CN116179457A - 一种促进植物益生甲基杆菌叶际定殖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进植物益生甲基杆菌叶际定殖的方法。该方法利用甲基杆菌的突变株在植物叶际上进行定殖；该突变株是利用现代分子生物学技术敲除甲基杆菌ppsR基因序列或ppsR基因的启动子序列，或是通过随机***突变或定点***突变破坏ppsR基因序列降低ppsR结合到光合基因簇相关基因的启动子区域能力，或是通过定点突变改变ppsR基因的启动子序列，降低ppsR基因转录表达水平。本发明能够高效提高甲基杆菌作为植物益生菌和叶际菌肥的应用能力。实践证明，本发明获得了一种有效提高光合作用促进甲基杆菌在植物叶际上生长能力的技术策略，具有提高植物叶际定殖的显著效果，具有好的促农作物生长和生产的应用潜力。

Description

一种促进植物益生甲基杆菌叶际定殖的方法
技术领域
本发明涉及一种通过提高植物益生甲基杆菌的光合作用促进其在植物叶际定殖的方法，属于微生物技术和现代农业领域。
背景技术
微生物菌剂因其绿色高效、可持续施用、低副作用等优势特点在农业生产中应用越来越广泛。甲基杆菌(Methylobacterium和Methylorubrum)利用植物叶际生长代谢过程中释放的甲醇等有机碳一作为生长的唯一碳源和能源，形成植物叶际的一类优势菌群。许多甲基杆菌(如：稻谷甲基杆菌Methylobacterium oryzae、巢状甲基杆菌Mb.nodulans、扭脱甲基杆菌Methylorubrum.extorquens、耐辐射甲基杆菌Mb.radiotolerans、絮凝甲基杆菌Mb.gregans和西班牙甲基杆菌Mb.hispanicum)能够合成植物生长所需生长激素、***素以及释放次生代谢产物，从而促进玉米、大豆、花生、生菜、番茄、甜瓜等作物生长和抑制禾谷镰刀菌、立枯丝核菌等病原菌繁殖，是一种重要的植物叶际共生益生菌。目前美国等农业生物技术公司已开发出多种甲基杆菌菌肥和生物农药产品。
然而植物叶际表面释放甲醇随着昼夜波动且浓度低，导致叶际甲基杆菌面临寡甲醇碳源的逆境生态位，使得在不同作物上定殖效果差异大且普遍定殖效率低，促进作物生长和生产的效果不理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进植物益生甲基杆菌叶际定殖的方法，通过提高植物益生甲基杆菌的光合作用强度进而促进在植物叶际生态位定殖的方法，以弥补现有技术的不足。
基因组测序表明植物叶际分离到的甲基杆菌普遍含有光合作用所需的基因簇(Photosynthetic gene cluster，PGC)，包括合成细菌叶绿素a的bch基因簇，合成捕光蛋白复合体的puf基因簇，合成光反应中心蛋白复合体的puh基因簇，以及促进蛋白复合体自组装的调控基因lhaA和pucC，具有进行RC-II型光合作用的能力。然而在光暗循环培养下甲基杆菌的细菌叶绿素合成量显著低于其他种属的好氧不产氧光合细菌的含量，表明甲基杆菌的光合甲基代谢营养模式主要通过氧化同化甲醇获得生长所需的碳源和能量，光合作用仅能驱动光能转化成少量化学能。
因此，提高甲基杆菌光合作用能够增强在植物叶际微生物群落中的生长竞争力和适应度，提高在植物叶际生态下的定殖，增强对植物生长的益生作用。基于此，本发明提供一种通过提高甲基杆菌光合作用强度促进植物叶际上定殖的有效方法，以增强甲基杆菌促进农作物的生长和生产的能力。
为了提高甲基杆菌在植物叶际定殖能力，需要一种技术策略增强甲基杆菌光合作用产能效率。本发明发现在甲基杆菌中敲除ppsR基因，或通过***终止密码子使基因ppsR不能正常转录，显著提高光照培养下甲基杆菌合成细菌叶绿素a的含量和光合产能的能力，增强在甲醇等碳源上的生长能力，大幅提高植物叶际定殖效果。
