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种筛选或鉴定可使用MDM2拮抗剂治疗的患者的方法，包括确定所述患者是否具有：
从所述患者获得的生物样本中SKP2表达降低；和/或
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种鉴定有反应患者的方法，包括测试患者：
从所述患者获得的生物样本中SKP2表达降低；和/或
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种治疗方法，包括：
(a)鉴定一个需要治疗癌症的患者，任选地p53野生型癌症，例如髓系白血病，任选地AML；
(b)确定所述患者在从所述患者获得的生物样品内SKP2表达降低；
和
(c)用治疗有效量的MDM2拮抗剂治疗患者。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种治疗方法，包括：
(a)鉴定需要治疗癌症的患者，可选地是髓系白血病如AML；
(b)确定患者中本发明的生物标志物；
(c)基于对MDM2拮抗剂对具有本发明的一种或多种生物标志物的患者有效的认同，选择MDM2拮抗剂作为患者的治疗；
(d)用治疗有效量的MDM2拮抗剂治疗患者。
在进一步的实施方式中，癌症是具有易位t(15；17)的AML。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种为癌症患者选择一种治疗方法的方法，包括：
(a)测定一个或多个生物样品，从而确定患者中本发明的生物标志物；
(b)根据该测定结果选择该患者使用治疗有效量的MDM2拮抗剂进行治疗。
在进一步的实施方式中，本发明提供了选择一个用MDM2拮抗剂治疗的患者(例如，患有癌症)的方法，其特征在于所述患者因具有以下条件而被选择：
从所述患者获得的生物样本中SKP2表达降低或为低表达；
在进一步的实施方式中，本发明提供一种用于患者治疗癌症的MDM2拮抗剂，其特征在于所述患者已知具有：
从所述患者获得的生物样本中SKP2表达降低；和/或
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种用于治疗患者癌症的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于检测和/或定量SKP2的生物传感器和/或用于检测SKP2的试剂，可选地还包括根据本文所定义的方法使用试剂盒的说明书。
在进一步的实施方式中，本发明提供一种确定患有癌症的个体对MDM2拮抗剂治疗的反应的方法，包括：
从所述患者获得的生物样本中SKP2表达降低；和/或
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种确定患有癌症的个体对MDM2拮抗剂治疗的反应的方法，包括鉴定患者：
在从所述患者获得的生物样本中SKP2表达降低；然后
向所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种患者治疗癌症的方法，其中所述方法包括选择一个患者的步骤：
在从所述患者获得的生物样本中SKP2表达降低；和
向在本文步骤中选择的所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂与干扰素(例如干扰素α)的组合。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种药物施用过程，包括：
(i)SKP2表达的顺序测定；和
(ii)向SKP2水平降低的患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种被包装的药品，包括：
(i)MDM2拮抗剂；
(ii)详细说明在本文描述的生物标志物谱鉴定的患者中使用MDM2拮抗剂治疗的患者插页。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种治疗患者癌症的方法，其中所述方法包括：
(i)将来自患者的样品与引物、抗体、底物或探针接触，以确定SKP2的表达水平；
(ii)选择从所述患者获得的生物样品中SKP2水平降低的患者；
(iii)随后向在步骤(ii)中选择的所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂。
SKP2的水平可以通过直接测量SKP2的表达水平来确定。如前所述，可以测量SKP2的蛋白质或核酸水平。
在进一步的实施方式中，可以通过测量SKP2底物的水平来确定SKP2的水平。已知的SKP2底物公开于Chan等人的《科学世界杂志》(2010)，10，1001-1015中，特别是表1中描述的那些。
Chan等人的表1
Figure BDA0004083338540000081
在本发明的一个实施方式中，通过测量p27、p21、p57、E2F-1、MEF、P130、Tobl、cyclin D、cyclinE、Smad4、Myc、Mcb、RASSF1A、Foxo1、Orc1p、Cdt1、Rag2、Brca2、CDK9、MPK1和/或UBP43中的一种或多种的水平来评估SKP2水平。在一个实施方式中，通过鉴定p27、p21、p57、E2F-1、MEF、P130、Tobl、cyclin D、cyclin E、Smad4、Myc、Mcb、RASSF1A、Foxo1、Orclp、Cdt1、Rag2、Brca2、CDK9、MPK1和/或UBP43中的一种或多种的增加或高水平来确定缺失的SKP2。在某些实施方式中，测量或鉴定这些底物中的两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多的水平。在一个实施方式中，测量或鉴定所有这些底物的水平。在另一个实施方式中，测量或鉴定这些底物之一的水平。
通常检测、确定或已知水平以反映低SKP2。一个实施方式是ULN上方的SKP2底物的水平。
在本发明的一个实施方式中，通过测量肿瘤样品中p27的水平来确定缺失的SKP2。通过鉴定增加的或高p27水平来确定SKP2的缺失。通常，测量p27蛋白的水平。通常，p27蛋白水平使用基于免疫的测定(例如ELISA、MSD、WES、蛋白质印迹、IHC等)进行测量。在另一个实施方式中，测量p27 RNA水平(例如，通过PCR、纳米串、RNA序列)。
可以在与SKP2测量所公开的相同的样品中测量SKP2底物的水平。通常，在肿瘤样本中测量SKP2底物。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种用于鉴定可使用MDM2拮抗剂治疗的患者的方法，该方法包括：
(a)使来自患者的样品与多个寡核苷酸引物接触，所述多个引物包括至少一对用于SKP2和/或SKP2底物(例如，p27)的寡核苷酸引物，如上所述；
(b)对所述样品进行PCR以扩增样品中的基因表达产物/转录产物；
(c)确定至少一种所述基因的表达产物的水平；和
(d)当SKP2的表达水平相对于正常上限(ULN)较低时，将患者鉴定为用MDM2拮抗剂治疗的候选者。
当SKP2的表达水平相对于正常(ULN)的上限较低(例如低于)时，患者可任选地被鉴定为用MDM2拮抗剂治疗的候选者。在某些实施方式中，还确定了用于MDM2拮抗剂治疗的至少一种其他生物标志物的表达水平。因此，可以测试一组生物标志物，其中该组包括SKP2。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种用于鉴定可使用MDM2拮抗剂治疗的患者的方法，该方法包括：
(a)使来自患者的样品与抗SKP2的抗体接触；
(b)测定所述样品；
(c)确定SKP2水平；以及
(d)当SKP2水平相对于正常上限(ULN)降低或降低时，将患者鉴定为MDM2拮抗剂治疗的候选者。
(b)部分中的测定可以是或包括免疫组织化学测定。在一些实施方式中，该测定可以是或包括ELISA。当来自患者的样品与抗SKP2的抗体接触时，通常对所述样品进行免疫组织化学测定，并且当SKP2的水平相对于正常上限(ULN)较低(或不存在)时，患者被鉴定为用MDM2拮抗剂治疗的候选者。
一旦鉴定了可治疗的患者，本文所述的方法还可以包括用MDM2拮抗剂治疗患者的癌症。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种选择可接受MDM2拮抗剂治疗癌症的癌症患者的方法，包括：
(a)确定来自患者的生物样品中SKP2的水平；和
(b)从患者中选择生物样本中SKP2水平低于预定值的患者。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种用于预测MDM2拮抗剂对患者癌症的疗效或用于预测癌症患者对MDM2拮抗药对癌症的反应的方法，包括确定来自患者的生物样品中SKP2的水平，其中SKP2的生物样品水平等于或通常小于预定值是对患者疗效的预测。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种选择需要用MDM2拮抗剂治疗的癌症患者的方法，该方法包括测试从患者获得的肿瘤样品的低水平SKP2。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，包括(i)测试患有或可能患有癌症的患者的肿瘤样本中SKP2丢失，和(ii)将向采集样本的患者施用MDM2拮抗剂。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种鉴定患有最有可能受益于MDM2拮抗剂治疗的癌症的患者的方法，包括测定患者的肿瘤样本中一种或多种本发明的生物标志物的水平并根据呈现的水平鉴定该患者是否可能受益于MDM2拮抗剂治疗。
本发明的一些实施方式包括检测指示SKP2丢失的SKP2突变的存在。这些突变可于在正常非增殖组织中或没有突变的情况下确定的对照水平进行比较。
本发明不同地提供：一种确定癌症患者是否适合用MDM2拮抗剂治疗的方法；一种预测肿瘤细胞生长对MDM2拮抗剂抑制的敏感性的方法；一种预测受试者癌症对包括MDM2拮抗剂的癌症治疗的反应的方法；一种为患有癌症的受试者制定治疗计划的方法；一种用于鉴定对MDM2拮抗剂方案治疗有反应或敏感的患者的体外方法。该方法通常包括将样品(通常是肿瘤样品)中SKP2的水平与参考水平进行比较，并预测癌症对包括MDM2拮抗剂的癌症治疗的反应。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种体外方法，用于预测患有肿瘤的患者，其是用MDM2拮抗剂治疗的候选患者，对用该化合物治疗的反应的可能性，该方法包括以下步骤：(a)确定取自患者的一个或多个组织样本中SKP2的水平，其中(i)SKP2缺失或丢失(例如与至少一个正常非增殖组织的参考值相比)表明患者可能对治疗作出反应，和/或(ii)正常或高水平的SKP2表明患者不太可能对治疗做出反应。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种测定方法，包括：(a)测量或定量SKP2的水平；(b)比较SKP2的水平(例如相对于健康个体中确定的对照水平)(例如相对于正常非增殖组织中确定的对照水平)，以及SKP2的水平(例如相对于在健康个体中测定的对照水平))降低，和/或SKP2的丢失(例如，相对于正常非增殖组织中测定的对照水平)将患者鉴定为适合用MDM2拮抗剂治疗。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种测定，包括：
(i)使从患者获得的生物样品与抗体(例如针对SKP2的特异性抗体)接触；
(ii)洗涤样品以去除未结合的抗体；
(iii)测定结合抗体的信号强度；
(iv)将测量的信号强度与参考值进行比较，以及测定的强度是否相对于参考值增加；
(v)将患者的生物样本与以下接触
a.引物(例如SKP2基因的至少一个寡核苷酸引物对)，
b.抗体(例如针对SKP2的特异性抗体)，和/或
c.指示SKP2丢失的基因或突变体的引物；
(vi)对所述样品进行PCR、RT-PCR或下一代测序以扩增样品本的基因表达产物/转录产物；
(vii)确定至少一种所述基因的表达产物的水平；和
(viii)鉴定受试者适合MDM2拮抗剂治疗的可能性增加。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向通过测序或免疫确定的肿瘤样品中SKP2丢失的受试者施用MDM2拮抗剂。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种向有需要的患者施用MDM2拮抗剂的方法，包括：
(1)确定患者的SKP2水平；
(2)根据上述基因水平和(1)中确定的肿瘤基因型为患者分配表型，其中表型选自差(P)、中等(I)和敏感(S)，并且所述表型是根据肿瘤中的基因水平分配的；和
(3)给表型S的患者施用MDM2拮抗剂。
在进一步的实施方式中，本发明提供MDM2拮抗剂在制备用于治疗患者癌症的药物中的用途，其中癌症肿瘤具有SKP2丢失。
在进一步的实施方式中，本发明提供了MDM2拮抗剂在制造用于治疗患者癌症的药物中的应用，该患者根据本文描述的方法鉴定为可能对MDM2拮抗剂治疗有反应。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种制品，其包括包装在一起的MDM2拮抗剂药物，该药物包括在药学上可接受的载体和包装插件中，表明所述癌症药物用于治疗癌症患者(例如髓系白血病，任选地AML)，其基于通过用于测量所述水平的测定方法确定的SKP2水平。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种为MDM2拮抗剂药物打广告的方法，包括向目标受众宣传MDM2拮抗药物用于治疗SKP2丢失的癌症患者的用途。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种被配置为鉴定癌症患者的肿瘤(例如，髓系白血病，任选地AML)为可能受益于靶向MDM2的治疗试剂或治疗试剂组合的治疗或不太可能受益于所述治疗试剂或治疗试剂组合的治疗的装置。该装置可包括存储装置，其存储来自肿瘤或基于血液的样品的测序数据或免疫测定数据以检测SKP2丢失，以将患者鉴定为可能或不可能受益于靶向MDM2的治疗剂或治疗试剂组合。
在这里描述的方法的一个实施方式中，当SKP2水平低或不存在(例如SKP2丢失)时，则向患者施用MDM2拮抗剂。
在本文所述方法的另一个实施方式中，当SKP2水平高(或存在)时，则患者未被施用MDM2拮抗剂。
当本发明的生物标志物的表达高时，MDM2拮抗剂可以与另外的治疗组合施用，例如降低SKP2水平的另外的治疗。
SKP2水平可能受到减少基因表达的影响，例如Notchl信号传导诱导Skp2基因表达，抑制Notch1通路将降低Skp2水平。IKK-NF-kB通路还通过p52/RelA或p52/RelB与Skp2启动子的结合来调节Skp2基因的表达，降低对NFkB转录因子的信号传导将减少SKP2的表达。另一种调节Skp2基因表达的通路是磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路，因此PI3Ki或AKTi对PI3K活性的抑制减少了Skp2 mRNA水平。PI3K/AKT通路的上游调节因子，如BCR-ABL和HER2也调节SKP2的表达。
除了表达水平的调节外，skp2还可以通过蛋白质稳定性进行调节。SKP2磷酸化，例如通过AKT或CDK2，减弱SKP2泛素化和降解。因此，抑制SKP2磷酸化是减少SKP2蛋白水平的另一途径。
在某些实施方式中，可以将MDM2拮抗剂与不是MDM2拮抗剂的其它癌症治疗组合施用于患者。
在一个实施方式中，本发明的生物标志物，特别是本文列出的SKP2和/或SKP2底物可用于选择患者，以使用MDM2拮抗剂与下文(i)-(xlix)中所述的试剂组合治疗。
在一个实施方式中，由于存在高水平或增加水平的SKP2(“SKP2高”)，患者的肿瘤被确定为不适合用单剂MDM2抑制剂治疗，因此可以使用额外的试剂与MDM2抑制剂组合来触发低水平或降低水平的SKP2(“SKP2低”)。在一个实施方式中，患者的肿瘤被确定为SKP2高，并用MDM2拮抗剂与另外的抗癌剂组合治疗。在一个实施方式中，患者的肿瘤被确定为SKP2高，并用MDM2拮抗剂与下述(i)-(xlix)中所列的一种或多种试剂组合治疗。
在一个实施方式中，本发明的生物标志物，特别是本文列出的SKP2和/或SKP底物，可用于选择患者，以使用MDM2拮抗剂与AKT抑制剂、CDK2抑制剂、Notch1通路抑制剂、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路抑制剂、IKK-NF-kB通路抑制剂、BCR-ABL抑制剂和/或HER2抑制剂组合治疗。
在一个实施方式中，患者的肿瘤被确定为SKP2高，并用MDM2拮抗剂与AKT抑制剂、CDK2抑制剂、Notch1通路抑制剂、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT通路抑制剂、IKK-NF-kB通路抑制剂、BCR-ABL抑制剂和/或HER2抑制剂组合治疗。
在一个实施方式中，本发明的生物标志物，特别是本文列出的SKP2和/或SKP底物可用于选择患者，以使用MDM2拮抗剂与CDK2抑制剂组合治疗。
在一个实施方式中，本发明的生物标志物，特别是本文列出的SKP2和/或SKP底物可用于选择患者，以使用MDM2拮抗剂与Notch1通路抑制剂组合治疗。
在一个实施方式中，本发明的生物标志物，特别是本文列出的SKP2和/或SKP底物可用于选择患者，以使用MDM2拮抗剂与磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路抑制剂，特别是PI3Ki或AKTi的PI3K活性抑制剂组合治疗。
在一个实施方式中，本发明的生物标志物，特别是本文列出的SKP2和/或SKP底物可用于选择患者，以使用MDM2拮抗剂与IKKNF-kB通路抑制剂组合治疗，例如通过p52/RelA或p52/RelB结合到SKP2启动子和减少NFkB转录因子的信号传导。
在一个实施方式中，IKK-NF-kB通路抑制剂是IRAK抑制剂。
在一个实施方式中，本发明的生物标志物，特别是本文列出的SKP2和/或SKP底物可用于选择患者，以使用MDM2拮抗剂与BCR-ABL抑制剂和/或HER2抑制剂组合治疗。
术语“PI3K/AKT通路抑制剂”在本文中用于定义一种化合物，该化合物抑制AKT的激活、激酶本身的活性或调节下游靶点、阻断通路的增殖和细胞存活效应(包括本文所述通路中的一种或多种靶酶，包括磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、AKT、雷帕霉素的哺乳动物标靶(mTOR)、PDK-1、p70 S6激酶和叉头易位)。
PI3K/AKT通路抑制剂包括PKA/B和/或PKB(akt)抑制剂、PI3K抑制剂、mTOR抑制剂和/或钙调素抑制剂(叉头易位抑制剂)
PI3K/AKT通路抑制剂的实施例包括PI3K抑制剂。
PI3K/AKT通路抑制剂的实施例还包括mTOR。
PI3K/AKT通路抑制剂的实施例包括叉头易位抑制剂。
PI3K/AKT通路抑制剂的实施例包括AKT抑制剂。
在一个实施方式中，P13K/AKT通路抑制剂是选自一种或多种上述特定化合物的PI3K抑制剂。在一个实施方式中，P13K/AKT通路抑制剂是PI-103或LY294002。
在一个实施方式中，提供了如本文所述的MDM2拮抗剂和PI3K/AKT通路抑制剂的组合。
在另一个实施方式中，提供了一种治疗患者癌症的方法，其中所述方法包括选定一个患者的步骤：
(a)从所述患者获得的生物样品中具有高水平的SKP2(或低水平的SKP2底物)；和
(b)向步骤(a)中选择的所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂和降低SKP2水平的试剂。
在一个实施方式中，降低SKP2水平的试剂或治疗是抗癌剂或治疗。在一个实施方式中，降低SKP2水平的试剂或治疗是PI3K/AKT通路抑制剂。
在另一个实施方式中，提供了用于治疗具有正常或高SKP2表达的癌症的方法的MDM2拮抗剂，其与诱导对MDM2拮抗剂的敏感性的试剂例如降低SKP2水平的试剂组合。
另一个实施方式提供了一种治疗患者癌症的方法，其中所述方法包括选择患者的步骤：
(a)在从所述患者获得的生物样品中具有正常或高水平的SKP2；和
(b)向步骤(a)中选择的所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂和诱导对MDM2拮抗剂的敏感性的试剂，例如降低SKP2水平的试剂。
在一些实施方式中，诱导对MDM2拮抗剂的敏感性的试剂可以是ASTX660，也称为托利那泮(tolinapant)。
附图说明
图1：用化合物1处理后凋亡和非凋亡癌细胞系中的差异基因表达水平。
图2：AML细胞系响应于化合物1(A)的处理被分类为凋亡或非凋亡。凋亡AML细胞系中的基础SKP2表达低于非凋亡AML细胞系(B)。
图3：SKP2过表达降低化合物1诱导的细胞毒性(A)。SKP2表达不调节对ABT-199(BCL-2抑制剂)的敏感性(B)。SKP2过表达减少了凋亡AML细胞系中化合物1依赖性细胞死亡(C)。
图4：SKP2敲低增加化合物1诱导的非凋亡AML细胞系中的细胞毒性(A)。SKP2过表达减少p53通路的化合物1依赖性激活(B)。
图5：SKP2过表达降低体内对化合物1的敏感性。与基础SKP2表达相比，当SKP2过表达时，用化合物1处理后循环肿瘤DNA水平更高。
图6：SKP2的过度表达在体内将敏感的AML细胞系转化为耐药细胞系。当SKP2表达低时，化合物1减少了白血病细胞的数量(C与B相比)。当SKP2过表达时，化合物1不会减少白血病细胞的数量(E与D相比)。
图7：与SKP2表达较高的AML细胞相比，分离自患者的SKP2低AML细胞对化合物1更敏感。SKP2表达增加与对化合物1的敏感性降低相关。
图8：通过细胞计数法测量裂解的caspase-3来测量OCI-AML3细胞系在处理72小时后的凋亡诱导。
定义
术语“MDM2抑制剂”和“MDM2拮抗剂”用作同义词，并定义如本文所述的MDM2化合物或MDM2化合物的类似物，包括离子、盐、溶剂化物、异构体、互变异构体、N-氧化物、酯、前药、同位素和其保护形式(优选其盐或互变异构体或异构体或N-氧化物或溶剂化物，更优选其盐或互变异构体或N-氧化物或溶剂化物)，如本文所述。
“MDM2拮抗剂”是指一种或多种MDM2家族成员特别是MDM2和MDM4(也称为MDMx)的拮抗剂。术语“拮抗剂”是指阻断或抑制激动剂介导的生物反应的一种受体配体或药物。拮抗剂对其同源受体具有亲和力但没有激动效力，且结合后会破坏相互作用并抑制受体上的任何配体(例如内源性配体或底物，激动剂或反向激动剂)的功能。拮抗作用可以直接或间接产生，并且可以通过任何机制和在任何生理水平介导。因此，配体的拮抗作用可能在不同的环境下以功能不同的方式表现。拮抗剂通过与受体上的活性位点或变构位点结合来介导它们的作用，或者它们可以在通常不参与生物调节受体活性的独特结合位点处相互作用。拮抗剂活性可以是可逆的或不可逆的，这取决于拮抗剂-受体复合物的寿命，这进而取决于拮抗剂受体结合的特性。
“效力”是药物活性的度量，用产生给定强度效果所需的量来表示。高效药物会在低浓度下诱发较大应答。效力与亲和力和功效成比例。亲和力是药物与受体结合的能力。疗效是受体占用与在分子、细胞、组织或***水平启动反应的能力之间的关系。
如本文所用，术语“介导的”，例如与如本文所述的MDM2/p53结合使用(并且应用于例如各种生理过程、疾病、状态、病状、治疗、治疗或干预)，旨在限制性地操作，使得所述术语所应用于的各种过程、疾病、状态、病状、治疗和干预中，为有蛋白质发挥生物作用。在所述术语应用于疾病、状态或病状的情况下，蛋白质所发挥的生物作用可以是直接的或间接的，并且对于疾病、状态或病状的症状(或所述疾病、所述状态或所述病状的病因或进展)的表现来说可以是必要的和/或充分的。因此，蛋白质功能(并且具体地，功能的异常水平，例如过表达或表达不足)不一定是疾病、状态或病状的近端病因：而是，经考虑，介导的疾病、状态或病状包括具有多因素病因和复杂进展的那些疾病、状态或病状，所讨论的蛋白质仅部分参与其中。在所述术语应用于治疗、预防或干预的情况下，蛋白质所发挥的作用可以是直接的或间接的，并且对于治疗、预防或干预结果的操作来说可以是必要的和/或充分的。因此，由蛋白质介导的疾病状态或病状包括对任何特定癌症药物或治疗的抗性的发展。
如本文在治疗病状，即状态、病症或疾病的上下文中所使用的术语“治疗”通常涉及无论是针对人还是针对动物(例如，在兽医应用中)的治疗和治疗，其中一些期望的治疗效果是例如对病状的进展的抑制得以实现并且包括进展速率降低、进展速率停止、病状改善、正在治疗的至少一种与病状相关或由病状引起的症状减轻或缓解以及病状治愈。例如，治疗可以是减轻一种疾病的一种或若干种症状或完全根除疾病。
如本文在治疗病状，即状态、病症或疾病的上下文中所使用的术语“预防”(即，使用化合物作为预防措施)通常涉及无论是针对人还是针对动物(例如，兽医应用)的预防(prophylaxis或prevention)，其中一些期望的预防效果得以实现，例如预防一种疾病的发生或抵御一种疾病。预防包括完全和绝对阻断病症的所有症状持续无限的时间段、仅仅减缓疾病的一种或若干种症状的发作或降低疾病发生的可能性。
对如癌症等疾病状态或病状的预防或治疗的提及包括在其范围内缓解或降低例如癌症的发病率。
相对于单个的化合物/试剂在单独施用时的治疗效果，本发明的组合可以产生治疗有效的效果。
术语“有效”包括有利效果，如累加性、协同作用、副作用减少、毒性降低、疾病进展时间增加、存活时间增加、一种试剂对另一种试剂的敏化或复敏或应答率提高。有利地，有效的效果可以允许向患者施用较低剂量的每种或任一种组分，由此降低化学治疗的毒性，同时产生和/或维持相同的治疗效果。本发明上下文中的“协同”效应是指由组合产生的治疗效果大于组合中的试剂在单独提供时的治疗效果的总和。本发明的上下文中的“累加”效应是指由组合产生的治疗效果大于组合中的试剂中的任何试剂在单独提供时的治疗效果。如本文所用，术语“应答率”在实体瘤的情况下是指在给定时间点，例如12周时，肿瘤的大小减小的程度。因此，例如，50％的应答率意指肿瘤大小减小50％。本文对“临床应答”的提及是指50％或更高的应答率。“部分响应”在本文中被定义为小于50％的应答率。
如本文所用，术语“组合”，如应用于两种或更多种化合物和/或试剂，旨在定义其中两种或更多种试剂结合的材料。此上下文中的术语“组合(combined)”和“组合(combining)”应相应地进行解释。
组合中的两种或更多种化合物/试剂的结合可以是物理的或非物理的。物理结合的组合的化合物/试剂的实施例包括：
·包括混合(例如在相同单位剂量内)的两种或更多种化合物/试剂的组合物(例如，单一配方)；
·包括其中两种或更多种化合物/试剂化学/物理化学地连接(例如，通过交联、分子团聚或与共同媒剂部分结合)的材料的组合物；
·包括其中两种或更多种化合物/试剂化学/物理化学地共包装(例如，安置在脂质囊泡、颗粒(例如，微粒或纳米颗粒)或乳液液滴之上或之内)的材料的组合物；
·其中两种或多种化合物/试剂共包装或共存在(例如，作为单位剂量阵列的一部分)的试剂试剂盒、试剂包或患者包；
非物理结合的组合的化合物/试剂的实施例包括：
·包括两种或更多种化合物/试剂中的至少一种化合物/试剂以及针对所述至少一种化合物临时结合以形成两种或更多种化合物/试剂的物理结合的说明的材料(例如，非单一配方)；
·包括两种或更多种化合物/试剂中的至少一种化合物/试剂以及针对与两种或更多种化合物/试剂的组合治疗的说明的材料(例如，非单一配方)；
·包括两种或多种化合物/试剂中的至少一种化合物/试剂以及针对向患者群体施用的说明的材料，其中两种或多种化合物/试剂中的其它化合物/试剂已经(或正在)施用；
·包括两种或更多种化合物/试剂中的量或形式特别适用于与两种或多种化合物/试剂中的其它化合物/试剂组合使用的至少一种化合物/试剂的材料。
如本文所用，术语“组合治疗”旨在定义包括使用两种或更多种化合物/试剂的组合(如上文所定义)的治疗。因此，在本申请中对“组合治疗”、“组合”和化合物/试剂“组合”使用的提及可以指化合物/试剂作为同一总体治疗方案的一部分施用。因此，两种或更多种化合物/试剂中的每种化合物/试剂的剂量学可以不同：每种化合物/试剂可以同时或在不同时间施用。因此，应当了解，组合中的化合物/试剂可以在同一试剂配方中(即，一起)或在不同的试剂配方中(即，单独)依次施用(例如，之前或之后)或同时施用。同时在同一配方是作为单一配方，而同时在不同的药物配方中是非单一的。关于施用途径，组合治疗中的两种或更多种化合物/试剂中的每种化合物/试剂的剂量学也可以有所不同。
如本文所用，术语“药物试剂盒”定义了一个或多个单位剂量的阵列的药物组合物以及给药装置(例如，测量装置)和/或递送装置(例如，吸入器或注射器)，所述药物组合物和所述给药装置和/或递送装置任选地全部包括在共同的外部包装内。在包括两种或更多种化合物/试剂的组合的试剂试剂盒中，单个的化合物/试剂可以是单一或非单一的配方。泡罩包内可以含有单位剂量。药物试剂盒可以任选地进一步包括使用说明。
如本文所用，术语“药物包”定义了一个或多个单位剂量的阵列的药物组合物，任选地包括在共同的外部包装内。在包括两种或更多种化合物/试剂的组合的试剂包中，单个的化合物/试剂可以是单一或非单一的配方。泡罩包内可以含有单位剂量。药物包可以任选地进一步包括使用说明。
如本文所用，术语“任选地经取代的”是指可以是未经取代的或可以被如本文所定义的取代基取代的基团。
具体实施方式
本发明基于生物标志物的鉴定，该生物标志物允许确定癌症患者对MDM2拮抗剂治疗的可能反应。这提供了使用MDM2拮抗剂对癌症的精确治疗。
在某些实施方式中，本发明提供了一种使用MDM2拮抗剂治疗癌症的伴随诊断。如本文所用，术语伴随诊断用于指鉴定患者是否会对药物产生反应所需的测试(即必要的伴随诊断)和旨在确定患者是否会反应良好或最佳(有时称为补充诊断)。在某些实施方式中，生物标志物鉴定会反应的患者，并因此区分有反应者和无反应者。在另一个实施方式中，生物标志物鉴定会有最佳反应的患者，从而医生可以为该患者选择最佳治疗。
在一些实施方式中，本发明提供了用于确定SKP2表达水平的测定法。如上所述，这可以直接或间接确定。该测定可能包括也可能不包括推断预后结果的步骤。该测定通常是对患者样本(例如癌症活检或血液样本)进行的体外测定(无论癌症是否为血癌)。
有效癌症治疗的生物标志物
本公开提供了一种生物标志物，其表明癌细胞对MDM2拮抗剂治疗的敏感性增加。因此，SKP2的鉴定允许选择癌症患者进行MDM2拮抗剂治疗。
本发明的生物标志物是S相激酶相关蛋白2，通常称为“SKP2”。这种蛋白质和基因是本领域已知的。人SKP2具有Entrez基因ID 6502(位于5p13.2)和Uniprot登录号Q13309。
SKP2低表达表明癌细胞对MDM2拮抗剂治疗的敏感性。正常或高SKP2表达表明癌细胞对MDM2拮抗剂治疗的抗性。在实施例2中，凋亡AML细胞系中的基础SKP2表达低于非凋亡AML细胞系(图2)。SKP2表达与体外MDM2拮抗剂治疗的敏感性相关(图3A-C、4A-B)，但不调节其他促凋亡分子的活性(图3B)。SKP2表达还调节了体内和患者AML细胞对MDM2拮抗剂治疗的敏感性(图5-6-7)。
因此，低水平的SKP2预示着癌细胞对MDM2拮抗剂治疗的敏感性增强。
在一些实施方式中，SKP2缺失可由SKP2基因中的一个或多个突变引起。突变可以包括一个或多个核苷酸替代、添加、缺失、倒换或其他DNA重排或其任何组合。在一些实施方式中，SKP2基因中的一个或多个突变是失活的。
当确定多个生物标志物时，生物标志物的组合可称为一个生物标志物组合。生物标志物组合可以包括或由鉴定的生物标志物组成。
除了SKP2之外，其他生物标志物和/或数据，例如人口统计学数据(例如，年龄、性别)，可以包括在用于确定MDM2抑制的适用性的一组数据中。当可选地包括其他生物标志物时，生物标志物(即本发明的生物标志物加上其他生物标志物)的总数可以是2、3、4、5、6或更多。在一些实施方式中，具有较少成分的预测性生物标志物组合可以简化所需的测试。
如本文所用，术语“丢失”和“降低”将被赋予其通常的含义。如本文所用的术语“增加”和“增强”将被赋予它们通常的含义。
可以通过对本领域技术人员来说显而易见的适当技术来确定生物标志物。生物标志物可以通过直接或间接技术确定。基因表达可以通过检测mRNA转录产物来测定。可以用免疫组织化学检测蛋白质生物标志物。
在一些实施方式中，本发明的一种或多种生物标志物的缺失可以通过评估一种或多种生物标志物的功能来确定。生物标志物表达水平可以与功能水平成正比。可以直接或间接确定一种或多种生物标志物的功能。
在一些实施方式中，可以将表达水平与以相同方式反映已知与对治疗的敏感性相关的表达水平的阈值进行比较，以评估测试值是否指示患者对MDM2抑制治疗的敏感性。
根据本公开评估的患者已知或怀疑患有癌症。测试的样品可能已知或怀疑包括癌细胞。在典型的实施方式中，被测试的样品将是癌组织活检。活检可以是液体活检或实体组织(例如，实体瘤)活检。
生物标志物水平
本发明提供SKP2作为生物标志物。已经观察到，SKP2水平降低表明对MDM2抑制剂治疗癌症的敏感性增加。
可以相对于正常健康个体进行比较，通常相对于与癌细胞类型相同的非癌细胞进行比较。
在一些实施方式中，相对于来自同一个体的非癌细胞(通常是来自同一个人的同类型非癌细胞)，确定降低的生物标志物水平。
在进一步的实施方式中，基于已知的正常群体值，相对于实验室标准和值来确定生物标志物水平。通常，已知水平取自非癌细胞。
在其他实施方式中，生物标志物水平相对于来自正常(非癌性)个体的已知值。例如，BloodSpot(www.bloodspot.eu)是一个正常和恶性血细胞的基因表达的数据资源，包括了AML基因表达数据，如本文其他地方所讨论的。
在一些其他实施方式中，相对于来自MDM2抑制剂无反应受试者的癌症样品中或来自MDM2抑制物无反应受检者的癌症样本中确定的水平来评估生物标志物水平。
在一个实施方式中，相对于从未患癌症的正常受试者获得的对照样品中所述RNA的量，SKP2的RNA水平降低。
在另一个实施方式中，SKP2的RNA水平相对于从同一患者获得的早期样品中所述RNA的量降低，当该患者没有癌症时。
在一个实施方式中，其相对于正常水平(例如“正常上限”或ULN)降低。
在一个实施方式中，至少一种生物标志物的水平在癌症与对照样本中的曲线下面积(AUC)大于(针对水平增加的生物标志物)或小于(对于缺失的生物标志物)0.5，是相对于(a)未患癌症的组织或人的样本中至少一种生物标志物的水平，或(b)受试者的样本中的一种或多种对照蛋白的水平。任选地，AUC大于或小于0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.975或0.99。
在一些实施方式中，至少一种生物标志物的水平是对照的至少一个标准偏差，是相对于(a)未患有癌症的组织或人的样本中的一种或多种生物标志物的水平，或(b)癌症受试者的样本中一种或多种对照蛋白的水平。
在一些实施方式中，用于比较的对照是从健康患者获得的样本或从诊断患有癌症的患者获得的非癌性组织样本，例如来自肿瘤所在的相同器官的非癌性组织样本(例如，非癌性白细胞可以用作白血病的对照)。在一些实施方式中，对照是历史对照或标准值(即，先前测试的对照样本或代表基线或正常值的样本组)。
用于与样本比较以测定差异表达的对照或标准品，包括被认为正常的样本(因为它们没有因所需特征发生改变，例如未患有结肠癌的受试者的样本)及实验室值，即使可能是任意设置的。实验室标准和值可以根据已知或确定的人群值来设置，并且可以用图形或表格的形式提供，后者方便对测量的、实验确定的值进行比较。
在这样的实施方式中，一个或多个生物标志物的参考分数基于正常健康个体。
癌症
呈现已鉴定的SKP2生物标志物的癌症用MDM2拮抗剂成功治疗的可能性增加。待治疗的癌症没有特别限制，只要它呈现生物标志物。
这种癌症通常是p53野生型。如本领域所公认的，p53野生型癌细胞表达的肿瘤抑制基因p53处于野生型水平，并具有野生型功能。野生型p53细胞不包括导致p53肿瘤抑制功能降低的p53基因突变。
实施例2中提供的初始生物标志物数据是从包括结肠、血液、乳腺、肺、皮肤、卵巢和胰腺在内的一系列癌组织中产生的。
因此，癌症可能是液体癌或实体瘤。
实施例3及其后的详细生物标志物分析集中于血癌，特别是急性髓系白血病(AML)。因此，在某些实施方式中，癌症是液体癌症，典型地是血癌。典型的血癌包括白血病、淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金)和骨髓瘤。
在一个实施方式中，癌症是淋巴瘤。这可能是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，也可能是霍奇金淋巴瘤。
在一个实施方式中，癌症是骨髓瘤。这可能是多发性骨髓瘤(MM)。
典型的癌症是白血病。白血病包括急性成淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞白血病(CML)和急性单核细胞白血病(AMoL)。
更典型地，癌症是髓系白血病。髓系白血病包括慢性髓系白血病(CML)和急性髓系白血病(AML)。
典型的癌症是急性髓系白血病(AML)。
在一个实施方式中，AML是具有易位t(15；17)的AML。
在另一个实施方式中，癌症是实体瘤。实体瘤可以是结肠癌。在进一步的实施方式中，癌症是乳腺癌。在另一个实施方式中，癌症是肺癌。在又一个实施方式中，癌症是皮肤癌，例如黑素瘤或癌。在另一个实施方式中，癌症是卵巢癌。在一个不同的实施方式中，癌症是胰腺癌。
可根据本发明评估治疗的特定癌症包括但不限于急性髓系白血病(AML)。在一些示例性测定中，观察到AML是最敏感的癌症。
在某些实施方式中，癌细胞的增殖被在纳摩尔范围内的IC50的MDM2拮抗剂抑制。在某些实施方式中，IC50值小于500nM、小于400nM、小于300nM或小于200nM。在一些实施方式中，IC50值小于100nM。IC50值可以例如使用本文所示的GraphPad Prism软件或本领域已知的方法来计算。
在某些实施方式中，MDM2拮抗剂诱导癌细胞凋亡。细胞凋亡通常可以由活化的caspase-3介导。细胞凋亡的诱导可以通过检测在用1μM的MDM2拮抗剂处理72小时后对活化的caspase-3呈阳性的细胞来确定。如对技术人员显而易见的，可以使用其他测定浓度和/或处理时长，例如MDM2拮抗剂浓度1μM处理48小时或浓度5μM处理48小时。在某些实施方式中，至少10％、至少20％或至少30％的细胞对活化caspase-3染色呈阳性，是诱导细胞凋亡的一个指标。在某些实施方式中，40％是鉴定细胞凋亡的强诱导的可靠水平，其中一个群体中>40％的细胞对活化caspase-3染色呈阳性，可被认为是凋亡的。如对技术人员显而易见的，可以对细胞和测定使用其他水平，例如10％、20％、30％、50％、60％、70％、75％或更多。活性caspase-3染色试剂盒是可商购的，例如可从Abcam(Cambridge，UK)以目录号ab65617获得“Cleaved Caspase-3 Staining Kit (Red)”。也可以使用Invitrogen Cell Event染料(C10423)。
Annexin V染料也可用于检测细胞凋亡。这在实施例中使用，并且在本领域中作为用于检测细胞凋亡的有用染料是众所周知的。
MDM2拮抗剂
