CN116172201B - 一种万寿菊提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种万寿菊提取物及其制备方法和应用，属于植物提取技术领域。所述制备方法包括：(1)将万寿菊干制品按照1g：20mL～60mL的料液比加入到体积比为40％～60％的有机溶剂水溶液中，调节pH值至7～9，于20～65℃条件下浸提，分离得到萃取液；(2)去除萃取液中的有机溶剂，干燥后制得万寿菊提取物。通过本发明技术实现了万寿菊中抗氧化抗衰老功效成分的高效富集提取，本发明提供的提取物中主要成分鞣花酸和奎宁酸含量相对高。该提取物具有较强的抗氧化和抗衰老能力，在功能性食品、宠物食品、医药产品等领域中具有极大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种万寿菊提取物及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤衰老是指光、空气污染等环境因素和饮食、睡眠、运动等生活习惯因素导致的老化，主要表现为皱纹、皮肤松弛、粗糙、淡黄或灰黄色的皮肤变色、毛细血管扩张、色素斑形成等。常见的皮肤老化包括自然老化和光老化两种。后者指的是由于环境因素(UV辐射、吸烟、饮酒、吹风、冷热刺激、有害化学物品的接触等)引起的皮肤老化，而UV辐射是加速皮肤老化和加快自然衰老进程的主要因素。据估计，暴露皮肤的损伤约90％是由UV辐射引起的，长期暴露在UV照射下，会引起皮肤粗糙、红肿热痛、色素沉着、毛细血管扩张、皱纹加深加粗等现象，影响美容和美观，从而引发一系列皮肤病变，如日光性角化病、日光性雀斑样痣、日光性弹性纤维变性、胶样粟丘疹等，严重影响人类健康。引起皮肤光老化的机制多种多样且极其复杂，主要涉及氧化应激、DNA损伤、胶原蛋白流失、炎症反应等方面。
随着人们对食品健康与安全的日益重视，各类具有独特生理活性的天然产物正逐渐受到青睐。各种植物提取物(尤其是来自花部位)作为功效成分的产品成为市场的热点。天然花卉中含有大量的抗氧化性物质，能够有效清除或抑制ROS的产生，或通过上调抗氧化防御***和抑制皮肤炎症反应，提高皮肤胶原纤维及胶原蛋白含量，增强其抗氧化能力，在抗衰老等领域中有着非常巨大的开发潜力。
万寿菊(Tagetes erecta L.)为菊科万寿菊属一年生草本植物，头状花序单生，舌状花为黄色或暗橙色，管状花花冠为黄色。万寿菊作为一种观赏植物在世界各地广泛栽培，目前人们对万寿菊的认识主要集中在观赏性上，但实际上万寿菊同样具备非常高的食药价值。其干燥花蕾中含有丰富的生物活性物质(黄酮类、色素类、酚酸类化合物，以及挥发油、鞣质、蛋白质、糖苷等)，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等药理作用，因而有较高的食药价值。万寿菊的花瓣具有清热解毒，化痰止咳的功效，对呼吸道感染，支气管炎，眼角膜炎等具有良好的功效。
在实际万寿菊资源开发利用方面，其主要加工工艺仍为干制，仅少部分加工成花茶。对万寿菊提取利用往往是获得粗水提物，未明确万寿菊相应活性的实际功效成分。文献(Edible Flowers of Tagetes erecta L.as Functional Ingredients:PhenolicComposition,Antioxidant and Protective Effects on Caenorhabditis elegans)报道将其应用在抗衰老药品或食品中，但其中的主要功能因子和作用机制均不明朗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对万寿菊的活性成分进行高效提取的方法，并对万寿菊提取物的抗氧化抗炎功效进行深入研究，以填补目前万寿菊提取物在抗衰老成分的研究空缺。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种万寿菊提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将万寿菊干制品按照1g：20mL～60mL的料液比加入到体积比为40％～60％的有机溶剂水溶液中，调节pH值至7～9，于20～65℃条件下浸提，分离得到萃取液；
