CN116179573B - 胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1在调控植物生长发育中的应用 - Google Patents

胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1在调控植物生长发育中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1在调控植物生长发育中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明公开一种分离的胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1的应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；并通过在胡萝卜中表达的DcGA2ox1的克隆、重组表达载体的构建、拟南芥和胡萝卜的转化以及上述基因在调控转基因植株株高、开花和种子发育中的应用，结果显示：该基因过表达可以矮化植株，抑制花和种子发育，因此，该基因能够应用于植物生长发育调控中，为其在植物生长方面的研究提供了科学依据。

Description

胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1在调控植物生长发育中的 应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1在调控植物生长发育中的应用。
背景技术
胡萝卜(Daucus carota L.)，伞形科(Apiaceae)草本植物，是重要的园艺经济作物之一。胡萝卜也是世界十大蔬菜之一，同时胡萝卜的市场需求还在持续增长。胡萝卜肉质根富含类胡萝卜素、维生素和天然色素等营养成分，具有较高的营养价值。
赤霉素(Gibberellic acid，GA)是一类能促进植物生长的，具赤霉素烷环结构的植物激素，能够促进细胞、茎伸长，叶片扩展，单性结实，果实生长，打破种子体眠，改变雌雄花比率，影响开花时间，减少花果的脱落。
GA合成和代谢过程中的关键酶包括柯巴焦磷酸合酶(CPS)、内根—贝壳杉烯合成酶(KS)、内根—贝壳杉烯氧化酶(KO)、GA20–氧化酶(GA20ox)、GA–3β–羟基化酶(GA-3β-hydroxylase)和GA2-氧化酶(GA2ox)等。GA2ox基因编码的GA2-氧化酶在GA合成中起负调控作用，它能够通过2β羟基化使具有生物活性的GA及其直接合成前体分解为无活性的GA。
研究显示，GA2ox参与了植物生长发育的许多过程，如节间伸长、根生长、果实发育以及非生物胁迫响应等。但是目前还没有关于胡萝卜GA2ox基因的相关报道，这影响了利用该基因调控胡萝卜生长发育的研究。
发明内容
本发明的目的是提供胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1在调控植物生长发育中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用基因工程得到的含有DcGA2ox1的转基因植株矮化，雄蕊和种子发育受到抑制，该基因在调控植物生长发育方面具有广泛的应用前景。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1在调控植物生长发育中的应用，所述DcGA2ox1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
ATGGTGCTCGAGCAACCACAGTTGACTACTCCCACATTGCTTCATGGCGTTCCTGTCATTGACCTCTCAAACCCTGACTCTATTCCATGCCTTGTCAAGGCCTGTGAAGACTATGGTTTCTTCAAAGTTGTCAACCATGGCATCCCTGCTCATTTCATCTCCACTCTTGAGTCACAAGCCATCGATTTCTTTTCTTTACCTCTACATGAAAAAGAAAAGGCAGGACCTCCTCACCCTTTTGGCTATGGAAACAAGACCATTGGACGTAACGGCGACTTCGGCTGGCTTGAATATCTCCTCTTAACAACCGACCATGCCTTTGATTACCACAATCTTGCTTCTGTCTCTGCTCAGACCCCGGAAACTTTTAGGCGGGCTGTGAACGATTATGTATTTGCTGTGAAGAATATGGCATGTCAGATTCTGGAGCTTTTGGCGGATGGTTTGAGGATTCAAGAGAAGAATGTGTTTAGTAAACTTCTGATGGATGAACAGAGTGACTCTGTTTTTAGGCTGAATCACTATCCTCCCTCTCCAGATAAAAATTTGATTGGGTTCGGAGAACACACCGACCCACAAATCATATCTGTTCTGAGGTCTAATAACACCTCAGGCCTTGAAATCTGTTTGAAAGATGACAGCTCTTGGTTTTCAGTTCCTCCTGACCAAGACTCCTTCTTCATCAACGTTGGAGACTCTTTACAGGTGATGACTAATGTGAGGTTTAAGAGTGTGAAGCATAGGGTTTTGGCAAATAGTGAGAAATCAAGGGTGTCAATGATTTATTTCGGAGGACCACCACTAAGTGAAAAGATAGCTCCATTGCCTTCTTTGCTCATGGAAGGAGAGAACAGCAGTTTGTACAAGGAGTTTACTTGGTTCGAGTACAAAAAGTCTGCCTACAAGTCAAGGCTTGCTGACAATAGGCTCTGCCTGTTTGAGAAAATCGCAGCCTCATAA。
本发明还提供胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1表达的蛋白在调控植物生长发育中的应用，所述DcGA2ox1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:2如下所示：
MVLEQPQLTTPTLLHGVPVIDLSNPDSIPCLVKACEDYGFFKVVNHGIPAHFISTLESQAIDFFSLPLHEKEKAGPPHPFGYGNKTIGRNGDFGWLEYLLLTTDHAFDYHNLASVSAQTPETFRRAVNDYVFAVKNMACQILELLADGLRIQEKNVFSKLLMDEQSDSVFRLNHYPPSPDKNLIGFGEHTDPQIISVLRSNNTSGLEICLKDDSSWFSVPPDQDSFFINVGDSLQVMTNVRFKSVKHRVLANSEKSRVSMIYFGGPPLSEKIAPLPSLLMEGENSSLYKEFTWFEYKKSAYKSRLADNRLCLFEKIAAS*；“*”为终止子。
本发明还提供一种重组载体在调控植物生长发育中的应用，所述重组载体包含所述的DcGA2ox1。
本发明还提供一种重组基因工程细胞在调控植物生长发育中的应用，所述重组基因工程细胞包括所述的重组载体。
优选的是，所述调控植物生长发育包括调控植物株高以及调控花和种子发育。
优选的是，所述植物包括拟南芥和胡萝卜。
本发明还提供一种调控植物生长发育的方法，包括将胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1转入受体植物，调控所述受体植物生长发育；所述DcGA2ox1的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
优选的是，过表达所述DcGA2ox1，降低所述受体植物株高以及抑制花和种子发育。
优选的是，所述受体植物包括拟南芥和胡萝卜。
本发明公开了以下技术效果：
本发明从胡萝卜品种‘黑田五寸’中获得一个响应植株生长发育过程的基因DcGA2ox1，其为植物的一个新的赤霉素氧化酶基因，通过实验验证了，该基因在植物生长调控方面的功能，结果显示：通过基因工程获取的含有该基因的转基因植物株高变矮，植物雄蕊发育延迟，种子数量减少，证明该基因在调控植物生长方面具有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明转DcGA2ox1基因拟南芥植株筛选结果图；
图2为本发明WT拟南芥植株与转DcGA2ox1基因拟南芥T3代植株的生长状态对比图，其中WT表示野生型对照组，DcGA2ox1表示转DcGA2ox1基因拟南芥植株；
图3为本发明WT拟南芥植株与转DcGA2ox1基因拟南芥T3代植株的莲座叶生长状况和株高对比图，其中WT表示野生对照组，OE-11、OE-14和OE-34表示转DcGA2ox1基因拟南芥不同株系；
图4为本发明WT拟南芥植株与转DcGA2ox1基因拟南芥T3代植株的花发育对比图，其中WT表示野生对照组，OE-11、OE-14和OE-34表示转DcGA2ox1基因拟南芥不同株系；
图5为本发明WT拟南芥植株与转DcGA2ox1基因拟南芥T3代植株的种子发育对比图，其中WT表示野生对照组，OE-11、OE-14和OE-34表示转DcGA2ox1基因拟南芥不同株系；
图6为本发明WT拟南芥植株与转DcGA2ox1基因拟南芥T3代植株的荧光定量表达验证结果图，其中WT表示野生对照组，OE-11、OE-14和OE-34表示转DcGA2ox1基因拟南芥不同株系；