转化相关蛋白53(TP53)基因编码一个53KDa的蛋白-p53。肿瘤抑制蛋白p53通过许多翻译后修饰(包括磷酸化、乙酰化和甲基化)对细胞应激(例如缺氧、DNA损伤和癌基因激活)作出反应，并在被激活的多种通路中充当信号节点。p53在其他生理过程中具有额外的作用，包括自噬、细胞粘附、细胞代谢、生育能力以及干细胞衰老和发育。p53的磷酸化是由激活包括ATM、CHK1和2，以及DNA-PK在内的激酶引起的，其使蛋白具有稳定和具有转录活性形式，从而产生一系列基因产物。对p53激活的反应包括细胞凋亡、存活、细胞周期停滞、DNA修复、血管生成、侵袭和自动调节。其特定组合同细胞的遗传背景一道，会造成观察到的细胞效应，即细胞凋亡、细胞周期停滞或衰老。对于肿瘤细胞，由于肿瘤抑制蛋白和相关的细胞周期检查点控制的丢失，再加上肿瘤胁迫，可能会倾向于凋亡通路。
众所周知，在缺氧和DNA损伤等应激状态下，蛋白质p53的细胞水平会增加。已知p53启动许多基因的转录，这些基因控制细胞周期的进展、DNA修复的启动和程序性细胞死亡。这为基因研究证实的p53的肿瘤抑制作用提供了一种机制。
p53与MDM2蛋白的结合相互作用可负向紧密地调节p53的活性，MDM2的转录本身受到p53直接调节。当p53的反式激活结构域与MDM2蛋白结合时，它就会失活。一旦失活，p53的功能就会被抑制，p53-MDM2复合物就会成为泛素化的靶标。
在正常细胞中，活性p53和与MDM2结合的非活性p53之间的平衡在自动调节负反馈回路中得到维持。也就是说p53可以激活MDM2的表达，后者反过来导致p53的抑制。
已经发现，在大约一半的所有常见成人散发性癌症中，p53由突变导致的失活很常见。此外，在大约10％的肿瘤中，MDM2的基因扩增和过度表达导致功能性p53丢失，从而导致恶性转化和肿瘤生长失控。
p53失活通过一系列机制成为常见的导致癌症发展和进展原因事件。这些包括突变导致的失活、致癌病毒靶向，以及在相当大比例的情况下，MDM2基因的扩增和/或转录率升高导致MDM2蛋白表达过量或活化增加。已在常见散发性癌症的肿瘤样本中观察到MDM2的基因扩增导致MDM2蛋白表达过量。总体而言，大约10％的肿瘤有MDM2扩增，其中肝细胞癌(44％)、肺(15％)、肉瘤和骨肉瘤(28％)以及霍奇金病(67％)的发生率最高(Danovi etal.，Mol.Cell.Biol.2004，24，5835-5843，Toledo et al.，Nat Rev Cancer 2006，6，909-923，Gembarskaet a1.，Nat Med 2012，18，1239-1247)。通常，激活的p53对MDM2的转录激活会导致MDM2蛋白水平增加，从而形成负反馈回路。基因敲除小鼠模型表明了MDM2和MDMX对p53调节的基本特性。MDM2-/-基因敲除小鼠在植入时是胚胎致死的。致死性可通过MDM2和TP53的双重敲除中得以挽救。MDM2通过与p53反式激活结构域结合并封闭，并通过其E3-泛素连接酶活性促进蛋白酶体破坏该复合体，从而直接抑制p53的活性。此外，MDM2是p53的转录靶标，因此这两种蛋白质在自动调节反馈回路中被连接，确保p53激活是短暂的。
SKP2是SCFSkp2泛素连接酶复合物底物鉴定所需的F盒蛋白。它靶向多种蛋白质进行降解，包括p21、p27和p300。p300能够乙酰化和激活p53。SKP2的上调已在许多实体癌细胞系中被鉴定，包括结肠癌(HCT116)、骨肉瘤(U2OS)和绒毛膜癌(Kitagawa等人，2008年，细胞，29，第216-231页)。SKP2在癌症中的过度表达与p300降解和p53活化的丢失有关。SKP2亚型Skp2B也被证明通过靶向乳腺癌中的抑制蛋白降解来阻止p53激活(Chander等人，2009年，EMBO报告，11(3)，第220-225页)。因此，这些研究鉴定了实体瘤中SKP2的高表达。
尽管MDMX显示出与MDM2强的氨基酸序列和结构同源性，但两种蛋白质都不能替代另一种蛋白质的丢失；MDMX缺失小鼠在子宫内死亡，而MDM2敲除在早期胚胎发生过程中致死，但是两者都可以通过p53敲除来挽救，证明了致死性依赖于p53。MDMX可与p53结合并抑制p53依赖的转录，但与MDM2不同，它不被p53转录激活，因此不会形成相同的自动调节回路。此外，MDMX既没有E3泛素连接酶活性也没有核定位信号，但人们相信它通过与MDM2形成异二聚体从而帮助MDM2稳定来促进p53降解。
MDM2-p53抑制的治疗原理是蛋白质-蛋白质相互作用的有效拮抗剂将p53从MDM2的抑制控制中解放出来并在肿瘤细胞中激活p53介导的细胞死亡。在肿瘤中，选择性设想是由p53感知先前存在的DNA损伤或致癌激活信号而产生的，这些信号先前已被正常或过表达水平的MDM2作用所阻断。在正常细胞中，p53激活预计会导致非凋亡通路的激活，如果有的话，还会导致保护性生长抑制反应。而且，由于MDM2-p53拮抗剂的非基因毒性作用机制，它们适用于治疗癌症，特别是在儿科人群中。MDM4也是p53的重要负调节因子。
大约50％的癌症细胞中，编码p53的基因TP53发生突变，导致该蛋白质的肿瘤抑制功能丢失，有时甚至出现获得新致癌功能的p53蛋白质版本。
MDM2扩增水平高的癌症包括脂肪肉瘤(88％)、软组织肉瘤(20％)、骨肉瘤(16％)、食管癌(13％)和某些儿科恶性肿瘤，包括B细胞恶性肿瘤。
MDM2拮抗剂的实施例
据报道，来自罗氏的MDM2小分子拮抗剂依达奴林(RG-7388)正在进行I-III期临床试验，用于治疗实体瘤和血液肿瘤、AML、弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症和滤泡性淋巴瘤。依达奴林(RG-7388)具有以下结构：
Figure BDA0004083338540000251
依达奴林(RG-7388)是可商购的或可以例如如PCT专利申请WO 2014/128094中所述或通过与其类似的方法制备。
HDM-201(NVP-HDM201，思瑞德林(Siremadlin))正由诺华公司开发，用于以野生型TP53为特征的晚期/转移性实体瘤、血液学肿瘤，包括ALL、AML、MS、转移性葡萄膜黑色素瘤、去分化脂肪肉瘤和分化良好的脂肪肉瘤的I/II期临床试验。拮抗剂HDM-201(NVP-HDM201)的化学结构如下：
Figure BDA0004083338540000252
HDM-201(NVP-HDM201)是可商购的或者可以例如如PCT专利申请WO 2013/111105中所述或通过与其类似的方法制备。
KRT-232(AMG-232，navtemadlin)是一种MDM2小分子拮抗剂，由NCI/Amgen/GSK在I-I/II期临床试验中开发，用于实体瘤、软组织肉瘤(如脂肪肉瘤)、复发或新诊断的胶质母细胞瘤、转移性乳腺癌、难治性MM、转移性皮肤黑色素瘤和复发/难治性AML。KRT-232(AMG-232)具有以下化学结构：
Figure BDA0004083338540000261
KRT-232(AMG-232，navtemadlin)是市售的，或者可以例如如PCT专利申请WO2011/153509中所述或通过类似的方法制备。
Aileron Therapeutics公司和罗氏正开发ALRN-6924(SP-315)，一种MDM2和MDM4的肽双重拮抗剂，处于II期临床试验，用于静脉治疗实体瘤、小细胞肺癌和包括淋巴瘤、急性髓系白血病在内的儿科肿瘤急性淋巴细胞白血病、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、脑肿瘤、脂肪肉瘤和转移性乳腺癌。ALRN-6924(SP-315)是一种合成肽，它的开发基于钉合肽技术，该技术可将肽锁定为特定的折叠形状(生物活性形状)，对蛋白酶具有抗性。ALRN-6924(SP-315)具有以下结构：
Figure BDA0004083338540000262
ALRN-6924(SP-315)是可商购的或可以例如如PCT专利申请WO2017205786中所述或通过与其类似的方法制备。
诺华正开发的CGM-097(NVP-CGM-097)是一种MDM2的小分子拮抗剂，处于I期临床研究，用于治疗晚期实体瘤和急性淋巴细胞白血病(B-ALL)。CGM-097(NVP-CGM-097)的化学结构如下：
Figure BDA0004083338540000263
CGM-097(NVP-CGM-097)是可商购的或者可以例如如PCT专利申请WO2011076786中所述或通过与其类似的方法制备。
甲苯磺酸米拉德美坦(DS-3032或DS-3032b)，授权给Rain Therapeutics公司，研究代码Rain-32，这是一种MDM2的小分子拮抗剂，由Daiichi Sankyo公司在I期临床试验中开发，用于晚期实体瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、难治性或复发性AML、ALL、多发性骨髓瘤、初发期CML或高危MDS和弥漫性大B细胞淋巴瘤。甲苯磺酸米拉德美坦(DS-3032)的化学结构如下：
Figure BDA0004083338540000271
甲苯磺酸米拉德美坦(DS-3032)是可商购的或可以例如如PCT专利申请WO 2015/033974中所述或通过与其类似的方法制备。
APG-115(AAA-115；NCT-02935907，alrizomadlin)是一种MDM2小分子拮抗剂，由亚盛医药(Ascentage Pharma)在I期临床试验中开发，用于治疗实体瘤和淋巴瘤、AML、腺样囊性癌(ACC)。APG-115(AAA-115；NCT-02935907)化学结构如下：
Figure BDA0004083338540000272
APG-115(AAA-115；NCT-02935907)其可商购获得或可以例如如PCT专利申请WO2015/161032中所述或通过与其类似的方法制备。
BI正开发的BI-907828是一种MDM2的拮抗剂，处于I期临床研究，用于治疗GBM、转移性脑肿瘤、NSCLC、软组织肉瘤和移行细胞癌(尿路上皮细胞癌)。
BI-907828是可商购的或者可以例如如PCT专利申请WO 2015/161032中所述或通过与其类似的方法制备。
密歇根大学正开发LE-004，一种MI-1061和沙利度胺偶联物的蛋白降解靶向组合体(PROTAC)，已表明它可通过诱导MDM2降解在人白血病的小鼠模型中有效抑制生长。该结构如下所示并且可以例如如PCT专利申请WO 2017/176957或WO 2017/176958中所述或通过与其类似的方法制备。LE-004的化学结构如下
Figure BDA0004083338540000281
MI-773(SAR405838)是一种高效的选择性MDM2抑制剂，与MDM2结合的特异性高于其他蛋白质，并在癌细胞系中有效抑制细胞生长。SAR405838有效诱导细胞凋亡并有效抑制细胞生长并诱导剂量依赖性细胞凋亡，目前正在进行临床试验。其结构是：
Figure BDA0004083338540000282
SAR405838可以例如如WO-A-2011/060049中所述制备。
DS-5272是MDM2的拮抗剂，由Daiichi Sankyo开发用于口服给药。其结构是：
Figure BDA0004083338540000283
DS-5272可以例如如PCT专利申请WO 2015/033974中所述或通过与其类似的方法制备。
SJ-0211是MDM2的拮抗剂，正由田纳西大学、肯塔基大学和圣裘德儿童研究医院开发，用于视网膜治疗的治疗。该结构是Nutlin-3类似物。
BI-0252是MDM2拮抗剂，由BI开发用于口服给药。BI-0252抑制MDM2和p53相互作用。其结构是：
Figure BDA0004083338540000291
AM-7209是MDM2的拮抗剂，由Amgen开发，作为AMG-232的备份。其结构是：
Figure BDA0004083338540000292
AM-7209可以例如如PCT专利申请WO 2014/200937中所述或通过与其类似的方法制备。
SP-141(JapA)是MDM2的直接拮抗剂，由德克萨斯理工大学开发。其结构是：
Figure BDA0004083338540000293
SCH-1450206是MDM2的拮抗剂，由先灵葆雅和默克开发用于口服给药。一个示例性结构是：
Figure BDA0004083338540000301
阿糖胞苷，也称为MK-8242和SCH-900242，是一种具有修饰糖部分(***糖而不是核糖)的胞苷的抗代谢类似物。一种具有潜在抗肿瘤活性的人类双微粒体2同源物(HDM2)的口服生物可利用抑制剂，经口服施用后，HDM2抑制剂MK-8242可抑制HDM2蛋白与肿瘤抑制蛋白p53的转录激活结构域的结合。通过阻止这种HDM2-p53相互作用，p53降解被抑制，这可能导致p53信号的恢复。这诱导了p53介导的肿瘤细胞凋亡。
Nutlin-3a是MDM2(鼠双分钟2的人类同源物)的拮抗剂或抑制剂，可破坏其与p53的相互作用，导致p53的稳定和活化。其结构是：
Figure BDA0004083338540000302
NXN-6(NXN-7；NXN-552；NXN-561；NXN-11)是MDM2的拮抗剂，由Nexus、Priaxon和BI开发用于口服给药。一个示例性结构是：
Figure BDA0004083338540000303
ADO-21是MDM2的拮抗剂，由亚当集团开发。
CTX-50-CTX-1是一种小分子MDM2拮抗剂，由MiRxPharmaceuticals，CRC开发。
ISA-27是一种小分子MDM2拮抗剂，由那不勒斯大学和萨勒诺大学开发。其结构是：
Figure BDA0004083338540000311
RG-7112(RO5045337)是一种有效的、选择性的、首个临床的、口服活性和可通过血脑屏障的MDM2-p53抑制剂。其结构是：
Figure BDA0004083338540000312
RO-8994是一种小分子MDM2拮抗剂，由罗氏开发。RO-8994已显示可抑制诱导p53线粒体效应的肿瘤生长。其结构是：
Figure BDA0004083338540000313
RO-8994是可商购获得或可例如如PCT专利申请WO 2011/067185中所述或通过与其类似的方法制备。
RO-6839921(RG-7775)是一种小分子MDM2拮抗剂，由罗氏开发用于IV施用。其结构是：
Figure BDA0004083338540000321
RO-6839921(RG-7775)可以例如如PCT专利申请WO 2014/206866中所述或通过与其类似的方法制备。
JNJ 26854165(Serdemetan)具有以下结构，它是一种口服HDM2抑制剂(或拮抗剂)，在体外和离体对多发性骨髓瘤(MM)细胞显示出有效的活性；是可恢复p53功能并可能影响其他HDM2依赖通路的潜在试剂。
Figure BDA0004083338540000322
ATSP-7041(SP-154)是一种MDM2和MDM4的钉合合成肽双重拮抗剂，由AileronTherapeutics和Roche开发，并处于临床前开发阶段。ATSP-7041(SP-154)的结构如下：
Figure BDA0004083338540000323
SAH-p53-8是MDM4、Hdm2和Caspase3的钉合合成肽拮抗剂，由哈佛学院和Dana-Faber开发，现处于临床前开发阶段。SAH-p53-8的结构如下：
Figure BDA0004083338540000324
PM-2(sMTide-02)是MDM4、Hdm2和Caspase3的钉合合成肽拮抗剂，由哈佛大学和Dana-Faber开发，并处于临床前开发阶段。PM-2(sMTide-02)具有以下结构：
Figure BDA0004083338540000331
K-178是MDM4小分子拮抗剂，由关西医科大学开发，处于临床前开发阶段。K-178的化学结构如下：
Figure BDA0004083338540000332
MMRi-64是一种MDM2和MDM4的小分子拮抗剂，由Roswell Park Cancer Institute开发，现处于发现阶段。MMRi-64的化学结构如下：
Figure BDA0004083338540000333
雅盖隆大学和第二军医大学也在开发MDM2和MDM4的小分子拮抗剂。例如，化学结构如下：
Figure BDA0004083338540000334
埃默里和乔治亚州立大学正在开发MDM2和MDM4的小分子拮抗剂，正处于临床前开发阶段，用于治疗急性淋巴细胞白血病。
Adamed正在开发MDM2和MDM4的小分子拮抗剂，正处于发现阶段。
在本发明的一个实施方式中，MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：依达奴林、HDM-201、KRT-232(AMG-232)、ALRN-6924、CGM-097、甲苯磺酸米拉德美坦(DS-3032b)、APG-115，BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、APG-155、RG-7112、RG7388、SAR405939、阿糖胞苷(也称为MK-8242和SCH-900242)、BI-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64和
Figure BDA0004083338540000341
或互变异构体或其溶剂化物或药学上可接受的盐。
在本发明的一个实施方式中，MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：依达奴林、HDM-201、KRT-232(AMG-232)、ALRN-6924、CGM-097、甲苯磺酸米拉德美坦(DS-3032b)、APG-115、BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、BI-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64和
Figure BDA0004083338540000342
或互变异构体或其溶剂化物或药学上可接受的盐。
在本发明的一个实施方式中，MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：依达奴林(RG-7388)、HDM-201、KRT-232(AMG-232)，ALRN-6924、MI-773(SAR405838)、米拉德美坦(DS-3032b)、APG-115、BI-907828，或互变异构体或其溶剂化物或药学上可接受的盐。
在本发明的一个实施方式中，MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：依达奴林(RG-7388)、HDM-201、KRT-232(AMG-232)、ALRN-6924、MI-773(SAR405838)、米拉德美坦(DS-3032b)、APG-115、BI-907828，或分子式为Io的化合物，或其互变异构体或其溶剂化物或药学上可接受的盐。
分子式为Io的化合物
特定的MDM2拮抗剂是我们在2016年9月29日提交的较早的国际专利申请PCT/GB2016/053042和PCT/GB2016/053041中披露的异二氢吲哚化合物，要求2015年9月29日提交的英国专利申请号1517216.6和1517217.4的优先权，其内容均并入在此全文引用。特别地，化合物(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(四氢吡喃-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸(“化合物1”)在我们早期的国际专利申请PCT/GB2016/053042。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是一种分子式为Io的化合物：
Figure BDA0004083338540000351
/>
或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中：
其中cyc为苯基或杂环基团Het，其为吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或哒嗪基，或其N-氧化物；
R1独立地选自羟基、卤素、硝基、腈、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、羟基C1-4烷基、C2-6烯基、C1-4烷氧基、卤代C1-4烷氧基、C2-4炔基、-O0，1-(CRxRy)v-CO2H、-(CRxRy)v-CO2C1-4烷基、-(CRxRy)v-CON(C1-4烷基)3、-P(＝O)(Rx)2、-S(O)d-Rx、-S(O)d-具有3至6个环成员的杂环基团和-S(O)d-N(R8)2，其中当cyc为Het时，R1与碳原子连接；
R2选自氢、C1-4烷基、C2-6烯基、羟基C1-4烷基、-(CRxRy)u-CO2H、-(CRXRy)u-CO2C1-4烷基和-(CRxRy)u-CONRxRy；
s选自0和1；
R3是氢或-(A)t-(CRxRy)q-X基；
t选自0和1；
q选自0、1和2。
其中，当R3为-(A)t-(CRxRy)q-X时，(i)是s、t和q中的至少一个不为0且(ii)当t为0时，s为1且q不为0；
A为C3-6环烷基或具有3至6个环成员的杂环基，其中所述杂环基包括一个或多个(例如1、2或3)个选自N、O、S及其氧化形式的杂原子；
X选自氢、卤素、-CN、-OR9、-(CH2)v-CO2H、-(CH2)v-CO2C1-4烷基、-S(O)d-Rx、-C(＝O)-C1-4烷基、-S(O)d-N(H)e(C1-4烷基)2-e、-NRxRy、-NHSO2Rx、-NRxCORy和-C(＝O)NRxRy；
R4和R5独立地选自卤素、腈、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基和卤代C1-4烷氧基；
R6和R7独立地选自氢、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、羟基C1-6烷基、-COOC1-6烷基、-(CH2)j-OC1-6烷基、-(CH2)j-O-(羟基C1-6烷基)、-C1-6烷基-NRxRy、-(CRxRy)p-CONRxRy、-(CRxRy)p-NRxCORy、-(CRxRy)p-O-CH2-CONRxRy，具有3到7个环杂成员的杂环基，具有3到7个环成员的-CH2-杂环基团、具有3到7个环成员的-CH2-O-杂环基、具有3到7个环成员的-CH2-NH-杂环基、具有3至7个环成员的-CH2-N(C1-6烷基)-杂环基团、具有3至7个环成员的-C(＝O)NH-杂环基团、C3-8环烷基、-CH2-C3-8环烷基、-CH2-O-C3-8环烷基和C3-8环烯基，其中，所述环烷基、环烯基或杂环基团可以任选地被一个或多个Rz基团取代，并且其中在每种情况下所述杂环基团包括一个或多个(例如，1、2、或3)选自N、O、S及其氧化形式的杂原子；
或者R6和R7基团与它们所连接的碳原子一起可以连接形成具有3至6个环成员的C3-6环烷基或杂环基，其中所述杂环基包括一个或多个(例如1、2或3)选自N、O、S及其氧化形式的杂原子，并且其中所述C3-6环烷基和杂环基可以任选地被一个或多个Rz基团取代；
R8和R9独立地选自氢、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、-(CH2)k-O-C1-6烷基、-(CH2)k-O-(羟基C1-6烷基)、羟基C1-6烷氧基、-(CH2)k-CO2C1-6烷基、-(CH2)k-CO2H、-C1-6烷基-N(H)e(C1-4烷基)2-e、-(CH2)j-C3-8环烷基和-(CH2)j-C3-8环烯基；
Rx和Ry独立地选自氢、卤素、硝基、腈、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基、-(CH2)k-O-C1-6烷基、羟基C1-6烷氧基、-COOC1-6烷基、-N(H)e(C1-4烷基)2-e、-C1-6烷基-N(H)e(C1-4烷基)2-e、-(CH2)k-C(＝O)N(H)e(C1-4烷基)2-e、C3-8环烷基和C3-8环烯基；
或Rx和Ry基团，连同它们所连接的碳或氮原子，可以连接形成具有3至6个环成员的C3-6环烷基或饱和杂环基，其可以任选地稠合到具有3至5个环成员的芳族杂环基；
或者当在碳原子上，Rx和Ry基团可以连接在一起形成＝CH2基团；
Rz独立地选自卤素、硝基、腈、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、＝O、羟基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基、-(CH2)k-O-C1-6烷基、羟基C1-6烷氧基、-C(＝O)C1-6烷基、-C(＝O)C1-6烷基-OH、-C(＝O)C1-6烷基-N(H)e(C1-4烷基)2-e、-C(＝O)N(H)e(C1-4烷基)2-e、-(CH2)r-CO2C1-6烷基，-(CH2)r-CO2H，-N(H)e(C1-4烷基)2-e、-C1-6烷基-N(H)e(C1-4烷基)2-e、具有3到6个环成员的杂环基，被-C(＝O)C1-4烷基取代的具有3到6个环成员的杂环基，被-C(＝O)OC1-4烷基取代具有3到6个环成员的杂环基，被-C(＝O)N(H)e(C1-4烷基)2-e取代的具有3-6个环成员的杂环基，具有3至6个环成员的-C(＝O)杂环基、C3-8环烷基和C3-8环烯基，其中如果R7是吡啶，则Rz不是-NH2；
a、j、d、e、n、r和p独立地选自0、1和2；
k和m独立地选自1和2；
u选自0、1、2和3；和
v选自0和1
分子式(Io)的化合物：具有手性中心，下面用“*”标记
Figure BDA0004083338540000371
分子式(Io)化合物包括一个在所示位置(本文称为(3))的立体中心，并且是手性非外消旋的。分子式(Io)的化合物具有由散列和实心楔形键显示的立体化学，并且这种立体异构体占优势。
通常，至少55％(例如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)的分子式为(Io)的化合物以所示立体异构体的形式存在。在一个一般实施方式中，分子式(Io)化合物的总量的97％(例如99％)或更多(例如，基本上全部)可以呈现为单个光学异构体(例如，对映异构体或非对映异构体)形式。
化合物还可以包括一个或多个其他手性中心(例如在-CR6R7OH基团中和/或在R3基团中和/或在-CHR2基团中)。
通常，分子式为(Io)的化合物具有至少10％的对映体过量(例如至少20％、40％、60％、80％、85％、90％或95％)。在一个一般实施方式中，分子式为(Io)的化合物具有97％(例如99％)或更多的对映体过量。
就本节而言，异吲哚啉-1-酮环编号如下：
Figure BDA0004083338540000372
根据化学命名软件包使用的协议命名化合物。
分子式(Io)化合物，其中cyc是苯基
其中cyc为苯基的分子式(Io)化合物公开于我们较早的国际专利申请PCT/GB2016/053042，该申请于2017年4月06日以WO 2017/055860公布。WO2017/055860中公开的化合物、子式和取代基(例如分子式(I)、I(e)、I(f)、I(g)、I(g′)、I(h)、I(i)、I(j)、I(k)、I(L)、I(m)、I(m′)、I(n)、I(o)、I(o′)、I(o″)、I(p)、I(p′)、I(q)、I(q′)、I(q″)、I(q″′)、I(q″″)、I(r)、I(s)、I(t)、I(u)、I(v)、I(v′)、I(w)、I(x)、I(x′)、I(y)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIIa)、(IIIb)、(IVa)、(IVb)、(V)、(VI)、(Via)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIId′)、(VIIe)、(VIIe′)、(a)、(b)、(ba)、(bb)、(bc)或(c))被交叉引用。因此，凭借该交叉引用，WO 2017/055860的化合物、子式和取代基被本申请直接且明确地公开。
分子式(Io)的具体子式、实施方式和化合物(其中cyc是苯基)包括以下：
在一个实施方式中，R1是氯或腈，特别是氯。
当R2不是氢时，分子式(Io)化合物可以作为至少两种非对映异构体存在：
Figure BDA0004083338540000391
非对映异构体1A
Figure BDA0004083338540000392
非对映异构体1B
为免生疑问，一般分子式(Io)并且所有子式都涵盖两种单独的非对映异构体和非对映异构体的混合物，它们作为-CHR2-基团中差向异构体被关联。在一个实施方式中，分子式(Io)化合物为非对映异构体1A或互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：在一个实施方式中，分子式(Io)化合物为非对映异构体1B或互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方式中，R2选自氢和-(CRxRy)u-CO2H(例如，-COOH、-CH2COOH、-CH2CH2-CO2H、-(CH(CH3))-CO2H和-(C(CH3)2)-CO2H)，
在一个实施方式中，a为1且取代基R4位于异吲哚啉-1-酮的4-位，且分子式(Io)化合物是分子式(Ir)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000401
R4独立地选自卤素、腈、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基和卤代C1-4烷氧基。
在一个实施方式中，R4是卤素。在一个实施方式中，R4是氟或氯。在另一个实施方式中，R4是氟。
在一个实施方式中，a为1，取代基R4在异吲哚啉-1-酮的4-位，R4为F，且分子式(Io)化合物为分子式(Is)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000402
当R6和R7不同时，分子式(Io)化合物可以作为至少两种非对映异构体存在：
Figure BDA0004083338540000411
非对映异构体2A
Figure BDA0004083338540000412
/>
非对映异构体2B
为免生疑问，一般分子式(Io)并且所有子式都涵盖两种单独的非对映异构体和非对映异构体的混合物，它们作为-CR6R7OH基团上的差向异构体被相关。
在一个实施方式中，R6是C1-6烷基(例如甲基或乙基，例如甲基)并且R7是恶烷基，并且分子式(Io)化合物是分子式(Iw)的化合物：
Figure BDA0004083338540000421
在分子式(Iw)的一个实施方式中，Rz是氢或氟。
子式
在一个实施方式中，R6是甲基或乙基，分子式(Io)化合物是分子式(IIIb)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000422
其中R1、R2、R3、R4、R5、R7、a、m和s如本文所定义。
在一个实施方式中，s为0，分子式(Io)化合物是分子式(IVb)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000423
其中R1、R2、R3、R4、R5、R7、a、m和s如本文所定义。
在一个实施方式中，m为1且取代基R4在苯基的4-位，并且分子式(Io)化合物是分子式(VI)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000431
在一个实施方式中，R5是氯，分子式(VI)化合物是分子式(VIa)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000432
在一个实施方式中，R3是甲基，分子式(VI)化合物是分子式(VIIf)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000433
在分子式(VIIf)的一个实施方式中，R6是乙基。
在分子式(VIIf)化合物的一个实施方式中，R7选自甲基、恶烷基、吡唑基、咪唑基、哌啶基和环己基，其中所述环烷基和杂环基任选地被一个或多个Rz基团(例如甲基、氟或羟基)取代。
在分子式(VIIf)化合物的一个实施方式中，R7选自恶烷基和甲基。
在分子式(VIIf)化合物的一个实施方式中，R7选自任选被一个或多个Rz基团(例如甲基、氟或羟基)取代的哌啶基。
在上述子式的另一个实施方式中，R2选自-(CH(CH3))-CO2H和-(C(CH3)2-CO2H)。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是一种分子式(Io)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中：
R1是卤素(例如，C1)、腈、O0，1(CRxRy)vCOOH(例如，-COOH、-CH2COOH、-OCH2COOH或-C(CH3)2COOH；
n为1或2；
R2选自氢和-(CRxRy)u-CO2H(例如，-COOH、-CH2COOH、-CH2CH2-CO2H、-(CH(CH3))-CO2H和-(C(CH3)2)-CO2H)。
R3是氢，s是1；
R4是卤素(例如，F)；
R5是卤素(例如，Cl)；
m为1；
R6是氢或C1-6烷基(例如-CH3或-CH2CH3)；
R7是C1-4烷基(例如，甲基)、羟基C1-4烷基(例如，羟甲基)、甲氧基C1-4烷基(例如，甲氧基甲基)、具有5或6个环成员的杂环基团(例如，哌啶基、恶烷基、咪唑基或吡唑基))；
其中所述具有5或6个环成员的杂环基团可以任选地被一个或两个独立地选自C1-4烷基(例如，甲基)的Rz基团取代。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式(Io)的化合物，其为实施例1-137之一或选自实施例1-137或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，其在本文定义的第一组实施例中描述，即化合物其中cyc是苯基，也如WO 2017/055860中所述)
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式(Io)的化合物，其为实施例1-97之一(其中cyc为苯基的实施例)或选自实施例1-97(其中cyc为苯基的实施例)或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，其在本文定义的第一组实施例中描述，即化合物其中cyc是苯基，也如WO 2017/055860中所述)。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是一种分子式(Io)的化合物，其选自以下化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物：
4-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-1-{[1-(羟甲基)环丙基]甲氧基}-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}苄腈
例如，
Figure BDA0004083338540000451
和
(3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)乙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]丙酸
例如，
Figure BDA0004083338540000452
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是一种分子式(Io)的化合物，其选自以下化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物：
4-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-1-{[1-(羟甲基)环丙基]甲氧基}-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}苄腈；和
(3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)乙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]丙酸。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是一种分子式(Io)的化合物，其是非对映异构体2B，并且选自以下化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物：
4-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-1-{[1-(羟甲基)环丙基]甲氧基}-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}苄腈；和
(3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)乙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]丙酸。
在一个实施方式中，分子式(Io)化合物是2-(5-氯-2-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}苯基)-2-甲基丙酸，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物
例如，
Figure BDA0004083338540000453
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式(Io)的化合物，其为(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸，(“化合物1”)或互变异构体，N-氧化物，其药学上可接受的盐或溶剂化物。
例如，
Figure BDA0004083338540000461
为免生疑问，应当理解，一个取代基的每个一般和具体实施方式和实施例可以与一个或多个，具体地所有如本文所定义的其它取代基的每个一般和具体实施方式和实施例组合，并且本申请涵盖所有此类实施方式。
分子式(Io)化合物，其中cyc是杂环基团