(2)去除萃取液中的有机溶剂，干燥后制得万寿菊提取物。
所述万寿菊指万寿菊植物未开放或初开的花蕾、花瓣、花蕊等。可用于本发明的万寿菊品种没有特别限制，可以是不同品种的万寿菊。
本发明采用的原料为万寿菊干制品，指新鲜万寿菊或普通晒干万寿菊经热风干燥至水分含量不超过10％的一类原料。原料可进行粉碎预处理，也可不经过粉碎预处理。优选的，对万寿菊干制品进行粉碎，有利于活性物质的溶出。
本发明研究表明，万寿菊提取物具有抗氧化、美白、延缓机体衰老等功效。进一步对万寿菊中护肤功效成分进行鉴定，明确万寿菊提取物中的主要活性成分包括：鞣花酸、奎宁酸、丁香酸、没食子酸、异槲皮苷和木犀草素，其中木犀草素首次在万寿菊中被发现。为了提高提取物中有效活性成分含量，本发明以成分性质为指导对提取方法进行优化。
步骤(1)中，通过控制料液比、pH条件、提取温度以及原料含水量，综合提高万寿菊提取物中总黄酮、总酚的含量，实现较高的提取率。
作为优选，所述有机溶剂为乙醇、甲醇或正丁醇，在所述有机溶剂水溶液条件下能有效提取上述活性成分。更为优选，有机溶剂水溶液的体积比浓度为50％。
作为优选，所述万寿菊干制品的含水量≤10％，含水量控制在10％以下，有利于提高提取物中活性成分的含量。
作为优选，万寿菊干制品与有机溶剂水溶液的料液比为1g：40mL。
本发明研究表明，在提取过程中，调节料液pH值在7～9条件下能够增加鞣花酸、奎宁酸溶解度，提高提取物中这两类成分的含量。鞣花酸具有抗氧化、抗炎和神经保护等活性，奎宁酸具有较好的抗氧化、抗癌、抗衰老等活性，通过提高这两类成分的含量，增强提取物在抗氧化、抗衰老方面的功效。
作为优选，利用碱性剂调节pH值至8±0.3；所述碱性剂为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢三钠、碳酸钾或碳酸氢钾。
浸提温度对目标成分尤其是黄酮类成分的提取影响较大，作为优选，浸提的温度为45～60℃。更为优选，浸提的温度为50℃。
作为优选，浸提的时间为20～30h。
作为优选，浸提过程中结合超声处理，超声条件为：超声频率300～500kHz，超声强度5～15W/cm2，时间为1.5～3.0h，超声结束后静置。更为优选，超声频率400kHz，超声强度10W/cm2条件下超声处理2h。
浸提结束后，将萃取液与万寿菊沉淀物分离，利用减压蒸发去除萃取液中的有机溶剂，得到浓缩液，再经冷冻干燥后得到万寿菊提取物。
本发明提供了一种由上述方法制备得到的万寿菊提取物。所述万寿菊提取物的活性成分以鞣花酸、奎宁酸、丁香酸、没食子酸、异槲皮苷和木犀草素为主。
在上述条件下制备的万寿菊提取物中总黄酮重量含量为16％～30％，总酚含量为50％～72％；其中鞣花酸的重量含量为1.2％～6.2％，奎宁酸的重量含量为0.4％～1.2％，异槲皮苷的重量含量为0.5％～2.7％，丁香酸的重量含量为0.3％～0.45％，没食子酸的重量含量为0.06％～0.3％，木犀草素的重量含量为0.04～0.1％。
本发明对制备的万寿菊提取物进行功效研究，由体外及体内实验验证，上述万寿菊提取物具有较强的抗氧化和抗衰老能力，食用能够有效发挥延缓衰老、美白等功效，因此可用于制备相关的食品或医药产品。
因此，本发明提供了所述万寿菊提取物在制备功能性食品或宠物食品中的应用。
进一步的，所述功能性食品为具有抗衰老延寿功效的食品如零食(饼干等)或饮品。所述宠物食品为具有抗衰老延寿功效的宠物饲料、宠物罐头或宠物零食。
本发明还提供了一种含有本发明的万寿菊提取物作为有效成分的组合物(包括食品组合物等)。这些组合物通过食用的方式用于机体的延缓衰老、抗氧化、抗炎等。
进一步地，所述组合物由0.01～99.9wt％的万寿菊提取物和作为余量的载体组成。
所述万寿菊提取物用于制备具有抗衰老、抗氧化等效果的健康食品或饮料，具体形式包括但不限于果蔬制品、肉蛋奶制品、焙烤食品、冷冻食品、粮食制品、水产制品、糖果及可可制品、甜味料、调味品、饮料、酒类、特膳食品等。
本发明具备的有益效果：
(1)通过本发明技术实现了万寿菊中抗衰老功效成分的高效富集提取，严格控制原料含水量以及浸提条件以提高提取物得率，进一步的，在浸提过程中调节料液pH至7～9，本发明增加这一工艺步骤有助于提高萃取液中活性成分鞣花酸、奎宁酸的溶解度，增加其含量，得到的万寿菊提取物质量好、品质稳定，并且工艺操作简便，对生产设备要求较低，利于产业化发展。