图7为本发明转DcGA2ox1基因胡萝卜植株筛选结果图；
图8为本发明对照胡萝卜植株与转DcGA2ox1基因胡萝卜植株的生长状态对比图，其中CK表示对照组，DcGA2ox1表示转DcGA2ox1基因胡萝卜植株。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1及其应用
1、试验方法
1.1胡萝卜总RNA的提取及cDNA的合成
采用RNA Simple Total RNA Kit(北京天根生化科技有限公司)从胡萝卜‘黑田五寸’样品中分别提取总RNA。用Prime Script RT reagent Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)将提取的总RNA反转录成cDNA。
1.2胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1的克隆
基于胡萝卜基因组和转录组测序信息，以拟南芥GA2ox家族为信息探针，进行检索分析，获得胡萝卜DcGA2ox1的基因序列。根据该序列设计一对引物：
正向引物(SEQ ID NO:3)：5’-ATGGTGCTCGAGCAACCACAG-3’；
反向引物(SEQ ID NO:4)：5’-TTATGAGGCTGCGATTTTCTC-3’。
以‘黑田五寸’cDNA为模板进行扩增，PCR反应体系为：模板DNA 2μL，上游引物1.5μL，下游引物1.5μL，PrimerStar Max Premix(2X)15μL，ddH2O 10μL；PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。PCR产物经质量体积分数1.2％琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，连接到pMD19-T载体(TaKaRa(大连)生物工程公司)，并转化大肠杆菌DH5α，提取质粒经PCR鉴定后委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.3DcGA2ox1基因的重组表达载体构建
(1)首先利用双酶切BamHI和SacI(Thermo Scientific)方法获得pCAMBIA1301的线性化载体，然后通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒(杭州唯特洁生化技术有限公司)纯化获得高纯度的pCAMBIA1301的线性化载体；
(2)将目的片段DNA和线性化载体pCAMBIA1301以3:1的摩尔比加到1.5mL的离心管中进行重组反应，混匀后在室温连接约30min，加入10μL的反应液到50μL的DH5a感受态细胞中，用移液器轻轻混匀，于冰上孵育30min，42℃水浴中热激45s后快速置冰上冷却2min；
(3)加入300μL LB液体培养基，37℃孵育45-60min。5000rpm离心2min收集菌体，弃掉部分上清，用剩余的培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有50mg/L Kan抗性的LB固体培养基上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养16-24h；
(4)挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定为阳性的菌落，挑取相应单菌落于含有50mg/L Kan抗生素的液体LB培养基中37℃、200rpm培养箱中培养过夜，提取质粒或将菌液直接测序以鉴定载体准确性。
(5)鉴定成功后，保存pCAMBIA1301-DcGA2ox1的质粒。
1.4重组载体转入农杆菌GV3101
(1)每100μL GV3101农杆菌感受态细胞中加入2μg重组载体pCAMBIA1301-DcGA2ox1，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2h；
(2)6000rpm离心1min收集菌体，留取100μL左右上清，轻轻吹打重悬菌体，将其均匀地涂布于含有50mg/L Kan和100mg/L Rif的YEB固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2天，挑取阳性克隆进行验证。
1.5拟南芥转化
1.5.1拟南芥的培养
将适量的野生型拟南芥种子置于1.5mL离心管中，用75％酒精洗涤3次，用5％NaClO洗涤1次。在超净工作台上用超纯水冲洗4-5次后，用灭菌后的接种环将种子均匀的铺在MS固体培养基上。将铺好的种子在4℃条件下春化3d，在光照培养箱中培养约10d。随后，选取长势一致的幼苗，种植在灭菌后的营养土中并在光培箱中继续培养。选取一个月左右的拟南芥幼苗为材料，用于转化实验。