分子式(Io)的化合物，其中cyc是一个公开于我们较早的国际专利申请PCT/GB2016/053041的杂环基团，该申请于2017年4月06日以WO 2017/055859公布。WO 2017/055859中公开的化合物、子式和取代基(例如，分子式(I)、I(a)、I(a′)、I(b)、I(c)、I(d)、I(e)、I(f)、I(g)、I(g′)、I(h)、I(i)、I(j)、I(k)、I(L)、I(m)、I(m′)、I(n)、I(o)、I(o′)、I(o″)、I(p)、I(p′)、I(q)、I(q′)、I(q″)、I(q″′)、I(q″″)、I(r)、I(s)、I(t)、I(u)、I(v)、I(v′)、I(w)、I(x)、I(x′)、I(y)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIIa)、(IIIIb)、(Iva)、(IVb)、(V)、(VI)、(VIa)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIId′)、(VIIe)、(VIIe′)、(a)、(b)、(ba)、(bb)、(bc)或(c))及其如本文所定义的实施例被交叉引用。因此，由于该交叉引用，本申请直接且明确地公开了WO 2017/055859的化合物，取代子式和取代基。
分子式(Io)化合物的特定子式，实施方式和化合物(其中cyc是杂环基团)包括以下：
在另一个实施方式中，R2为氢，分子式(Io)化合物是分子式(Ie)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000471
当R2不是氢时，分子式(Io)化合物可以作为至少两种非对映异构体存在：
Figure BDA0004083338540000481
非对映异构体1A
Figure BDA0004083338540000482
非对映异构体1B
为免生疑问，一般分子式(Io)并且所有子式都涵盖两种单独的非对映异构体和非对映异构体的混合物，它们作为-CHR2-基团中差向异构体被关联。在一个实施方式中，分子式(Io)化合物为非对映异构体1A或互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：在一个实施方式中，分子式(Io)化合物为非对映异构体1B或互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方式中，A为C3-6环烷基(即g为1、2或3)且t为1且s为0或1，且分子式(Io)化合物是分子式(If)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000491
在一个实施方式中，A为C3-6环烷基(即g为1、2或3)且t为1且s为1，且分子式(Io)化合物是分子式(Ig)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000492
在一个实施方式中，A是C3-6环烷基(即g是1、2或3)并且t是1并且s是1，并且环烷基是双取代的(即基团-(CRxRy)q-X和-CH2-O-异吲哚啉酮基团都连接到环烷基的同一原子上)，并且分子式(Io)是分子式(Ih)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000493
在一个实施方式中，A是环丙基(即，g是1)，t是1并且s是1。因此，环烷基是环丙基，并且分子式(Io)化合物是分子式(Ii)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000501
在一个实施方式中，A是C3-6环烷基基团(即，g是1、2或3)，t是1，s是1并且X是-CN，并且分子式(Io)化合物是分子式(Ik′)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000502
在另一个实施方式中，A是C3-6环烷基(即g是1、2或3)，t是1，s是1并且Rx和Ry是氢(包括1H和2H)并且分子式(Io)化合物是分子式(IL)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000503
在一个实施方式中，A是C3-环烷基(即g是1)，t是1，s是1并且X是-CN，并且分子式分子式(Io)化合物是分子式(In′)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000511
其中q是0或1。在化合物(In)的一个实施方式中，q为0。
在一个实施方式中，R3是-(CRxRy)q-X并且s是1，t是0并且q是1或2，并且式的分子式(Io)化合物是分子式(Ip)的化合物：
Figure BDA0004083338540000512
在一个实施方式中，A为具有3至6个环成员的C3-6环烷基或饱和杂环基，其中t为1，s为1，Y独立地选自-CH2-、O或SO2，i是0或1，g是1、2、3或4，并且i+g是1、2、3或4，并且分子式(Io)化合物是分子式(Iq)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000513
在一个实施方式中，i是1并且Y是O或SO2，特别是O。在一个实施方式中，分子式(Iq)化合物是分子式(Iq″″)化合物或互变异构体或溶剂化物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000521
在一个实施方式中，s为0，t为1，A为四氢呋喃基，q为0且X为氢。在一个实施方式中，R3是四氢呋喃基并且s是0。
在一个实施方式中，a为1且取代基R4位于异吲哚啉-1-酮的4-位，且分子式(Io)化合物是分子式(Ir)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000522
R4独立地选自卤素、腈、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基和卤代C1-4烷氧基。
在一个实施方式中，R4是卤素。在一个实施方式中，R4是氟或氯。在另一个实施方式中，R4是氟。
在一个实施方式中，a为1，取代基R4在异吲哚啉-1-酮的4-位，R4为F，且分子式(Io)化合物为分子式(Is)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000523
当R6和R7不同时，分子式(Io)化合物可以作为至少两种非对映异构体存在：
Figure BDA0004083338540000531
非对映异构体2A
Figure BDA0004083338540000532
非对映异构体2B
为免生疑问，一般分子式(Io)并且所有子式都涵盖两种单独的非对映异构体和非对映异构体的混合物，它们作为-CR6R7OH基团上的差向异构体被相关。
在一个实施方式中，R7是4-氟-1-甲基哌啶-4-基，分子式(Io)化合物是分子式(Ix”)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000541
子式
在一个实施方式中，分子式(Io)化合物是分子式(II)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000542
其中L是CR1、CH或N，并且R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、a、m和s如本文所定义。在一个实施方式中，L是CH。在一个实施方式中，L是N。在一个实施方式中，L是CR1例如C-OH或C-羟基C1-4烷基(例如C-OH或C-CH2OH)。
在另一个实施方式中，R1是氯或腈并且分子式(II)化合物是式(IIa)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000551
其中R1、R2、R3、R4、R5、R7、m和s如本文所定义。
在一个实施方式中，R6是乙基，分子式(II)化合物是分子式(IIIb)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000552
其中R1、R2、R3、R4、R5、R7、a、m和s如本文所定义。
在一个实施方式中，s为0，分子式(II)化合物是分子式(IVb)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000553
其中R1、R2、R3、R4、R5、R7、m和s如本文所定义。
在一个实施方式中，R4是氟，分子式(Io)化合物是分子式(V)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000561
其中R1、R2、R3、R5、R7、m和s如本文所定义。
在一个实施方式中，m为1且取代基R4在苯基的4-位，分子式(II)化合物为分子式(VI)化合物或其互变异构体或溶剂合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000562
在一个实施方式中，R5是氯，分子式(VI)化合物是分子式(VIa)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000563
在一个实施方式中，A为C3-6环烷基(g为1、2或3)且t为1，且分子式(VI)化合物为分子式(VII)化合物或互变异构体或溶剂化物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000571
在一个实施方式中，A是C3-6环烷基(g是1、2或3)并且t是1，并且环烷基是双取代的(即基团-(CRxRy)-X和CH2基团(其中s为1)或氧原子(其中s为0)都连接到环烷基的同一原子上，分子式(VII)化合物为分子式(VIIa)化合物或互变异构体或其溶剂合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000572
在一个实施方式中，g是1，因此环烷基为环丙基，分子式(VIIa)化合物是分子式(VIIb)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000573
在一个实施方式中，s为1，分子式(VIIb)化合物是分子式(VIIc)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000581
在一个实施方式中，X是-CN并且分子式(VlId)的化合物是分子式(VIle”)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000582
其中q为0或1，特别是q为0。
在一个实施方式中，R3是甲基，分子式(vI)化合物是分子式(VIIf)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000583
在分子式(a)化合物的一个实施方式中，R7是哌啶基或哌嗪基，任选被C1-6烷基(例如，甲基)和/或卤素(例如，氟代)取代。
在分子式(a′)化合物的一个实施方式中，R7是哌啶基，任选被C1-6烷基(例如，甲基)和/或卤素(例如，氟代)取代。
在一个实施方式中，A是具有3至6个环成员的杂环基，其中该杂环基包括一个或多个(例如1、2或3)个选自N、O、S及其氧化形式的杂原子(t为1；g是1、2、3或4；z表示N、O、S及其氧化形式；i是1、2或3；并且i+g＝2、3、4或5)，并且分子式(VI)是分子式(b)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000591
在一个实施方式中，s为0，g为2，q为0且X为氢，且分子式(b)的化合物为分子式(bb)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000592
在一个实施方式中，分子式(Io)化合物是分子式(c)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000601
其中R1为氯或腈，s为1且X为羟基或s为0且X为-C(＝O)NH2。
在一个实施方式中，分子式(Io)化合物是分子式(c’)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0004083338540000602
其中R1为氯或腈，s为1且X为羟基或s为0且X为-CN。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是一种分子式(Io)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中：
Het是吡啶基或嘧啶基
R1与碳原子相连并且独立地选自羟基、卤素、硝基、腈和C1-4烷基；
R2选自氢、C1-4烷基、C2-6烯基、羟基C1-4烷基和-CH2CO2H；
R3是氢或-(A)t-(CRxRy)q-X基；
s和t独立地选自0和1；
q选自0、1和2。
其中，当R3为-(A)t-(CRxRy)q-X时，(i)s、t和q中的至少一个不为0且(ii)当t为0时，s为1且q不为0；
A为具有3至6个环成员的杂环基，其中该杂环基包括一个或多个(例如1、2或3)个选自N、O、S及其氧化形式的杂原子；
X选自氢、卤素、-CN和-OR9；
R4和R5独立地选自卤素、腈和C1-4烷基；
R6选自氢和C1-6烷基；
R7选自具有3至7个环成员的杂环基团、具有3至7个环成员的-CH2-杂环基团、C3-8环烷基和-CH2-C3-8环烷基，其中所述环烷基或杂环基团可以任选地被一个或多个Rz基团取代，并且其中在每种情况下，杂环基团包括一个或多个(例如，1、2或3)个选自N、O、S及其氧化形式的杂原子；
R9选自氢和C1-6烷基；
Rx和Ry独立地选自氢和C1-6烷基；
Rz独立地选自卤素、硝基、腈、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C2-6烯基、羟基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)C1-6烷基和-N(H)e(C1-4烷基)2-e；
n和e独立地选自0、1和2；
m选自1和2；和
a选自0和1。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式(Io)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中：
Het是吡啶基或嘧啶基
R1与碳原子连接并且独立地选自卤素、羟基和腈；
R2选自氢、C1-4烷基和-CH2CO2H；
R3是氢或-(A)t-(CRxRy)q-X基；
A为具有3至6个环成员的杂环基，其中该杂环基包括一个或多个(例如1、2或3)个选自N、O、S及其氧化形式的杂原子；
s和t独立地选自0和1；
q选自0、1和2。
其中，当R3为-(A)t-(CRxRy)q-X时，(i)s、t和q中的至少一个不为0且(ii)当t为0时，s为1且q不为0；
X选自氢、卤素或-OR9；
R4和R5独立地选自卤素；
R6选自氢和C1-6烷基；
R7选自具有3至7个环成员的杂环基、具有3至7个环成员的-CH2-杂环基、C3-8环烷基和-CH2-C3-8环烷基，其中所述环烷基、环烯基或杂环基可以任选地被一个或多个Rz基团取代，并且其中在每种情况下，杂环基包括一个或多个(例如1、2或3)个选自N、O、S及其氧化形式的杂原子；
R9选自氢和C1-6烷基；
Rx和Ry独立地选自氢和C1-6烷基；
Rz独立地选自卤素、硝基、腈和C1-6烷基；
n为1，m为1；和
a选自0和1。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是一种分子式(Io)化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中：
Het是吡啶基或嘧啶基
R1与碳原子连接并且独立地选自卤素、羟基和腈；
R2选自氢、C1-4烷基和-CH2CO2H；
R3是-(A)t-(CRxRy)q-X；
A为具有3至6个环成员的杂环基，其中该杂环基包括一个或多个(例如1、2或3)个选自N、O、S及其氧化形式的杂原子；
s和t独立地选自0和1；
q选自0、1和2。
其中(i)s、t和q中的至少一个不为0，并且(ii)当t为0时，s为1且q不为0；
X选自氢、卤素和-OR9；
R4和R5独立地选自卤素；
R6选自氢和C1-6烷基；
R7是具有3至7个环成员的杂环基团，任选地被一个或多个Rz基团取代；
R9选自氢和C1-6烷基；
Rx和Ry独立地选自氢和C1-6烷基；
Rz独立地选自卤素和C1-6烷基；
n为1且m为1且
a为1。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式(Io)的化合物，其为实施例1-580之一(其中cyc为杂环基团的实施例)或选自实施例1-580或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物(在本文定义的第二组实施例中描述的分子式Io化合物即其中也如WO2017/055859所述cyc是Het的化合物)。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式(Io)的化合物，其为实施例1-460之一或选自实施例1-460或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物(在本文定义的第二组实施例中描述的分子式Io化合物，即其中也如WO2017/055859所述cyc是Het的化合物)。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式(Io)的化合物，其为实施例1-459之一或选自实施例1-459或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物(在本文定义的第二组实施例中描述的分子式Io化合物即其中也如WO 2017/055859所述cyc是Het的化合物)。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是一个分子式(Io)的化合物，其选自以下化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物：
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-{1-羟基-1-[反式-4-羟基环己基]乙基}-3-{[1-(羟甲基)环丙基]甲氧基}-2，3-二氢-1H-异吲哚啉-1-酮；
例如，
Figure BDA0004083338540000631
2-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-1-[(3S)-四氢呋喃-3-氧]-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}嘧啶-5-腈；
例如，
Figure BDA0004083338540000632
(3R)-2-[(5-氯-3-羟基吡啶-2-yl)甲基]-3-(4-氯苯)-4-氟-6-[1-羟基-1-(1-甲基-1H)-咪唑-4-基)丙基]-3-(2-羟基乙氧基)-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-酮；
例如，
Figure BDA0004083338540000641
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-(4-氟氧代-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-1-[(3S)-四氢呋喃-3-氧]-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-腈；
例如，
Figure BDA0004083338540000642
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-[(3-氟氧杂环丁烷-3-基)甲氧基]-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H)-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-腈；
例如，
Figure BDA0004083338540000643
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-({1-[羟基(2H2)甲基]环丙基}(2H2)甲氧基)-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-腈；
例如
Figure BDA0004083338540000644
和
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-羟基-1-(1-甲基哌啶-4-基)丙基]-3-[(3S)-四氢呋喃-3-氧]-2，3-羟基-1H-异吲哚-1-酮
例如，
Figure BDA0004083338540000645
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是一种分子式(Io)的化合物，其是非对映异构体2B，并且选自以下化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物：
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-{1-羟基-1-[反式-4-羟基环己基]乙基}-3-{[1-(羟甲基)环丙基]甲氧基}-2，3-二氢-1H-异吲哚啉-1-酮；
2-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-1-[(3S)-四氢呋喃-3-氧]-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}嘧啶-5-腈；
(3R)-2-[(5-氯-3-羟基吡啶-2-yl)甲基]-3-(4-氯苯)-4-氟-6-[1-羟基-1-(1-甲基-1H)-咪唑-4-基)丙基]-3-(2-羟基乙氧基)-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-酮；
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-(4-氟氧代-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-1-[(3S)-四氢呋喃-3-氧]-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-腈；
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-[(3-氟氧杂环丁烷-3-基)甲氧基]-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H)-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-腈；
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-({1-[羟基(2H2)甲基]环丙基}(2H2)甲氧基)-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-腈；和
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-羟基-1-(1-甲基哌啶-4-基)丙基]-3-[(3S)-四氢呋喃-3-氧]-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-酮。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是一种分子式(Io)的化合物，其是非对映异构体2B，并且选自以下化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物：
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-{1-羟基-1-[反式-4-羟基环己基]乙基}-3-{[1-(羟甲基)环丙基]甲氧基}-2，3-二氢-1H-异吲哚啉-1-酮；
2-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-1-[(3S)-四氢呋喃-3-氧]-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}嘧啶-5-腈；
(3R)-2-[(5-氯-3-羟基吡啶-2-yl)甲基]-3-(4-氯苯)-4-氟-6-[1-羟基-1-(1-甲基-1H)-咪唑-4-基)丙基]-3-(2-羟基乙氧基)-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-酮；
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-(4-氟氧代-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-1-[(3S)-四氢呋喃-3-氧]-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-腈；
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-[(3-氟氧杂环丁烷-3-基)甲氧基]-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H)-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-腈；
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-({1-[羟基(2H2)甲基]环丙基}(2H2)甲氧基)-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-腈；和
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-羟基-1-(1-甲基哌啶-4-基)丙基]-3-[(3S)-四氢呋喃-3-氧]-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-酮。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是一种分子式(Io)的化合物，其选自以下化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物：
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[2-羟基-1-(4-甲基哌嗪-1-基)丁烷-2-基]-3-[(3S)-四氢呋喃-3-氧]-2，3-二氢-1H-异吲哚1-1-酮；
例如，
Figure BDA0004083338540000661
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-甲氧基-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-酮；
例如，
Figure BDA0004083338540000662
1-({[(1R)-1-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-7-氟-5-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-基]氧基}甲基)环丙烷-1-甲腈；
例如，
Figure BDA0004083338540000663
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-[顺-3-羟基环丁氧基]-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-酮；
例如
Figure BDA0004083338540000664
和
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-[(2R)-2-羟丙氧基]-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-酮
例如，
Figure BDA0004083338540000671
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式(Io)的化合物，其是1-({[(1R)-1-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-7-氟-5-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-基]氧基}甲基)环丙烷-1-甲腈，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式(Io)的化合物，其是(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基))-1-羟丙基]-3-甲氧基-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-酮，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式(Io)的化合物，其是非对映异构体2A并且是1-({[(1R)-1-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-7-氟-5-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-基]氧基}甲基)环丙烷-1-腈，或其互变异构体、N-其氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式(Io)的化合物，其是非对映异构体2A并且是(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-(4-氟-1-甲基哌啶)-4-基)-1-羟丙基]-3-甲氧基-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-酮，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式(Io)的化合物，其它是非对映异构体2B并且是1-({[(1R)-1-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-7-氟-5-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-基]氧基}甲基)环丙烷-1-腈，或互变异构体，N-其氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式(Io)的化合物，其是非对映异构体2B并且是(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-(4-氟-1-甲基哌啶)-4-基)-1-羟丙基]-3-甲氧基-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-酮，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[(1S)-1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-甲氧基-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-酮，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[(1R)-1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-甲氧基-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-酮，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是1-({[(1R)-1-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-7-氟-5-[(1S)-1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-基]氧基}甲基)环丙烷-1-甲腈，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是1-({[(1R)-1-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-7-氟-5-[(1R)-1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-1-基]氧基}甲基)环丙烷-1-甲腈，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
为免生疑问，应当理解，一个取代基的每个一般和具体实施方式和实施例可以与一个或多个，具体地所有如本文所定义的其它取代基的每个一般和具体实施例和实施例组合，并且本申请涵盖所有此类实施例。
特定化合物
本发明的用途和方法适用于本文所述的所有分子式Io化合物，即MDM2拮抗剂可以是分子式Io化合物、其任何子式或本文所述的任何特定化合物，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式Io化合物，选自如本文定义的第一组实施例中所述的实施例1至134(即其中也如WO 2017/055860中所述cyc是苯基的化合物)。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是分子式Io化合物，选自如本文定义的第二组实施例中所述的实施例1至580(即其中也如WO2017/055859中所述cyc是Het的化合物)。
在本发明的一个特定实施方式中，MDM2拮抗剂是本文定义的分子式Io化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂合物，其为(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸。
(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4)-yl)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸在本文中称为“化合物1”
例如，
Figure BDA0004083338540000691
(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸在国际专利申请号PCT/GB2016/053042中作为实施例124公开，该申请于2017年4月6日作为WO 2017/055860发表。
化合物1的制备方法可见于2018年10月4日公布为WO 2018/178691的国际专利申请PCT/GB2018/050845。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是游离酸形式的化合物1。在另一个实施方式中，MDM2拮抗剂是一个化合物1药学上可接受的盐。
概述
其他MDM2拮抗剂可以以常规方式制备，例如通过与所述那些类似的方法。
MDM2拮抗剂的剂量学是本领域技术人员已知的。应当理解，优选的给药方法，每种MDM2拮抗剂的施用的剂量和方案将取决于被治疗的特定肿瘤和被治疗的特定宿主。最佳方法、施用方案、剂量和方案可由本领域技术人员使用常规方法并鉴于本文列出的信息而容易地确定。
盐、溶剂化物、互变异构体、异构体、N-氧化物、酯、前药和同位素
本文提及的任何化合物还包括离子形式、盐、溶剂化物、异构体(包括几何和立体化学异构体，除非另有说明)、互变异构体、N-氧化物、酯、前药、同位素及其保护形式，例如，如下所述；特别是其盐或互变异构体或异构体或N-氧化物或溶剂化物；更特别地，其盐或互变异构体或N-氧化物或溶剂化物。在一个实施方式中，提及化合物还包括其盐或互变异构体或溶剂化物。
盐
所述化合物可以以盐，例如加酸的盐的形式存在，或者在某些情况下以有机和无机碱的盐，如羧酸盐、磺酸盐和磷酸盐的形式存在。所有这些盐都在本发明的范围内，并且对分子式(Io)化合物的提及包括所述化合物的盐形式。
N-氧化物
含有胺官能团的化合物也可以形成N-氧化物。本文对含有胺官能团的化合物的提及还包括N-氧化物。
几何异构体和互变异构体
所述化合物可以以多种不同的几何异构体和互变异构形式存在，并且对分子式(Io)化合物的提及包括所有这些形式。为避免疑问，当化合物可以几种几何异构或互变异构形式中的一种形式存在，并且只有一种形式被具体描述或显示时，所有其他的都被用于本发明。
例如，某些杂芳基环可以两种互变异构体形式存在，如下文所示的A和B。为简洁起见，一个分子式可以展示一种形式，但所述分子式将被视为涵盖两种互变异构体形式。
立体异构体
除非另外提及或指明，否则化合物的化学名称表示所有可能的立体化学异构体形式的混合物。
分子式(Io)化合物
立体中心以通常的方式展示，例如使用“虚”或“实”楔线。
Figure BDA0004083338540000701
在化合物被描述为两种非对映异构体/差向异构体的混合物的情况下，立体中心的构型未被指定并用直线表示。
在化合物含有一个或多个手性中心并且可以以两个或多个光学异构体的形式存在的情况下，除非上下文另有要求，否则对化合物的提及包括其所有光学异构体形式(例如，对映异构体、差向异构体和非对映异构体)，无论呈单个的光学异构体还是混合物(例如，外消旋或非外消旋混合物)或两个或更多个光学异构体的形式。
特别关注的是那些立体化学纯的化合物。当化合物例如被指定为R时，这意指所述化合物基本上不含S异构体。如果化合物例如被指定为E时，这这意指所述化合物基本上不含Z异构体。术语顺式、反式、R、S、E和z是本领域技术人员众所周知的。
同位素变化
本发明包括所有药学上可接受的同位素标记化合物的用途，即化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数的原子所取代。
溶剂化物和结晶形式
所述化合物还涵盖该化合物的任何多晶形式，和溶剂化物如水合物、醇化物等。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的游离酸的结晶形式。
在一个实施方式中，MDM2拮抗剂是(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的结晶形式：
(a)以衍射角15.1、15.5、15.8和22.3度2θ(±0.2度2θ)处存在的峰为特征的X射线粉末衍射图；或者
(b)晶面间距为3.99、5.62、5.71和
Figure BDA0004083338540000711
特别是(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基的晶型-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的结晶形式有：