(2)本发明提供的提取物中主要成分鞣花酸、奎宁酸和异槲皮苷含量相对高，首次报道万寿菊提取物中含有木犀草素。该提取物具有较强的抗氧化和延缓衰老能力，食用能够有效发挥延缓衰老、减少皮肤色素沉积等功效，在功能性食品、宠物食品等领域中具有极大的应用前景。
附图说明
图1为万寿菊提取物总离子流图。
图2为提取物中鞣花酸母离子质谱图。
图3为提取物中鞣花酸子离子质谱图。
图4为提取物中奎宁酸母离子质谱图。
图5为提取物中奎宁酸子离子质谱图。
图6为提取物中丁香酸母离子质谱图。
图7为提取物中丁香酸子离子质谱图。
图8为提取物中没食子酸母离子质谱图。
图9为提取物中没食子酸子离子质谱图。
图10为提取物中异槲皮苷母离子质谱图。
图11为提取物中异槲皮苷子离子质谱图。
图12为提取物中木犀草素母离子质谱图。
图13为提取物中木犀草素子离子质谱图。
图14为上述6种化合物的结构式。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
原料万寿菊花蕾，由祁曦堂旗舰店处购买，统一经40℃烘制24h以上。
以下为通用方法：
1)总黄酮含量测定：
采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法。取稀释一定倍数的万寿菊提取物样品或芦丁标准液(0、30、60、90、120、150mg/L)2.5mL，加入150μL 5％亚硝酸钠溶液，摇匀后放置6min，再加入300μL 10％硝酸铝溶液摇匀后放置5min，加入1mL 1.0mol/L氢氧化钠溶液，用水定容至6mL，测定510nm处吸光值。分别以芦丁溶液浓度、吸光值为横、纵坐标作标准曲线，计算总黄酮含量，结果以100g万寿菊提取物中芦丁当量表示。
2)总酚含量测定：
采用福林酚法测定总酚。取稀释一定倍数的万寿菊提取物样品或绿原酸标准液(0、20、40、60、80、100mg/L)500μL，加100μL福林酚试剂，混匀后反应6min，加入1mL 7％Na2CO3，并定容至6mL，37℃下恒温反应90min后，测定750nm处吸光值。分别以绿原酸溶液浓度、吸光值为横、纵坐标作标准曲线，计算总酚含量，结果以100g万寿菊提取物中绿原酸当量表示。
3)提取物的定性、定量分析—UPLC高分辨质谱
通过UPLC-QE高分辨质谱对提取部位进行成分定性分析。测定条件为ACQUITY BEHC18柱(2.1mm×100mm，Waters)用于UPLC分析，柱温为40℃，流速为0.4mL/min，流动相为0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸-乙腈溶液(B)。流动相的梯度程序如下：0min(A:B＝95:5)、3min(A:B＝75:25)、4min(A:B＝35:65)和10min(A:B＝35:65)。进样量为10μL。QE在正负离子模式下工作。操作参数设定为：锥电压30v，毛细管电压2kv，源温度100℃。在95～1400的质荷比(m/z)范围内记录数据，扫描时间为0.25s，扫描间隔为0.02s，持续10min。在此基础上，结合质谱数据库Compound DiscovererTM检索匹配和文献查询，确定可能的成分。对新的及含量较高的成分利用UPLC-PDA进行定量分析。
实施例1
1、制备方法：将1kg干燥的水分含量≤10％(按照GB 5009.3-2016直接干燥法进行测定，若不符合水分含量要求则继续40℃烘制干燥)的万寿菊花瓣按1g：40mL料液比，加入50％(v/v)的乙醇水溶液，使用1mol/L Na2CO3溶液调节料液pH为8呈碱性，控制温度为50℃，于超声频率400kHz，超声强度10W/cm2，进行浸提2h以充分萃取并静置24h。通过离心将萃取液与万寿菊沉淀物分离，通过减压蒸发回收乙醇，得到浓缩液，经冷冻干燥后即得到万寿菊提取物。
2、对所得提取物的质量以及成分进行分析，成分鉴定结果如图1-13所示，明确了鞣花酸、奎宁酸、丁香酸、没食子酸、异槲皮苷和木犀草素为主要活性成分，结构式如图14所示。具体含量数据如表1所示。
实施例2