1.5.2拟南芥遗传转化
在20mL的LB液体培养基中分别加入10μL Rif和20μL Kan，摇匀并接菌，28℃220rpm震荡活化8-10h后，得到农杆菌的活化菌液。在200mL的YEB液体培养基中分别加入100μL Rif和200μL Kan，再加入5-10mL的活化菌液，28℃220rpm震荡培养14-16h，至OD值1.6-2.0，4500rpm离心10min，沉淀菌体弃上清，自然晾干。在沉淀菌体中加入100mL 5％蔗糖和20μL SILWETL-77表面活性剂溶液重悬菌体，移液器吹打均匀、重悬菌体。将离心瓶中菌液加到平皿中，将拟南芥花序合拢，浸入平皿，轻轻晃动15s，转化完后搅匀菌液用黑袋子将植株套好，避光保湿24h。一周后再重复转化一次。
1.5.3阳性植株筛选
种植拟南芥T0代所收获的种子，将T0代种子消毒，接种含潮霉素的MS筛选培养基上22℃光照培养10d，筛选获得T1代阳性植株。将T1代阳性植株进行单株收种以获得T1代种子，继续进行潮霉素筛选获得T2代阳性植株，植株生长至10d时，用镊子取出，使用GUS染色试剂盒对T2代阳性植株和WT对照进行染色。获得的阳性植株移栽生长，提取叶片基因组DNA作为模板，以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4为上下游引物，参照Green Taq Mix试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)的说明进行PCR分子鉴定，确定T2代阳性植株，PCR鉴定结果如图1所示。
1.5.4拟南芥阳性植株表型观测
将野生型WT拟南芥与T2代种子同时播种于消毒后的营养土种，4℃春化3d，移入植物生长间，至生长45d，进行观察(结果如图2所示)。至生长70d时，对其主茎长度进行测定，作为拟南芥的株高(结果如图3所示)。
1.5.5拟南芥阳性植株花发育测定
上述野生型WT拟南芥与T2代种子播种后获取的T3代植株，分别对其野生型和转基因拟南芥植株花发育状态进行观察，测定花丝顶端与柱头顶端之间的差值，结果如图4所示。
1.5.6拟南芥阳性植株种子发育观测
上述野生型WT拟南芥与T2代种子播种后获取的T3代植株，分别对其野生型和转基因拟南芥植株生长发育后期长角果内种子发育情况和种子数目进行观察和统计，结果如图5所示。
1.5.7拟南芥阳性植株定量表达验证
(1)取野生型(WT)和转基因拟南芥株系OE-11、OE-14和OE-34的叶片样本并立即用液氮速冻后，保存于-80℃冰箱中，根据“1.1胡萝卜总RNA的提取及cDNA的合成”中方法获取RNA和cDNA；
(2)选择胡萝卜DcGA2ox1、拟南芥的19个基因和拟南芥中Actin的转录表达水平为内参序列设计表达检测引物，如表1。
表1引物序列
(3)实时定量PCR使用南京诺唯赞生物科技有限公司提供的ChamQ SYBR qPCRMaster Mix试剂盒，按照操作说明进行。
(4)目的基因相对转录表达水平的计算公式为2-ΔΔCt，ΔΔCt＝(Ct目的基因-CtActin))处理组-(Ct目的基因-CtActin)对照组。
(5)对数据进行分析处理，绘制相对表达量水平验证结果图，如图6所示。
1.6胡萝卜转化
1.6.1胡萝卜的培养
挑选带有胚的胡萝卜“黑天五寸”种子，在5ml离心管中浸泡12h，然后用75％的酒精清洗1次，再用40％的NaClO清洗1次，后在40％的NaClO中浸泡45min。于超净工作台中用灭菌后的ddH2O清洗3～5次，并置于滤纸上吸干水分。将种子铺于B5固体培养基上催芽，暗培养10d左右。将幼苗的下胚轴切成3～5mm长的段，并用作外植体。
1.6.2胡萝卜遗传转化
将农杆菌在含有100mg/L Rif和50mg/L Kan的YEB培养基中在28℃下在震荡培养18h。将培养物4000rpm离心15min，以OD600＝0.4的密度重新悬浮在含3％蔗糖和200μM乙酰丁香酮(pH5.2)的B5培养基中，并震荡培养1h。将下胚轴段浸入农杆菌悬浮液中15min，将外植体转移到B5固体培养基中，然后在黑暗25℃下共培养2d。
将侵染好的外植体转入锥形瓶，用灭过菌的ddH2O清洗4次，再加入含羧苄青霉素钠(Cb)的无菌ddH2O，放置于100rpm摇床上，清洗10min。随后将外植体转入B5筛选固体培养基中暗培养30d。
1.6.3愈伤组织的培养和转基因再生植株的分化
将有愈伤组织分化的外植体转入新的筛选培养基中继代培养，直至愈伤组织足够大。然后将其转移到不含激素的B5固体培养基中诱导生芽分化。将分化出的胚性芽放置光培养，待其长出真叶后进行观察。