(a)以衍射角11.3、15.1、15.5、15.8、17.2、20.8、22.3和28.6度2θ(±0.2度2θ)处存在的峰为特征的X射线粉末衍射图；或者
(b)晶面距离为3.12、3.99、4.27、5.17、5.62、5.71、5.87和
Figure BDA0004083338540000712
/>
特别是(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的结晶形式有一种X射线粉末衍射图，其特征在于在本文表6中列出的衍射角(2θ)处存在的峰、晶面间距(d)和强度。
特别是(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-yl)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的结晶形式有X射线粉末衍射图案，其在与WO-A-2021/130682(通过引用并入本文中)的图12中所示的X射线粉末绕射图案的衍射角相同的衍射角处显示峰值，并且优选其中的峰值具有与WO-A-2021/130682的图12中的峰值相同的相对强度。
特别是(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的结晶形式有大致如WO-A-2021/130682图12所示的x射线粉末衍射图案。
在一个实施方式中，(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的结晶形式当进行DSC时，在266-267℃(例如，266.61℃)处显示放热峰。
结晶形式可以是基本上结晶的，这意味着一种单一的结晶形式可能占优势，尽管其他结晶形式可能以少量且优选可忽略的量存在。
例如，结晶形式可以包括不超过重量5％的任何其他结晶形式。
复合物
所述化合物在其范围内还包括所述化合物的配合物(例如，与环糊精等化合物的包合物或包合物，或与金属的配合物)。包合物、笼形包合物和金属复合物可以通过技术人员众所周知的方法形成。
前药
化合物还包括化合物的任何前药。例如，“前药”意指例如在体内转化为有生物活性化合物的任何化合物。
本发明的化合物的制备方法
分子式(Io)的化合物
在本部分中，与在本申请的所有其他部分中一样，除非上下文另有说明，否则对分子式Io的引用还包括如本文所定义的所有其他子式及其实施例，除非上下文另有说明。
分子式(Io)的化合物可以根据技术人员众所周知的合成方法制备。
所需的中间体或者是可商购的、文献中已知的、通过类似于文献中的方法制备的或者通过类似于以下示例性实验程序中描述的方法制备的。可以使用本领域众所周知的方法通过基团的官能团相互转化来制备其他化合物。
制备、分离和纯化其中cyc为苯基的化合物的一般方法可见于国际专利申请，其号为PCT/GB2016/053042，于2017年4月06日公布为WO 2017/055860：
制备、分离和纯化其中cyc为Het的化合物的一般方法可见于国际专利申请，其号为PCT/GB2016/053041，于2017年4月06日公布为WO 2017/055859。
生物标志物检测
在一些实施方式中，测定患者组织样本。所述组织可包括一种或多种癌细胞，或可包括癌细胞的核酸，通常是DNA，例如血液中获得的循环肿瘤DNA(ctDNA)。
在一些实施方式中，将样本放入体外诊断装置，该装置测量感兴趣的生物标志物的相关表达或生物标志物。
当实施本发明以确认治疗是否可能会有效时，患者通常可能已知或怀疑患有癌症。因此，在某些实施方式中，该方法用于评估已知或怀疑患有癌症的人类患者是否可以使用MDM2拮抗剂进行治疗。
本发明的方法通常包括通过使用一种或多种检测试剂和/或检测技术检测SKP2和任选的其他生物标志物。检测通常在患者样本上离体进行，例如在体外。在一个实施方式中，直接测量SKP2。在另一实施方式中，可以测量SKP2底物，通常是p27，以间接测量SKP2水平。
“检测”是指测定、定量、评分或测试生物标志物的表达水平。评估生物化合物，包括生物标志物蛋白、基因或mRNA转录物的方法是本领域已知的。检测生物标志物的方法包括直接和间接测量，这是公认的。本领域技术人员将能够选择测定特定生物标志物的适当方法。
“检测试剂”是特异性(或选择性)结合、相互作用或检测感兴趣的生物标志物的试剂或化合物。此类检测试剂可包括但不限于优先结合蛋白质生物标志物的抗体、多克隆抗体或单克隆抗体，或与mRNA或DNA生物标志物互补并选择性结合的寡核苷酸，通常在严格杂交条件下。
当提及检测试剂时，短语“特异性地(或选择性地)结合”或“特异性地(或选择性地)与之免疫反应”是指在生物分子的异质群体中确定生物标志物存在的结合反应。例如，在指定的免疫测定条件下，指定的检测试剂(例如抗体)与特定蛋白质的结合至少是背景的两倍，并且基本上不与样本中存在的其他蛋白质大量结合。在这种条件下的特异性结合可能需要根据其对特定蛋白质的特异性而选择的抗体。多种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定(酶联免疫吸附测定)通常用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(参见例如Harlow&Lane，Antibodies，A LaboratoryManual (1988)，关于免疫测定形式和可用于确定特定免疫反应的条件的描述)。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，更通常地是背景的10至100倍以上。
原位杂交(ISH)、定量实时聚合酶链反应(qRT PCR)和免疫组织化学(IHC)等技术传统上用于诊断或检测疾病生物标志物。然而，高通量、灵敏的方法(如下一代测序、单分子实时测序、数字病理学和定量组织病理学)的出现已经为伴随诊断或CDx的支持技术平台带来了转变。定量组织病理学和数字病理学都是基于医学成像的诊断方法；它们提供组织样本中蛋白质生物标志物的定位和测量。使用基于荧光的自动化成像平台鉴定和量化组织标志物。
当要检测的生物标志物是蛋白质时，检测方法包括基于抗体的测定、蛋白质阵列测定、基于质谱(MS)的测定和基于(近)红外光谱的测定。例如，免疫测定包括但不限于使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、荧光免疫测定等技术的竞争性和非竞争性测定***之类的。这样的测定是常规的并且在本领域中是众所周知的。
“分析”包括通过测量样本中的标志物(例如，是否存在标志物或成分表达水平)来确定与样品相关的一组值，并将测量值与同一受试者或其他对照受试者的一个样本或样本集合中的测量值进行比较。本教导的标志物可以通过本领域已知的各种常规方法中的任何一种来分析。“分析”可以包括进行统计分析以例如确定受试者是对治疗(例如本文所述的MDM2拮抗剂治疗)的反应者还是无反应者。
在本教导的上下文中，“样本”是指从受试者分离的任何生物样本，例如血液样本或活组织检查。样本可以包括但不限于单个细胞或多个细胞、细胞片段、体液等分试样、全血、血小板、血清、血浆、红细胞、白细胞或白细胞、内皮细胞、组织活检、滑液、淋巴液、腹水、间质或细胞外液。术语“样品”还包括细胞间隙中的液体，包括龈沟液、骨髓、脑脊液(CSF)、唾液、粘液、痰液、***、汗液、尿液或任何其他体液。“血样”可以指全血或其任何部分，包括血细胞、红细胞、白细胞或白细胞、血小板、血清和血浆。可以通过包括但不限于静脉穿刺、***、***、按摩、活检、针吸、灌洗、刮擦、手术切口或介入或本领域已知的其他方式的方式从受试者获得样本。
分析技术
在施用MDM2拮抗剂之前，可对患者进行筛选，以确定患者所患或可能患的疾病或病症是否易受抑制MDM2/p53的化合物治疗。术语“患者”包括人类和兽医学受试者，如灵长类动物，具体地人类患者。
例如，可以对患者的生物样本进行分析，以确定患者正在或可能经受的病状或疾病，如癌症，是否是特征在于遗传异常或蛋白质表达异常的病状或疾病，这些异常导致MDM2水平的上调或MDM2/p53下游的生化通路的上调。此外，可以分析患者的生物样本以确定患者患有或可能患有的病症或疾病(例如癌症)是否是以本发明的生物标志物为特征的病症或疾病。
此类异常的实施例；该异常导致MDM2活化或敏化，影响MDM2表达的调节通路的丢失或抑制，受体或其配体的上调，细胞遗传畸变，或受体或配体的突变体的存在。MDM2/p53上调的肿瘤，特别是MDM2表达过量或表现出野生型p53的肿瘤可能对MDM2/p53抑制剂特别敏感。此外，SKP2表达可能较低或降低。
术语“升高“和增加”包括表达上调或表达过量，包括基因扩增(即，多基因拷贝)、细胞遗传畸变和转录或翻译后效应所致的表达增加。因此，可以对患者进行诊断测试，以检测本发明生物标志物上调的合适蛋白质或标志物特征。术语诊断包括筛选。
术语“标记物”或“生物标志物”包括遗传标记物，包括例如测量DNA组成以鉴定p53或扩增MDM2中突变的存在，或者通常是本文广泛讨论的本发明的生物标记物。术语标志物还包括具有上调MDM2/p53或下调本文概述的生物标志物的特性的标志物，包括上述蛋白质的蛋白质水平、蛋白质状态和mRNA水平。基因扩增包括大于7个拷贝以及介于2个拷贝与7个拷贝之间的增益。
术语“减少”、“缺失”或“降低”包括表达降低或表达减少，包括下调(即基因拷贝减少)、细胞遗传学异常、转录效应导致的表达减少和基因丢失。因此，可以对患者进行诊断测试以检测较低水平的本发明生物标志物。
诊断测试和筛选通常对选自以下的生物样本(即身体组织或体液)进行：肿瘤活检样本、血液样本(脱落肿瘤细胞的分离和富集，或循环肿瘤DNA的分离)，脑脊液、血浆、血清、唾液、粪便活检、痰、染色体分析、胸水、腹膜液、口腔涂片、皮肤活检或尿液。
此外，还可以使用液体活检，例如基于血液的(***)循环肿瘤DNA(ctDNA)测试或基于NGS的液体活检测试，特别是用于检测癌症或鉴定突变。液体活检涉及下一代测序(NGS)，补充了传统的PCR和肿瘤活检检测方法进行了补充，例如通过对循环肿瘤细胞(CTCs)进行全基因组测序或对循环肿瘤DNA(ctDNA)进行大规模并行测序。
在一个实施方式中，获得的样本是血液样本，例如血浆或血清样本，特别是血清样本。在一个实施方式中，获得的样本是肿瘤活检样本。
在一个实施方式中，通常将血液收集在血清分离管中，在医学实验室或在护理点进行分析。在第二个实施方式中，通过活检分析肿瘤并在医学实验室进行分析。
筛选方法可以包括但不限于标准方法，例如逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质分析或原位杂交，例如荧光原位杂交(FISH)。
鉴定和分析细胞遗传畸变、基因扩增、缺失，下调，突变和蛋白质上调的方法是本领域技术人员已知的。筛选方法可以包括但不限于标准方法，如通过常规的桑格尔(Sanger)或下一代测序方法进行DNA序列测定、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA测序(RNAseq)、Nanostring杂交接近度RNA nCounter测定(Nanostring hybridisationproximity RNA nCounter assay)或原位杂交，如荧光原位杂交(FISH)或等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)。此外，评估蛋白质水平的方法包括免疫组织化学或其他免疫测定。因此，在一个实施方式中，分析患者样本中的蛋白质表达。在另一个实施方式中，使用诸如FISH的技术分析患者样本中的基因表达，例如基因畸变。用于评估基因拷贝变化的方法包括细胞遗传实验室中常用的技术，如MLPA(多重连接依赖性探针扩增)、一种检测异常拷贝数的多重PCR方法，或其它可以检测基因扩增、获得和缺失的PCR技术。
在用RT-PCR进行筛选时，创建mRNA的cDNA拷贝、然后用PCR扩增cDNA来评估肿瘤中的mRNA水平。PCR扩增的方法、引物的选择和用于扩增的条件是本领域技术人员已知的。核酸操纵和PCR采用标准方法来进行，如在例如以下文献中所描述：Ausubel，F.M.等人，eds.(2004)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons Inc.，or Innis，M.A.et al.，eds.(1990)《PCR方案：方法和应用指南(PCR Protocols：a guide to methodsand applications)》，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥。涉及核酸技术的反应和操纵还在Sambrook等人，(2001)，第3版，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)》，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)中进行了描述。可替代地，可以使用可商购获得的RT-PCR试剂盒(例如罗氏分子生化(RocheMolecular Biochemicals))或如以下美国专利中所阐述的方法：4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659、5,272,057、5,882,864和6,218,529，并且所述美国专利通过引用并入本文中。例如本文概述的基因中的突变可以通过PCR确定。在一个实施方式中，特异性引物对是可商购的或如文献中所述。
用于评估mRNA表达的原位杂交技术的实施例是荧光原位杂交(FISH)(参见Angerer(1987)《酶学方法(Meth.Enzymol.)》，152：649)。
可以进行下一代测序(NGS)、DNA测序或Nanostring技术。
通常，原位杂交包括以下主要步骤：(1)将要分析的组织固定；(2)对样品进行预杂交处理以增加靶核酸的可及性并减少非特异性结合；(3)使核酸混合物与生物结构或组织中的核酸进行杂交；(4)杂交后清洗以去除杂交中未结合的核酸片段；以及(5)对杂交的核酸片段进行检测。此类应用中使用的探针通常用例如放射性同位素或荧光报告基因标记。某些探针足够长，例如从约50个、100个或200个核苷酸到约1000个或更多个核苷酸，以能够在严格条件下与靶核酸特异性杂交。用于执行FISH的标准方法在以下文献中进行了描述：Ausubel，F.M.等人编辑(2004)《当代分子生物学实验指南》约翰威利父子公司和荧光原位杂交：技术综述(Fluorescence In Situ Hybridization：Technical Overview)JohnM.S.Bartlett《癌症分子诊断、方法和方案(Molecular Diagnosis of Cancer，Methodsand Protocols)》第2版；ISBN：1-59259-760-2；2004年3月，第077-088页；《系列：分子医学方法(Series：Methods in Molecular Medicine.)》
用于基因表达谱的方法，在(DePrimo等人(2003)，《BMC癌症(BMC Cancer)》，3∶3)中有描述。简而言之，方案如下：从总RNA合成双链cDNA时，用(dT)24寡聚物引导第一链cDNA合成、然后用随机六聚体引物进行第二链cDNA合成。双链cDNA作为模板使用生物素化核糖核苷酸在体外转录cRNA。根据由昂飞公司(Affymetrix)(美国加利福尼亚州圣克拉拉(Santa Clara，CA，USA))描述的方案对cRNA进行化学片段化，然后在人类基因组阵列上杂交过夜。可替代地，单核苷酸多态性(SNP)阵列是一种DNA微阵列，其可以用于检测群体内的多态性。
此外，检测试剂盒可能使用Nanostring技术或ddPCR。
可替代地，由mRNA表达的蛋白质产物可以通过以下进行测定：肿瘤样本的免疫组织化学(或其他的免疫测定)、用微孔板进行固相免疫测定、蛋白质印迹、2维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、ELISA、流式细胞仪和本领域已知的用于检测特异性蛋白质的其它方法，例如毛细管电泳。检测方法将包括使用位点特异性抗体。技术人员将会认识到，所有这些用于检测MDM2和p53上调，检测MDM2或p53变异体或突变体，或MDM2的负调节因子的丢失(例如，p14ARF)或本文所述基因的众所周知的技术都可以用于本发明案例中。具体而言，本文所述基因的水平可以使用免疫组织化学来测量。细胞质中的表达可以通过肿瘤细胞染色来评估。在一些实施方式中，使用这些技术测定SKP2。在一些实施方式中，使用这些技术测定一种或多种SKP2底物。
可以使用标准蛋白质测定法测量蛋白质水平，特别是增加、降低或异常水平的蛋白质。升高或降低的水平，或低或过量表达也可以组织样本中检测到，例如一个肿瘤组织可通过使用来自Chemicon国际公司(Chemicon International)的测试对蛋白质水平进行测定。将从样品裂解物中免疫沉淀所关注的蛋白质并对其水平进行测量。
在基因为SKP2的实施方式中，将认识到有多种分析方法可用于测定，例如ELISA、免疫比浊法、快速免疫扩散和视觉凝集。
在测试基因表达的实施方式中，将认识到存在可用于测定的各种分析方法。
在包括检测SKP2丢失的一个实施方式中，这种检测通常可以在DNA(即DNA测序)、RNA(即qPCR、基因阵列、外显子组测序等)或蛋白质(即免疫组化)水平上使用经临床测定的活组织检查进行。在替代实施方式中，SKP2丢失的检测包括一种或多种：反相蛋白质阵列、蛋白质印迹、半定量或定量IHC。
免疫组织化学(IHC)是生物标志物检测的重要技术。首先，它允许在检查的癌症组织的组织学相关区域中直接观察生物标志物的表达。第二，IHC在通过标准方法处理的FFPE组织切片上运行，确保生物标志物测定可以在临床可用的样本上运行。第三，经过验证的IHC测定可以很容易地应用于临床实践。例如，有多种经过验证的临床上使用的IHC检测，例如，检测PD-L 1、HER2和ALK的测定fhttps：//www.fda.gov/medical-devices/vitro-diagnostics/list-cleared-or-approved-companion-diagnostic-deVices-vitro-and-imaging-tools)。传统上，病理学家用视觉评分作为IHC数据。例如，在HSCORE的计算中，每个强度级别染色面积百分比的总和乘以染色的加权强度(例如，1、2或3；其中0是无染色，1是弱染色，2是中度染色和3是强染色)[McCarty等人：Cancer Res 1986，46：4244s-4248s]。出于测定验证的目的，这些测定常常在排列在染色TMA切片上的样本上进行，从而允许足够多的样本代表以进行统计学上严格的测试。组织标本由极少数载玻片上组织核心充分的代表，最大限度地减少IHC成本和组织使用，并方便观察者内、观察者间和实验室间的研究。对感兴趣的图像区域(例如，组织样本的癌变区域)进行分类，并且量化这些区域内的IHC染色强度的计算机辅助方法也可用于生成数据。
这样的技术将在本文所述的其他基因的检测中发现同样的适用性。在一些实施方式中，本文所述基因水平增加的检测包括聚合酶链式反应(PCR)测定，或直接核酸测序或与对所述基因特异的核酸探针杂交。
因此，所有这些技术也可用于鉴定特别适合用MDM2拮抗剂治疗的肿瘤。
在适当的情况下，也可以利用离体功能测定，例如测量癌症患者的循环白血病细胞，来评估对MDM2/p53抑制剂激发产生的反应。
因此，本发明的另外的方面包括使用MDM2拮抗剂来制备用于治疗或预防已经进行过筛选并且已经确定患有或有风险患有将易感于用MDM2/p53抑制剂治疗的疾病或病状的患者的疾病状态或病状的药物。
本发明的另一方面包括MDM2拮抗剂，其用于预防或治疗选自具有SKP2丢失的亚群体的患者的癌症。
本发明的另一方面包括MDM2拮抗剂，其用于预防或治疗选自具有p53野生型和SKP2丢失的亚群体的患者的癌症。
本发明的另一方面包括MDM2拮抗剂，其用于预防或治疗SKP2丢失患者的癌症。
血管正常化的MRI测定(例如，使用MRI梯度回波、自旋回波和对比度增强来测量血容量、相对血管大小和血管通透性)与循环生物标志物组合也可用于鉴定适合于用本发明所用化合物治疗的患者。
因此，本发明的另外的方面是一种用于诊断和治疗由MDM2/p53介导的疾病状态或病状的方法，所述方法包括(i)筛选患者以确定所述患者正在或可能经受的疾病或病状是否易感于用MDM2/p53抑制剂治疗的疾病或病状；以及(ii)何处指出患者因此易患的疾病或病状，之后向患者施用如本文所定义的MDM2拮抗剂和其亚组或实施例。
在一个实施方式中，本发明的方法另外包括筛选具有一种或多种MDM家族成员(例如，MDM2和/或MDMx)过表达的患者的步骤。
在一个实施方式中，本发明的方法还包括筛选具有导致MDM2过度表达的细胞遗传学异常的患者的步骤。
在一个实施方式中，患者的样本与引物、抗体、底物或探针接触以确定本文所述基因的水平。
在一个实施方式中，该方法包括：(i)将患者样本与引物、抗体、底物或探针接触，和(ii)确定本文所述基因的水平。
可以用抗体(例如与荧光探针偶联的抗体)对未处理的细胞进行细胞内染色来分析基础水平。本文所述的生物标志物的抗体可从一系列供应商商购获得。特别地，待使用的抗体可以是FDA批准的体外诊断试剂盒(IVD)的一部分。
在一个实施方式中，该方法包括：(i)将患者样本与抗体接触，和(ii)确定本文所述的一种或多种生物标志物的水平。在一个替代实施方式中，该方法的步骤(i)包括将患者样本与一种或多种生物标志物底物的一种或多种PCR引物接触。
在一个实施方式中，该方法包括：(i)将患者样本与抗体接触，和(ii)确定核定位水平以评估本文所述的一种或多种生物标志物的水平。在一个替代实施方式中，该方法的步骤(i)包括将患者样本与生物标志物底物抗体接触。
在适当的情况下，可以使用免疫组织化学或使用抗体的免疫荧光来确定核定位水平。
可使用反相蛋白质阵列、蛋白质印迹、半定量或定量IHC或DNA测序检测导致SKP2丢失的突变。在一个实施方式中，该方法包括：(i)使患者样品与抗突变抗体接触，以及(ii)确定患者肿瘤是SKP2丢失。在一个实施方式中，该方法包括：(i)使患者样品与抗突变抗体接触，以及(ii)确定SKP2的水平(或其丢失)。
SKP2缺失和突变的检测可以通过从患者样本(例如肿瘤活检)中提取DNA、通过PCR扩增和使用合适引物的DNA测序来进行。PCR引物可以设计或可商购获得。突变阵列试剂盒也可商购获得。
在一个实施方式中，该方法包括：(i)使患者样品与一种或多种SKP2 PCR引物接触，以及(ii)确定SKP2突变或缺失的存在或不存在。在替代实施方式中，该方法的步骤(i)包括将患者样品与一种或多种SKP2底物的一种或多种PCR引物接触。
在一个实施方式中，该方法包括：(i)使患者样品与SKP2抗体接触，以及(ii)确定SKP2突变或缺失的存在或不存在。在替代实施方式中，该方法的步骤(i)包括使患者样品与SKP2底物抗体接触。
可以使用ELISA试剂盒确定蛋白质水平。用于患者样本的ELISA试剂盒可在临床环境中用于评估血液化学。这些抗体利用蛋白质特异性抗体，例如抗生物标志物抗体，如抗SKP2，或偶联抗体。特别是，要使用的抗体是FDA批准的体外诊断试剂盒的一部分。在一个实施方式中，使用符合临床生物化学协会(ACB)定义的标准的测试来确定该水平。
在一个实施方式中，该方法包括：(i)将患者样本与抗体接触，和(ii)确定来自本文所述基因的蛋白质水平。
特别是，样本在水平定量的条件下被接触。
例如，在上述接触步骤中，样本通常在缓冲液的存在下与引物、探针、底物或抗体接触。底物可以是例如荧光探针。
选择患者
应当理解，根据本发明选择用MDM2拮抗剂治疗的患者将根据前一节中描述的方法测试或测量SKP2。
例如，这样一个选定的患者将具有：
SKP2表达降低或低。
在一个实施方式中，选定的患者表现出或呈现出至少一种癌症症状，特别是TP53野生型肿瘤。
在一个实施方式中，选定的癌症患者以前没有用MDM2拮抗剂治疗过。在一个实施方式中，选定的患者以前没有对MDM2拮抗剂的治疗产生反应。
在一些实施方式中，通过PCR、HTG边序列法(HTG EdgeSeq)或定量基因表达测定(例如NanoString nCounter)来确定核酸表达谱。在一些实施方式中，通过免疫测定确定蛋白质表达谱(例如SKP2)。
基因表达测定
在一个实施方式中，相对于从未患癌症的正常受试者获得的对照样品中所述RNA的量，SKP2的RNA水平降低。
在替代实施方式中，相对于从同一患者获得的非肿瘤样品中所述RNA的量，SKP2的RNA水平在肿瘤中降低。
在一些实施方式中，降低的水平与来自MDM2抑制剂无反应受试者的样品中确定的RNA量有关。
在一个实施方式中，其相对于正常水平降低。
正常上限(ULN)是指处于整个范围95％的水平。它是一组值，正常人群中95％落在其中(即，95％的预测区间)。
在一个实施方式中，降低的水平是相对于对照样本、正常上限(ULN)或取自所述患者的样本的>1倍差异，例如1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或它们之间的任何范围。在一个实施方式中，相对于对照样品或ULN，降低的水平在1至50倍之间。在一个实施方式中，降低的水平非常高，例如相对于对照样品、ULN或取自所述患者的样品的>10倍的差异，例如10、10.5、11、11.5、12、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、1000倍的差异或其间的任何范围。在一个实施方式中，相对于对照样品或ULN，降低的水平在10至1000倍之间。在一个实施方式中，相对于对照样品，降低的水平在2倍和10倍之间(例如5倍)。
可以确定疾病个体和正常个体(参考值或对照样本)之间的倍数差异。该参考值可从正常个体中计算，或基于排除待测试样本类型的样本池(例如TP53野生型和降低型SKP2)。在一个实施方式中，患者髓系白血病样品中SKP2基因表达与正常组织的差异(血点(BloodSpot)资源，核酸研究所(Nucleic Acids Res.)2016年1月4日；44)为0.66至-3.55(l0g2等级)，AML样品中SKP2基因表达的中值降低为-1.35。
在一个实施方式中，RNA的浓度通过RT-PCR和/或微阵列和/或纳米串来确定。每种测定通常具有与特定测定方法相关的“正常上限”(ULN)值。此类ULN通常使用特定测定方法从足够样本量的正常健康受试者中确定，以测量RNA浓度。然后通常将仍被认为在正常范围内(例如，在平均值的两个标准偏差内)的最高RNA浓度确定为ULN。由于此类ULN值将随着测量浓度的特定测定方法而变化，因此每个特定测定方法将具有与该测定方法相关的独特的ULN值。
如本文所示，浓度可用于预测癌症患者是否可能受益于MDM2拮抗剂治疗。
蛋白质测定
在一个实施方式中，SKP2的蛋白质水平相对于从未患癌症的正常受试者获得的对照样品中所述蛋白质的量降低。
在替代实施方式中，SKP2的蛋白质水平相对于从同一患者获得的早期样品中所述蛋白质的量降低。
在一个实施方式中，它相对于正常水平减少或降低。
正常上限(ULN)是指处于整个范围95％的水平。这是一组值，95％的正常人群落在该值范围内(即95％的预测区间)。
在一个实施方式中，水平降低是相对于对照样本，正常上限(ULN)或所述患者的样本，相差<1倍，例如相差0.75、0.5、0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02倍或0.01倍或其间任何范围。在一个实施方式中，水平降低是相对于对照样本或ULN，相差倍数在1至0.01倍之间。在一个实施方式中，水平降低是非常低，例如相对于对照样品、ULN或所述患者的样本相差>0.01倍，例如相差0.001倍或它们之间的任何范围。在一个实施方式中，水平降低是0，即完全没有。
在另一个实施方式中，SKP2水平通过免疫组织化学确定。
蛋白质、蛋白质复合物或蛋白质组标志物可以通过本领域已知的多种方法特异性地鉴定和/或定量，并且可以单独或组合使用。基于免疫学或抗体的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、蛋白质印迹、免疫荧光、微阵列、一些色谱技术(即免疫亲和色谱)、流式细胞术、免疫沉淀等。此类方法基于对与感兴趣的蛋白质或蛋白质复合物相关的一种特定表位或多种表位组合具有特异性的一个或多个抗体。非免疫学方法包括那些基于蛋白质或蛋白质复合物本身的物理特性的方法。此类方法的实施例包括电泳、一些色谱技术(例如高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白质液相色谱(FPLC)、亲和色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱等)、质谱、测序、蛋白酶消化，等等。此类方法基于质量、电荷、疏水性或亲水性，其来源于所述蛋白质或蛋白质复合物的氨基酸组成，以及氨基酸的特定序列。
在一个实施方式中，不存在SKP2表达。具有低水平SKP2的样品可被鉴定为SKP2阴性，例如SKP2丢失。
在一个实施方式中，通过突变分析例如DNA测序来评估SKP2的丢失。
还可以确定SKP2的细胞质和细胞核表达水平。SKP2蛋白的核定位是细胞中的标记。核表达水平可以用组织学分数(范围，0-100)来评分，该分数表示用抗体(例如针对生物标志物的单克隆抗人抗体)处理后获得的阳性细胞百分比。可以进行免疫染色表达评分。
细胞质中SKP2的水平也可以使用免疫组织化学或免疫荧光来测量。
在一个实施方式中，相对于从未患癌症的正常受试者获得的对照样品中所述蛋白质的量，SKP2的水平降低。
在一个实施方式中，相对于从同一患者获得的非肿瘤样品中所述蛋白质的量，SKP2在肿瘤中的水平降低。
在一个实施方式中，SKP2的表达水平降低50％、60％、70％、80％、90％、95％、96、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％。100％的表达降低是完全降低，即完全丢失。在一些实施方式中，提供至少50％的降低。在一些实施方式中，提供至少75％的降低。
在一些实施方式中，提供至少80％的降低。
在一些实施方式中，提供至少95％的降低，例如至少99％。
定量方法
本发明涉及鉴定可使用MDM2拮抗剂进行治疗的患者。在一些实施方式中，所述方法至少包括以下步骤：
(a)使来自患者的样品与针对SKP2和/或一种或多种SKP2底物的抗体接触；
(b)对所述样本进行ELISA或免疫组织化学测定；
(c)确定SKP2的水平；以及
(d)当(i)SKP2水平相对于正常上限(ULN)降低时，将患者鉴定为MDM2拮抗剂治疗的候选者；或(ii)SKP2不存在；或(iii)SKP2的水平相对于正常上限(ULN)较低。
在其他实施方式中，用于鉴定可使用MDM2拮抗剂治疗的患者的方法包括：
(a)使来自患者的样品与抗SKP2和/或一种或多种SKP2底物的抗体接触以确定SKP2蛋白表达水平；
(c)当SKP2水平相对于正常上限(ULN)降低时，用MDM2拮抗剂治疗患者
还描述了一种用于鉴定或选择用MDM2拮抗剂治疗的患者的方法，该方法包括：
(a)使来自患者的样品与抗SKP2和/或一种或多种SKP2底物的抗体接触以确定SKP2蛋白表达水平；
(b)当SKP2的水平相对于正常上限(ULN)降低时，用MDM2拮抗剂治疗患者。
所选患者通常是癌症患者。当患者在来自患者的生物样本中的SKP2水平低于预定值(或不存在)时，通常选择患者。
癌症可以是液体癌或实体瘤。在一个实施方式中，癌症是液体癌，例如血癌。在进一步的实施方式中，癌症可以是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
通常，癌症是白血病，也可以是髓系白血病。
在另一个实施方式中，癌症是急性髓系白血病。
癌症可以是实体瘤。在一个实施方式中，实体瘤是结肠癌。在另一个实施方式中，癌症是乳腺癌。在另一个实施方式中，癌症是肺癌。在又一个实施方式中，癌症是皮肤癌，例如黑色素瘤或癌。在一个不同的实施方式中，癌症是胰腺癌。
可根据本发明评估治疗的特定癌症包括但不限于急性髓系白血病(AML)。在最初的测定中，AML被认为是最敏感的癌症。
一种用于预测MDM2拮抗剂对患者癌症的疗效的方法，包括确定来自患者的生物样品中SKP2的水平，其中SKP2的生物样品水平低于预定值是对患者疗效的预测。
在一个实施方式中，患者髓系白血病样品与正常组织中SKP2基因表达的差异为0.66至-3.55(log2等级)，AML样品中SKP2表达的中值降低为-1.35。SKP2的低表达似乎与特定的AML亚型(例如，具有易位t(15；17)的AML)更相关[来源：BloodSpot(www.blodspot.eu，Nucleic Acids Res.2016年1月4日；44)]。类似地，AML样品与正常组织中CDKN1B(p27)的表达差异在-3.76至2.37(log2级)之间，并且在SKP2表达水平较低的AML样品中表达上调1倍。
在一个实施方式中，提供了用于治疗癌症的方法中的MDM2拮抗剂，其中所述癌症是具有易位t(l5；17)的AML。
实施这些方法的***
本文所述的方法可以利用***来辅助患者的评估或预后。该***可以是具有各种装置组件(单元)集成在其中的单个装置。该***还可以具有其各种组件，或这些组件中的一些，作为单独的装置。组件可以包括测量装置、图形用户界面和计算机处理单元。
该***通常包括与界面的数据连接，由此界面本身可以是***的一部分或者可以是远程界面。后者指的是用不同的装置来提供实际界面的可能性，该装置最好是手持装置，例如智能手机或平板电脑。在这种情况下，数据连接将优选涉及无线数据传输，例如通过Wi-Fi或蓝牙，或通过其他技术或标准。
在某些实施方式中，测量装置被配置为接收组织样本，例如通过将一个或多个癌细胞或一滴血置于可***装置中的药筒上。该装置可以是能够从相同样本确定生物标志物或多个生物标志物水平的现有装置。处理单元可以从测量装置接收蛋白质浓度的数值。处理单元通常配备有软件(通常是嵌入式软件)，允许它根据输入数据计算一个分值。
在另一个实施方式中，用于评估人类癌症患者是否适合用MDM2拮抗剂治疗的***包括：
(a)检测装置能够并适于在人类患者的样本中检测本发明的生物标志物或多种生物标志物。这样的装置是已知的，并且对于技术人员而言是容易获得的。通常，提供一个用于在接收其中受试者样本的容器，该容器配备有检测方式；
(b)一个处理器，其能够并适于根据所述蛋白质所测定的浓度确定患者接受MDM2拮抗剂治疗的可能性的指示。
可选地，该***包括一个能呈现信息的用户界面(或与远程界面的数据连接)，特别是图形用户界面(GUI)；GUI是一种用户界面类型，它允许用户通过图形图标和视觉指示器(例如二级符号)与电子装置进行交互，而不是基于文本的用户界面、键入的命令标签或文本导航(在本发明中这些界面没有一个被排除)；GUI是众所周知的，通常用于手持移动装置，例如，MP3播放器、便携式媒体播放器、游戏装置、智能手机和小型些的家庭、办公室和工业用遥控器；如上所述，界面也可以任选地选择成能够输入信息，例如关于患者的信息。
在一个实施方式中，一种用于确定人类癌症患者是否适合用MDM2拮抗剂治疗的***包括存储存储器，该存储存储器用于存储与来自患者的样本相关的数据，该数据包括与指示来自受试者的样本中生物标志物表达水平的生物标志物组相关的数据，所述生物标志物组包括SKP2；以及
处理器交互式地耦合到存储存储器，用于对患者进行分类。
试剂盒
本发明还单独或作为上述***的一部分提供了用于检测SKP2和/或一种或多种SKP2底物的试剂盒，以评估患者对MDM2抑制对癌症治疗的反应的可能性。该试剂盒通常包括用于检测本发明的一种或多种生物标志物的一种或多种检测试剂。这些试剂可以用于直接检测或间接检测生物标志物，例如检测相关底物。
通常，该试剂盒包括两种或更多种，或三种或更多种检测试剂，每种试剂针对本发明的不同生物标志物。
如上文参考本发明的方法所讨论的，试剂盒可包括更多检测试剂，例如用于其他蛋白质的检测试剂。在优选实施方式中，试剂盒中可用的检测试剂包括用于检测构成本发明生物标志物组的一种、两种、三种或四种蛋白质的检测试剂，如上所述。
所述试剂盒可以包括固体支持物，例如芯片、微量滴定板或珠子或包括所述检测试剂的树脂。在一些实施方式中，试剂盒包括质谱探针。
该试剂盒还可以提供对未结合的检测试剂或所述生物标志物和/或生物标志物(夹心型测定)特异的洗涤溶液和/或检测试剂。
这样的试剂盒将适当地包括用于检测和/或定量SKP2的生物传感器，任选地连同根据本文所述方法使用试剂盒的说明书。
已经建立了表征本发明生物标志物状态的遗传和生物化学方法。也有成熟的生化方法来显示血液中蛋白质量的特性，例如血清样本。
在一个实施方式中，本发明包括被包装的癌症治疗。被包装的治疗包括与说明书包装在一起的组合物，该说明书关于在被选定使用本发明的患者中为预期使用目的，使用有效量的本发明的组合物。在其他实施方式中，本发明提供了将本发明的任何组合物用于制造治疗受试者癌症的药物的用途。
在一个实施方式中，本发明提供了用于从单个患者样本确定SKP2水平的试剂盒或面板或阵列。
生物效应
本文所述的化合物、亚组及其实施例已显示能够抑制p53与MDM2的相互作用。这种抑制导致细胞增殖停滞和细胞死亡(通常是细胞凋亡)，这可用于预防或治疗本文所述的疾病状态或病症，例如下面讨论的疾病和病症，以及上面所描述的其中p53和MDM2起作用的疾病和病症。因此，例如，设想本文所述的化合物可用于减轻或减少癌症的发生率。
本文所述的化合物可用于治疗成年人群。本发明中使用的化合物可用于治疗儿科人群。
本文所述的化合物已被证明是形成MDM2-p53复合物的良好拮抗剂。本文所述的化合物能够与MDM2结合并且对MDM2表现出效力。本发明的化合物对MDM2/p53的疗效，已用本文所描述的测定方案和本领域已知的其它方法确定。更特别地，式(Io)化合物及其亚基对MDM2/p53具有亲和力。
本发明中使用的某些化合物是IC50值小于0.1μM，特别是小于0.01或0.001μM的化合物。
MDM2/p53功能与许多疾病有关，因为它在多种过程中发挥作用，例如血管重塑和抗血管生成过程以及代谢通路的调节，以及肿瘤发生。由于它们对MDM2的亲和力，预计这些化合物可用于治疗或预防一系列疾病或病症，包括自身免疫病症；糖尿病；慢性炎性疾病，例如狼疮肾炎、***性红斑狼疮(SLE)、自身免疫介导的肾小球肾炎、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病、自身免疫性糖尿病、湿疹超敏反应、哮喘、COPD、鼻炎和上呼吸道疾病；角化过度疾病，例如常染色体隐性遗传先天性鱼鳞病(ARCI)；肾脏疾病，包括肾小球疾病、慢性肾脏疾病(CKD)肾脏炎症、足细胞丢失、肾小球硬化、蛋白尿和进行性肾脏疾病；心血管疾病，例如心脏肥大、再狭窄、心律失常、动脉粥样硬化；缺血性损伤相关的心肌梗塞、血管损伤、中风和再灌注损伤；血管增生性疾病；眼部疾病，例如年龄相关性黄斑变性，特别是湿性年龄相关性黄斑变性、缺血性增殖性视网膜病，例如早产儿视网膜病(ROP)和糖尿病性视网膜病，以及血管瘤。
由于他们对MDM2具有亲和力，因此预期所述化合物可以可用于治疗或预防增殖性病症，如癌症。