制备方法：将1kg干燥的水分含量≤10％(按照GB 5009.3-2016直接干燥法进行测定，若不符合水分含量要求则继续40℃烘制干燥)的万寿菊花瓣按1g：40mL料液比，加入60％(v/v)的甲醇水溶液，使用1mol/L CH3COOH溶液调节料液pH为7，控制温度为45℃，于超声频率400kHz，超声强度10W/cm2，进行浸提2h以充分萃取并静置24h。通过过滤将萃取液与万寿菊沉淀物分离，通过减压蒸发回收甲醇，得到浓缩液，经冷冻干燥后即得到万寿菊提取物。
对所得提取物的质量以及成分进行分析，具体数据如表1所示。
实施例3
制备方法：将1kg干燥的水分含量≤10％(按照GB 5009.3-2016直接干燥法进行测定，若不符合水分含量要求则继续40℃烘制干燥)的万寿菊花蕾按1g：60mL料液比，加入40％(v/v)的正丁醇水溶液，使用2mol/L NaOH溶液调节料液pH为9，控制温度为60℃，于超声频率400kHz，超声强度10W/cm2，进行浸提2h以充分萃取并静置24h。通过过滤将萃取液与万寿菊沉淀物分离，通过减压蒸发回收正丁醇，得到浓缩液，经冷冻干燥后即得到万寿菊提取物。
对所得提取物的质量以及成分进行分析，具体数据如表1所示。
对比例
1、料液比条件
对比例1-1，将实施例1中的料液比改成1g：10mL，其余同实施例1。
对比例1-2，将实施例1中的料液比改成1g：70mL，其余同实施例1。
2、温度条件
对比例2-1，将实施例1中的温度改成15℃，其余同实施例1。
对比例2-2，将实施例1中的温度改成70℃，其余同实施例1。
3、pH条件
对比例3-1，将实施例1中的pH改成6.5，pH调节液改为CH3COOH溶液，其余同实施例1。
对比例3-2，将实施例1中的pH改成9.5，其余同实施例1。
4、原料含水量条件
对比例4-1，将实施例1中的水分含量改成15％，其余同实施例1。
表1.不同制备方法参数下万寿菊提取物得率及各成分含量
得率单位：％；总黄酮含量单位：g芦丁当量/100g花提取物；总酚含量单位：g绿原酸当量/100g花提取物；各主要成分单位：％。
如表1所示，料液比、温度、pH值及原料含水量都会影响万寿菊提取物得率以及活性成分含量。其中，温度的影响较大，温度过高会破坏活性成分，尤其是黄酮类成分，此外鞣花酸会因受热而降解为没食子酸。而温度过低会导致提取得率低下。另外，浸提液pH在碱性条件下会增加鞣花酸、奎宁酸溶解度，使得提取物中这两类成分含量更高，但pH碱性过强时，黄酮类成分含量会降低。此外，当原料万寿菊水分含量大于10％时，提取物得率会降低。
活性检测例1：万寿菊提取物体外抗氧化能力研究
通过DPPH，ABTS，ORAC，FRAP法测定实施例1，2，3中万寿菊提取物体外抗氧化能力研究，数据如表2所示。具体方法如下：
1)DPPH法：
实验前精确称取20mg的DPPH溶于适量甲醇中，定容至500mL。以25μM～800μMTrolox为对照品，取稀释一定倍数的提取物溶液或对照品溶液100μL，加入3.9mL DPPH，37℃避光反应60min，于515nm波长处测定吸光值。以Trolox浓度为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线，结果以每克提取物中Trolox当量表示(mmol Trolox/g DW)。
2)ABTS法：
分别配制7.4mM ABTS以及2.6mM过硫酸钾，临用前等体积混合，37℃避光反应12h，稀释约27倍后，直至734nm下吸光值为约0.7后即可使用。以25μM～800μM Trolox为对照品，取稀释一定倍数的提取物溶液或对照品溶液100μL，加入3.0mL ABTS反应液，37℃避光反应60min后于734nm处测定吸光值。以Trolox浓度为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线，结果以每克提取物中Trolox当量表示(mmol Trolox/g DW)。
3)ORAC法：
配置pH 7.4，浓度为75mM磷酸盐缓冲液，以其为溶剂配制荧光素及AAPH溶液。以0～80μM Trolox为对照品，分别向黑色酶标96孔板中加入20μL提取物溶液(稀释一定倍数后)、120μL荧光素，37℃保温5min后加入60μL AAPH，使荧光素和AAPH终浓度分别为70nM和12mM，立即进入荧光酶标仪测定。测定条件为每2min测定一次，持续3h。激发波长及发射波长分别为485nm、530nm。以Trolox浓度为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线，结果以每克提取物中Trolox当量表示(mmol Trolox/g DW)。