结合上述研究，为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：
一种甲基杆菌的突变株，该突变株是利用现代分子生物学技术敲除甲基杆菌ppsR基因序列或ppsR基因的启动子序列，或是通过随机***突变或定点***突变破坏ppsR基因序列降低ppsR结合到光合基因簇相关基因的启动子区域能力，或是通过定点突变改变ppsR基因的启动子序列，降低ppsR基因转录表达水平。
所述现代分子生物学技术包括但不限于同源双交换技术、转座技术、CRISPR-Cas9技术等。
进一步的，所述甲基杆菌是指以有机碳一，包括甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、甲胺等作为生长的碳源和能源的一类呈粉色的革兰氏阴性细菌，包括但不限于稻谷甲基杆菌Mb.oryzae、结瘤甲基杆菌Mb.nodulans、扭脱甲基杆菌Mr.extorquens、耐辐射甲基杆菌Mb.radiotolerans、絮凝甲基杆菌Mb.gregans和西班牙甲基杆菌Mb.hispanicum。
一种促进植物益生甲基杆菌叶际定殖的方法，该方法利用所述甲基杆菌的突变株在植物叶际上进行定殖。
进一步的，该方法具体为：液体培养所述甲基杆菌的突变株至生长指数中后期，调整菌体浓度至OD600为0.5左右，以该菌悬液浸泡植物种子或滴灌植物根部或喷洒植物叶际。
所述甲基杆菌的突变株能够应用于促进植物叶际生长定殖中。
进一步的，所述甲基杆菌的突变株在制备植物益生菌或叶际菌肥中的应用。
进一步的，所述植物叶际是指植物出现在地表以上的部分，包含花、茎、叶、果实；所述植物主要包括但不限于玉米、小麦、大豆、花生、西红柿、黄瓜、甜瓜等蔬果作物，杜娟花、菊花、水仙花、绣球花等观赏植物，以及其他甲基杆菌叶际定殖的植物。
所述甲基杆菌的突变株在甲醇作为碳源或丙二醇碳源上，在给光的光暗循环实验室培养条件下，有效增强光合作用基因转录，提高光合作用强度，细菌叶绿素a的合成量显著高于野生菌。所述甲基杆菌的突变株在甲醇碳源或丙二醇碳源上，在光暗循环实验室培养条件培养下，细胞内ATP的含量显著高于野生菌。所述甲基杆菌的突变株在甲醇碳源或丙二醇碳源上，在光暗循环实验室培养条件培养下，具有显著高于野生菌的生长能力，包括提高生长速率和提高生物量得率。
本发明的优点和有益效果
本发明提供了一种甲基杆菌的改进菌株，敲除ppsR基因或启动子序列，或是通过***失活破坏ppsR基因，都能增强光合作用基因转录水平提高细菌叶绿素a的合成量，提高胞内ATP含量，提高在甲醇等碳源上生长能力，最终显著提高在不同科属植物叶际上定殖效果；经过实际验证，施用菌剂3周后植物叶际甲基杆菌的突变株定殖量达每克叶际植物鲜重108-109CFU以上。
本发明能够高效提高甲基杆菌作为植物益生菌和叶际菌肥的应用能力。实践证明，本发明获得了一种有效提高光合作用促进甲基杆菌在植物叶际上生长能力的技术策略，具有提高植物叶际定殖的显著效果，具有好的促农作物生长和生产的应用潜力。
附图说明
图1为甲基杆菌模式菌扭脱甲基杆菌野生菌株在光暗循环(LD)与纯黑暗(D)培养条件下光合作用相关基因的转录水平对比结果图(A)，与扭脱甲基杆菌光暗循环培养条件下产生细菌叶绿素a的高分辨质谱鉴定(B)。
图2为甲基杆菌模式菌扭脱甲基杆菌敲除基因ppsR突变菌株在光暗循环(LD)与纯黑暗(D)培养条件下光合作用相关基因转录水平对比结果图。
图3为扭脱甲基杆菌中敲除基因ppsR的突变菌株在1,2-丙二醇(A)及甲醇(B)碳源条件下细菌叶绿素a合成量均显著高于野生菌株的结果对比图。其中AM1_LD:光暗循环培养模式的扭脱甲基杆菌野生菌株；AM1ΔppsR_LD:光暗循环培养模式的扭脱甲基杆菌敲除基因ppsR突变菌株；AM1_D:纯黑暗暗培养模式的扭脱甲基杆菌野生菌株；AM1ΔppsR_D:纯黑暗培养模式的扭脱甲基杆菌敲除基因ppsR突变菌株；AM1ΔbchCXYZ和AM1ΔbchF：扭脱甲基杆菌敲除细菌叶绿素a合成途径关键基因的突变株。