可以治疗(或抑制)的癌症(及其良性对应物)的实施例包括但不限于上皮起源的肿瘤(腺瘤和各种类型的癌，胃肠道(包括食管、胃(胃)、小肠、结肠、肠、结直肠、直肠和***)、肝(肝细胞癌)、胆囊和胆道***、外分泌胰腺、肾脏(例如肾细胞癌)，肺(例如腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌，支气管肺泡癌和间皮瘤)、头颈部(例如舌癌、口腔癌、喉癌、咽癌、鼻咽癌、扁桃腺癌、唾液腺癌、鼻腔癌和鼻窦癌)、卵巢、输卵管、腹膜、***、外阴、***、睾丸、宫颈、子宫肌层、子宫内膜、，甲状腺(例如甲状腺滤泡癌)、脑、肾上腺、***、皮肤和附件(例如黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、角化棘皮瘤、发育不良痣)；血液学恶性肿瘤(即白血病、淋巴瘤)和癌前血液学疾病和边界性恶性疾病，包括血液学恶性疾病和相关的淋巴系疾病(例如急性淋巴细胞白血病[ALL]、慢性淋巴细胞白血病[CLL]、B细胞淋巴瘤如弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBCL])、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和白血病、自然杀伤[NK]细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、意义不明的单克隆丙种球蛋白病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后淋巴增生性疾病)，以及血液学恶性肿瘤和相关的髓系疾病(例如急性髓系白血病[AML]、慢性髓系白血病[CML]、慢性髓单核细胞白血病[CMML]，嗜酸细胞增多综合征，骨髓增生性疾病，如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞白血病)；间质来源的肿瘤，例如软组织、骨或软骨的肉瘤，如骨肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤因肉瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、胃肠道间质瘤、良性和恶性组织细胞瘤以及***性皮肤纤维肉瘤；中枢或外周神经***的肿瘤(例如星形细胞瘤(例如胶质瘤)、神经瘤和胶质母细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、松果体肿瘤和神经鞘瘤)；内分泌肿瘤(例如垂体肿瘤、肾上腺肿瘤、胰岛细胞肿瘤、甲状旁腺肿瘤、类癌和甲状腺髓样癌)；眼部和附件肿瘤(例如视网膜母细胞瘤)；生殖细胞和滋养层肿瘤(例如畸胎瘤、***瘤、无性细胞瘤、***和绒毛膜癌)；以及儿童和胚胎肿瘤(例如髓母细胞瘤、神经母细胞瘤，肾母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤)；或先天性或其他综合征，使患者易患恶性肿瘤(例如着色干皮病)。
细胞的生长是一种严密控制的功能。癌症是异常细胞生长的一种状况，当细胞以不受控制的方式复制(数量增加)、不受控制地生长(变大)和/或通过细胞凋亡(程序性细胞死亡)、坏死或失巢凋亡而经历减少的细胞死亡时会产生癌症。在一个实施方式中，异常细胞生长选自不受控制的细胞增殖、过度的细胞生长或减少的程序性细胞死亡。具体地，异常细胞生长的病状或疾病是癌症。
因此，在本发明用于治疗包括异常细胞生长(即，不受控制和/或快速的细胞生长)的疾病或病状的药物组合物、用途或方法中，在一个实施方式中，包括异常细胞生长的疾病或病状是癌症。
许多疾病的特征在于持续的和不受调节的血管生成。慢性增殖性疾病通常伴随着严重的血管生成，这可能有助于或维持炎症和/或增殖状态，或其通过血管的侵入性增殖导致组织破坏。已发现肿瘤生长和转移是血管生成依赖性的。因此，本发明中使用的化合物可用于预防和破坏肿瘤血管生成的起始。
血管生成通常用于描述新血管生成或血管替代，或新血管形成。这是在胚胎中建立脉管***必要和生理正常的过程。通常，大多数正常成人组织中不会发生血管生成，除非是在***、月经和伤口愈合部位。然而，许多疾病的特征在于持续的和不受调节的血管生成。例如，在关节炎中，新的毛细血管侵入关节并破坏软骨。在糖尿病(以及许多不同的眼病)中，新血管侵入黄斑或视网膜或其他眼部结构，并可能导致失明。动脉粥样硬化的过程与血管生成有关。已发现肿瘤生长和转移是血管生成依赖性的。这些化合物可能有益于治疗诸如癌症和转移、眼部疾病、关节炎和血管瘤等疾病。
因此，本发明中使用的化合物可用于治疗转移和转移癌。转移或转移性疾病是疾病从一个器官或部分扩散到另一个非相邻器官或部分。可由本发明所用化合物治疗的癌症包括原发性肿瘤(即起源部位的癌细胞)、局部侵袭(在局部区域穿透和浸润周围正常组织的癌细胞，和转移性(或继发性)肿瘤，即由恶性细胞形成的肿瘤，恶性细胞通过血流(血液扩散)或通过***或通过体腔(经体腔)循环到体内的其他部位和组织。特别地，本发明中使用的化合物可用于治疗转移和转移癌。
在一个实施方式中，血液***恶性肿瘤是白血病。在另一个实施方式中，血液***恶性肿瘤是淋巴瘤。在一个实施方式中，癌症是AML。在另一个实施方式中，癌症是CLL。
在一个实施方式中，本发明的化合物用于预防或治疗白血病，如急性或慢性白血病，具体地急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或慢性骨髓性白血病(CML)。在一个实施方式中，本发明的化合物用于预防或治疗淋巴瘤，如急性或慢性淋巴瘤，具体地伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤。
在一个实施方式中，本发明的化合物用于预防或治疗急性骨髓性白血病(AML)或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
在一个实施方式中，本发明的化合物用于预防或治疗血液恶性肿瘤(即白血病、淋巴瘤)和癌前血液疾病和临界恶性肿瘤疾病，包括血液恶性肿瘤和淋巴谱系的相关病症(例如急性淋巴细胞白血病)[ALL]、慢性淋巴细胞白血病[CLL]、B细胞淋巴瘤例如弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBCL]、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和白血病、自然杀伤[NK]细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、意义不明的单克隆丙种球蛋白病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后淋巴组织增生性疾病)，以及血液***恶性肿瘤和髓系相关疾病(例如急性髓性白血病[AML]、慢性髓性白血病[CML]、慢性粒单核细胞白血病[CMML]、嗜酸性粒细胞增多症、骨髓增殖性疾病，例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞白血病。
一个实施方式包括本发明中用于预防或治疗患者癌症的化合物，所述患者选自具有p53野生型或具有MDM2扩增的癌症的亚群体。
癌症可以是对用MDM2拮抗剂治疗敏感的癌症。癌症可以是MDM2表达过量的癌症。癌症可以是p53野生型的癌症。
具体的癌症包括具有MDM2扩增和/或MDM2表达过量的那些癌症，例如肝细胞癌、肺癌、肉瘤、骨肉瘤和霍奇金病。
特定的癌症包括具有野生型p53癌症。具体癌症包括具有野生型p53的那些癌细胞，特别是但不绝对的，如果MDM2高表达。
在一个实施方式中，癌症是p53功能性肿瘤。在一个实施方式中，这种待治疗的疾病是p53功能性实体和血液恶性肿瘤。在另一个实施方式中，待治疗的患者患有p53突变肿瘤，例如有p53突变肿瘤的AML患者。
在一个实施方式中，癌症是脑肿瘤，例如神经胶质瘤或神经母细胞瘤。
在一个实施方式中，癌症是皮肤癌，例如黑素瘤。
在一个实施方式中，癌症是肺癌，例如NSCLC或间皮瘤。在一个实施方式中，癌症是肺癌，例如间皮瘤。在一个实施方式中，间皮瘤是恶性腹膜间皮瘤或恶性胸膜间皮瘤。
在一个实施方式中，癌症是胃肠道癌，例如GIST、胃、结直肠或肠道癌。
在一个实施方式中，癌症是骨肉瘤。
在一个实施方式中，癌症是脂肪肉瘤。
在一个实施方式中，癌症是尤文氏肉瘤。
在一个实施方式中，癌症是脂肪肉瘤、软组织肉瘤、骨肉瘤、食道癌和某些儿科恶性肿瘤，包括B细胞恶性肿瘤。
在一个实施方式中，癌症是结肠直肠、乳腺、肺和脑。
在一个实施方式中，癌症是小儿癌症。
在一个实施方式中，癌症是为p53野生型。
在一个实施方式中，癌症是肺癌，例如NSCLC或间皮瘤、肾癌，例如KIRC或脑癌，例如胶质母细胞瘤。
在一个实施方式中，癌症是已知显示SKP2丢失的癌症。在一个实施方式中，癌症是脑癌、肾癌，例如透明细胞肾细胞癌(ccRCC)或KIRC、食道癌或黑色素瘤。
-在一个实施方式中，癌症是上皮起源的肿瘤；间质性肿瘤；中枢或外周神经***肿瘤；内分泌肿瘤；眼部和附件肿瘤；生殖细胞和滋养层肿瘤；儿童和胚胎肿瘤；或先天性或其他综合征，使患者易患恶性肿瘤。-在一个实施方式中，癌症是上皮起源的肿瘤；间质性肿瘤；中枢或外周神经***肿瘤；内分泌肿瘤；眼部和附件肿瘤；生殖细胞或滋养层肿瘤。
特定的癌症是否是对MDM2拮抗剂敏感的癌症可以通过题为“诊断方法”的部分中所阐述的方法来确定。
另外的方面提供了化合物用于制备用于治疗如本文所描述的疾病或病状，具体地癌症的药物的用途。
某些癌症对用特定药物治疗具有抗性。这可能是由于肿瘤的类型(最常见的上皮恶性肿瘤固有地具有化学抗性，而***对当前可用的化学治疗或放射治疗方案具有相对抗性)，或者随着疾病的进展或作为治疗的结果，抗性可能会自发产生。在这方面，对***的提及包括对抗雄激素治疗，具体地阿比特龙(abiraterone)或恩杂鲁胺(enzalutamide)具有抗性的***或去势抗性***。类似地，对多发性骨髓瘤的提及包括硼替佐米(bortezomib)不敏感的多发性骨髓瘤或难治性多发性骨髓瘤，并且对慢性骨髓性白血病的提及包括伊米替尼(imitanib)不敏感的慢性骨髓性白血病和难治性慢性骨髓性白血病。在这方面，对间皮瘤的提及包括对拓扑异构酶毒剂、烷化剂、抗微管蛋白剂、抗叶酸剂、铂化合物和放射治疗具有抗性的间皮瘤，特别是对顺铂(cisplatin)具有抗性的间皮瘤。
化合物还可以通过使细胞对化学治疗敏感并作为抗转移剂而可用于***生长、发病原、对化学治疗和放射治疗的抗性。
所有类型的治疗性抗癌干预必然会增加施加在靶肿瘤细胞上的压力。MDM2/p53的拮抗剂代表一类具有以下效力的化疗药物：(i)使恶性细胞对抗癌药物和/或治疗敏感；(ii)缓解或减少对抗癌药物和/或治疗的抗性的发生率；(iii)逆转对抗癌药物和/或治疗的抗性；(iv)增强抗癌药物和/或治疗的活性；(v)延迟或防止对抗癌药物和/或治疗的抗性的发生。
在一实施方式中，本发明提供了一种用于治疗由MDM2介导的疾病或病状的化合物。在进一步的实施方式中，由MDM2介导的疾病或病状是以MDM2表达过量和/或活性增加，或MDM2高拷贝数和/或野生型p53为特征的癌症。
另外的方面提供了化合物用于制备用于治疗如本文所描述的疾病或病状，具体地癌症的药物的用途。
在一个实施方式中，提供了一种用于预防或治疗由MDM2/p53介导的疾病或病状的化合物。在一个实施方式中，提供了一种用于抑制MDM2蛋白与p53之间的相互作用的化合物。
在一个实施方式中，提供了包括有效量的至少一种如所定义的化合物的药物组合物。
在一个实施方式中，提供了一种用于预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用包括至少一种如所定义的化合物的药物的步骤。
药物配方
虽然单独施用活性化合物是可能的，但活性化合物通常以药物组合物(例如，配方)的形式存在。
因此，本发明进一步提供如上所定义的试剂组合物，以及制造包括(例如混合)至少一种MDM2拮抗剂的试剂组合物的方法，包括公式(Io)的化合物(以及本文所定义的其亚组)，以及一种或多种药学上可接受的辅料和本文所述的其他可选的治疗或预防剂。
药学上可接受的赋形剂可以选自例如载体(例如，固体、液体或半固体载体)、佐剂、稀释剂、填充剂或膨胀剂、造粒剂、包衣剂、释放控制剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、悬浮剂、增稠剂、调味剂、甜味剂、掩味剂、稳定剂或试剂组合物中常规使用的任何其它赋形剂。下面更详细地阐述了用于各种类型的药物组合物的赋形剂的实施例。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内适用于与受试者(例如，人类受试者)的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏应答或其它问题或并发症、与合理的益处/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。在与配方的其它成分相容的意义上，每种赋形剂也必须是“可接受的”。
可以根据已知技术调配含有MDM2拮抗剂包括分子式(Io)化合物，的药物组合物，参见例如雷明顿氏药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》，马克出版公司(MackPublishing Company)，美国宾夕法尼亚州伊斯顿。
药物组合物可以呈适于口服、肠胃外、局部、鼻内、支气管内、舌下、眼、耳、直肠、***内或经皮施用的任何形式。在组合物旨在用于肠胃外施用时，可以将所述组合物调配用于静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下施用或通过注射、输注或其它递送方式直接递送到靶器官或组织中。可以通过团注、短期输注或长期输注并且可以通过被动递送或通过使用合适的输注泵或注射器驱动器进行递送。
适合肠胃外施用的试剂配方包括水性和非水性无菌注射溶液，所述溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、杀菌剂、共溶剂、表面活性剂、有机溶剂混合物、环糊精复合剂、乳化剂(用于形成和稳定乳液配方)、用于形成脂质体的脂质体组分、用于形成聚合凝胶的可胶凝聚合物、冻干保护剂以及用于尤其使活性成分以可溶形式稳定并使配方与预期接受者的血液等渗的试剂组合。肠胃外施用的试剂配方也可以采用水性和非水性无菌悬浮液的形式，所述悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂(R.G.Strickly，口服和可注射配方中的增溶赋形剂(Solubilizing Excipients in oral and injectable formulations)，《试剂研究(Pharmaceutical Research)》，2004年第21(2)卷，第201-230页)。
配方可以存在于单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿、小瓶和预填充注射器中，并且可以在仅需要在使用前一刻添加无菌液体载体，例如注射用水的冷冻干燥(冻干)条件下储存。在一个实施方式中，配方作为活性药物成分提供在瓶中，以便随后使用适当的稀释剂进行重构。
药物配方可以通过冻干MDM2拮抗剂，包括分子式(Io)的化合物或其亚组来进行制备。冻干是指使组合物冷冻干燥的程序。因此，冷冻干燥和冻干在本文中用作同义词。
临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。
用于肠胃外注射的本发明药物组合物还可以包括药学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液以及用于在使用前重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒剂的实施例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素和其合适的混合物、植物油(如葵花籽油、红花油、玉米油或橄榄油)和可注射有机酯，如油酸乙酯。可以例如通过使用如卵磷脂等增稠材料、通过在分散液的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
本发明的组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。还可以令人期望的是包括调节张度的试剂，如糖、氯化钠等。通过包括延迟吸收的如单硬脂酸铝和明胶等试剂可以实现可注射试剂形式的延长的吸收。
在本发明的一个典型实施方式中，药物组合物呈适于例如通过注射或输注静脉内施用的形式。对于静脉内施用，溶液可以按原样给药，或可以在施用前注射到输注袋(含有药学上可接受的赋形剂，如0.9％盐水或5％右旋糖)中。
在另一个典型实施方式中，药物组合物呈适于皮下(s.c.)施用的形式。
适于口服施用的药物剂型包括片剂(包衣或未包衣)、胶囊(硬壳或软壳)、囊片、丸剂、锭剂、糖浆、溶液、粉剂、颗粒剂、酏剂和悬浮剂、舌下片剂、薄片或贴剂，如口腔贴片。
因此，片剂组合物可以含有单位剂量的活性化合物以及惰性稀释剂或载体，如糖或糖醇，例如乳糖、蔗糖、山梨糖醇或甘露糖醇，和/或非糖衍生的稀释剂，如碳酸钠、磷酸钙、碳酸钙，或纤维素或其衍生物，如微晶纤维素(MCC)、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和淀粉，如玉米淀粉。片剂还可以含有标准成分，如粘合剂和造粒剂，如聚乙烯吡咯烷酮、崩解剂(例如，可溶胀交联聚合物，如交联羧甲基纤维素)、润滑剂(例如，硬脂酸盐)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸酯)、抗氧化剂(例如，BHT)、缓冲剂(例如，磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)和泡腾剂，如柠檬酸盐/碳酸氢盐混合物。此类赋形剂是众所周知的，并且无需在此详细讨论。
片剂可以被设计为在与胃液接触时释放药物(速释片剂)或在延长的时间段内或在GI道的特定区域以受控方式释放(控释片剂)。
胶囊配方可以属于硬明胶或软明胶种类，并且可以含有呈固体、半固体或液体形式的活性组分。明胶胶囊可以由动物明胶或其合成的或植物衍生的等同物形成。
固体剂型(例如，片剂、胶囊等)可以是包衣的或未包衣的。包衣既可以作为保护膜(例如，聚合物、蜡或清漆)，也可以作为用于控制药物释放或用于美学或鉴定目的的机制。包衣(例如，EudragitTM型聚合物)可以被设计为在胃肠道内的期望位置处释放活性组分。因此，包衣可以被选择成以在胃肠道内在某些pH条件下降解，由此在胃中或在回肠、十二指肠、空肠或结肠中选择性地释放化合物。
作为包衣的替代或除包衣之外，试剂可以存在于包括可以适于以受控方式在胃肠道中释放化合物的释放控制剂，例如释放延迟剂的固体基质中。可替代地，药物可以存在于可以适于在胃肠道中在不同酸度或碱度的条件下选择性地释放化合物的聚合物包衣，例如聚甲基丙烯酸酯聚合物包衣中。可替代地，基质材料或缓释包衣可以采用可侵蚀聚合物(例如，马来酸酐聚合物)的形式，在剂型穿过胃肠道时，所述可侵蚀聚合物基本上连续受到侵蚀。在另一个替代方案中，包衣可以设计成在肠道中在微生物作用下崩解。作为进一步的替代方案，活性化合物可以调配在提供对化合物的释放的渗透性控制的递送***中。渗透性释放和其它延迟释放或持续释放配方(例如，基于离子交换树脂的配方)可以根据本领域技术人员众所周知的方法来制备。
可以将MDM2拮抗剂，包括分子式(Io)化合物调配成具有载体并以纳米颗粒的形式施用，所述纳米颗粒的增加的表面积有助于所述化合物的吸收。另外，纳米颗粒提供了直接渗透到细胞中的可能性。纳米颗粒药物递送***在Ram B Gupta和Uday B.Kompella编辑的“用于药物递送的纳米颗粒技术(Nanoparticle Technology for Drug Delivery)”，英富曼卫生保健出版社(Informa Healthcare)，ISBN 9781574448573，2006年3月13日出版中进行了描述。用于药物递送的纳米颗粒还在《控制释放杂志(J.Control.Release)》，2003，91(1-2)，167-172和Sinha等人，《分子癌症治疗学(Mol.Cancer Ther.)》8月1日，(2006)5，1909中进行了描述。
药物组合物通常包括大约1％(w/w)到大约95％的活性成分和99％(w/w)到5％(w/w)的药学上可接受的赋形剂或赋形剂的组合。通常，药物组合物包括大约20％(w/w)到大约90％的活性成分和80％(w/w)到10％(w/w)的药学上可接受的一种赋形剂或多种赋形剂的组合。药物组合物包括大约1％到大约95％，通常大约20％到大约90％的活性成分。根据本发明的药物组合物可以是例如呈单位剂量形式，例如呈安瓿、小瓶、栓剂、预填充注射器、糖衣丸、片剂或胶囊的形式。
药学上可接受的赋形剂可以根据配方的期望物理形式进行选择，并且可以例如选自稀释剂(例如，固体稀释剂，如填充剂或膨胀剂；以及液体稀释剂，如溶剂和共溶剂)、崩解剂、缓冲剂、润滑剂、助流剂、释放控制剂(例如，缓释剂或延迟聚合物或蜡)、粘合剂、造粒剂、颜料、增塑剂、抗氧化剂、防腐剂、调味剂、掩味剂、张度调节剂和包衣剂。
技术人员将具有选择适当量的成分用于配方的专业知识。例如，片剂和胶囊通常含有0-20％崩解剂、0-5％润滑剂、0-5％助流剂和/或0-99％(w/w)填充剂/或膨胀剂(这取决于试剂剂量)。所述片剂和所述胶囊还可以含有0-10％(w/w)聚合物粘合剂、0-5％(w/w)抗氧化剂、0-5％(w/w)颜料。缓释片剂将另外含有0-99％(w/w)聚合物(这取决于剂量)。片剂或胶囊的薄膜包衣通常含有0-10％(w/w)控释(例如，延迟)聚合物、0-3％(w/w)颜料和/或0-2％(w/w)增塑剂。
肠胃外配方通常含有0-20％(w/w)缓冲剂、0-50％(w/w)助溶剂和/或0-99％(w/w)注射用水(WFI)(这取决于剂量和是否冻干)。用于肌肉内贮库的配方也可以含有0-99％(w/w)油。
用于口服施用的药物组合物可以通过以下来获得：将活性成分与固体载体组合；如果需要的话，将所产生的混合物制粒；并且如果需要或必要的话，在加入适当的赋形剂后将混合物加工成片剂、糖衣丸芯或胶囊。所述药物组合物也可以并入允许活性成分以测得量扩散或释放的聚合物或蜡质基质中。
本发明用于化合物也可以被调配为固体分散体。固体分散体是两种或更多种固体的均匀极细分散相。固溶体(分子分散***)是一种固体分散体，众所周知其用于制药技术(参见Chiou和Riegelman，《药物科学杂志(J.Pharm.Sci.，60，1281-1300(1971))并且可用于提高溶解速率和提高水溶性差的药物的生物利用度。
本发明还提供了包括本文所描述的固溶体的固体剂型。固体剂型包括片剂、胶囊、咀嚼片和可分散或泡腾片。已知的赋形剂可以与固溶体共混以提供期望的剂型。例如，胶囊可以含有与(a)崩解剂和润滑剂或(b)崩解剂、润滑剂和表面活性剂共混的固溶体。另外，胶囊可以含有膨胀剂，如乳糖或微晶纤维素。片剂可以含有与至少一种崩解剂、润滑剂、表面活性剂、膨胀剂和助滑剂共混的固溶体。咀嚼片可以含有与膨胀剂、润滑剂和如果需要的话，另外的甜味剂(如人造甜味剂)和合适的调味剂共混的固溶体。固溶体也可以通过将药物和合适的聚合物的溶液喷洒到惰性载体，如糖珠(“非粉末(non-pareil)”)的表面上来形成。随后可以将这些珠填充到胶囊中或压制成片剂。
药物配方可以以在单个包装，通常是泡罩包中含有整个治疗过程的“患者包”的形式呈递给患者。与传统处方相比，患者包具有优点，在所述传统处方中，试剂师将患者的药物供应与散装供应分开，因为患者始终可以获得患者包中所含有的包装说明书，而所述包装说明书通常在患者处方中缺失。已经示出包括包装说明书可提高患者对医师的指示的依从性。
用于局部使用和鼻腔递送的组合物包括软膏、乳膏、喷雾剂、贴剂、凝胶、液滴和***物(例如，眼内***物)。此类组合物可以根据已知方法调配。
用于直肠或***内施用的配方的实施例包括子宫托和栓剂，它们可以例如由含有活性化合物的成型的可模压或蜡型材料形成。活性化合物的溶液也可以用于直肠施用。
用于通过吸入施用的组合物可以采用可吸入粉末组合物或液体或粉末喷雾剂的形式，并且可以使用粉末吸入器装置或气雾剂分配装置以标准形式施用。此类装置是众所周知的。对于通过吸入施用，粉末配方通常包括活性化合物以及惰性固体粉末稀释剂，如乳糖。
MDM2拮抗剂，包括式(Io)化合物，通常以单位剂量形式存在，因此通常含有足够的化合物以提供所需水平的生物活性。例如，配方可以含有1纳克到2克活性成分，例如，1纳克到2毫克活性成分。在这些范围内，化合物的特定子范围是0.1毫克到2克活性成分(更通常的是10毫克到1克，例如50毫克到500毫克)，或1微克到20毫克(例如1微克到10毫克，例如0.1毫克到2毫克活性成分)。
对于口服组合物，单位剂型可以含有1毫克到2克，更通常地10毫克到1克，例如50毫克到1克，例如100毫克到1克活性化合物。
活性化合物将以足以实现期望治疗效果的量施用于有需要的患者(例如，人类或动物患者)。
与其他抗癌试剂组合使用
如本文所定义的MDM2拮抗剂可用于预防或治疗由MDM2/p53介导的一系列疾病状态或病状。此类疾病状态和病状的实施例在上文中进行了阐述。
化合物通常施用于需要此种施用的受试者，例如人类或动物患者，通常是人类。
化合物将通常以治疗或预防有用且通常无毒的量施用。然而，在某些情况下(例如，在危及生命的疾病的情况下)，施用式(Io)化合物的益处可能超过任何毒性或副作用的缺点，在这种情况下，可能认为需要以与毒性程度相关的量施用化合物。
化合物可以在延长的时期内施用以维持有益的治疗效果，或者可以仅施用持续较短时间段。可替代地，所述化合物可以以连续方式或以提供间歇给药的方式(例如，脉动方式)施用。
MDM2拮抗剂的典型日剂量可以为每千克体重100皮克到100毫克，更典型地为每千克体重5纳克到25毫克，更通常地为每千克10纳克到15毫克(例如10毫微克至10毫克，更典型地为每公斤1微克至每公斤20毫克，例如每公斤1微克至10毫克)，尽管在需要时可以施用更高或更低的剂量。分子式(Io)的化合物可以每天给药或例如每2、或3、或4、或5、或6、或7、或10或14、或21、或28天重复给药。
剂量也可以表示为相对于患者体表面积施用的药物量(mg/m2)。MDM2拮抗剂的典型日剂量可以在3700pg/m2至3700mg/m2的范围内，更典型地为185ng/m2至925mg/m2，更通常地为370ng/m2至555mg/m2(例如，370ng/m2至370mg/m2，更典型地37mg/m2至740mg/m2，例如37mg/m2至370mg/m2)，尽管需要时可较高或较低剂量。例如，式(Io)中所用的化合物可以每天给药或每2、或3、或4、或5、或6、或7、或10、或14、或21、或28天重复给药。
本发明中使用的化合物可以采用一系列剂量口服给药，例如，0.1至5000mg，或1至1500mg、2至800mg或5至500mg，例如，2至200mg或10至1000mg，剂量的具体实施例包括10、20、50和80mg。该化合物可以每天给药一次或多于一次。该化合物可以连续给药(即在治疗方案的持续期间每天服用不间断)。或者，化合物可以间歇给药(在连续服用一段给定时间如一周，然后停药一段时间如一周，然后再连续服用一段时间如一周，在整个治疗期间方案如此类推)。涉及间歇给药的治疗方案的实施例包括，其中施用周期中为一周用、一周停的的方案；或两周用，一周停；或三周用，一周停；或者两周用，两周停；或四周用两周停；或一周用三周停-这样进行一个或多个周期，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个周期。这种不连续的治疗也可以基于天数而不是一整周。例如，治疗可以包括每日给药持续1至6天，不给药持续1至6天，在治疗方案期间重复这种模式。未给药本发明所用化合物的天数(或周数)不一定必须等于给药本发明所用化合物的天数(或周数)。
在一个实施方式中，本发明的化合物可以每天3mg/m2至125mg/m2的量施用。治疗可以采用连续的每日给药或更通常由治疗中断隔开的多个治疗周期组成。单个治疗周期的一个实施例是连续5次每日给药，随后3周不进行治疗。
一种特定的给药方案是每天一次(例如口服)，持续一周(例如治疗5天)，然后有一个1、2或3周的治疗中断。另一种给药方案是每周一次(例如口服)，持续1、2、3或4周。
在一个特定的给药方案中，将向患者输注分子式(Io)的化合物，每天一小时，持续最多十天，特别地一周最多五天，并且治疗以合适的间隔重复，例如两到四个星期，特别地是每三个星期一次。
更具体地，患者可以每天输注式(Io)化合物一小时，持续5天，并且每三周重复一次治疗。
在另一个特定的给药方案中，给予患者输注30分钟至1小时的，随后进行维持输注，输注时间可变，例如1至5小时，例如3小时。
本发明中使用的化合物也可以通过推注或连续输注给药。在治疗周期中，本发明中使用的化合物可以每日给药至每周一次、或每两周一次、或每三周一次、或每四周一次给予。如果在治疗周期期间每天给药，则该每日给药的治疗可以在所述治疗周期中的数周内中断：例如，一周给药(或数天)，然后一周不给药(或数天)，该模式在治疗周期中不断重复。
在进一步的具体的给药方案中，给予患者12小时至5天的连续输注，特别地24小时至72小时的连续输注。
最后，然而所施用的化合物的量和所使用的组合物的类型要与所治疗的疾病或生理条件的性质相称，并且由医师判断。
将本发明的化合物作为单用试剂，或将本发明的化合物组合通过不同机制起作用以调节细胞生长的另一种试剂，来治疗癌症发展的两个特性特征，可能是可获益的。可以进行组合实验，例如，如Chou TC、Talalay P.剂量-效应关系的定量分析：多种药物或酶抑制剂的组合效应(Quantitative analysis of dose-effect relationships：the combinedeffects of multiple drugsor enzyme inhibitors).《酶调节进展(Adv EnzymeRegulat)》1984；22：27-55中所描述的。
如本文所定义的化合物可以作为唯一的治疗剂施用，或者所述化合物可以以与用于治疗特定的疾病状态，例如肿瘤性疾病，如上文所定义的癌症的一种或多种其它化合物(或治疗)的组合治疗施用。为了治疗上述病状，在癌症治疗中本发明的化合物可以有利地与一种或多种其它试剂组合，更具体地与其它抗癌试剂或辅助试剂(治疗中的支持性试剂)。可以与MDM2拮抗剂一起(无论是否同时施用或以不同的时间间隔施用)施用的其它治疗试剂或治疗的实施例，包括但不限于：
·拓扑异构酶I抑制剂；
·抗代谢物；
·微管蛋白靶向试剂
·DNA结合剂和拓扑异构酶II抑制剂
·烷化剂
·单克隆抗体.
·抗荷尔蒙
·信号转导抑制剂
·蛋白酶体抑制剂
·DNA甲基转移酶抑制剂
·细胞因子和维甲酸
·染色质靶向治疗
·放射治疗；和，
·其它治疗或预防剂。
抗癌试剂或辅助试剂(或其盐)的具体实施例包括但不限于选自以下组(i)-(xlviii)任选地组(xlix)中的任何试剂：
(i)铂化合物，例如顺铂(任选与氨磷汀组合)、卡铂或奥沙利铂；
(ii)紫杉烷化合物，例如紫杉醇、紫杉醇蛋白结合颗粒(AbraxaneTM)、多西他赛、卡巴他赛或拉罗他赛；
(iii)拓扑异构酶I抑制剂，例如喜树碱化合物，例如喜树碱、伊立替康(CPT11)、SN-38或拓扑替康；
(iv)拓扑异构酶II抑制剂，例如抗肿瘤表鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，例如依托泊苷、或替尼泊苷；
(v)长春花生物碱，例如长春碱、长春新碱、脂质体长春新碱(Onco-TCS)、长春瑞滨、长春地辛、长春氟宁或长春新碱；
(vi)核苷衍生物，例如5-氟尿嘧啶(5-FU，任选与亚叶酸组合)、吉西他滨、卡培他滨、替加氟、UFT、S1、克拉屈滨、阿糖胞苷(Ara-C，阿糖胞苷)、氟达拉滨、氯法拉滨或奈拉滨；
(vii)抗代谢物，例如氯法拉滨、氨基蝶呤(aminopterin)或甲氨蝶呤(methotrexate)、阿扎胞苷(azacitidine)、阿糖胞苷、氟尿苷(floxuridine)、喷司他丁(pentostatin)、硫鸟嘌呤、硫嘌呤、6-巯基嘌呤、或羟基脲(羟基尿素)；
(viii)烷基化剂，例如氮芥或亚硝基脲，例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀(BCNU)、苯达莫司汀、噻替帕、美法仑、曲硫丹、洛莫司汀(CCNU)、阿曲他明、白消安、达卡巴嗪、雌莫司汀、氟莫司汀、异环磷酰胺(任选与美司钠组合)、哌泊溴曼、丙卡巴肼、链脲佐菌素、替莫唑胺、尿嘧啶、甲氯乙胺、甲基环己基氯乙基亚硝基脲或尼莫司汀(ACNU)；
(ix)蒽环类、蒽二酮类和相关药物，例如柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)(任选地与右雷佐生(dexrazoxane)组合)、多柔比星的脂质体配方(例如，CaelyxTM、MyocetTM、DoxilTM)、伊达比星(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、表柔比星(epirubicin)、安吖啶(amsacrine)或戊柔比星(valrubicin)；
(x)埃坡霉素，例如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕土匹龙(patupilone)、BMS-310705、KOS-862和ZK-EPO，埃坡霉素A、埃坡霉素B、脱氧埃坡霉素B(也被称为埃坡霉素D或KOS-862)、氮杂埃坡霉素B(也被称为BMS-247550)、奥立马利(aulimalide)、异奥立马利(isolaulimalide)或吕瑟罗宾(luetherobin)；
(xi)DNA甲基转移酶抑制剂，例如替莫唑胺、氮杂胞苷或地西他滨；
(xii)抗叶酸剂，例如甲氨蝶呤、培美曲塞二钠或雷替曲塞；
(xiii)细胞毒性抗生素，例如抗霉素D、博来霉素、丝裂霉素C、放线菌素、胭脂红霉素、道诺霉素、左旋咪唑、普卡霉素或光神霉素；
(xiv)微管蛋白结合剂，例如考布他汀(combrestatin)、秋水仙碱(colchicine)或诺考达唑(nocodazole)；
(xv)信号转导抑制剂，例如激酶抑制剂，例如受体酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR(上皮生长因子受体)抑制剂、VEGFR(血管内皮生长因子受体)抑制剂、PDGFR(血小板衍生生长因子受体)抑制剂、Axl抑制剂、MTKI(多靶点激酶抑制剂)、Raf抑制剂、ROCK抑制剂、mTOR抑制剂、MEK抑制剂或PI3K抑制剂)例如甲磺酸伊马替尼、厄洛替尼、吉非替尼、达沙替尼、拉帕替尼、多沃替尼、阿西替尼、尼罗替尼、凡德他尼、瓦他利尼、帕唑帕尼、索拉非尼、舒尼替尼、西罗莫司、依维莫司(RAD 001)、威罗非尼(PLX4032或RG7204)、达拉非尼、恩科拉非尼、司美替尼(AZD6244)、曲美替尼(GSK121120212)、达托利塞(BEZ235)、布帕尼西(BKM-120；NVP-BKM-120)、BYL719、库潘利塞(BAY-80-6946)\ZSTK-474、CUDC-907、阿哌利塞(GDC-0980；RG-7422)、皮克利塞(pictilisib/pictrelisib、GDC-0941、RG-7321)、GDC-0032、GDC-0068、GSK-2636771、艾代拉里斯(原CAL-101、GS1101、GS-1101)、MLN1117(INK1117)、MLN0128(INK128)、IPI-145(INK1197)、LY-3023414、帕他色替、阿氟色替、MK-2206、MK-8156、LY-3023414、LY294002、SF1126或PI-103、索诺利塞(PX-866)或AT13148。
(xvi)极光激酶抑制剂，例如AT9283、巴拉塞替(AZD1152)、TAK-901、MK0457(VX680)、cenisertib(R-763)、达努塞替(PHA-739358)、阿立塞替(MLN-8237)或MP-470；
(xvii)CDK抑制剂，例如AT7519、劳斯考文汀(roscovitine)、塞利西利(seliciclib)、阿洛西迪布(alvocidib)(夫拉平度(flavopiridol))、地那昔利布(dinaciclib)(SCH-727965)、7-羟基星形孢菌素(UCN-01)、JNJ-7706621、BMS-387032(也就是SNS-032)、PHA533533、ZK-304709或AZD-5438，包括CDK4抑制剂，如帕博西尼(palbociclib)(PD332991)和瑞博西利布(ribociclib)(LEE-011)；
(xviii)PKA/B抑制剂和PKB(akt)通路抑制剂，例如AT13148、AZ-5363、Semaphore、SF1126和MTOR抑制剂，例如雷帕霉素类似物、AP23841和AP23573、钙调蛋白抑制剂(叉头易位抑制剂)、API-2/TCN(曲克立宾)、RX-0201、恩扎妥林HCl(LY317615)、NL-71-101、SR-13668、PX-316或KRX-0401(哌立福新/NSC 639966)；
(xix)Hsp90抑制剂，例如欧娜莱斯布(onalespib)(AT13387)、除莠霉素(herbimycin)、格尔德霉素(geldanamycin)(GA)、17-烯丙氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)，例如NSC-330507、Kos-953和CNF-1010、17-二甲氨基乙基氢氯化物-17-去甲氧基格尔德霉素盐酸盐(17-DMAG)，例如NSC-707545和Kos-1022、NVP-AUY922(VER-52296)、NVP-BEP800、CNF-2024(BIIB-021，口服嘌呤)、甘乃特斯皮布(ganetespib)(STA-9090)、SNX-5422(SC-102112)或IPI-504；
(xx)单克隆抗体(未偶联或偶联放射性同位素、毒素或其他试剂)、抗体衍生物和相关试剂，例如抗CD、抗VEGFR、抗HER2或抗EGFR抗体，例如利妥昔单抗(CD20)、奥法木单抗(CD20)、替伊莫单抗(CD20)、GA101(CD20)、托西莫单抗(CD20)、依帕珠单抗(CD22)、林妥珠单抗(CD33)、吉妥单抗(CD33)、阿仑单抗(CD52)、加利昔单抗(CD80)、曲妥珠单抗(HER2抗体)、帕妥珠单抗(HER2)、曲妥珠单抗-DM1(HER2)、厄妥索单抗(HER2和CD3)、西妥昔单抗(EGFR)、帕尼单抗(EGFR)、耐昔妥珠单抗(EGFR)、尼妥珠单抗(EGFR)、贝伐珠单抗(VEGF)、卡妥索单抗(EpCAM和CD3)、阿巴伏单抗(CA125)、法妥组单抗(叶酸受体)、依托珠单抗(CS1)、地诺单抗(RANK配体)、芬妥木单抗(IGF1R)、CP751、871(IGF1R)、马帕木单抗(TRAIL受体)、metMAB(met)、米妥莫单抗(GD3神经节苷脂))、萘妥昔单抗(埃托-那普妥莫单抗)(5T4)或西妥昔单抗(IL6)或免疫调节剂，例如CTLA-4阻断抗体和/或针对PD-1和PD-L1和/或PD-L2的抗体，例如，伊匹木单抗(CTLA4)、MK-3475(派姆单抗，以前称为lambrolizumab，抗-PD-1)、纳武单抗(一种抗-PD-1)、BMS-936559(抗-PD-L1)、MPDL320A、AMP-514或MEDI4736(抗-PD-L1)、或替西木单抗(原为ticilimumab、CP-675、206，抗-CTLA-4)；