4)FRAP法：
以40mM HCl为溶剂配置10mM TPTZ溶液，20mM FeCl3水溶液，30mM，pH＝3.6乙酸钠缓冲液，将三者以1:1:10(v/v/v)混合制得FRAP工作液(于2h内用完)。以FeSO4为对照品，取稀释一定倍数后的提取物溶液或对照品溶液100μL，加入3.0mL FRAP工作液，37℃避光反应60min后于595nm处测定吸光值。以FeSO4浓度为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线，结果以每克提取物中FeSO4当量表示(mmol FeSO4/g DW)。
表2.不同制备方法下万寿菊提取物的体外抗氧化能力
如表2所示，以实施例1中的提取方法制备所得的万寿菊提取物体外抗氧化性最好，即通过料液比为1g：40mL，萃取处理温度为50℃，萃取液调节pH＝8。
活性检测例2：万寿菊提取物美白功效研究
万寿菊提取物及其主要成分抑制酪氨酸酶活性研究，数据如表4所示。具体方法如下：
将提取物或各成分物质用250μL DMSO溶解并用缓冲溶液配成50mg/L的溶液，稀释成1mg/mL的溶液，按表3中反应液A1，A2，A3，A4组成，依次准备吸取等浓度的不同样品溶液和阳性对照溶液，缓冲溶液和酶溶液，充分混匀后放入37℃气浴中孵育10min，然后加入相应底物溶液，单酚酶40min后测定各反应液在475nm处的吸光值，二酚酶5min后测定各反应液在475nm处的吸光值。按照如下公式计算抑制率：
酪氨酸单酚酶/二酚酶抑制率/％＝[1-(ODA3-ODA4)/(ODA1-ODA2)]×100
表3.体外酪氨酸酶活性测定中的反应体系
| 反应液成分体系 | A1/mL | A2/mL | A3/mL | A4/mL |
| 目标溶液 | 0 | 0 | 0.3 | 0.3 |
| 缓冲溶液 | 0.4 | 0.5 | 0.1 | 0.2 |
| 底物(酪氨酸/L-DOPA) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 酪氨酸酶 | 0.1 | 0 | 0.1 | 0 |
表4.万寿菊提取物及其主要成分对酪氨酸单酚酶和酪氨酸二酚酶的抑制率
| 组别 | 酪氨酸单酚酶(％) | 酪氨酸二酚酶(％) |
| 实施例1 | 65.71 | 56.93 |
| 实施例2 | 65.45 | 55.47 |
| 实施例3 | 66.81 | 57.73 |
| 鞣花酸 | 69.45 | 50.28 |
| 奎宁酸 | 72.32 | 60.56 |
| 丁香酸 | 37.39 | 26.88 |
| 没食子酸 | 42.93 | 26.34 |
| 异槲皮苷 | 9.67 | 11.44 |
| 木犀草素 | 28.32 | 20.88 |
| 熊果苷(阳性对照) | 67.20 | / |
| 曲酸(阳性对照) | / | 62.03 |
酪氨酸酶活性可分为单酚酶(以酪氨酸为底物)和二酚酶(以多巴为底物)活性。如表4所示，实施例1、2、3中的万寿菊提取物的酪氨酸单酚酶的抑制率均大于65％，尽管稍弱于阳性对照熊果苷，但万寿菊提取物仍具有单酚酶抑制活性，其中主要成分鞣花酸抑制活性接近熊果苷。万寿菊提取物的酪氨酸二酚酶的抑制率均大于55％，其中主要成分鞣花酸、奎宁酸、丁香酸、没食子酸和木犀草素二酚酸抑制率均大于20％。因此，万寿菊提取物具有一定的美白功效，其主要成分鞣花酸、奎宁酸、丁香酸、没食子酸和木犀草素。
活性检测例3：万寿菊提取物延缓机体衰老作用研究
采用配制不同浓度溶液灌胃小鼠的方法，以观察万寿菊提取物延缓机体衰老的作用。具体方法如下：