图4为扭脱甲基杆菌中敲除基因ppsR的突变菌株生长速率和生物量积累显著高于野生菌株的结果对比图。其中AM1:扭脱甲基杆菌野生菌株；AM1ΔppsR:扭脱甲基杆菌敲除基因ppsR突变菌株；LD：光暗循环培养模式；D：纯黑暗培养模式
图5为扭脱甲基杆菌中敲除基因ppsR突变菌株(AM1ΔppsR)在拟南芥叶际定殖能力显著高于野生菌株(AM1)的结果对比图。
图6为扭脱甲基杆菌ppsR失活菌株(AM1ppsR*)在拟南芥叶际定殖能力显著高于野生菌株(AM1)的结果对比图。
图7为耐辐射甲基杆菌中敲除基因ppsR突变菌株(RA01)在拟南芥叶际定殖能力显著高于野生菌株(RA)的结果对比图。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。
本发明对所述的甲基杆菌(或突变株)实验室培养条件，采用30℃条件下培养；所述培养的方式优选为摇瓶培养，转速为80-200rpm，光暗循环培养模式选择光照强度在30-200μmol photons m-2s-1范围内，光照节律为8～16h光照、对应16～8h黑暗循环培养，纯黑暗培养模式全程保持避光。在本发明中，Hypho培养基的配制方法优选如下：大量元素(2X)：大量元素A：5.06g/LK2HPO4，2.585g/L NaH2PO4；大量元素B：0.4095g/L MgSO4·7H2O，1g/L(NH4)2SO4；若配制固体培养基，则在大量元素B中，加入琼脂30g/L。单独灭菌，使用时按照1：1比例混匀。微量元素：微量元素A和微量元素B分开储存，配置100mL 1000X微量元素。微量元素A：1g Na2EDTA，0.1gFeSO4·7H2O，用1M NaOH调pH至4；微量元素B：0.14g CaCl2·2H2O，0.1gMnCl2·4H2O，0.02g Na2MoO4·2H2O，0.03g CuSO4·5H2O，0.16g CoCl2·6H2O，0.44gZnSO4·7H2O，用HCl调pH至1-2。微量元素配制完成后用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，配好之后放在4℃冷藏保存，使用时按稀释1000倍比例添加。实验室标准培养条件甲醇和1,2-丙二醇浓度均为0.5％(v/v)。
具体实施例以扭脱甲基杆菌和耐辐射甲基杆菌为代表进行研究。
实施例1扭脱甲基杆菌在光暗循环培养模式下光合作用相关基因转录水平上调，合成细菌叶绿素
本实施例展示了扭脱甲基杆菌野生型菌株在光暗循环与纯黑暗两种培养模式下，光合基因的转录水平差异。光合细菌在光暗循环培养模式下其光合基因簇会受到调控表达，可以额外将光能转化为化学能，从而有助于菌体生长。
本实施例对扭脱甲基杆菌的光合基因簇是否受光照调控表达进行验证，在含有1,2-丙二醇(0.5％)的Hypho培养基中对菌体进行培养，光照条件为50-100μmol photons m- 2s-1，光照节律为12h光照/12h黑暗(纯黑暗培养作为对照)，30℃80rpm摇床条件下进行培养，对两种培养条件下生长到指数中后期的菌体进行RNA提取，利用RT-qPCR的方法对光合基因簇部分基因(bchC,bchX，bchY,bchZ，bchF，bchM，pufM,pufC,pufL,puhC,puhA,pucC)的转录水平变化进行测定，横坐标为验证的基因类型，纵坐标为该基因在光暗培养与黑暗培养条件下转录变化倍数的log2对数值。结果显示，所有检测基因，包括bchC,bchX，bchY,bchZ，bchF，bchM，pufM,pufL,puhC,puhA,pucC，在光暗循环培养下，转录水平都提高2倍以上，其中细菌叶绿素合成相关基因，包括bchC,bchX，bchY,bchZ，bchF，bchM，提高幅度接近或超过4倍(图1A)。为确认扭脱甲基杆菌合成细菌叶绿素能力及细菌叶绿素的结构亚型，首先将上述光暗循环培养条件下的菌体胞内色素进行提取，菌体用10倍体积的甲醇进行提取，过滤后利用高分辨率质谱进行定性分析。扭脱甲基杆菌胞内提取的细菌叶绿素和细菌叶绿素a标准品的质谱图完全一致(图1B)，证明其光暗循环培养条件下可产生细菌叶绿素a。