1.6.4转基因胡萝卜鉴定
取筛选出的阳性植株的叶片提取DNA，利用PCR方法鉴定其含有DcGA2ox1基因，进行转基因植株的目的基因的分子验证，最终确认基因已经转入阳性植株。使用GUS染色试剂盒(上海浦迪生物科技有限公司)对阳性植株和对照植株进行染色，结果如图7所示。
1.6.5胡萝卜阳性植株表型观测
将对照植株与转基因胡萝卜植株在生长3个月后同时取样，结果如图8所示。
2、试验结果
(1)如图2和图3所示，结果显示将本发明克隆获得的胡萝卜DcGA2ox1基因转入拟南芥植株中获得的阳性植株，莲座叶生长缓慢，叶片少且较小，株高明显矮于对照植株。
(2)如图4所示，转基因植株的雄蕊发育明显受到抑制，表明DcGA2ox1基因的表达改变了受体植物的花发育。
(3)如图5所示，转基因植株的种子数量明显少于对照，表明DcGA2ox1基因的表达改变了受体植物的种子发育。
(4)如图6所示，荧光定量PCR结果显示转基因植株中的19个基因的表达水平均受到DcGA2ox1基因过表达的影响。
上述荧光定量表达与生理指标分析结果可证明：胡萝卜DcGA2ox1基因能显著矮化受体植株，抑制花发育和种子发育。
(5)如图7所示，PCR和GUS染色均显示胡萝卜DcGA2ox1基因已转入受体植物胡萝卜中。
(6)如图8所示，将本发明克隆获得的胡萝卜DcGA2ox1基因转入胡萝卜植株中获得的阳性植株，地上部生长缓慢，株高明显矮于对照。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1在调控植物生长发育中的应用，其特征在于，所述DcGA2ox1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述调控植物生长发育为降低植物株高、抑制雄蕊发育以及减少种子数目，所述植物为拟南芥。
2.胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1在调控植物生长发育中的应用，其特征在于，所述DcGA2ox1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述调控植物生长发育为降低植物株高，所述植物为胡萝卜。
3.胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1表达的蛋白在调控植物生长发育中的应用，其特征在于，所述DcGA2ox1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，所述调控植物生长发育为降低植物株高、抑制雄蕊发育以及减少种子数目，所述植物为拟南芥。
4.胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1表达的蛋白在调控植物生长发育中的应用，其特征在于，所述DcGA2ox1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，所述调控植物生长发育为降低植物株高，所述植物为胡萝卜。
5.一种重组载体在调控植物生长发育中的应用，其特征在于，所述重组载体包含权利要求1中所述的DcGA2ox1，所述调控植物生长发育为降低植物株高、抑制雄蕊发育以及减少种子数目，所述植物为拟南芥。
6.一种重组载体在调控植物生长发育中的应用，其特征在于，所述重组载体包含权利要求1中所述的DcGA2ox1，所述调控植物生长发育为降低植物株高，所述植物为胡萝卜。
7.一种重组基因工程细胞在调控植物生长发育中的应用，其特征在于，所述重组基因工程细胞包括权利要求5中所述的重组载体，所述调控植物生长发育为降低植物株高、抑制雄蕊发育以及减少种子数目，所述植物为拟南芥。
8.一种重组基因工程细胞在调控植物生长发育中的应用，其特征在于，所述重组基因工程细胞包括权利要求5中所述的重组载体，所述调控植物生长发育为降低植物株高，所述植物为胡萝卜。
9.一种调控植物生长发育的方法，其特征在于，包括将胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1转入受体植物，调控所述受体植物生长发育；所述DcGA2ox1的核苷酸序列如SEQID NO:1所示；所述调控植物生长发育为降低植物株高、抑制雄蕊发育以及减少种子数目，所述植物为拟南芥。
10.一种调控植物生长发育的方法，其特征在于，包括将胡萝卜赤霉素氧化酶基因DcGA2ox1转入受体植物，调控所述受体植物生长发育；所述DcGA2ox1的核苷酸序列如SEQID NO:1所示；所述调控植物生长发育为调控降低植物株高，所述植物为胡萝卜。
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