(xxi)***受体拮抗剂或选择性***受体调节剂(SERM)或***合成抑制剂，例如他莫昔芬(tamoxifen)、氟维司群(fulvestrant)、托瑞米芬(toremifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、法洛德(faslodex)或雷洛昔芬(raloxifene)；
(xxii)芳香酶抑制剂及相关药物，如依西美坦、阿那曲唑、来曲唑、睾内酯氨基谷氨酰胺、米托坦或伏罗唑；
(xxiii)抗雄激素(即，雄激素受体拮抗剂)和相关试剂，例如比卡鲁胺(bicalutamide)、尼鲁他胺(nilutamide)、氟他胺(flutamide)、环丙孕酮(cyproterone)或酮康唑(ketoconazole)；
(xxiv)激素和其类似物，如甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)(又名乙芪酚)或奥曲肽(octreotide)；
(xxv)类固醇，例如丙酸屈莫他酮(dromostanolone propionate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、诺龙(nandrolone)(癸酸酯、苯丙酸酯)、氟甲雌酮(fluoxymestrone)或棉酚(gossypol)；
(xxvi)甾体细胞色素P450 17α-羟化酶-17，20-裂解酶抑制剂(CYP17)，例如阿比特龙(abiraterone)；
(xxvii)***释放激素激动剂或拮抗剂(GnRA)，例如阿巴瑞克(abarelix)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸组瑞林(histrelin acetate)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、曲普瑞林(triptorelin)、布舍瑞林(buserelin)或地洛瑞林(deslorelin)；
(xxviii)糖皮质激素，例如***(prednisone)、***龙(prednisolone)或***(dexamethasone)；
(xxix)分化剂，例如类视黄醇(retinoids)、类维甲酸(rexinoids)、维生素D(vitamin D)或视黄酸(retinoic acid)和视黄酸代谢阻断剂(RAMBA)，例如维甲酸(accutane)、阿利维甲酸(alitretinoin)、贝沙罗汀(bexarotene)或维甲酸(tretinoin)；
(xxx)法呢基转移酶抑制剂，例如替比法尼(tipifarnib)；
(xxxi)染色质靶向治疗，如组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，例如丁酸钠、辛二酰苯胺异羟酰胺酸(SAHA)、缩酚酸肽(FR 901228)、达西司他(dacinostat)(NVP-LAQ824)、R306465/JNJ-16241199、JNJ-26481585、曲古菌素A(trichostatin A)、伏立诺他(vorinostat)、衣原体(chlamydocin)、A-173、JNJ-MGCD-0103、PXD-101或制牙菌素(apicidin)；
(xxxii)靶向泛素-蛋白酶体通路的药物，包括蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米、卡非佐米、CEP-18770、MLN-9708或ONX-0912；NEDD8抑制剂；HDM2拮抗剂和去泛素酶(DUB)；
(xxxiii)光动力学药物，例如卟啉钠(porfimer sodium)或替莫泊芬(temoporfin)；
(xxxiv)海洋生物衍生的抗癌剂，如曲布替丁(trabectidin)；
(xxxV)用于放射免疫治疗的放射性标记药物，例如使用发射β粒子的同位素(例如，碘-131，钇-90)或发射α粒子的同位素(例如铋-213或锕-225)，例如替伊莫单抗或碘和托西莫单抗或α镭223；
(xxxvi)端粒酶抑制剂，例如端粒抑素；
(xxxvii)基质金属蛋白酶抑制剂，例如巴蒂马斯塔(batimastat)、马里马司他(marimastat)、百武斯德他(prinostat)或酶特斯他(metastat)；
(xxxviii)重组干扰素(如干扰素-γ和干扰素α)和白介素(例如，白介素2)，例如阿地白介素(aldesleukin)、地尼白介素(denileukin diftitox)、干扰素α 2a、干扰素α 2b或聚乙二醇干扰素α2b；
(xxxix)选择性免疫应答调节剂，例如里多巴胺(thalidomide)或来那多胺(1enalidomide)；
(xl)治疗性疫苗，诸如sipuleucel-T(Provenge)或OncoVex等；
(xli)细胞因子激活剂，包括哌替巴尼(picibanil)、罗默肽(romurtide)、西佐非仑(sizofiran)、病毒素(virulizin)或胸腺素(thymosin)；
(xlii)三氧化二砷；
(xliii)G-蛋白偶联受体(GPCR)抑制剂，例如阿曲生坦(atrasentan)；
(xliv)酶，如L-天冬酰胺酶、聚乙二醇化酶、拉布立酶或聚乙二醇化酶；
(xlv)DNA修复抑制剂，例如PARP抑制剂，例如奥拉帕尼、维拉帕尼、伊尼帕尼、INO-1001、AG-014699或ONO-2231；
(xlvi)死亡受体激动剂(例如，TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体)，如马帕姆单抗(mapatumumab)(原名HGS-ETR1)、康珠单抗(conatumumab)(原名AMG 655)、PR095780、来沙木单抗(1exatumumab)、度拉纳明(dulanermin)、CS-1008、阿陂马单抗(apomab)或重组TRAIL配体，如重组人TRAIL/Apo2配体；
(xlvii)免疫治疗诸如免疫检查点抑制剂；癌症疫苗和CAR-T细胞治疗；
(xlviii)细胞死亡(凋亡)调节剂，包括Bcl-2(B细胞淋巴瘤2)拮抗剂，如维奈托克试剂(venetoclax)(ABT-199或GDC-0199)、ABT-737、ABT-263、TW-37、沙布托克(sabutoclax)、奥布托克(obatoclax)和MIM1和IAP拮抗剂，包括LCL-161(诺华试剂(Novartis))、Debio-1143(德铂菲玛(Debiopharma)/阿森纳(Ascenta))、AZD5582、比里纳潘特(Birinapant)/TL-32711(四联症(TetraLogic))、CUDC-427/GDC-0917/RG-7459(Genentech)、JP1201(Joyant)、T-3256336(Takeda)、GDC-0152(Genentech)或HGS-1029/AEG-40826(HGS/Aegera)；
(xlix)预防剂(辅助剂)；即减少或缓解与化学治疗试剂相关的一些副作用的试剂，例如
-止吐剂；
-防止或缩短化学治疗相关的中性粒细胞减少症持续时间并防止因血小板、红细胞或白细胞水平降低而引起的并发症的试剂，例如白细胞介素-11(例如奥普瑞白介素)、***(EPO)及其类似物(如达贝泊汀α)、集落刺激因子类似物，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(例如，沙格司亭(sargramostim))，和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及其类似物(例如，斐格司汀(filgrastim)、聚乙二醇斐格司汀(pegfilgrastim)、
-抑制骨吸收的试剂，例如狄诺塞麦(denosumab)或双膦酸盐，例如唑来膦酸(zoledronate)、唑来膦酸(zoledronic acid)、帕米膦酸(pamidronate)或伊班膦酸(ibandronate)；
-抑制炎性应答的试剂，如***、***或***龙；
-用于降低患有肢端肥大症或其它罕见激素产生肿瘤的患者的生长激素和IGF-I(和其它激素)的血液水平的试剂，例如激素生长抑素激素的合成形式，例如醋酸奥曲肽(octreotide acetate)；
-降低叶酸水平的药物的解毒剂，如甲酰四氢叶酸(leucovorin)或亚叶酸(folinic acid)；
-止痛剂，例如阿片类，如***(morphine)、二***(diamorphine)和芬太尼(fentanyl)；
-非甾体抗炎药(NSAID)，如COX-2抑制剂，例如塞来昔布(celecoxib)、依托考昔(etoricoxib)和罗美昔布(lumiracoxib)；
-用于粘膜炎的试剂，例如帕利夫明(palifermin)；
-用于治疗副作用，包括厌食、恶病质、水肿或血栓栓塞发作的试剂，如醋酸甲地孕酮。
在一个实施方式中，本发明的SKP2生物标志物可用于选择用MDM2拮抗剂与上述(i)-(xlix)中列出的一种或多种试剂组合治疗的患者。在一个实施方式中，本发明的SKP2生物标志物可用于选择用MDM2拮抗剂与重组干扰素、DNA修复抑制剂如PARP抑制剂组合治疗的患者；IAP拮抗剂；铂化合物；烷基化剂和/或放射治疗。
在一个实施方式中，由于存在正常或高水平的SKP2，患者的肿瘤被确定不适合用单一试剂MDM2抑制剂治疗，因此患者可以用MDM2抑制剂与可用于引起对MDM2拮抗剂敏感性的其他试剂组合治疗。在一个实施方式中，患者的肿瘤被确定为SKP2正常或高，并用MDM2拮抗剂与另外的抗癌剂组合治疗。在一个实施方式中，确定患者的肿瘤具有SKP2存在和/或正常水平或高水平的SKP2基因表达，并用MDM2拮抗剂与上述(i)-(xlix)中所列的一种或多种试剂组合治疗。
在一个实施方式中，SKP2可用于选择用MDM2拮抗剂与上述一种或多种试剂(i)-(xlix)组合治疗的患者。
在一个实施方式中，SKP2可用于选择用MDM2拮抗剂与一种或多种重组干扰素(例如干扰素-γ和干扰素α)和白细胞介素(例如白介素2)组合治疗的患者，例如阿尔德白介素、地高辛、干扰素α2a、干扰素α2b或聚乙二醇干扰素α2b。在一个实施方式中，患者的肿瘤被确定为SKP2正常或高，并用MDM2拮抗剂与一种或多种重组干扰素组合治疗。
在一个实施方式中，SKP2可用于选择用MDM2拮抗剂与DNA修复抑制剂(如PARP抑制剂)组合治疗的患者，例如奥拉帕利、维拉帕利、伊尼帕利、INO-1001、AG-014699或ONO-2231。在一个实施方式中，患者的肿瘤被确定为SKP2正常或高，并用MDM2拮抗剂与PARP抑制剂组合治疗。在一个实施方式中，PARP抑制剂例如选自奥拉帕利、鲁卡帕利、韦利帕利、伊尼帕利、INO-1001、AG-014699、ONO-2231和塔拉扎帕利。
在一个实施方式中，SKP2可用于选择与IAP拮抗剂组合使用MDM2拮抗剂治疗的患者，所述IAP拮抗剂包括LCL-161(诺华)、Debio-1143(Debiopharma/Acenta)(xevinapant)、AZD5582、Birinapant/TL-32711(TetraLogic)、CUDC-427/GDC-917/RG-7459(Genentech)、JP1201(Joyant)、T-3256336(Takeda)、GDC-0152(Genenteh)或HGS-1029/AEG-40826(HGS/Aegera)。在一个实施方式中，患者的肿瘤被确定为SKP2正常或高，并用MDM2拮抗剂与IAP拮抗剂组合治疗。在一个实施方式中，1AP拮抗剂例如选自LCL-161(诺华)、Debio-1143(Debiopharma/Assenta)、AZD5582、Birinapant/TL-32711(TetraLogic)、CUDC-427/GDC-0917/RG-7459(Genentech)、JP1I201(Joyant)、T-3256336(Takeda)、GDC-0152(Genenteh)、ASTX660(tolinapant)和HGS-1029/AEG-40826(HGS/Aegera)。在一个实施方式中，IAP拮抗剂包括Debio-4028或Ascentage IAP抑制剂APG-1387。在一个实施方式中，确定患者的肿瘤具有正常或高水平的SKP2，并用MDM2拮抗剂与IAP拮抗剂组合治疗。
在一个实施方式中，SKP2可用于选择用MDM2拮抗剂与铂化合物组合治疗的患者，例如顺铂(可选地与阿米福汀组合)、卡铂或奥沙利铂；烷化剂，如氮芥或亚硝脲，例如环磷酰胺、氯氰菊酯、卡莫司汀(BCNU)、苯达莫司汀、噻替帕、美法仑、苏消安、洛莫司汀(CCNU))、阿替拉敏、白消安、达卡巴嗪、埃斯特拉莫司汀、氟替莫司汀和异环磷酰胺(任选与美司那组合使用)、哌波隆、普鲁卡嗪、链脲霉素、替莫唑胺、尿嘧啶、甲***、甲基环己基氯乙基亚硝脲或尼莫司汀(ACNU)和/或放射治疗。在一个实施方式中，患者的肿瘤被确定为SKP2正常或高，并用MDM2拮抗剂与铂化合物(例如顺铂(可选地与阿米福汀结合)、卡铂或奥沙利铂)组合治疗；烷化剂，如氮芥或亚硝脲，例如环磷酰胺、氯氰菊酯、卡莫司汀(BCNU)、苯达莫司汀、噻替帕、美法仑、苏消安、洛莫司汀(CCNU))、阿替拉敏、白消安、达卡巴嗪、埃斯特拉莫司汀、氟替莫司汀和异环磷酰胺(任选与美司那组合使用)、哌波隆、普鲁卡嗪、链脲霉素、替莫唑胺、尿嘧啶、甲***、甲基环己基氯乙基亚硝脲或尼莫司汀(ACNU)和/或放射治疗。在一个实施方式中，铂化合物选自，例如顺铂(任选地与氨磷汀(amifostine)组合)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、双环铂(dicycloplatin)、七铂(heptaplatin)、洛铂(lobaplatin)、奈达铂(nedaplatin)、沙铂(satraplatin)或四硝酸三铂(triplatintetranitrate)，具体地顺铂、卡铂或奥沙利铂；在一个实施方式中，烷化剂，例如氮芥(nitrogen mustard)或亚硝基脲(nitrosourea)，是选自例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、氨莫司汀(ambamustine)、苯达莫司汀(bendamustine)、噻替哌(thiotepa)、美法仑(melphalan)、苏消安(treosulfan)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、白消安(busulfan)、达卡巴嗪(dacarbazine)、雌莫司汀(estramustine)、福莫司汀(fotemustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)(任选地与美司钠(mesna)组合)、哌柏溴烷(pipobroman)、丙卡巴肼(procarbazine)、链脲佐菌素(streptozocin)、替莫唑胺(temozolomide)、尿嘧啶(uracil)、甲氯乙胺(mechlorethamine)、盐酸甲氯乙胺(mechlorethamine oxide hydrochloride)、甲基环己基氯乙基亚硝基脲(methylcyclohexylchloroethylnitrosurea)、尼莫司汀(nimustine)(ACNU)、泼尼莫司汀(prednimustine)、甲氯乙胺(meclorethamine)、依托糖苷(etoglucid)；链脲佐菌素(streptozotocin)、伊洛福芬(irofulven)、二溴卫矛醇(mitolactol)、葡磷酰胺(glufosfamide)、依磷环磷酰胺(evofosfamide)、乙烯亚胺(ethylenimines)或甲基三聚氰胺(methylamelamines)()，包括六甲三聚氰胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)或三羟甲基三聚氰胺(trimemylolomelamine)；在一个实施方式中，本发明的SKP2生物标志物可用于选择用MDM2拮抗剂与放射治疗组合治疗的患者。在一个实施方式中，患者的肿瘤被确定为SKP2正常或高水平，并使用MDM2拮抗剂组合放射治疗进行治疗。
在另一个实施方式中，提供了一种治疗患者癌症的方法，其中所述方法包括选定一个患者的步骤：
(a)在从所述患者获得的生物样品中具有正常或高水平的SKP2；和
(b)向步骤(a)中选择的所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂和例如通过降低SKP2水平来诱导对MDM2拮抗药的敏感性的试剂。
在一个实施方式中，诱导敏感性例如降低SKP2水平的试剂或治疗是抗癌试剂或治疗。在一个实施方式中，诱导敏感性(如降低SKP2水平)的制剂或治疗方法是重组干扰素(如干扰素-γ和干扰素α)和白介素(如白介素2)，如醛白素、德尼罗金diftitox、干扰素α2a、干扰素α2b或聚乙二醇干扰素α2b，或DNA修复抑制剂，如PARP抑制剂，或IAP拮抗剂或铂化合物，如顺铂(可与阿米福汀联合使用)、卡铂或奥沙利铂；烷基化剂，如氮芥或亚硝基脲，如环磷酰胺、氯霉素、卡莫司汀(BCNU)、苯达莫司汀、硫代替帕、美法兰、曲磺胺、洛莫司汀(CCNU)、阿曲胺、布苏凡、达卡巴嗪、埃斯特拉姆斯汀、氟替莫司汀、异环磷酰胺(可选与美沙那组合使用)、哌波溴曼、丙卡嗪、链霉素、替莫唑胺、尿嘧啶、氯苯甲胺、甲基环己基氯乙基硝基脲或尼莫司汀(ACNU)，和/或放疗。
在一个实施方式中，诱导敏感性(例如降低SKP2水平)的试剂或治疗选自重组干扰素和白细胞介素、DNA修复抑制剂、IAP拮抗剂或铂化合物。在一个实施方式中，诱导敏感性(例如降低SKP2水平)的试剂或治疗是IAP拮抗剂。
在一个实施方式中，引发细胞凋亡的试剂或治疗是一种IAP拮抗剂。在一个实施方式中，IAP拮抗剂是LCL-161(Novartis)、Debio-1143(Debiopharma/Ascenta)、AZD5582、比瑞那帕/TL-32711(TetraLogic)、CUDC-427/GDC-0917/RG-7459(Genemech)、JP1201(Joyant)、T-3256336(Takeda)、GDC-0152(Genentech)或HGS-1029/AEG-40826(HGS/Aegera)。
在一个实施方式中，IAP拮抗剂是ASTX660、LCL-161(诺华)、Debio-1143(Debiopharma/Acenta)、AZD5582、Birinapant/TL-32711(TetraLogic)、CUDC-427/GDC-0917/RG-7459(Genentech)、JP1201(Joyant)、T-3256336(Takeda)、GDC-0152(Genenteh)或HGS-1029/AEG-40826(HGS/Aegera)。在一个实施方式中，IAP拮抗剂包括Debio-4028或Ascentage IAP抑制剂APG-1387。在一个实施方式中，IAP拮抗剂是ASTX660(tolinapant)。在一个实施方式中，本发明涉及一种MDM2拮抗剂例如(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸和ASTX660的组合。
一方面，本发明提供一种组合
(i)(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟代-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸(“异吲哚-1-酮化合物”)或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐；和
(ii)1-{6-[(4-氟苯基)甲基]-5-(羟甲基)-3，3-二甲基-1H，2H，3H-吡咯并[3，2-b]吡啶-1-基}-2-[(2R，5R)-5-甲基-2-{[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基}哌嗪-1-基]乙烷-1-酮(“ASTX660”)或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
特别地，本发明的这个方面提供：
一种组合，其包括如本文公开的一种组合(例如异吲哚啉-1-酮化合物的或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐组合ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐)和任选的一种或多种(例如1或2)其他治疗试剂(例如抗癌试剂)。
一种组合，如本文所公开的包括异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和一种另外的的治疗试剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂合物或药学上可接受的盐，其中异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，是物理学相关联的。
一种组合，其包括异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂，例如如本文所公开的ASTX660或其互变异构体或溶剂合物或药学上可接受的盐，其中异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗物，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐为：(a)混合状态；(b)化学/物理化学相关联；(c)化学/物理化学共同包装在一起；或(d)未混合但共同包装在一起或共同呈现。
一种组合，其包括异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂，例如如本文所公开的ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和治疗试剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐是没有物理学关联的。
一种组合，其包括异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂，例如如本文所公开的ASTX660或其互变异构体或溶剂合物或药学上可接受的盐，其中所述组合包括：(a)所述两种或更多种化合物中的至少一种以及用于使所述至少一种化合物临时缔合以形成所述两种或更多种化合物的物理缔合的说明；(b)两种或更多种化合物中的至少一种以及与两种或更多种化合物组合治疗的说明；(c)两种或更多种化合物中的至少一种以及用于对已经(或正在)施用两种或更多种化合物中的另一种的患者群体的给药说明；(d)两种或更多种化合物中的至少一种，其量或形式特别适合于与两种或更多种化合物中的其他化合物组合使用。
一种组合，其包括异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂，例如如本文所公开的ASTX660或其互变异构体或溶剂合物或药学上可接受的盐，采用药盒或患者包的形式。
一种试剂组合物包括一种组合，所述组合包括异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂，例如如本文所公开的ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
一种组合，其包括异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂，例如用于治疗的ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，或一种包括如本文所公开的组合的试剂组合物。
一个组合，其包括异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂合物或药学上可接受的盐，或包括如本文所公开的组合的试剂组合物，用于预防或治疗如本文所述的疾病状态或病症。
一种组合，其包括异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，或包括如本文所公开的组合的试剂组合物，该组合可用于制造用于预防或治疗如本文所述的疾病状态或病症的试剂。
一种用于预防或治疗如本文所述的疾病或病症的方法，包括向患者施用包括以下的组合：异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，或包括如本文所公开的组合的试剂组合物。
一种用于预防或治疗如本文所述的疾病或病症的方法，包括向有需要的患者施用(i)另外的治疗试剂，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物和(ii)如本文所定义的异吲哚啉-1-酮化合物，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
一种组合，其包括异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂合物或药学上可接受的盐或包括组合的试剂组合物，用于如本文所公开的用途，特别是用于如本文所公开的预防或治疗方法中，其中疾病状态或病症是由MDM2-p53介导的。
一个组合，其包括异吲哚-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或其药学上可接受的盐和另外的治疗剂，例如ASTX660或其互变构体或其溶剂化物或者其药学上可以接受的盐的组合，或使用本文所公开的组合进行预防或治疗的方法，其中根据本文所述的SKP2生物标志物选择患者。
一个组合，其包括异吲哚-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或其药学上可接受的盐和另外的治疗剂例如ASTX660或其互变构体或其溶剂化物或者其药学上可以接受的盐的组合，或使用本文公开的组合进行预防或治疗的方法，其中患者被选为具有SKP2正常或高的肿瘤。
一个组合，其包括异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂合物或药学上可接受的盐或包括用于本文所公开的组合的试剂组合物，或使用如本文所公开的组合的预防或治疗方法，其中疾病状态或病症是癌症。
一个组合，其包括异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂合物或药学上可接受的盐或包括用于本文所公开的组合的试剂组合物，或使用如本文所公开的组合的预防或治疗方法，其中疾病状态或病症是癌症，该癌症是急性髓系白血病。
一个组合，其包括异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂，例如如本文所公开的ASTX660或其互变异构体或溶剂合物或药学上可接受的盐，用于如本文所公开的预防或治疗急性髓系白血病。
用于预防或治疗如本文所述的疾病状态或病症的异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂合物，其中异吲哚啉-1-酮化合物被用于组合另外的治疗试剂，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
用于预防或治疗如本文所述的癌症的异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂合物，其中异吲哚啉-1-酮化合物被用于组合另外的治疗试剂，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
用于预防或治疗如本文所述的疾病状态或病症的ASTX660或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，其中治疗试剂被用于组合异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
用于在有需要的患者中预防、治疗或控制癌症的异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，与另外的治疗试剂组合，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，并且任选地与一种或多种其他治疗试剂组合，用于在有需要的患者中预防、治疗或控制癌症。
异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，可用于制备用于治疗患者的癌症的试剂中，其中所述患者正在用另一种治疗试剂治疗，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
一种治疗试剂，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂合物，可用于制造用于治疗癌症的试剂，其中患者正在用如本文所公开的异吲哚啉-1-酮化合物或互变异构体，N--氧化物，其药学上可接受的盐或溶剂化物进行治疗。
异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，可用于制备用于提高或增强患有癌症的患者的反应率的试剂，其中所述患者正在接受另一种治疗试剂，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，进行治疗。
异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂合物，可用于治疗包括或在哺乳动物中细胞生长异常引起的疾病或病症，其中哺乳动物正在接受用另一种治疗试剂，例如ASTX660或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，进行治疗。
异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂合物，可用于减轻或降低包括哺乳动物中细胞生长异常引起的疾病或病症的发生率，其中所述哺乳动物正在接受治疗另一种治疗试剂，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，进行治疗。
使用如本文所公开的组合例如，包括异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和另外的治疗试剂的组合，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐)，可制备用于抑制肿瘤细胞生长的试剂组合物。
一个产品含有异吲哚啉-1-化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物作为其第一活性成分，以及一种另外的治疗试剂，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，作为另外的活性成分，作为组合制剂可同时、单独或顺序用于治疗癌症。
在一个实施方式中，组合使用的附加治疗剂是降低SKP2水平的试剂或治疗。在一个实施方式中，降低SKP2水平的试剂或治疗是重组干扰素(例如干扰素-γ和干扰素α)和白细胞介素(例如白介素2)，例如阿地白介素、denileukin diftitox、干扰素α2a、干扰素α2b或聚乙二醇干扰素α2b，或DNA修复抑制剂如PARP抑制剂，或IAP拮抗剂或铂化合物，例如顺铂(任选地与阿米福汀组合)、卡铂或奥沙利铂；烷化剂，如氮芥或亚硝脲，例如环磷酰胺、氯氰菊酯、卡莫司汀(BCNU)、苯达莫司汀、噻替帕、美法仑、苏消安、洛莫司汀(CCNU))、阿替拉敏、白消安、达卡巴嗪、埃斯特拉莫司汀、氟替莫司汀和异环磷酰胺(任选与美司那组合使用)、哌波隆、普鲁卡嗪、链脲霉素、替莫唑胺、尿嘧啶、甲***、甲基环己基氯乙基亚硝脲或尼莫司汀(ACNU)和/或放射治疗。
一种制备、分离和纯化1-{6-[(4-氟苯基)甲基]-5-(羟甲基)-3，3-二甲基-1H，2H，3H-吡咯并[3，2-b]吡啶-1-基}-2-[(2R，5R)-5-甲基-2-{[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基}哌嗪-1-基]乙烷-1-酮(ASTX660)及其药学上可接受的盐的具体工艺，所述药学上可接受的盐包括乳酸盐可以在2015年06月25日作为WO 2015/092420公开的国际专利申请PCT/GB2014/053778的实施例2中找到。在一个实施方式中，它是1-{6-[(4-氟苯基)甲基]-5-(羟甲基)-3，3-二甲基-1H，2H，3H-吡咯并[3，2-b]吡啶-1-基}-2-[(2R，5R)-5-甲基-2-{[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基}哌嗪-1-基]乙烷-1-酮的乳酸盐。
本发明的组合中存在的每种化合物可以以单独不同的剂量方案和通过不同的途径给予。因此，两种或更多种试剂中的每种试剂的剂量学可以不同：每种试剂可以同时或在不同时间施用。本领域技术人员将通过他或她的公知常识了解要使用的给药方案和组合治疗。例如，本发明的化合物可以与根据其现有组合方案施用的一种或多种其它试剂组合使用。下面提供了标准组合方案的实施例。
紫杉烷化合物的有利施用为，每平方米体表面积50至400mg(mg/m2)的剂量给药，例如75至250mg/m2，特别是每疗程中紫杉醇以约175至250mg/m2的剂量给药，多西他赛给药约75至150mg/m2。
喜树碱化合物有利施用为，每平方米体表面积0.1至400mg(mg/m2)的剂量给药，例如1至300mg/m2，特别是每疗程中伊立替康以约100至350mg/m2的剂量给药，拓扑替康给药约1至2mg/m2。
抗肿瘤鬼臼毒素衍生物有利施用为，每平方米体表面积30至300mg(mg/m2)的剂量给药，例如50至250mg/m2，特别是每疗程中依托泊苷以约35至100mg/m2的剂量给药，替尼泊苷给药约50至250mg/m2。
抗肿瘤长春花生物碱有利施用为，每平方米体表面积2-30mg(mg/m2)的剂量给药，特别是每疗程长春碱的给试剂量约为3至12mg/m2，长春新碱给试剂量约为1至2mg/m2，长春瑞滨的给试剂量约为10至30mg/m2。
抗肿瘤核苷衍生物有利施用为，每平方米体表面积200至2500(mg/m2)，例如700至1500mg/m2的剂量给药，特别是每疗程中5-FU的给试剂量为200至500mg/m2，吉西他滨的剂量约为800至1200mg/m2，卡培他滨的剂量约为1000至2500mg/m2。
烷化剂如氮芥或亚硝基脲有利施用为，每平方米体表面积100至500mg(mg/m2)的剂量给药，例如120至200mg/m2，特别是每疗程中环磷酰胺的给试剂量约100至500mg/m2，苯丁酸氮芥的给试剂量为约0.1至0.2mg/kg，卡莫司汀的剂量为约150至200mg/m2，洛莫司汀的剂量为约100至150mg/m2。
抗肿瘤蒽环类衍生物有利施用为，每平方米体表面积10至75mg(mg/m2)的剂量给药，例如15至60mg/m2，特别是每疗程中多柔比星的给试剂量约为40至75mg/m2，柔红霉素的给试剂量约为25至45mg/m2，伊达比星的给试剂量约为10至15mg/m2。
抗***试剂有利的施用为，每天约1至100mg的剂量，取决于具体的试剂和所治疗的病症。他莫昔芬有利的施用为，5至50mg的剂量通常地10至20mg口服一天两次，持续足够时间的治疗以实现和维持治疗效果。托瑞米芬有利施用为，约60mg的剂量口服，每日一次，持续足够时间的治疗以实现和维持治疗效果。阿那曲唑有利施用为，约1mg的剂量口服，每日一次。屈洛昔芬有利的施用为，约20-100mg的剂量口，每日一次。雷洛昔芬有利的施用为，约60mg的剂量口服，每日一次。依西美坦有利施用为，约25mg的剂量口服，每日一次。
抗体的有利施用为，以每平方米体表面积约1至5mg(mg/m2)的剂量给药，或者如果不同的话如本领域已知的。曲妥珠单抗的有利施用为，每平方米体表面积1至5mg(mg/m2)的剂量给药，特别是每疗程2至4mg/m2。
在分子式(Io)的化合物以与一种、两种、三种、四种或更多种其它治疗试剂(通常一种或两种治疗试剂，更通常一种治疗试剂)的组合施用时，所述化合物可以同时或序贯施用。在后一种情况下，两种或多种化合物将在一段时间内以足以确保实现有利或协同效应的量和方式施用。当序贯给药时，它们可以紧密间隔的给药(例如间隔5-10分钟)或以更长的时间间隔给药(例如间隔1、2、3、4或更多小时，或者在需要时间隔更长的时间来给药)，精确的剂量方案与治疗试剂的性质相称。这些剂量可以例如在每个疗程施用一次、两次或更多次，例如可以每7、14、21或28天重复一次。
应当理解，组合中每种成分的典型的施用方法和顺序，以及每种相应剂量和方案将取决于所施用的本发明的特定其它试剂和化合物、其施用途径、被治疗的特定肿瘤和被治疗的特定宿主。本领域技术人员可以使用常规方法并鉴于本文中列出的信息可容易地确定最佳给药方法和顺序以及给试剂量和方案。
本领域技术人员可以确定根据本发明的化合物和一种或多种其它抗癌剂作为组合给予时的重量比。所述比率以及确切的施用剂量和频率取决于根据本发明的特定化合物和所使用的其它抗癌剂、所治疗的特定病状、所治疗病状的严重程度、年龄、体重、性别、饮食、施用时间和特定患者的一般身体状况、施用方式以及个体可能服用的其它试剂，如本领域技术人员众所周知的。此外，很明显，每日有效量可以根据治疗对象的反应和/或根据医生对本发明所用化合物的评价而降低或增加。本发明的MDM2拮抗剂和另一种抗癌试剂的特定重量比可以为1/10至10/1，更特别地1/5至5/1，甚至更特别地1/3至3/1。
Skp2水平可能受到减少基因表达的影响，例如Notch1信号传导诱导Skp2基因表达，抑制Notch1通路将降低Skp2水平。IKK-NF-kB通路还通过p52/RelA或p52/RelB与Skp2启动子的结合来调节Skp2基因的表达，降低对NFkB转录因子的信号传导将减少Skp2的表达。另一种调节Skp2基因表达的通路是磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路，因此P13Ki或AKTi对PI3K活性的抑制减少了Skp2 mRNA水平。PI3K/AKT通路的上游调节因子，如BCR-ABL和HER2也调节Skp2的表达。
除了表达水平的调节外，skp2还可以通过蛋白质稳定性进行调节。Skp2磷酸化，例如通过AKT或CDK2，减弱Skp2的泛素化和降解。因此，抑制Skp2磷酸化是降低Skp2蛋白水平的另一途径。
在一个实施方式中，本发明的生物标志物，特别是本文列出的SKP2和/或SKP底物可用于选择患者，以与上述(i)-(xlix)组合使用MDM2拮抗剂治疗。
在一个实施方式中，患者的肿瘤被确定不适合单药MDM2抑制剂治疗，因为存在高SKP2，因此可以使用一种额外的试剂组合MDM2抑制剂来触发低SKP2。在一个实施方式中，患者的肿瘤被确定为SKP2高，并用MDM2拮抗剂与另外的抗癌剂组合治疗。在一个实施方式中，患者的肿瘤被确定为SKP2高，并用MDM2拮抗剂与上述(i)-(xlix)中列出的一种或多种试剂组合治疗。
在一个实施方式中，本发明的生物标志物，特别是本文列出的SKP2和/或SKP底物，可用于选择患者，以使用MDM2拮抗剂与AKT抑制剂、CDK2抑制剂、Notch1通路抑制剂、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路抑制剂、IKK-NF-kB通路抑制剂、BCR-ABL抑制剂和/或HER2抑制剂组合治疗。