实施例2敲除基因ppsR进一步提高扭脱甲基杆菌光合作用相关基因转录水平
本实施例通过同源双交换敲除扭脱甲基杆菌的ppsR基因，获得扭脱甲基杆菌敲除ppsR突变菌株AM1ΔppsR。按照实施例1的方式进行培养以及光合基因簇部分基因(bchC,bchX，bchY,bchZ，bchF，bchM，pufM,pufC,pufL,puhC,puhA,pucC)转录水平进行分析，横坐标为验证的基因类型，纵坐标为该基因在光暗培养与黑暗培养条件下转录变化倍数的log2对数值。根据实验结果，RT-qPCR的分析显示负调控因子ppsR的敲除，导致在1,2-丙二醇作为碳源、光暗循环培养模式下，与纯黑暗培养相比，大部分光合基因(bchC,bchX，bchY,bchZ，bchF，bchM，pufM,pufL,puhC,puhA,pucC)的转录水平提高20倍以上，部分基因，包括细菌叶绿素合成基因(bchC,bchX)，光反应中心合成基因(pufL,pufM)和光捕获复合体基因(puhA)，提高幅度超过100倍(图2)，这表明ppsR基因的敲除解除了对扭脱甲基杆菌光合基因簇的负调控作用，使其对光照的响应显著增强。该ppsR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例3敲除基因ppsR提高扭脱甲基杆菌细菌的叶绿素a合成量
本实施例比较了光暗循环与纯黑暗两种培养模式下扭脱甲基杆菌敲除ppsR突变菌株AM1ΔppsR和野生型菌株AM1的胞内细菌叶绿素在1,2-丙二醇和甲醇两种碳源下培养的含量变化，1,2-丙二醇碳源下培养条件参考实施例1，甲醇下培养利用含有0.5％甲醇的Hypho培养基，光照条件为50-100μmol photons m-2s-1，光照节律为12h光照/12h黑暗(纯黑暗培养作为对照)，30℃200rpm摇床条件下进行培养。细菌叶绿素提取和定量方法参考实施例1，同时按照实施例2的方法将光合基因簇上的其他基因bchF和bchCXYZ进行敲除。根据1,2-丙二醇为碳源培养条件下的分析结果(图3A)，横坐标为不同培养条件下不同基因型的菌株，AM1_LD:光暗循环培养模式的扭脱甲基杆菌野生菌株；AM1ΔppsR_LD:光暗循环培养模式的扭脱甲基杆菌敲除基因ppsR突变菌株；AM1_D:纯黑暗暗培养模式的扭脱甲基杆菌野生菌株；AM1ΔppsR_D:纯黑暗培养模式的扭脱甲基杆菌敲除基因ppsR突变菌株；AM1ΔbchCXYZ_LD和AM1ΔbchF_LD：光暗循环培养模式下扭脱甲基杆菌敲除细菌叶绿素a合成途径关键基因的突变株。结果显示ppsR基因敲除显著提高了菌株在光暗循环下胞内细菌叶绿素a的含量，从0.144mg/g提高到0.241mg/g，提高幅度达67％，而敲除细菌叶绿素合成相关基因例如bchF和bchCXYZ后胞内检测不到细菌叶绿素a。在甲醇为碳源培养条件下(图3B)，光暗循环与纯黑暗两种模式下AM1均检测不到细菌叶绿素a，而扭脱甲基杆菌敲除ppsR突变菌株AM1ΔppsR在光暗循环与纯黑暗两种模式下培养，细菌叶绿素a的含量分别为0.198mg/g和0.319mg/g。以上结果表明，负调控因子ppsR的敲除，提高了扭脱甲基杆菌在1,2-丙二醇和甲醇两种不同碳源、光暗循环培养条件下细菌叶绿素a的合成能力。
实施例4敲除基因ppsR提高扭脱甲基杆菌的ATP合成量