选择88只健康昆明种小鼠，随机分为正常对照组、空白对照组、实施例1、实施例2、实施例3的万寿菊提取物(500mg/kg)。造模方法采用小鼠衰老模型，以生理盐水配置10％的D-半乳糖溶液，除正常对照组外，其余6组每天在颈背部皮下分别注射0.14g/kg的D-半乳糖溶液以构造小鼠衰老模型，连续给予D-半乳糖50天。从第二周开始，对各实施例万寿菊提取物低、高剂量组的小鼠，每天分别灌胃250mg/kg、500mg/kg的万寿菊提取物；正常对照组、空白对照组小鼠灌胃等量生理盐水。每日定时观察记录小鼠的体征行为及其活动情况，记录小鼠的体重变化、毛发光泽程度、采食状况、对刺激反应的灵敏度、激怒反应、嗜睡程度等。末次给药2h后，取出脑、脾、肾、肝，吸去血液，剪去脂肪、系膜。将小鼠脾脏，经生理盐水洗净后，用滤纸粘去脏器表面水分，称重并计算脾脏指数。将脑、脾、肾、肝制备成10％的组织匀浆，按试剂盒的说明方法，分别测定小鼠的脑、脾、肾、肝中SOD和MAD含量。实验数据通过SPSS 15.0统计软件进行方差分析，结果以(x±s)表示，组间采用t检验进行统计，P＜0.05为差异显著。
结果显示：正常对照组小鼠精神状态良好、行动敏捷、毛发光泽、不易抓取；空白对照组小鼠精神不振、行动迟缓、毛色枯槁不光泽、脱毛抓取时不反抗，易于抓取。给药组小鼠上述表现较空白对照组有良性逆转；万寿菊提取物各高剂量组较正常组小鼠外形无变化，活动如常。D-半乳糖空白对照组小鼠脾脏系数明显下降，与正常对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，脾脏指数随着万寿菊提取物剂量增大而明显升高。结果见表5。
正常小鼠组织中SOD含量较高，而衰老小鼠组织中SOD含量较低。万寿菊提取物能够提高小鼠脑组织SOD含量，与空白组相比，低剂量组的差异无统计学意义(P＞0.05)，高剂量组的差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)，接近正常水平。灌胃万寿菊提取物后，能够提高小鼠肾组织SOD含量，与空白组相比，低剂量组差异无统计学意义(P＞0.05)，高剂量组的差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)。万寿菊提取物能够明显提高小鼠肝组织SOD含量，与空白组相比，低、高剂量组的差异均具有显著的统计学意义(P＜0.01)。具体结果见表6。
正常小鼠组织的MDA含量较低，而衰老小鼠组织的MDA含量较高。万寿菊提取物能够降低小鼠脑组织MDA含量，与空白组相比，低剂量组的差异无统计学意义(P>0.05)，高剂量组的差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)，接近正常水平。灌胃万寿菊提取物后，能够降低小鼠肾组织MDA含量，与对照组相比，低剂量组差异无统计学意义(P＞0.05)，高剂量组的差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)接近正常水平。万寿菊提取物能够明显降低小鼠肝组织MDA含量，与空白组相比，低剂量组的差异均具有显著的统计学意义(P＜0.05)，高剂量组的差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)，并且MDA含量低于正常水平。具体结果见表7。
表5.万寿菊提取物对小鼠脾脏指数的影响
| 组别 | 万寿菊提取物(mg/kg) | 脾脏指数 |
| 空白组(模型组) | \ | 22.61±2.17 |
| 正常组 | \ | 30.77±1.71* |
| 实施例1低剂量组 | 250 | 27.83±1.54 |
| 实施例1高剂量组 | 500 | 30.67±2.05* |
| 实施例2低剂量组 | 250 | 25.17±1.95 |
| 实施例2高剂量组 | 500 | 28.24±2.16* |
| 实施例3低剂量组 | 250 | 20.63±1.92 |
| 实施例3高剂量组 | 500 | 29.11±2.72* |
注：与空白组相比，*P＜0.05
表6.万寿菊提取物对小鼠脑、肾、肝组织SOD含量的影响
注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
表7.万寿菊提取物对小鼠脑、肾、肝组织MDA含量的影响
注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