在一个实施方式中，患者的肿瘤被确定为SKP2高，并用MDM2拮抗剂与AKT抑制剂、CDK2抑制剂、Notch1通路抑制剂、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT通路抑制剂、IKK-NF-kB通路抑制剂、BCR-ABL抑制剂和/或HER2抑制剂组合治疗。
在一个实施方式中，本发明的生物标志物，特别是本文列出的SKP2和/或SKP底物可用于选择患者，以使用MDM2拮抗剂与CDK2抑制剂组合治疗。在一个实施方式中，CDK2抑制剂选自AT7519、劳斯考文汀(roscovitine)、塞利西利(seliciclib)、阿洛西迪布(alvocidib)(夫拉平度(flavopiridol)、阿贝马昔单抗(abemaciclib)、地那昔利布(dinaciclib)(SCH-727965)、7-羟基星形孢菌素(UCN-01)、JNJ-7706621、BMS-387032(又名SNS-032)、PHA533、ZK-304709、佐替拉西利布(zotiracilib)和AZD-5438。其他CDK2抑制剂包括PHA-793887、PHA-690509、PF-07104091、roniciclib(BAY-1000394)、米尔西利布(milciclib)、NUV-422、依布昔单抗(ebvaciclib)(PF-06873600)、FN-1501、法德拉克利布(fadraclib)(CYC-065)、AGM-130、R-547、AG-24322和IIIM-290。
在一个实施方式中，本发明的生物标志物，特别是本文列出的SKP2和/或SKP底物可用于选择患者，以使用MDM2拮抗剂与Notchl通路抑制剂组合治疗。一种这样的Notch抑制剂是pictilisb。
在一个实施方式中，本发明的生物标志物，特别是本文列出的SKP2和/或SKP底物可用于选择患者，以使用MDM2拮抗剂与磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路抑制剂，特别是PI3Ki或AKTi的PI3K活性抑制剂组合治疗。
在一个实施方式中，本发明的生物标志物，特别是本文列出的SKP2和/或SKP底物可用于选择患者，以使用MDM2拮抗剂与IKK NF-kB通路抑制剂组合治疗，例如通过p52/RelA或p52/RelB结合到SKP2启动子和减少NFkB转录因子的信号传导。在一个实施方式中，IKK-NF-kB通路抑制剂是IκB激酶(IKK)的抑制剂。在一个实施方式中，IKK-NF-kB通路抑制剂是核因子κB诱导激酶(NIK或MAP3K14)的抑制剂。一种特殊的化合物是来自Janssen的Nik抑制剂TRC694。
在一个实施方式中，IKK-NF-kB通路抑制剂是IRAK抑制剂。在一个实施方式中，IKKNF-kB通路抑制剂是例如PF-06650833、R-835、帕西尼尼(pacritinib)、CA-4948、BAY-183839。
在一个实施方式中，本发明的生物标志物，特别是本文列出的SKP2和/或SKP底物可用于选择患者，以使用MDM2拮抗剂与BCR-ABL抑制剂和/或HER2抑制剂组合治疗。一种这样的BCR-ABL抑制剂是asciminib。还有伊马替尼、asciminib(Bcr-Ab1)、氟马替尼(Abl)、博舒替尼、达沙替尼、奥维替尼、阿西替尼、尼罗替尼、萨拉卡替尼(AZD-0530)、普纳替尼。其他BCR-ABL抑制剂包括拉多替尼(Supect，IY-5511)、巴非替尼(INNO-406，NS-187)、沃多巴替尼(K-0706)、瑞巴替尼(DCC-2036)、NPB-001056，NRC-AN-019、PF-114、AEG-41174或AZD-0424。在一个实施方式中，BCR-ABL抑制剂是伊马替尼、达沙替尼、普纳替尼。
HER2抑制剂包括阿法替尼(双重EGFR/HER2)或HER2抗体，例如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗-DM1、厄妥美索单抗。其他HER2抑制剂包括图卡替尼(tucatinib)(Tukysa，ARRY-380，MK-7119，ONT-380，伊尔比尼替尼(irbinitinib))、焦替尼(pyrotinib)(Airuini，SHR-1258)、达科米尼(dacomitinib)(Vizimpro，PF-00299804)、莫布司替尼(mobocertinib)(AP-32788，TAK-788)、瓦利替尼(var1itinib)(ARRY-33543，ASLAN-001；LINO-1608，SPS-4370，QBT-01)、泰洛昔替尼(tarloxotinib)(Tarlox，PR-610，SN-33999，TH-4000)、波索提布(poziotinib)(HM-781-36，NOV-120101)、埃珀替尼(epertinib)(S-222611)、萨皮替尼(sapitinib)(AZD-8931)、莫立替尼(mubritinib)(TAK-165)、卡奈替尼(canertinib)(CI-1033，PD-183805)或塞拉替尼(selatinib)、CP-724714(HY-14674)。其他HER2抗体包括马吉托昔单抗(margetuximab)(Margenza，MGAH-22)或科波塔单抗(coprelotamab)(GB-221)，B-002。在一个实施方式中，HER抑制剂是拉帕替尼、来那替尼、曲妥珠单抗。
术语“PI3K/AKT通路抑制剂”在本文中用于定义一种化合物，该化合物抑制AKT的激活、激酶本身的活性或调节下游靶点、阻断通路的增殖和细胞存活效应(包括本文所述通路中的一种或多种靶酶，包括磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、AKT、雷帕霉素的哺乳动物标靶(mTOR)、PDK-1、p70 S6激酶和叉头易位)。
PI3K/AKT通路抑制剂包括PKA/B和/或PKB(akt)抑制剂、PI3K抑制剂、mTOR抑制剂和/或钙调素抑制剂(叉头易位抑制剂)
PI3K/AKT通路抑制剂的实施例包括PI3K抑制剂，如apitolisib、buparlisib、copanlisib、pictilisib、dactolisib，idelalisib、serabelisib、duvelisib、ipatasertib、alpelisib、afuresertib、paxalisib、sonolisib、pilaralisib、fimepinostat(CUDC-907)、SKLB-1028、GSK1059615(PI3K)、ZSTK-474、GSK-2636771、samotolisib(LY-3023414)、LY294002、SF1126和PI-103。进一步的实施例包括umbralisib(Ukoniq，RP-5624，TGR-1202)、inavolisib(GDC-0077，RG-6114，RO-7113755)、parsaclisib(IBI-376，INCB-050465)、zandelisib(ACC-524，ME-401，PW-143)、leniolisib(CDZ-173)、linperlisib(YY-20394)、eganelisib(IPI-549)、tenalisib(RP-6530)、seletalisib(UCB-5857)、dezapelisib(INCB-040093)、nemiralisib(GSK-2269557)、bimiralisib(NCB-5，PQR-309)，voxtalisib(SAR-245409，XL-765)、panulisib(P-7170)、gedatolisib(PF-05212384)、taselisib(GDC-0032，RG-7604)、puquitinib(XC-302)、acalisib(CAL-120，GS-9820)或omipalisib(GSK-2126458)。
特定的PI3K抑制剂包括apitolisib、buparlisib、copanlisib、pictilisib、ZSTK-474、fimepinostat(CUDC-907)、GSK-2636771和LY-3023414。
替代的特定PI3K抑制剂包括apitolisib、buparlisib、copanlisib、pictilisib、dactolisib，idelalisib、serabelisib、duvelisib、ipatasertib、alpelisib、afuresertib、paxalisib、sonolisib、pilaralisib、fimepinostat或samotolisib。
PI3K/AKT通路抑制剂的实施例还包括mTOR抑制剂，如西罗莫司(最初称为雷帕霉素)和雷帕霉素类似物，如RAD 001(依维莫司)、CCI 779(替西罗莫司)和瑞达莫司(AP23573)，或sapanisertib(MLN0128(INK128)，mTOR复合物I(mTORCI)和mTORC2的双重抑制剂。进一步的实施例包括佐他罗林(ABT-578)、依维莫司(Afinitor，RAD-001)、西罗莫司(雷帕蒙，雷帕霉素)、福西克罗匹罗(CPX-POM)、CC-115、BI-860585(XP-105)、onatasertib(ATG-008，CC-223)或vistusertib(AZD-2014)。
PI3K/AKT通路抑制剂还包括MTOR抑制剂，如雷帕霉素类似物、AP23841和AP23573、钙调素抑制剂(叉头易位抑制剂)、API-2/TCN(曲里滨)、RX-0201、盐酸恩扎司他林(LY317615)、NL-71-101、SR-13668、PX-316或KRX-0401(perifosine/NSC 639966)；
PI3K/AKT通路抑制剂的实施例包括叉头易位抑制剂，如钙调素抑制剂，例如CBP-501。哈佛大学的钙调素抑制剂是叉头易位抑制剂。
PI3K/AKT通路抑制剂的实施例包括AKT抑制剂，如perifosine、ipatasertib、uprosertib、afuresertib、MK-2206、MK-8156、AT13148、capivasertib(AZD5363)、triciribine、Enzastaurin、XL-418、GSK-690693和RX-0201。
特定的AKT抑制剂包括perifosine、ipatasertib、afuresertib、MK-2206、MK-8156、AT13148和AZD-5363。
特定的AKT抑制剂包括ipatasertib、uprosertib、afurisertib、capivasertib。
在一个实施方式中，P13K/AKT通路抑制剂是选自一种或多种上述特定化合物的P13K抑制剂。在一个实施方式中，P13K/AKT通路抑制剂是PI-103或LY294002。
在一个实施方式中，提供了本文所述MDM2拮抗剂和PI3K/AKT通路抑制剂的组合，所述PI3K/AKT通路抑制剂选自：apitolisib、buparlisib、copanlisib、pictilisib、ZSTK-474、CUDC-907、GSK-2636771、LY-3023414、ipatasertib、afuresertib、MK-2206、MK-8156、Idelalisib、BEZ235(dactolisib)、BYL719、GDC-0980、GDC-0941、GDC-0032和GDC-0068。
在另一个实施方式中，提供了一种治疗患者癌症的方法，其中所述方法包括选定一个患者的步骤：
(a)在从所述患者获得的生物样品中具有高水平的SKP2(或低水平的SKP2-底物)；和
(b)向步骤(a)中选择的所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂和降低SKP2水平的试剂。
本发明中使用的化合物也可以与非化疗治疗如放射治疗、光动力治疗、基因治疗组合施用；手术和控制饮食。放射治疗可以用于根治性、姑息性、辅助性、新辅助性或预防性目的。
本发明中使用的化合物还具有用于放射治疗和化疗的致敏肿瘤细胞的治疗应用。因此，本发明中使用的化合物可以用作“放射增敏剂”和/或“化学增敏剂，或者可以与另一种“放射增感剂”和(或)“化学增敏感剂”组合使用。在一个实施方式中，本发明化合物用作化学增敏剂。
术语“放射增敏剂”被定义为以治疗有效量施用于患者以增加细胞对电离辐射的敏感性和/或促进可用电离辐射治疗的疾病的治疗的分子。
术语“化学增敏剂”被定义为以治疗有效量施用于患者以增加细胞对化学治疗的敏感性和/或促进可用化学治疗治疗的疾病的治疗的分子。
许多癌症治疗方案目前使用放射增敏剂与X射线辐射组合。X射线活化的放射增敏剂的实施例包括但不限于以下：甲硝唑、米索硝唑、去甲基米索硝唑、哌莫硝唑、依他硝唑、尼莫唑、丝裂霉素C、RSU 1069、SR 4233、Eo9、RB 6145、烟酰胺、5-溴脱氧尿苷(BUdR)、5-碘脱氧尿苷(IUdR)、溴脱氧胞苷、氟脱氧尿苷(FudR)、羟基脲、顺铂和其治疗有效的类似物和衍生物。
癌症的光动力治疗(PDT)使用可见光作为增感剂的放射活化剂。光动力放射增敏剂的实施例包括但不限于以下：血卟啉衍生物、光敏蛋白、苯并卟啉衍生物、锡卟啉、脱镁硼化物-a、细菌叶绿素-a、萘酞菁、酞菁、锌酞菁和其治疗有效的类似物和衍生物。
放射增敏剂可以与治疗有效量的一种或多种其它化合物组合使用，包括但不限于：促进放射增敏剂掺入靶细胞的化合物；控制治疗剂、营养物和/或氧气流向靶细胞的化合物；在有或没有额外辐射的情况下作用于肿瘤的化学治疗剂；或用于治疗癌症或其它疾病的其它治疗有效化合物。
化学增敏剂可以与治疗有效量的一种或多种其它化合物组合使用，包括但不限于：促进化学增敏剂掺入靶细胞的化合物；控制治疗剂、营养物和/或氧气流向靶细胞的化合物；作用于肿瘤的化学治疗剂；或用于治疗癌症或其它疾病的其它治疗有效化合物。钙拮抗剂，例如维拉帕米，被发现可与抗肿瘤试剂组合使用，以在对所接受的化学治疗试剂有抗性的肿瘤细胞中建立化学敏感性并增强此类化合物在试剂敏感性恶性肿瘤中的疗效。
为与另一种化学治疗试剂的组合用药，分子式(Io)的化合物和一种、两种、三种、四种或更多种其它治疗试剂可以例如一起调配成含有两种、三种、四种或更多种治疗试剂的剂型，即在一个单一试剂组合物中含有所有组分。可替代地，单独的治疗剂可以单独调配并以试剂盒的形式一起存在，任选地附有所述试剂盒的使用说明。
在一个实施方式中，试剂组合物包括分子式(Io)化合物以及药学上可接受的载体和任选地一种或多种治疗试剂。
在另一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的组合在制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物组合物中的用途。
在进一步的实施方式中，本发明涉及含有式(Io)化合物和一种或多种抗癌剂的产品，作为同时、单独或连续用于治疗癌症患者的组合制剂。
现在参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
现在本发明的MDM2拮抗剂将通过但不限于参考以下实施例中所描述的具体实施方式来说明。例如，使用自动命名包，如AutoNom(MDL)或ChemAxon Structure to Name对化合物进行命名，或由化学品供应来命名。
下面第一组MDM2拮抗剂的实施例，其中，cyc是苯基，可以按照国际专利申请PCT/GB2016/053042中的描述进行制备，该申请于2017年04月06日公布为WO 2017/055860：
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下面第二组MDM2拮抗剂的实施例，其中，cyc是Het，可以按照国际专利申请PCT/GB2016/053041中的描述进行制备，该申请于2017年04月06日公布为WO 2017/055859：
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(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸酸(“化合物1”)的制备1
Figure BDA0004083338540001511
步骤1：2-丙烯-1-基(2S，3S)-3-(4-氯苯)-3-[1-(4-氯苯)-7-氟-1-羟基-5-[(1S))-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-丙酸甲酯
在(S)-2-(4-氯苯甲酰基)-3-氟-5-(1-羟基-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)丙基)苯甲酸溶液(制备52)(0.686g，1.6mmol)、2-丙烯-1-基(2S，3S)-3-氨基-3-(4-氯苯)-2-丙酸甲酯(制备62)(0.54g，2.12mmol)和二异丙基乙胺(0.83mL，4.8mmol)的DMF(15mL)溶液中加入HATU(0.91g，2.4mmol)，反应混合物搅拌2小时，加入水并用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和NaHCO3盐水洗涤，干燥并蒸发溶剂。粗产物通过色谱法纯化，得到标题化合物(0.75g，72％)。MS：[MH]-＝654。
步骤2：2-丙烯-1-基(2S，3S)-3-(4-氯苯)-3-[(1R)-1-(4-氯苯)-7-氟-5-[(1S))-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-丙酸甲酯
标题化合物由乙基(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[1-(4-氯苯基)-7-氟-1-羟基-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-丙酸甲酯和甲醇制备，方式与制备10中所述方式类似，但使用MeOH替代1，1-双(羟甲基)环丙烷。非对映异构体通过手性SFC分离，标题化合物是较快洗脱的异构体。MS：[M+H]+＝670。
步骤3：(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸
标题化合物由丙2-丙烯-1-基(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-丙酸甲酯制备，方式类似用实施例90的步骤4中所述的方式。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：12.56-12.00(1H，m)，7.71(1H，s)，7.42(1H，d)，7.02(4H，d)，6.88(3H，d)，4.91(1H，s)，4.23(1H，d)，3.99-3.85(2H，m)，3.75(1H，dd)，3.25-3.10(5H，m)，2.02-1.90(1H，m)，1.90-1.78(2H，m)，1.67(1H，d)，1.43-1.17(6H，m)，0.95(1H，d)，0.58(3H，t)。MS：[M+H]+＝630。
(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4)-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸(三(羟甲基)氨基甲烷盐)
将上述化合物溶解在EtOH和加入1mol.eq.的三(羟甲基)氨基甲烷。真空除去溶剂，得到无色固体。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ7.69(s，1H)，7.39(d，J＝10.7Hz，1H)，7.01(broad s，4H)，6.96-6.88(m，4H)，4.92(broad s，1H)，4.34-4.22(m，1H)，3.88(dd，J＝10.9，4.2Hz，1H)，3.74(dd，J＝11.1，4.2Hz，1H)，3.71-3.61(m，1H)，3.29(s，6H)，3.33-3.22(m，1H)，3.21-3.14(m，1H)，3.13(s，3H)，1.94(tt，J＝12.2，3.6Hz，1H)，1.89-1.78(m，2H)，1.66(d，J＝12.8Hz，1H)，1.41-1.24(m，2H)，1.19(d，J＝6.8Hz，3H)，0.93(d，J＝13.2Hz，1H)，0.57(t，J＝7.3Hz，3H)。MS：[M+H]+＝630。
(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸(“化合物1”)的制备2
第1阶段：3-溴-5-氟苯甲酸叔丁酯
Figure BDA0004083338540001521
将3-溴-5-氟苯甲酸(32.0g，1.0当量)在DCM(288mL，9vol)和THF(32mL，1voI)的混合物中搅拌直至大部分固体溶解。添加DMF(0.57mL，5mol％)，并将烧瓶置于环境温度水浴中。通过注射泵在1小时内加入草酰氯(13.7mL，1.10当量)；添加结束后30分钟，用HPLC完成反应(样品在MeOH中淬灭以在分析前形成甲酯)。将所得稀浆液老化过夜，浓缩至100mL体积，用THF(160mL，5vol)稀释并再次浓缩至100mL。用THF将所得的酰氯稀浆液稀释至160mL总体积。用THF(243mL)稀释LiOtBu的THF溶液(20wt％，67.3g，77mL，1.15当量)，然后用冰/盐浴将该溶液冷却至-9℃的内部温度。在55分钟内向其中加入含有酰氯的浆液，同时内部温度保持在-3℃以下。添加结束后15分钟反应完成。随着溶液升温至环境温度，溶液老化过夜，用庚烷(320 mL，10vol)稀释，并用水(160 mL，5vol)洗涤。将水层去除至界面处的不溶性碎布，然后有机层通过solka-floc垫来进行过滤。垫用庚烷(10mL)冲洗，然后将合并的有机层用水(2x80mL，2.5vol)洗涤2次。将所得有机层减压蒸馏至最终体积为100mL，用庚烷(160mL，5vol)稀释，并再次浓缩至总体积为100mL。3-溴-5-氟苯甲酸叔丁酯溶液直接用于下一步。NMR1H(400MHz；CDCl3)：7.89-7.88(1H，m)，7.60-7.57(1H，m)，7.40-7.37(1H，m)，1.57(9H，s)。
第2阶段：3-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]苯甲酸
Figure BDA0004083338540001531
3-溴-5-氟苯甲酸叔丁酯(20.0g，1.0当量)和1-(氧杂-4-基)丙基-1-酮(10.85g，1.05当量)的2-MeTHF溶液(200mL，10vol)用0.5M LiCl的THF溶液(72.7mL，0.5当量)处理并冷却至-70℃。在1小时内滴加正丁基锂的己烷溶液(2.2M，39.0mL，1.1当量)；添加结束时反应完成。将混合物升温至-20℃，用半饱和水溶液淬灭。用半饱和NH4Cl水溶液(200mL)淬灭并搅拌10分钟。使混合物沉降并分离各层。有机相用水(50 mL，2.5vol)洗涤。通过HPLC测定该溶液的20.6g的3-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂环-4-基)丙基]苯甲酸叔丁酯(84％测定产率)。LCMS(M-H)-；m/z＝337.2。通过减压蒸馏将有机溶液浓缩至约40mL总体积(～2vol)。3-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]苯甲酸叔丁酯的浓缩溶液在20℃下用TFA(28.0mL，6.0当量)处理并当HPLC分析显示反应完成98％时将溶液升温至60℃并老化2小时；将混合物冷却至20℃，然后用MTBE(40mL，2vol)和庚烷(80mL，4vol)稀释。溶液用正宗的3-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]苯甲酸叔丁酯接种并在种床生长的同时老化30分钟。通过加入庚烷(120mL)将浆液稀释1小时，过滤，滤饼用庚烷(40mL)洗涤，得到为灰白色固体状的标题化合物(14.89g，87％产率)。NMR 1H(400MHz；DMSO)：13.23(1H，s)，7.79(1H，t)，7.50-7.47(1H，m)，7.43-7.39(1H，m)，4.79(1H，s，broad)，3.79(2H，ddd)，3.18(2H，dt)，1.86-1.79(3H，m)，1.64(1H，d)，1.36-1.09(2H，m)，0.93(1H，d)，0.58(3H，t)；LCMS(M+H)+：m/z＝283.1
第3阶段：3-氟-5-[1-(氧杂-4-基)-1-[(三甲基甲硅烷基)氧基]丙基]苯甲酸
Figure BDA0004083338540001532
在0℃下向3-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]苯甲酸(7.06g，1.0当量)的DCM(40mL)悬浮液中加入Et3N(7.08g，2.6当量)超过30分钟(保持温度低于5℃)。用TMSOTf(13.34g，2.4当量)的DCM(40mL)溶液用所得澄清溶液处理60分钟(保持温度低于5℃)。将反应混合物在0℃再搅拌1小时。15分钟内将水(88mL)加入冷反应混合物中，然后各相分离。有机相用0.2M KHSO4溶液(53mL)和水(2×88mL)洗涤。溶液经Na2SO4干燥并用真空浓缩。将粗产物(油状物)从DCM/庚烷中结晶，得到为灰白色固体状的标题化合物(8.24g，93％)。NMR1H(400MHz；DMSO)：7.79(1H，t)，7.65-8.62(1H，m)，7.35-7.31(1H，m)，3.98(2H，ddd)，3.33(2H，dtd)，2.04-1.84(3H，m)，1.75(1H，d)，1.37(1h，qd)，1.26-1.20(2H，m)，0.72(3H，t)，0.25(9H，s)；LCMS(M+H)+：m/z＝355.2
第4阶段：2-(4-氯苯甲酰基)-3-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]苯甲酸
Figure BDA0004083338540001541
在-70℃内部温度下向THF(60mL，15vol)中加入n-BuLi(9.8mL，2.0当量，2.3M己烷溶液)。在60分钟内滴加3-氟-5-[1-(氧杂-4-基)-1-[(三甲基甲硅烷基)氧基]丙基]苯甲酸(4.0g，1.0当量)的THF(20.0mL，5vol)溶液，同时保持内部温度低于-65℃。在添加结束后将所得淡红色溶液搅拌30分钟，然后将4-氯苯甲酰氯(1.6mL，1.15当量)的THF(2 vol，8.0mL)溶液在10分钟内加入，同时内部温度保持在-60℃以下——加入结束时反应完成；将该溶液加热至0℃，得到2-(4-氯苯甲酰基)-3-氟-5-[1-(氧杂-4-基)-1-[(三甲基甲硅烷基)氧基]丙基]苯甲酸的四氢呋喃溶液。LCMS(M+H)+：m/z＝493.2
向溶液中加入浓H3PO4(3.8mL，5.0当量)并将混合物在50℃搅拌18小时。将该混合物用甲苯(40mL，10vol)和4％氯化钠(20毫升，5体积)水溶液稀释。各相分离，顶部有机层用4％氯化钠(20毫升)水溶液和水(10毫升)洗涤。将有机层浓缩至～1/3体积，然后用甲苯(60mL，15vol)稀释。将溶液浓缩至总体积约35mL(～9vol，50℃浴温，80mbar压力)，经过一段时间固体沉淀。将浆料在50℃下老化1小时，然后冷却至环境温度并老化3小时。将浆液过滤，滤饼用2x8mL(2x2vol)甲苯洗涤，然后在真空烘箱(50℃烘箱温度)中干燥至质量恒定。得到为白色固体状的标题化合物，校正产率为81％(4.04g，95wt％)。LCMS(M+H)+：m/z＝421.1
第5阶段：2-(4-氯苯甲酰基)-3-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]苯甲酸-双[(1S)-1-苯乙基]胺盐
Figure BDA0004083338540001551
将2-(4-氯苯甲酰基)-3-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]苯甲酸(外消旋体，300g，85wt％，255g 6，1.0当量)溶于异丙醇(4000mL)中，在55℃下搅拌10分钟以得到均匀溶液，然后冷却至25℃。在2分钟内向溶液中加入双[(1S)-1-苯乙基]胺(136.52g；1.0当量)的IPA(300ml)溶液，然后用IPA冲洗(200mL)。将溶液在环境温度(22-23°)下搅拌15分钟，然后用标题化合物的真实样品(0.50g)接种；固体结晶容易并且观察到轻微的吸热(ca-0.4°)。将悬浮液在19℃的内部温度下搅拌20小时，过滤，滤饼用IPA(450mL)洗涤。将固体在真空抽吸下干燥2小时，然后在50℃的真空烘箱中干燥20小时，得到米色固体；175.5g(作为(IPA)溶剂化物产额为41％)-使用HPLC，混合物为95∶5e.r。
手性HPLC条件：
柱：ChiralPak IC-33μcolumn 4.6x150 mm
柱温：27o
洗脱液：庚烷/IPA80：20，含0.1％的TFA
流量：1.0mL/min@254nm
保留所需的(S)对映异构体；RT＝4.60分钟。不需要的(R)对映体)，RT＝5.83分钟
通过升温至80o并在该温度下搅拌15分钟直至形成均匀溶液的方式，将材料(250g，1.0当量，95：5er)溶解在(IPA)(4000mL，16vol)中。将溶液在约1小时内冷却至52℃，用真实的标题化合物样品(0.50g)接种并将悬浮液在4小时内冷却至20℃，然后在室温下搅拌，在该温度下过夜(总共24小时)。通过真空过滤分离固体，滤饼用IPA(2x450mL)洗涤，滤饼吸干5分钟，然后在50℃真空烘箱中进一步干燥。获得的2-(4-氯苯甲酰基)-3-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]苯甲酸-双[(1S)-1-苯乙基]胺盐为米色固体状(219.2g；88％回收率)；使用HPLC，所述e.r.为99.6：0.4。NMR1H(400MHz；DMSO)：7.84(1H，d)，7.67(1H，t)，7.65(1H，t)，7.58(1H，t)，7.56(1H，t)，7.47(1H，dd)，7.34-7.30(4H，m)，7.28-7.20(6H，m)，4.90(1H，s)，3.90(1H，dd)，3.80-3.72(1H，m)，3.51-3.46(1H，m)，3.30-3.15(1H，m)，1.93-1.83(3H，m)，1.68(1H，d)，1.41-1.28(1H，m)，1.26(3H，s)，1.24(3H，s)，1.04(3H，s)，1.03(3H，s)，0.65(3H，t)
第6阶段：2-(三甲基甲硅烷基)乙基(2S，3S)-3-氨基-3-(4一氯苯基)-2-甲基丙酸盐-盐酸盐
Figure BDA0004083338540001561
在(2S，3S)-3-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-(4-氯苯基)-2-甲基丙酸(109.82g，1.0当量)，2-三甲基甲硅烷基乙醇(49.66g，1.2当量)和DMAP(4.28g，0.05mol％)的DCM(1100mL，10vol)悬浮液中，于-10℃在75分钟内以五等份加入EDC·HC1(100.65g，1.5当量)(保持温度低于0℃)。所得澄清溶液缓慢升温至室温并搅拌16小时。在15分钟内将1N HCl溶液(1000mL)缓慢添加到反应混合物中并分离各相。有机相用5％NaHCO3溶液(500mL)和水(2x500mL)洗涤。将有机相真空浓缩，得到2-(三甲基甲硅烷基)乙基(2S，3S)-3-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-(4-氯苯基)-2-甲基丙酸酯，其在下一步骤中直接使用。LCMS(M+H)+：m/z＝414.2
将粗物质(蜡状白色固体)重新溶解在DCM(200mL)/庚烷(1500mL)中，并在2小时内将4N HCl的二恶烷溶液(350mL，4.0当量)滴加到庚烷溶液中。在此添加过程中，HCl盐开始沉淀，随着反应在环境温度下老化24小时，悬浮液逐渐变稠。将悬浮液用MTBE(800mL)稀释，过滤，滤饼用MTBE(2x200mL)洗涤，在真空烘箱中于50℃干燥至恒重后得到标题化合物，为白色片状固体(108.22g，88％)。NMR 1H(400MHz；CDCl3)：8.93(3H，bs)，7.39-7.29(4H，m)，4.3(1H，bd)，4.06-3.92(2H，m)，3.17-3.08(1H，m)，1.32(3H，d)，0.80-0.71(2H，m)，-0.02(9H，s)；LCMS(M+H)+：m/z＝314.1
第7阶段：2-(三甲基甲硅烷基)乙基(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-羟基-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-丙酸甲酯
Figure BDA0004083338540001562
将二氯甲烷(150mL，10vol)添加到2-(4-氯苯甲酰基)-3-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]苯甲酸-双[(1S)-1-苯乙基]胺盐(15.0g，1.0当量)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基(2S，3S)-3-氨基-3-(4-氯苯)-2-丙酸甲酯-盐酸盐(8.2g，1.1当量)、EDC盐酸盐(4.7g，1.15当量)、DMAP(260mg，0.1当量)和2-羟基吡啶-N-氧化物(230mg，0.1当量)的混合物。将混合物搅拌18小时，然后加入NaHCO3(4.5g，2.5当量在60mL H2O中)水溶液进行淬灭。分离各层并将DCM相浓缩至30mL(2vol)。加入MTBE(150mL，10vol)，用2倍水溶液依次洗涤有机层。H3PO4(3.5mL，2.5当量在60mL水中)水溶液，NaHCO3(4.5g，2.5当量在60mLH2O中)水溶液和水(60mL)。将有机层浓缩至60mL(2vol)，用MeOH(300mL，20vol)稀释，并浓缩至150mL(10vol)。用水(15mL)稀释MeOH溶液，用真实样品(15mg，0.1wt％)接种，种子床生长的同时在环境温度下老化30分钟。用2小时内加入水(45 mL)稀释浆液，老化1小时，然后过滤。将滤饼用2.5/1MeOH：H2O (45 mL)和水(45 mL)洗涤，并在真空烘箱中在50℃下干燥18h，得到标题化合物，为白色固体(13.5g，89％的产额，使用19FNMR d.r.>99：1)。NMR1H(400MHz；CDCl3)：7.80(1H，s)，7.15(1H，d)，7.01-6.99(4H，m)，6.97-6.92(4H，m)，4.77(1H，s)，4.36(1H，d)，4.16-4.08(1H，m)，3.94-3.90(1H，m)，3.89-3.79(2H，m)，3.47(1H，d)，3.31(1H，t)，3.08(1H)，t)，2.55(1H，s)，1.91(1H，sep)，1.86-1.77(2H，m)，1.74-1.71(1H，m)，1.41-1.22(5H，m)，0.94(1H，d)，0.68-0.54(5H，m)，0.10(9H，s)，NMR19F(376MHz，CDC13)δ：--119.1和LCMS(M+H)+：m/z＝716.2
第8阶段：2-(三甲基甲硅烷基)乙基(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-丙酸甲酯
Figure BDA0004083338540001571
在100mL的三颈烧瓶中，于室温下将固体2-(三甲基甲硅烷基)乙基(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-羟基-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-丙酸甲酯(2.5g，1.0当量)溶于无水THF中(12.5mL，5vol)。将溶液冷却至-70℃内部温度，并添加MeOTf(三氟甲磺酸甲酯)(0.46mL，1.2当量)。将所得澄清溶液保持在-70℃的内部温度下，通过注射泵在1小时内滴加LiOtBu(20wt％在THF中，1.9mL，1.2当量)。将混合物在-70℃保持18小时，然后在2小时内升温至-15℃，此时转化率>98％。将反应混合物用IPA(12.5mL)稀释，然后用水(12.5mL)稀释。该溶液用产物10接种，并在形成种床的同时，于环境温度下搅拌30分钟。在1.5小时内通过注射泵缓慢的进一步加水(25mL)，并将浆液在环境温度下老化1小时，然后过滤。将滤饼用1∶1IPA/水(20mL)洗涤并在真空烘箱中于50℃干燥，得到标题化合物(2.4g)(未校正产率94％，100∶0.5d.r.，用19F NMR)。NMR 1H(400MHz；CDCl3)：7.67(1H，d)，7.28(1H，dd)，6.93-6.88(8H，m)，4.30-4.19(m，2H)，4.01(dd，1H)，3.92-3.77(m，3H)，3.40-3.26(m，2H)，3.22(s，3H)，1.97-1.84(m，4H)，1.72(bs，3H)，1.49-1.38(m，2H)，1.36(d，3H)，1.07(bd，1H)，0.69(t，3H)，0.61-0.52(m，2H)，-0.08(s，9H)；NMR19F(376MHz，CDCl3)δ：-118.8以及LCMS(M+H)+：m/z＝730.3
第9阶段：(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸
Figure BDA0004083338540001581
/>
2-(三甲基甲硅烷基)乙基(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-丙酸甲酯(170.0g，1.0当量)和CsF(70.7g，2.0当量)加入5L固定容器中，并在环境温度下加入DMF(510mL，3vol)。将混合物升温至60℃并在该温度老化7小时，此时反应完成。将混合物冷却至20℃并搅拌过夜。DMF用EtOAc(1700mL，10mL)和1M HCl(510mL，3vol)稀释。分离各层，进行浓缩前有机层依次用5％LiCl(4x680mL，4vol)水溶液和水(2x680mL，4vol)洗涤。将所得油状物从EtOAc中浓缩两次(每次250mL)，得到标题化合物，为淡黄色泡沫状(141g校正量，92重量％，96％产率)。将固体悬浮在EtOAc(684mL，4vol)中并加热至70℃，该温度下静置1h，然后在2h内冷却至20℃。在70分钟内加入庚烷(1370mL，8vol)，浆液老化过夜。过滤固体，用EtOAc/庚烷1：2(2x300 mL)洗涤，并在真空烘箱中在50℃下干燥至恒重，得到133g(86％产率)。
产物以稳定的无水结晶形式分离。这被指定为游离酸“形式F”，是一种稳定的结晶多晶型物。
XRPD在以下共振处出峰(表6)：
表6.