本实施例展示了ppsR的敲除突变株和野生型菌株在光暗循环与纯黑暗两种培养模式下细胞内的能量水平差异，培养方法参考实施例1，ATP、ADP和AMP的提取利用冻干的细胞样品，加入2ml乙醇提取缓冲液(20％乙醇，70mM HEPES缓冲液，pH5.2)，100℃水浴3分钟后冰浴3分钟，离心后上清进行浓缩，随后用HPLC的方法，色谱柱Waters Spherisorb ODS2(4.6mm×250mm×5μm)，根据标准品的标准曲线进行定量分析，并根据ATP、ADP和AMP的含量计算细胞能荷EC值。根据ATP含量的测定分析(表1，其中AM1 D:纯黑暗培养模式的扭脱甲基杆菌野生菌株；AM1 LD:光暗循环培养模式的扭脱甲基杆菌野生菌株；AM1ΔppsR_D:纯黑暗培养模式的扭脱甲基杆菌敲除基因ppsR突变菌株；AM1ΔppsR_LD:光暗循环培养模式的扭脱甲基杆菌敲除基因ppsR突变菌株)，1,2-丙二醇为碳源的培养条件下，扭脱甲基杆菌敲除ppsR突变菌株AM1ΔppsR与野生菌株AM1相比，显著提高了光暗循环后胞内ATP合成量，从4.13nmol/mg提高到5.91nmol/mg，提高幅度达40％，根据能荷水平(Energy charge,EC)的分析，EC值从0.81提高到了0.84。在甲醇为碳源的培养条件下，扭脱甲基杆菌敲除ppsR突变菌株AM1ΔppsR与野生菌株AM1相比，光暗循环培养下胞内ATP合成量从5.17nmol/mg提高到6.71nmol/mg，提高幅度接近30％，根据能荷水平(EC)的分析(表1)，EC值从0.83提高到了0.85。以上结果表明，负调控因子ppsR的敲除，提高了扭脱甲基杆菌在1,2-丙二醇和甲醇两种不同碳源、光照循环培养条件下的胞内ATP的合成水平。
表1为扭脱甲基杆菌中敲除基因ppsR的突变菌株中胞内ATP合成量和细胞能荷显著高于野生菌株的结果对比
Figure BDA0003993522010000061
实施例5敲除基因ppsR提高扭脱甲基杆菌的生长速率与生物量得率
本实施例比较了光暗循环与纯黑暗两种模式下，扭脱甲基杆菌ppsR敲除突变株AM1ΔppsR和野生型菌株AM1在1,2-丙二醇和甲醇下的生长曲线及最高生物量积累，培养方法参考实施例3。图4A和图4C分别为1,2-丙二醇和甲醇为碳源下光暗循环(LD)和黑暗培养(D)条件下的菌体(AM1和AM1ΔppsR)生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为OD600下的吸光值。图4B和图4D分别为1,2-丙二醇和甲醇为碳源下光暗循环(LD)和黑暗培养(D)条件下的菌体(AM1和AM1ΔppsR)生物量最大值。1,2-丙二醇培养条件下(图4A和4B)，相同初始接种量，扭脱甲基杆菌敲除ppsR突变菌株AM1ΔppsR在光暗循环培养条件下，其生长过程中的吸光值OD600一直高于其它对照菌株，最高生物量达到1.37g/L，与其他对照组菌株相比提高23％～35％。在甲醇为碳源的培养条件下(图4C和4D)，扭脱甲基杆菌敲除ppsR突变菌株AM1ΔppsR和野生菌株AM1在光暗循环培养条件下，其生长过程中的吸光值OD600一直高于其黑暗培养条件下的对照菌株，扭脱甲基杆菌敲除ppsR突变菌株AM1ΔppsR在光暗循环培养条件下的最高生物量达到1.05g/L，与其他对照组菌株相比提高13％～23％。以上结果表明，负调控因子ppsR的敲除，提高了扭脱甲基杆菌在1,2-丙二醇和甲醇两种不同碳源、光照循环培养条件下的生物量得率，使其在相同浓度碳源培养下，生物量积累显著提高。
实施例6敲除基因ppsR提高扭脱甲基杆菌在拟南芥叶际定殖能力