实验数据显示，万寿菊提取物能明显改善衰老小鼠脾脏指数、肝组织中SOD和MDA含量，说明万寿菊提取物能够有效抑制小鼠在衰老过程中脾脏和肝脏的损伤，具有保护免疫器官、改善免疫***的作用。因此，万寿菊提取物可有效提高机体免疫能力，通过清除体内氧自由基，抑制脂质过氧化进而起到延缓机体衰老作用。
活性检测例4：万寿菊提取物在抗宠物衰老药物或宠物食品中的潜在应用
动物(例如，猫和犬)的与年龄相关病况之一是氧化损伤，氧化应激机制是神经退行性疾病的重要发病机制。本实验以老龄化的3只犬，分别为：7岁贵宾犬，8岁边牧，7岁泰迪为研究对象，添加1％的万寿菊提取物于犬粮中，喂养90天，以验证万寿菊提取物在抗宠物衰老药物或宠物食品中的潜在应用。以喂养宠物犬后，宠物犬尿中的8-羟基脱氧鸟苷(氧化损伤的生物标志物)的尿水平来研究宠物体内的氧化状态，以活动能力和认知力两种指标来衡量对宠物衰老的改善作用。结果如表8所示。
表8.万寿菊提取物对宠物犬尿液中8-羟基脱氧鸟苷含量、活动能力和认知力的影响
注：认知力：有改善+，有明显改善++
结论：
(1)喂食万寿菊提取物后，衰老的宠物犬的尿中8-羟基脱氧鸟苷水平显著降低，说明宠物犬体内氧化状态明显改善。
(2)喂食万寿菊提取物后，衰老的宠物犬的活动能力和认识力均有明显改善，说明万寿菊提取物可以提高宠物犬的认知力，延缓其衰老进程。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例和对比例。显然，本发明不限于以上实施例和对比例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联系到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种万寿菊提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将万寿菊干制品按照1g：20 mL~60 mL的料液比加入到体积比为40%~60%的有机溶剂水溶液中，所述有机溶剂为乙醇、甲醇或正丁醇，调节pH值至7~9，于45~60℃条件下浸提，分离得到萃取液；
(2)去除萃取液中的有机溶剂，干燥后制得万寿菊提取物；
所述万寿菊提取物组成包括鞣花酸、奎宁酸、丁香酸、没食子酸、异槲皮苷和木犀草素，所述万寿菊提取物中总黄酮重量含量为16%~30%，总酚含量为50%~72%；其中鞣花酸的重量含量为1.2%~6.2%，奎宁酸的重量含量为0.4%~1.2%，异槲皮苷的重量含量为0.5%~2.7%，丁香酸的重量含量为0.3%~0.45%，没食子酸的重量含量为0.06%~0.3%，木犀草素的重量含量为0.04%~0.1%。
2.如权利要求1所述的万寿菊提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，有机溶剂水溶液的体积比浓度为50%。
3.如权利要求1所述的万寿菊提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述万寿菊干制品的含水量≤10%，料液比为1g：40 mL。
4.如权利要求1所述的万寿菊提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，浸提的时间为20~30 h。
5.如权利要求1所述的万寿菊提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，浸提过程中结合超声处理，超声条件为：超声频率300~500 kHz，超声强度5~15 W/cm2，时间为1.5~3.0h，超声结束后静置。
6.如权利要求1所述的万寿菊提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，利用碱性剂调节pH值至8±0.3；所述碱性剂为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢三钠、碳酸钾或碳酸氢钾。
7.如权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的万寿菊提取物。
8.如权利要求7所述的万寿菊提取物在制备功能性食品或宠物食品中的应用，其特征在于，所述功能性食品为具有抗衰老、抗氧化、美白功效的食品。
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