Figure BDA0004083338540001582
/>
Figure BDA0004083338540001591
步骤10a：(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸三(羟甲基)氨基甲烷盐
Figure BDA0004083338540001601
(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4)-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸(113.0g，1.0当量)和三(羟甲基)氨基甲烷(21.95g，1.01当量)以固体形式装入2L容器中。在氮气下搅拌加入甲醇(1130mL)，得到流动悬浮液。通过在30分钟内升温至38-40o溶解固体，得到澄清溶液。将其冷却至20-22°，然后在Buchi旋转蒸发仪上减压浓缩，得到白色泡沫。将泡沫转移到结晶盘中并在真空下(ca20mmHg)于60o干燥一个周末(60小时)，得到标题化合物，为脆的白色泡沫(134.1g；99.5)。
制备化合物1的其他方法可见于2018年10月04日以WO 2018/178691公布的国际专利申请PCT/GB2018/050845。
生物测定
实施例1：式(Io)化合物
使用96孔板结合法(ELISA)测定MDM2-p53相互作用
ELISA测定在链霉亲和素包被的板中进行，每个200μl孔用1μg ml-1生物素化的IP3肽预孵育。用PBS洗涤板后，板即可用于MDM2结合。
在96孔板等分化合物和对照物的DMSO溶液，在室温(例如20℃)下以最终2.5-5％(v/v)DMSO浓度与190μl体外翻译的MDM2的优化浓度的等分预孵育20分钟，然后，将MDM2-化合物混合物转移到b-IP3链霉亲和素板，并在4℃下孵育90分钟。用PBS洗涤三次以去除未结合的MDM2，将每个孔与原代小鼠单克隆抗MDM2抗体(Ab-5，Calbiochem，根据所使用的抗体储备液以1/10000或1/200稀释使用)的TBS-Tween(50mM Tris pH7.5；150mM NaCl；0.05％Tween20非离子去污剂)缓冲溶液在20℃下孵育1小时，然后用TBS-Tween洗涤三次，然后在20℃下与山羊抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗的TBS-Tween缓冲溶液(根据抗体储液以1/20000或1/2000使用)孵育45分钟。通过用TBS-Tween洗涤三次去除未结合的二抗。结合的HRP活性通过增强化学发光(ECLTM，Amersham Biosciences)测定，使用二酰肼底物鲁米诺的氧化来产生可量化的光信号。给定浓度下MDM2抑制的百分比计算如下：[1-(在化合物处理的样本中检测到的RLU-RLU阴性DMSO对照)÷(RLU的DMSO阳性和阴性对照的)]x100或(在化合物处理的样本检测到的RLU÷DMSO对照中的RLU)x100。IC50是用MDM2抑制(％)对浓度的图计算的，并且是两个或三个独立实验的平均值。
蛋白质印迹分析
用的5、10和20μM化合物的0.5％DMSO溶液处理SJSA细胞6小时。将细胞与仅有0.5％DMSO的对照一起用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗，并且在SDS缓冲液(62.5mMTris pH6.8；2％十二烷基硫酸钠(SDS)；10％甘油)中裂解细胞来制备蛋白提取物，超声处理2x5秒(Soniprep150ME)以分解高分子量DNA并降低样品的粘度。使用Pierce BCA测定***(Pierce，Rockford，IL)估计样本的蛋白质浓度，并使用标准SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹程序测定50μg等分的蛋白质。加入β-巯基乙醇(5％)和溴酚蓝(0.05％)，然后将样本煮沸5分钟，然后短暂离心，然后上样到预制的4-20％梯度Tris-甘氨酸缓冲SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)。每块凝胶上都含有分子量标准品(SeeBlueTM，Invitrogen)，并且在NovexXL槽(Invitrogen)中在180伏下进行90分钟的电泳。使用BioRad电泳槽和25mM Tris、190mM甘氨酸和20％甲醇转移缓冲液在30伏或70伏两小时将分离的蛋白质通过电泳过夜从凝胶上转移到HvbondC硝酸纤维素膜(Amersham)上。用于免疫检测转移蛋白的一抗是：1∶1000的小鼠单克隆NCL-p53DO-7(Novocastra)；1∶500的MDM2(Ab-1，clone IF2)(Oncogene)；1∶100的WAF1(Ab-1，clone 4D10)(Oncogene)；1∶1000的肌动蛋白(AC40)(Sigma)。所用的二抗是1∶1000的过氧化物酶偶联的、亲和纯化的山羊抗小鼠(Dako)。通过增强化学发光(ECLTM，Amersham)进行蛋白质检测和观察，通过暴露于蓝光敏感放射自显影胶片(Super RX，Fuji)进行光检测。
方案A：SJSA-1和SN40R2测定
测试的MDM2扩增细胞系是一对等基因匹配的p53野生型和突变骨肉瘤基因(分别为SJSA-1和SN40R2)。所有细胞培养均在补充有10％胎牛血清的RPMI1640培养基(Gibco，Paisley，UK)中生长，进行常规检测来确认支原体感染呈阴性。使用如前所述的磺基罗丹明B(SRB)方法测定细胞的生长及抑制。将100μl 3x104/ml和2x104/ml SJSA-1和SN40R2细胞分别接种到96孔组织培养板中，在5％CO2加湿培养箱中37℃孵育24小时，然后将培养基更换为100μl的含有一系列MDM2-p53拮抗剂浓度的测试培养基，继续孵育72小时使细胞生长，然后加入25μL的50％三氯乙酸(TCA)于4℃处理1小时来固定细胞。用蒸馏水洗掉TCA，并将100μL的SRB染料(0.4％w/v溶于1％乙酸)(Sigma-Aldrich，Poole，Dorset)加入到板的每个孔中。在室温下与SRB染料孵育30分钟后，用1％乙酸洗涤板，然后放干。SRB染色的蛋白质，可测定孔中细胞数量，将其重新悬浮在100μL的10mM Tris-HCl(pH10.5)中，并使用FluoStarOmega读板器在每个孔中测量λ＝570nm处的吸光度。使用Prism v4.0统计软件通过数据的非线性回归分析计算GI50。
方案B：SJSA-1和SN40R2测定
Figure BDA0004083338540001622
LuminescentCell Viability Assay是一种基于定量ATP的存在确定培养中活细胞数量的均相方法，ATP的存在表明存在代谢活性细胞。SJSA-1和SN40R2均在补充有10％FBS(PAA#A15-204)和10U/ml青霉素/链霉素的RPMI1640(Life Technologies#61870)中生长。75μl含2000个细胞被接种到96孔板的每个孔中，并在37℃下在5％CO2加湿培养箱中放置24小时。然后将一系列浓度的MDM2-p53拮抗剂的DMSO溶液添加到细胞中，使最终DMSO浓度为0.3％，并再孵育72小时让细胞生长。将100μl CTG试剂(Promega#G7573)加入到所有孔中，并在顶部计数点测定发光。EC50值由S型4参数曲线来确定，采用XLfit组合Activity Base(IDBS；Guildford，Surrey，UK)。
抗增殖活性
使用阿拉玛蓝测定法测定细胞生长的抑制作用(Nociari，M.M，Shalev，A.，Benias，P.，Russo，C.Journal of Immunological Methods1998，213，157-167)。该方法基于活细胞将重苏灵还原为其荧光产物间苯二酚的能力。在每个增殖测定中，将细胞铺板到96孔板上，使其恢复16小时后，再添加抑制剂化合物处理72小时(在0.1％DMSOv/v中)。在孵育期结束时，加入10％(v/v)阿拉玛蓝并再孵育6小时，然后测定535nM ex/590nM em处的荧光产物。本发明化合物的抗增殖活性可通过测量化合物抑制癌细胞系生长的能力来测定，例如可从DSMZ、ECACC或ATCC获得。
结果：其中cyc是苯基的第一组实施例
表7-从如本文所描述的测定获得的生物数据
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在获得了多于一个数据点的情况下，上表示出了这些数据点的平均值(例如，几何或算术平均值)。
当然应当理解，本发明不旨在限于仅通过实施例的方式描述的上述实施方式的细节。
结果：其中cyc为Het的第二组实施例
结果
表8-从如本文所描述的测定获得的生物数据
Figure BDA0004083338540001671
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Figure BDA0004083338540001821
在获得了多于一个数据点的情况下，上表示出了这些数据点的平均值(例如，几何或算术平均值)。
当然应当理解，本发明不旨在限于仅通过实施例的方式描述的上述实施方式的细节。
实施例2：在210个p53野生型癌细胞系的细胞系平板筛选中预测对化合物1的抗增殖作用的敏感性增加的生物标志物的研究
化合物1在一组210个p53野生型癌细胞系中筛选，该细胞系来源于一系列肿瘤组织，包括结肠、血液、乳腺、肺、皮肤、卵巢和胰腺。从原始剂量反应曲线计算IC50值和活性面积。急性髓系白血病(AML)细胞系被发现是最敏感的。凋亡与非凋亡AML细胞系的差异基因表达分析令人惊讶地发现，SKP2低表达是AML中的新生物标志物(图1)。
方法：
癌细胞在适合的培养基中培养。使用Vi-cell XR细胞计数器对细胞进行收集和计数。将细胞调整至合适的密度并以100μL的体积接种到96孔不透明壁透明底板中，并在5％CO2湿润环境中37℃下孵育过夜。没有细胞添加到第1列，因为这将用作空白对照。
在DMSO中制备浓度10m的化合物1的储备液。储备液在DMSO中进一步稀释，然后添加到含有细胞的96孔板重复的孔中，得到0.1％的DMSO终浓度。然后将板在5％CO2的湿润环境中在37℃下孵育3天。每个细胞系以三份样本测试。
向测定板的每个孔中加入100μL CellTiter-Glo试剂。将板在定轨振荡器上混合10分钟，然后在室温下孵育10分钟。然后在EnSpire读板器中读取该板(用于发光)。
计算每个孔，减去仅培养基对照(无细胞)作为平均DMSO对照减去仅培养基对照的百分比。使用GraphPad Prism(GraphPad Software，La Jolla California USA)计算S型剂量反应(可变斜率)曲线和IC50值。
差异基因表达
通过使用Illumina HiSeq平台的配对末端(2x150bp)、链特异性RNA测序和每个样品的3个生物复制，对人AML细胞系进行基因表达谱分析。测序由GATC Biotech(现为Eurofins Genomics)完成，RNA测序数据的生物信息学分析由内部完成。平均每个样本产生约8900万条读数。使用Bowtie v2.2.9[Langmead等人2019基因组生物学]将原始读数与人类基因组hg19/GRC37基因组对齐。平均而言，94％的读数与基因组唯一一致。基于GENCODEv19注释，使用htseq软件套件(版本0.11.1)的htseq计数工具将对齐的BAM文件用于转录和基因定量。来自DESeq2 R包(v1.14.1，Love等人基因组生物学550，2014)的方差稳定转换函数用于标准化原始计数数据，并执行无监督分层聚类。生物复制高度相关(R2＝0.99)。
使用DESeq2 R包进行差异基因表达。校正p值<0.05的基因被认为在凋亡和非凋亡样品之间显著差异表达。在下调的基因中，SKP2被鉴定为在凋亡细胞系中显著下调(图1)
实施例3：凋亡AML细胞系中基础SKP2表达较低
由于AML是经常发现低SKP2的适应症之一，因此在12个AML细胞系的小组中进一步研究了化合物1的抗增殖活性。化合物1诱导的细胞凋亡水平以caspase-3活化的细胞百分比来测量。除阴性对照(KG-1，TP53突变体)外，在所有细胞系中观察到激活的caspase-3的化合物1依赖性增加。特别是，5个细胞系(MV4-11、EOL-1、Molm-13、OCI-AML-2和BDCM)显示出强烈的凋亡诱导，在用100nM化合物1处理48小时后，激活的caspase-3染色阳性的细胞超过30％。为了进行随访分析，这5个细胞系被分为“凋亡”细胞系，而其他4个“非凋亡”细胞系(HNT-34、OCI-AML3、ML-2、GDM-1)在用化合物1进行相同处理后显示出<30％的凋亡(图2A)。化合物1诱导的细胞凋亡的程度不能从阿拉玛蓝增殖试验获得的IC50值中预测，因此强调了根据细胞系的凋亡潜力对后续分析进行分组的影响，如下文所述。
SKP2的免疫印迹显示，与4个非凋亡细胞系(HNT-34、OCI-AML3、ML-2、GDM-1)中的高SKP2表达水平相比，所有5个凋亡细胞系中(MV4-11、EOL-1、Molm-13、OCI-ADML-2和BDCM)的SKP2蛋白表达水平均较低(图2B)。TP53突变KG-1细胞系作为阴性对照。有趣的是，所有5个凋亡细胞系(MV4-11、EOL-1、Molm-13、OCI-AML-2和BDCM)显示出高水平的p27蛋白表达，而4个非凋亡细胞系中的p27表达水平较低(HNT-34、OCI-AML3、ML-2和GDM-1)(图2B)。因此，SKP2是治疗癌症的MDM2拮抗剂敏感性的潜在生物标志物。此外，在SKP2表达和p27表达之间观察到负相关(图2B)。
方法：
细胞计数法检测活化的Caspase-3
在6孔板中建立AML细胞系以用化合物1处理。处理前一天，将细胞系以0.5x106个细胞/ml(2ml/孔)的速度接种在6孔板中，并在37℃的加湿5％的CO2/空气培养箱中过夜。将细胞与0.1μM化合物1在37℃的加湿5％的CO2/空气培养箱中孵育48小时后，将细胞旋转并重新悬浮在500μl PBS中。将200μl每个样品加入96孔板的两个孔中。向两个孔中的一个孔中加入50μl无血清培养基作为未染色对照。Caspase-3底物(CellPlayerTM动力学半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7凋亡测定(Essen生物科学有限公司，英国赫特福德郡韦林花园城)，Cat.No.4440))添加到另一个孔中，通过添加50μl的5X Ce11Player Caspase-3/7(在无血清RPMI培养基中为10μM)以开始细胞染色，获得2μM的最终浓度。将平板在黑暗中孵育30分钟，然后在Guava EasyCyte HT细胞仪(Merck Millipore，Kenilworth，NJ，USA)中测量荧光染色细胞。在GRN-B(绿色)通道中记录激活的caspase-3染色，使用未染色和DMSO对照孔设置门控染色和未染色细胞群，从而计算凋亡细胞的百分比。
蛋白质印迹
通过取细胞丸并加入冰冷的1x完全Tris裂解缓冲液(1％Triton x-100、150mMNaCl、20mM Tris.HCl pH 7.5，外加蛋白酶抑制剂(完全迷你型，1片/10ml，Roche，WelwynGarden City，Herts，UK)、50mM NaF和1mM Na3V04)来制备细胞裂解物。将样本漩涡震荡并在冰上放置30分钟。通过在冷却的微量离心机中以14,000rpm离心15分钟来净化裂解物，并取出上清液样本用于蛋白质测定(BCA测定-Pierce，Paisley，UK)。然后通过蛋白质印迹分析细胞裂解物。在煮沸10分钟之前，将等量的蛋白质裂解物与SDS样品缓冲液(Novex，Paisley，UK)和DTT混合。通过SDS PAGE(4-12％Nu PAGE凝胶-Novex，Paisley，Scotland)解析样品，将其吸附在硝化纤维过滤器上，用Odyssey封闭缓冲液(LI-CORBioscience，Lincoln，USA)封闭，并在4℃下与特异性一级抗体孵育过夜，在奥德赛封闭缓冲液中稀释。洗涤后，将印迹与用Odyssey封闭缓冲液(LiCor Biosciences，Lincoln，USA)以1：10,000稀释的红外染料标记的抗兔IR800或抗山羊IR800二抗度孵育1小时。然后扫描印迹以检测Odyssey红外成像***(LiCOR Biosciences，Lincoln，USA)上的红外荧光。
抗体 供应商 Cat.No. 物种/抗体类型
SKP2 细胞信号技术 #4358 兔单克隆抗体
p27 细胞信号技术 #3686S 兔单克隆抗体
β-肌动蛋白 细胞信号技术 #3700 小鼠单克隆抗体
实施例4：化合物1的抗增殖作用由SKP2敲低和过度表达调节
SKP2的免疫印迹显示，所有5个凋亡细胞系(MV4-11、EOL-1、Molm-13、OCI-AML-2和BDCM)均表达低水平的SKP2蛋白。为了测试SKP2的过度表达是否会导致对化合物1治疗的抗性增加，将高度凋亡的MV4-11细胞系工程化以过度表达SKP2。阿拉玛蓝增殖试验表明，与对照相比，SKP2过表达(SKP2 OE)使MV4-11细胞对化合物1治疗产生耐药性(图3A)。有趣的是，该效应是化合物1特有的，因为用ABT-199处理后没有观察到差异(图3B)。SKP2过表达对化合物1治疗抗性的影响也通过细胞术证实。在用2种不同浓度的化合物1处理48小时后，在SKP2过表达细胞(SKP2 OE)中观察到细胞凋亡的显著减少(图3C)。相反，在用0.1μM化合物1处理后，与对照组(无SKP2敲除)相比，非凋亡AML细胞系中的SKP2敲减(高基础SKP2表达)增加了约30％的凋亡(图4A)。在用化合物1处理8小时后，通过western blotting进行的p53通路分析显示SKP2过表达细胞(SKP2 OE)中关键下游p53靶点(MDM2和p21)的活化降低(图4B)。这些体外研究表明，低SKP2表达是癌症，特别是AML对MDM2拮抗剂敏感性的相关生物标志物。
结果表明，SKP2诱导了对MDM2拮抗剂的抗性，但并未调节其他关键凋亡调节因子的活性(图3)。该作用机制研究表明，SKP2是MDM2的特异性生物标志物。
方法：
细胞系生成
shRNA慢病毒转导：
Figure BDA0004083338540001851
shRNA慢病毒转导颗粒(Sigma Aldrich，Pool，UK)用于敲除OCI-AML3AML细胞系中的SKP2。通过对嘌呤霉素(1μg/ml)的细胞抗性建立了稳定的基因敲除，并通过蛋白质印迹在蛋白质水平上进行了确认。含有不靶向任何人类基因的***序列的非靶向shRNA控制载体(Sigma-Aldrich，Pool，UK)用作阴性对照。
精密LentiORF转导：
使用精密LentiORF慢病毒转导颗粒(Cat.OHS5900-224629438，Dharmacon，UK)在MV4-11AML细胞系中过度表达SKP2。稳定的基因过表达是通过细胞对防癌素(5μg/ml)的抗性建立的，并通过蛋白质印迹在蛋白质水平上得到证实。精密LentiORF对照空载体(Dharmacon，UK)作为阴性对照。
阿拉玛蓝测定
通过阿拉玛蓝测定法(Bio-Rad，Irvine，CA，USA)测定活细胞的数量。所有细胞系在RPMI-1640+10％FBS培养基中生长和测定。在黑色96孔平底(透明)组织培养物处理板上以5x104个细胞/ml的速度接种200μl细胞，并在37℃的空气中5％的CO2的湿润气氛中培养过夜。
首先将化合物在DMSO中稀释，然后加入无血清培养基中，然后加入培养细胞的三个孔中，得到0.1％的DMSO最终浓度。然后将平板在37℃的空气中5％的CO2的湿润气氛中孵育24小时。将20μl阿拉玛蓝TM(AbD Serotec/Bio-Rad)添加到每个孔中，然后在5％的CO2和空气的气氛中在37℃下培养板4-6小时。然后在SpectraMax Gemini读取器(MolecularDevices，San Jose，CA，USA)上以535nm(激发)和590nm(发射)读取板。计算每个孔，减去仅培养基对照(无细胞)作为平均DMSO对照减去仅培养基对照的百分比。使用Prism GraphPad软件(第7版，加利福尼亚州拉荷拉市，美国)计算乙状结肠剂量反应(可变斜率)曲线和IC50值。
细胞凋亡测定法
在6孔板中建立AML细胞系以用化合物1处理。处理前一天，将细胞系以0.5x106个细胞/ml(2 ml/孔)的速度接种在6孔板中，并在37℃的加湿5％的CO2/空气培养箱中过夜。将细胞与化合物1孵育后，将细胞旋转并根据制造商的方案(Annexin V，Alexa FluorTM 647共轭物，目录号：A23204，Thermo Scientific，UK)。简言之，用Annexin V-结合缓冲液再悬浮细胞，并用膜联肽V-缀合物染色。将样品在室温下在黑暗中孵育20分钟。用AnnexinV-结合缓冲液洗涤后，用流式细胞仪分析细胞。
对于caspase 3/7染色CellEventTM Caspase 3/7绿色试剂(LifeTechnologies)，根据制造商的方案使用用于激活caspase-3和-7的荧光底物。将细胞在室温下与5μM底物孵育30分钟，然后用流式细胞仪分析。
蛋白质印迹
通过取细胞丸并加入冰冷的1x完全Tris裂解缓冲液(1％Triton x-100、150mMNaCl、20mM Tris.HCl pH 7.5，外加蛋白酶抑制剂(完全迷你型，1片/10ml，Roche，WelwynGarden City，Herts，UK)、50mM NaF和1mM Na3V04)来制备细胞裂解物。将样本漩涡震荡并在冰上放置30分钟。通过在冷却的微量离心机中以14,000rpm离心15分钟来净化裂解物，并取出上清液样本用于蛋白质测定(BCA测定-Pierce，Paisley，UK)。然后通过蛋白质印迹分析细胞裂解物。在煮沸10分钟之前，将等量的蛋白质裂解物与SDS样品缓冲液(Novex，Paisley，UK)和DTT混合。通过SDS PAGE(4-12％Nu PAGE凝胶-Novex，Paisley，Scotland)解析样品，将其吸附在硝化纤维过滤器上，用Odyssey封闭缓冲液(LI-CORBioscience，Lincoln，USA)封闭，并在4℃下与特异性一级抗体孵育过夜，在奥德赛封闭缓冲液中稀释。洗涤后，将印迹与用Odvssey封闭缓冲液(LiCor Biosciences，Lincoln，USA)以1：10,000稀释的红外染料标记的抗兔IR800或抗山羊IR800二抗度孵育1小时。然后扫描印迹以检测Odyssey红外成像***(LiCOR Biosciences，Lincoln，USA)上的红外荧光。
抗体 供应商 Cat.No. 物种/抗体类型
SKP2 细胞信号技术 #4358 兔单克隆抗体
MDM2 研发*** AF1244 兔单克隆抗体
p53 研发*** AF1355 山羊多克隆抗体
p21 细胞信号技术 #2947 兔单克隆抗体
β-肌动蛋白 细胞信号技术 #3700 小鼠单克隆抗体
实施例5：SKP2表达调节体内对化合物1的敏感性
除了在体外评估SKP2过表达和敲除的影响外，还使用基于MV4-11细胞系的播散性AML模型在体内评估了SKP2对癌症增殖的影响。为了产生AML的全身体内模型，在NSG小鼠的尾静脉中注射MV4-11细胞，该细胞被设计为过度表达SKP2或空载体。通过循环人类DNA的PCR评估全身肿瘤负荷。2周后，将小鼠随机分组，开始化合物1治疗。在没有SKP2过表达的情况下，化合物1治疗后仅存在低水平的循环人类DNA，证实了化合物1对MV4-11模型的有效抗肿瘤作用(图5)。有趣的是，当SKP2过表达时，用化合物1治疗对全身肿瘤负担没有影响(图5)。总的来说，这些数据表明SKP2过表达在体内驱动对化合物1的抗性。
为了确认化合物1治疗对白血病骨髓移植的影响，在治疗后14天，使用FACS分析骨髓(BM)中MV4-11肿瘤细胞的百分比。在没有SKP2过表达的情况下，化合物1导致白血病肿瘤细胞显著降低(图6A-C)。然而，当SKP2过表达时，化合物1对骨髓肿瘤负荷没有影响(图6A和D，E)。因此，SKP2的过表达能够在体内将敏感的AML细胞系转化为耐药细胞系，这提供了证据，表明低SKP2是对MDM2拮抗作用的重要生物标志物。
方法：
体内***性AML小鼠模型
雌性NSG小鼠(6-8周大)购自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)。给动物静脉注射5x106 MV4-11细胞，并通过循环人类DNA的PCR评估肿瘤植入。根据PCR检测到的全身肿瘤负荷，将小鼠随机分为治疗组。然后每周通过连续出血和PCR监测白血病负荷。每天对小鼠进行观察，并在出现晚期疾病(后肢瘫痪、不能进食/喝水、奄奄一息的嗜睡)时对其进行人道安乐死。
骨髓流式细胞术
在用化合物1治疗的第14天，从荷瘤小鼠中收获骨髓。骨髓细胞用PE-CF594抗人CD45(BD 562312)、BB515抗小鼠CD45(BD564590)和DAPI染色。植入骨髓中的人细胞的量以活小鼠CD45+细胞的百分比表示。
循环人DNA的PCR
在肝素化毛细管中收集血液样本，并将样本储存在-80℃下，直至分析。使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen，Cat：69504)提取DNA，并使用TaqManTM进行人DNA的PCR使用以下引物进行基因分型Master Mix(ThermoFisherScientific目录号：4371355)：
正向引物(101 F)，5′-GGTGAAACCCCGTCTCTACT-3′；
反向引物(206 R)，5′-GGTTCAAGCGATTCTCCTGC-3′；
水解探针(144RH)是5′-CGCCCGGCTAATTTTTGTAT-3′。
将小鼠TFRC用作数据标准化的参考测定(ThermoFisherScientificCat.4458366)
实施例6：SKP2表达与分离自患者的急性髓系白血病细胞对化合物1的敏感性相关
分离自患者的SKP2低急性髓系白血病细胞比SKP2高细胞对化合物1更敏感(图7)。SKP2低表达是患者来源样本中AML对MDM2拮抗剂敏感性的生物标志物。
方法：
评价原发性AML母细胞对化合物1的敏感性
一级冷冻AML样本购自NBS Biobank(俄罗斯莫斯科)。在由StemSpan SFEM II培养基(Stemcell，#09605)、1x StemSpan CD34+扩增补充物(Stemcell，#02691)、2％FBS和1％青霉素/链霉素组成的选定扩增培养基中培养13个原发性AML样品，所述扩增培养基具有高的blast含量(>80％)。为了评估化合物1在这些原代细胞上诱导细胞凋亡的能力，用两种化合物1浓度建立24小时凋亡测定，并使用Annexin V/PI染色通过流式细胞术测量细胞死亡。
原发性AML细胞SKP2蛋白表达的评估
使用ProteinSimple-Wes***(美国加利福尼亚州圣何塞)进行毛细管Western分析。所用抗体对SKP2(#4358)和TXN1(#2429)具有特异性，作为负载对照。用0.1×样品缓冲液稀释样品。然后将4份稀释样品与1份5×荧光主混合物(含5×样品缓冲液、5×荧光标准液和200mM DTT)并在95℃下加热持续5分钟，在该变性步骤之后，将制备的样品、阻断试剂、一级抗体(SKP2的1∶10稀释，TXN1的1∶100稀释)、HRP偶联的二级抗体和化学发光底物分配到测定板中的指定孔中。生物素化阶梯提供了每种测定的分子量标准。板加载后，分离电泳和免疫检测步骤在全自动ProteinSimple Wes***中进行。
广泛的研究证实了SKP2低表达是癌症，特别是AML对MDM2拮抗剂治疗敏感性的生物标志物。验证包括：基础水平与敏感性；基因敲除和过度表达；MDM2拮抗剂的特异性；行动机制研究；相关体内模型；和原发性AML患者样本。
实施例7：通过MDM2拮抗剂(化合物1)和IAP拮抗剂(ASTX660)的组合在急性髓系白血病(AML)细胞系中诱导凋亡的表征在用MDM2拮抗剂化合物1处理24小时、48小时或72小时后，通过裂解caspase-3细胞术分析具有野生型(WT)TP53的一组AML细胞系的凋亡诱导。
在用0.1μM化合物1处理后观察到一系列诱导的凋亡水平，并选择OCI-AML3(因为其在72小时后具有较低的凋亡诱导水平)，以分析化合物1与IAP拮抗剂ASTX660在添加TNFα的情况下的潜在组合作用。如图8(下图)所示，即使在72小时处理后，0.1μM化合物1单独处理也不会在OCI-AML3细胞中诱导高水平的凋亡。然而，当0.1μM化合物1与1μM ASTX660和1ng/ml TNF-α组合时，72小时后测量的OCI-AML3细胞凋亡水平协同增加，这表明MDM2拮抗剂与IAP拮抗剂组合对诱导AML细胞系中的细胞死亡具有潜在益处。
方法：
将OCI-AML3细胞以0.25x106个细胞/ml接种到6孔板中，置于有10％FBS的RPMI-1640培养基中，并在37℃的加湿的5％的CO2/空气培养箱中放置过夜。第二天，用0.1μM化合物1或1μM ASTX660+1ng/ml TNF-α或这些处理的组合处理细胞，并在37℃下孵育72小时(建立0.1％v/v的DMSO对照以进行比较)。72小时后，通过离心收集细胞并重悬于0.5ml的PBS+1％的FBS中。通过添加2μM的CellEvent caspase-3/7绿色检测试剂(Thermo Fisher，Paisley，UK)在37℃下30分钟，来分析切割的caspase-3的水平，然后在Guava easyCyte HT细胞仪中测定荧光染色的细胞(Merck Millipore，Kenilworth，NJ，USA)。在FL1(绿色)通道中记录了裂解的caspase-3染色，使用未染色和DMSO对照孔设置门控染色和未染色细胞群，从而计算凋亡细胞的百分比。
讨论：化合物1和ASTX660的组合
所描述的实验表明，SKP2低表达的p53 wt肿瘤对化合物1敏感，而SKP2高表达的p53 wt肿瘤则不那么敏感。例如，OCI-AML3系具有高水平的SKP2(图2A)，化合物1不会通过细胞凋亡诱导大量的细胞死亡(图2B和图8)。
多于一种能够诱导细胞凋亡的试剂的组合可以增加肿瘤对单一试剂的敏感性。IAP拮抗剂ASTX660的加入使OCI-AML3对化合物1诱导的细胞凋亡敏感(图8)，尽管根据本文所述的工作，OCI-AML3的特征是对化合物1不敏感。
药物配方实施例
(i)片剂配方
含有式(Io)化合物的片剂组合物通过将适量的化合物(例如50-250mg)与适当的稀释剂、崩解剂、压缩剂和/或助流剂混合来制备。一种可能的片剂包括50mg化合物和197mg乳糖(BP)作为稀释剂和3mg硬脂酸镁作为润滑剂并以已知方式压制形成片剂。压制而成的片剂可以任选地进行薄膜包衣。
(ii)胶囊配方
通过将100-250mg式(Io)化合物与等量乳糖混合并将所得混合物填充到标准硬明胶胶囊中来制备胶囊配方。可以根据需要以适当的量包括适当的崩解剂和/或助滑剂。
(iii)可注射配方I
可以通过将分子式(Io)化合物(例如，以盐形式)溶解在含有10％丙二醇的水中以得到浓度为1.5％(重量比例)的活性化合物，来制备通过注射施用的肠胃外组合物。然后将溶液做等渗处理，过滤灭菌或最终灭菌，装入安瓿或小瓶或预填充注射器中，并密封。
(iv)可注射配方II
注射用肠外组合物通过将式(Io)化合物(例如盐形式)(2mg/ml)和甘露醇(50mg/ml)溶解在水中，无菌过滤溶液或通过末端灭菌，并填充到可密封的1ml小瓶或安瓿或预填充注射器中来制备。
(v)可注射配方III
可通过将式(Io)化合物(例如盐形式)以20mg/ml溶解于水中，然后调整为等张力来制备用于注射或输注静脉注射的配方。然后将小瓶密封，并通过高压灭菌，或装入安瓿或小瓶或预填充注射器中，通过过滤灭菌，并密封。
(vi)可注射配方IV
可通过将分子式(Io)化合物(例如，以盐形式)以20mg/ml溶解在含有缓冲液(例如，0.2M乙酸盐，pH 4.6)的水中来制备通过注射或输注进行静脉内输送的配方。然后将小瓶、安瓿或预填充注射器密封，并通过高压灭菌或通过过滤灭菌，并密封。
(vii)皮下或肌肉内注射配方
通过将分子式(Io)化合物与药用级玉米油混合以得到5-50mg/ml的浓度来制备用于皮下或肌肉内施用的组合物。将组合物灭菌，并装入合适的容器中。
(viii)冻干配方I
将调配的分子式(Io)化合物的等分试样放入50ml小瓶中并冻干。在冻干期间，使用一步冷冻方案将组合物在(-45℃)下冷冻。将温度升至-10℃以进行退火，然后在-45℃下降至冷冻，然后在+25℃下初次干燥大约3400分钟，然后进行二次干燥，如果温度达到50℃，则增加步骤。将初次和二次干燥期间的压力设定为80毫托。
(ix)冻干配方II
将调配的如本文所定义的分子式(Io)化合物或其盐的等分试样放入50mL小瓶中并冻干。在冻干期间，使用一步冷冻方案将组合物在(-45℃)下冷冻。将温度升至-10℃以进行退火，然后在-45℃下降至冷冻，然后在+25℃下初次干燥大约3400分钟，然后进行二次干燥，如果温度达到50℃，则增加步骤。将初次和二次干燥期间的压力设定为80毫托。
(x)用于静脉内施用的冻干配方III
通过将分子式(Io)化合物溶解在缓冲液中来制备水性缓冲溶液。将缓冲溶液装入容器(例如1型玻璃小瓶)，进行过滤以去除颗粒物质，然后将其部分密封(例如，通过Fluorotec活塞)。如果化合物和配方足够稳定，则通过在121℃下高压灭菌合适的时间段对配方进行灭菌。如果配方对高压灭菌不稳定，则可以使用合适的过滤器对其进行灭菌，并在无菌条件下装入无菌小瓶中。使用合适的循环将溶液冷冻干燥。冷冻干燥循环完成后，将小瓶用氮气回填至大气压力，加塞并固定(例如，用铝卷边)。对于静脉内施用，冷冻干燥的固体可以用药学上可接受的稀释剂，如0.9％盐水或5％右旋糖重构。溶液可以按原样给药，或可以在施用前进一步稀释到输注袋(含有药学上可接受的稀释剂，如0.9％盐水或5％右旋糖)中。
(xii)瓶装粉末剂
通过用式(Io)化合物填充瓶子或小瓶来制备用于口服施用的组合物。然后用合适的稀释剂，例如水、果汁或可商购获得的媒剂，如OraSweet或Syrspend对组合物进行重构。可以将重构的溶液分配到给药杯或口服注射器中以进行施用。
应当理解，本文描述的实施例和实施方式仅用于说明目的，并且将向本领域的技术人员提出根据其的各种修改或变化，并且将被包括在本申请的精神和范围内以及本申请的范围内。附加权利要求。本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请均出于所有目的通过引用整体并入本文。
序列表
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<223> 水解探针
<400> 3
cgcccggcta atttttgtat 20

Claims (41)

1.一种治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中所述癌症：
是SKP2缺失的。
2.根据权利要求1所述的MDM2拮抗剂，其中所述SKP2缺失通过以下方式确定：
直接确定SKP2水平；或
确定p27、p21、p57、E2F-1、MEF、P130、Tob1、cyclin D、cyclin E、Smad4、Myc、Mcb、RASSF1A、Foxo1、Orc1p、Cdt1、Rag2、Brca2、CDK9、MPK1和/或UBP43中的一种、两种、三种、四种或更多种的增加或高水平；或
确定p27和任选的p21、p57、E2F-1、MEF、P130、Tob1、cyclin D、cyclin E、Smad4、Myc、Mcb、RASSF1A、Foxo1、Orc1p、Cdt1、Rag2、Brca2、CDK9、
MPK1和/或UBP43中的一种或多种的增加或高水平。
3.根据权利要求1或2所述的MDM2拮抗剂，其中在治疗之前测试患者组织样本以确定癌症表达谱。
4.根据权利要求3所述的MDM2拮抗剂，其中所述样本包括癌症DNA、ctDNA或癌细胞。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的MDM2拮抗剂，其中所述测试包括检测蛋白质、mRNA和/或ctDNA的测定。
6.根据权利要求5所述的MDM2拮抗剂，其中，(i)蛋白检测使用免疫测定法、蛋白质结合测定法、基于抗体的测定法、基于抗原结合蛋白的测定法、基于蛋白质的阵列、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、蛋白质阵列、印迹、蛋白质印迹、比浊法、比浊法、色谱法、质谱法、酶活性、放射免疫测定法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫电化学发光法、免疫电泳法、竞争性免疫测定法，或免疫沉淀；和/或(ii)其中，使用RT-PCR或定量基因表达测定法检测mRNA。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的MDM2拮抗剂，其中基于所述确定的表达谱选择所述患者进行治疗。
8.根据任何前述权利要求所述的MDM2拮抗剂，其中所述癌症是血癌、白血病、淋巴瘤、髓系白血病或急性髓系白血病。
9.根据权利要求8所述的MDM2拮抗剂，其中所述癌症是具有易位t(15；17)的急性髓系白血病。
10.根据任何前述权利要求所述的MDM2拮抗剂，其中所述癌症是P53野生型。
11.根据任何前述权利要求所述的MDM2拮抗剂，其中所述癌细胞在所述治疗步骤之后发生细胞凋亡。
12.根据任何前述权利要求所述的MDM2拮抗剂，其中在至少一部分癌细胞中活化的caspase-3由MDM2拮抗剂诱导。
13.根据权利要求11所述的MDM2拮抗剂，其中在至少40％的癌细胞或至少60％的癌细胞中活化的caspase-3由MDM2拮抗剂诱导。
14.根据任何前述权利要求所述的MDM2拮抗剂，其中所述MDM2拮抗剂是分子式(Io)的化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或如本文定义的溶剂合物，例如，(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、药学上可接受的盐或溶剂化物。
15.根据任何前述权利要求所述的MDM2拮抗剂，其中，所述MDM2拮抗剂是选自由以下组成的组：化合物1、依达奴林(RG-7388)、HDM-201、KRT-232(AMG-232)、ALRN-6924、MI-773(SAR405838)、米拉德梅坦(DS-3032b)、APG-115、BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、BI-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64和
Figure FDA0004083338530000021
或互变异构体或溶剂化物或其药学上可接受的盐。
16.在人类患者的癌细胞样品中SKP2的表达水平作为生物标记物或生物标志物用于评估所述癌症是否易受MDM2拮抗剂治疗的用途，例如，其中所述MDM2拮抗物是式(Io)化合物或如本文所定义的互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，例如(2S，3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
17.一种预测或评估人类癌症患者对MDM2拮抗剂治疗的反应性的方法，包括评估SKP2癌症患者样品中的表达水平；
并确定测试的表达水平是否表明癌症应该用MDM2拮抗剂治疗。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述评估步骤包括将所述表达水平与(i)对用MDM2拮抗剂的治疗有反应或无反应相关的表达水平相比较，或(ii)来自健康同一类型非癌的细胞的表达水平相比较。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中，基于所述生物标志物概况将所述患者分类为一组，任选地其中所述组包括或由以下各项组成：
(i)有反应者和无反应者；或者
(ii)强烈的反应者。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中当SKP2的表达水平低于被鉴定为不适合治疗的患者时，患者被鉴定为特别适合治疗。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中，当检测到降低的SKP2表达相对于表达水平(i)与MDM2拮抗剂治疗无反应相关或(ii)来自相同类型的健康非癌细胞时，所述患者被鉴定为使用MDM2拮抗剂治疗。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其包括检测来自所述人类患者的癌细胞样本中生物标志物的表达水平的步骤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述检测是使用体外检测测定法进行的。
24.一种确定人类癌症患者对用MDM2拮抗剂治疗的易感性的方法，包括在患者的癌细胞样本中检测到以下的表达
SKP2；
并且，根据样本中生物标志物的表达水平，评估患者的癌症是否可能对MDM2拮抗剂的治疗产生反应。
25.一种检测患有癌症的人类患者中SKP2表达的方法。
26.根据权利要求25所述的方法，其包括以下步骤：
(a)从人类患者获取癌细胞样本；和
(b)通过将样本与一种或多种用于检测生物标志物表达的试剂接触来检测所述生物标志物是否在取样的癌细胞中表达。
27.根据权利要求17至26中任一项所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂是如本文定义的分子式(Io)的化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂合物，例如，(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
28.根据权利要求16至26中任一项所述的方法，其中MDM2拮抗剂是选自由以下组成的组：化合物1、依达奴林(RG-7388)、HDM-201、KRT-232(AMG-232)、ALRN-6924、MI-773(SAR405838)、米拉德梅坦(DS-3032b)、APG-115和BI-907828，或其互变异构体或溶剂化物或其药学上可接受的盐。
29.根据权利要求17至28中任一项所述的方法，其还包括通过施用MDM2拮抗剂来治疗所述患者的所述癌症的所述步骤。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂是如本文定义的分子式(Io)的化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂合物，例如，(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
31.根据权利要求29的方法，其中所述MDM2拮抗剂是选自由以下组成的组：化合物1、依达奴林(RG-7388)、HDM-201、KRT-232(AMG-232)、ALRN-6924、MI-773(SAR405838)、米拉德梅坦(DS-3032b)、APG-115BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、BI-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64和
Figure FDA0004083338530000041
或互变异构体或溶剂化物或其药学上可接受的盐。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中基于所述方法的结果向所述患者提供所述治疗。
33.一种用于检测来自人类患者的样品中对MDM2抑制的敏感性的至少一种生物标志物的表达水平的试剂盒或装置，包括用于检测SKP2的一种或多种检测试剂。
34.一种用于确定人类癌症患者是否适合用MDM2拮抗剂治疗的***，包括用于存储与来自所述患者的样本相关联的数据的存储存储器，所述数据包括与指示来自所述受试者的所述样本中生物标记物表达水平的所述生物标记物组相关的数据，所述生物标志物包括SKP2；和
处理器交互式地耦合到存储存储器，用于对患者进行分类。
35.根据前述权利要求任一项所述的MDM2拮抗剂的用途、用途、方法、试剂盒或***，其中所述癌症表现出SKP2丢失。
36.根据权利要求1至32中任一项所述的MDM2拮抗剂的用途、用途或方法，其中所述MDM2拮抗剂是与第二治疗剂组合治疗的一部分。
37.一种用于治疗具有正常或高SKP2表达的癌症的方法中的MDM2拮抗剂，其与诱导对MDM2拮抗药的敏感性的试剂例如降低SKP2水平的试剂组合。
38.一种治疗患者癌症的方法，其中，所述方法包括选择患者的步骤：
(a)在从所述患者获得的生物样品中具有正常或高水平的SKP2；和
(b)向步骤(a)中选择的所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂和诱导对MDM2拮抗剂的敏感性的试剂，例如降低SKP2水平的试剂。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的MDM2拮抗剂的用途、用途或方法，其中所述第二治疗剂或所述诱导对MDM2拮抗药敏感性的试剂是ASTX660。
40.一种包括MDM2抑制剂的药物组合物，其中所述MDM2抑制剂为(Io)式或互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或其溶剂化物的化合物，例如(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或其溶剂化物，用于治疗SKP2缺失的癌症患者。
41.一种用于治疗癌症患者的方法中的MDM2拮抗剂，其中所述方法包括：
(i)确定来自患者的样品是SKP2缺失的；和
(ii)为患者施用有效量的MDM2拮抗剂。
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