本实施例展示扭脱甲基杆菌敲除ppsR突变菌株AM1ΔppsR在拟南芥叶际定殖能力增强。将扭脱甲基杆菌敲除ppsR突变菌株AM1ΔppsR与野生菌株AM1在一定浓度甲醇为碳源的条件下培养至指数中期，收集菌体，并用10mM MgCl2水溶液调整OD600至0.5。取灭菌拟南芥种子点种于含1％蔗糖的1/2MS培养基后，取5μl菌液浸泡种子，16小时光照与8小时黑暗的光暗节律条件下无菌培养三周。取拟南芥叶际部分，置于含有0.2％v/v silwet L-77的10mM MgCl2溶液震荡1小时，后稀释涂布于123mM甲醇碳源平板上，7天后分别计数其CFU，发现每克鲜重拟南芥定殖扭脱甲基杆菌敲除ppsR突变菌株AM1ΔppsR的活细胞数量高于野生菌株AM1约2.07倍，如图5所示。
实施例7通过***终止密码子使基因ppsR不能正常转录表达，提高扭脱甲基杆菌在拟南芥叶际定殖能力
本实施例通过同源双交换在基因ppsR第12个核苷酸位置***终止密码子UAA，获得扭脱甲基杆菌ppsR失活菌株(AM1ppsR*)，AM1ppsR*中ppsR基因不能正常转录表达，降低其对扭脱甲基杆菌光合基因簇的负调控作用。以实施例5所述方法检测扭脱甲基杆菌ppsR失活菌株AM1ppsR*与野生菌株AM1在拟南芥叶际定殖能力，发现每克鲜重拟南芥定殖扭脱甲基杆菌ppsR失活菌株AM1ppsR*的活细胞数量高于野生菌株AM1约2.37倍，如图6所示。
实施例8敲除基因ppsR提高耐辐射甲基杆菌在拟南芥叶际定殖能力
本实施例通过同源双交换在耐辐射甲基杆菌中将基因ppsR敲除，得到耐辐射甲基杆菌敲除基因ppsR突变菌株，以实施例5所述方法检测耐辐射甲基杆菌敲除基因ppsR突变菌株与野生菌株杂拟南芥叶际定殖能力，发现每克鲜重拟南芥定耐辐射甲基杆菌敲除基因ppsR突变菌株RA01的活细胞数量高于野生菌株RA约1.55倍，如图7所示。该ppsR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

Claims (8)

1.一种甲基杆菌的突变株，其特征在于，该突变株是利用现代分子生物学技术敲除甲基杆菌ppsR基因序列或ppsR基因的启动子序列，或是通过随机***突变或定点***突变破坏ppsR基因序列降低ppsR结合到光合基因簇相关基因的启动子区域能力，或是通过定点突变改变ppsR基因的启动子序列，降低ppsR基因转录表达水平。
2.如权利要求1所述的甲基杆菌的突变株，其特征在于，所述现代分子生物学技术包括同源双交换技术、转座技术、CRISPR-Cas9技术。
3.如权利要求1所述的甲基杆菌的突变株，其特征在于，所述甲基杆菌是指以有机碳一，包括甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、甲胺等作为生长的碳源和能源的一类呈粉色的革兰氏阴性细菌，包括但不限于稻谷甲基杆菌Mb. oryzae、结瘤甲基杆菌Mb. nodulans、扭脱甲基杆菌Mr. extorquens、耐辐射甲基杆菌Mb. radiotolerans、絮凝甲基杆菌Mb. gregans和西班牙甲基杆菌Mb. hispanicum。
4.一种促进植物益生甲基杆菌叶际定殖的方法，其特征在于，该方法利用权利要求1所述甲基杆菌的突变株在植物叶际上进行定殖。
5.如权利要求4所述的促进植物益生甲基杆菌叶际定殖的方法，其特征在于，该方法具体为：液体培养所述甲基杆菌的突变株至生长指数中后期，调整菌体浓度至OD600为0.5左右，以该菌悬液浸泡植物种子或滴灌植物根部或喷洒植物叶际。
6.如权利要求4所述的促进植物益生甲基杆菌叶际定殖的方法，其特征在于，所述植物叶际是指植物出现在地表以上的部分，包含花、茎、叶、果实；所述植物主要包括玉米、小麦、大豆、花生、西红柿、黄瓜、甜瓜蔬果作物，杜娟花、菊花、水仙花、绣球花等观赏植物，以及其他甲基杆菌叶际定殖的植物。
7.权利要求1所述甲基杆菌的突变株能够应用于促进植物叶际生长定殖中。
8.权利要求1所述甲基杆菌的突变株在制备植物益生菌或叶际菌肥中的应用。
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