CN113151135A - 一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用 - Google Patents
一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113151135A CN113151135A CN202110536143.4A CN202110536143A CN113151135A CN 113151135 A CN113151135 A CN 113151135A CN 202110536143 A CN202110536143 A CN 202110536143A CN 113151135 A CN113151135 A CN 113151135A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus subtilis
- dac
- nprb
- recombinant
- chitobiose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title claims abstract description 88
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 title claims abstract description 88
- 101710086811 Chitooligosaccharide deacetylase Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 235000013305 food Nutrition 0.000 title abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 claims description 56
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 claims description 39
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 37
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 claims description 15
- 101150077915 oppA gene Proteins 0.000 claims description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 13
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 claims description 12
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 11
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 101150009126 C4 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 claims description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 48
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 48
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 39
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 4
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N Glc-NH2 Natural products O=CC(N)C(O)C(O)C(O)CO FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 8
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 6
- 229960001911 glucosamine hydrochloride Drugs 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- CBOJBBMQJBVCMW-BTVCFUMJSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-amino-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal;hydrochloride Chemical compound Cl.O=C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO CBOJBBMQJBVCMW-BTVCFUMJSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100544639 Bacillus subtilis (strain 168) yncM gene Proteins 0.000 description 4
- 101100544635 Escherichia coli (strain K12) yncI gene Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000010443 CRISPR/Cpf1 gene editing Methods 0.000 description 3
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N Lewis A pentasaccharide Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(C)=O)C(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)OC1CO DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010073261 Ovarian theca cell tumour Diseases 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 3
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 208000001644 thecoma Diseases 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- FZHXIRIBWMQPQF-VANKVMQKSA-N L-glucosamine Chemical compound O=C[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CO FZHXIRIBWMQPQF-VANKVMQKSA-N 0.000 description 2
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N beta-D-glucosaminyl-(1->4)-beta-D-glucosamine Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](N)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Substances [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 3-[[oxo(pyridin-4-yl)methyl]hydrazo]-N-(phenylmethyl)propanamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNC(=O)CCNNC(=O)C1=CC=NC=C1 NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YIFUFYZELCMPJP-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O YIFUFYZELCMPJP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BPANDPNDMJHFEV-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BPANDPNDMJHFEV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FOEHRHOBWFQSNW-KATARQTJSA-N Leu-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O FOEHRHOBWFQSNW-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- DAYQSYGBCUKVKT-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O DAYQSYGBCUKVKT-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- SJNZALDHDUYDBU-IHRRRGAJSA-N Lys-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O SJNZALDHDUYDBU-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BLIPQDLSCFGUFA-GUBZILKMSA-N Met-Arg-Asn Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BLIPQDLSCFGUFA-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- RCEAADKTGXTDOA-UHFFFAOYSA-N OS(O)(=O)=O.CCCCCCCCCCCC[Na] Chemical compound OS(O)(=O)=O.CCCCCCCCCCCC[Na] RCEAADKTGXTDOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000522615 Pyrococcus horikoshii Species 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- DOBIBIXIHJKVJF-XKBZYTNZSA-N Thr-Ser-Gln Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O DOBIBIXIHJKVJF-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N Thr-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-VPENINKCSA-N aldehydo-D-xylose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 229940054441 o-phthalaldehyde Drugs 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M sodium bicarbonate Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用,属于生物分子改造及基因工程技术领域。本发明通过对几丁二糖脱乙酰酶Dac的表达载体pP43NMKmut‑C4‑yncM‑Dac的信号肽进行筛选和优化,提高几丁二糖脱乙酰酶Dac的分泌效率,提高酶活,并构建了可以稳定高效表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的食品安全级工程菌株。与现有技术相比,几丁二糖脱乙酰酶胞外酶活得到了极大的提高。本转化方法简单易行,条件温和,高效环保,产物得率高。此法有利于解决传统合成法中污染严重,产率低下等问题,而且此法易于控制,利于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用,属于生物分子改造及基因工程技术领域。
背景技术
几丁二糖脱乙酰酶Dac属于糖类酯酶,对乙酰氨基葡萄糖单体依然具有很高的催化活性,在代谢途径中首先作用的底物为几丁寡糖GlcNAcn或几丁二糖GlcNAc2,从GlcNAcn或GlcNAc2的还原端水解下乙酰基团,生成非还原性末端部分乙酰化的GlcNAc-GlcN后,在外切氨基葡萄糖苷酶GlmA的水解作用下,将GlcNAc-GlcN水解成N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc和氨基葡萄糖GlcN,此后,几丁二糖脱乙酰酶Dac再作用于生成的N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc单体,将其水解成氨基葡萄糖GlcN。
相较于目前市场上存在的多针对以寡聚体或多聚体形式存在的乙酰氨基葡萄糖有催化活性的脱乙酰酶,来源于极端嗜热古菌Pyrococcus horikoshii的几丁二糖脱乙酰酶Dac可以利用N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc为底物进行单酶催化反应,实现氨基葡萄糖GlcN的一步高效生产。
氨基葡萄糖GlcN是一种重要的功能性单糖,在生物体的生长过程中起着不可替代的作用。作为组成黏膜分泌物、***、皮肤、肌腱、韧带和软骨等必不可少的成分,氨基葡萄糖GlcN在许多国家已被列为医药品行列。氨基葡萄糖GlcN除了在治疗软骨性关节炎方面有着良好的作用外,对肝癌细胞的生长也有一定的抑制作用。
目前,氨基葡萄糖GlcN在许多国家已被列入医药品行列,其生产方式一般为甲壳素水解法和微生物发酵法。其中,甲壳素水解法常用强酸热解以脱除乙酰基,容易产生大量的环境污染物,而且原料会受到地域和季节的限制,获得的产品中乙酰基的脱除程度不一致,导致产品均一性差。微生物发酵法虽然克服了化学水解法带来的严重污染,但发酵液中难以实现氨基葡萄糖GlcN的高浓度积累。由于氨基葡萄糖GlcN存在广泛的市场,因此,探寻一种更高效、更安全的氨基葡萄糖GlcN生产方法势在必行。
枯草芽胞杆菌作为一种典型的模式工业微生物,具有遗传背景清晰、基因编辑成熟等优点。随着对枯草芽孢杆菌遗传调控机制的不断揭示,作为异源蛋白表达“细胞工厂”的枯草芽胞杆菌已被证实基因组上包含很多对生长和异源酶表达不利的非必需基因,如:前噬菌体、菌体自溶、芽胞形成、异源酶转录负调控因子等基因,现如今通过对其基因组进行删减的手段,合理设计简化细胞内的调控代谢网络,为细胞减负的同时提高宿主对异源酶的生产效率,使其成为理想的底盘细胞。
例如记载于公开号为CN109777761B的中国发明专利中,公开了一种分泌表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的工程菌及其构建方法,通过融合表达几丁二糖脱乙酰酶Dac与yncM信号肽,并获得了5’端的非翻译区突变体,发酵60h胞外酶活最高为1548.7U/ml。
但是,目前的几丁二糖脱乙酰酶Dac的酶活较低,并且现有的几丁二糖脱乙酰酶Dac工程菌仍难以满足工业化利用酶法制备氨基葡萄糖GlcN的最低酶活需求,氨基葡萄糖GlcN在转化过程中的产量和转化率还较低,所以需要进一步提高氨基葡萄糖GlcN的产量。
发明内容
为解决现有技术中存在的几丁二糖脱乙酰酶Dac产量低、活性低、工程菌株传代不稳定、生长受限等问题,本发明旨在通过信号肽的筛选及优化,提高几丁二糖脱乙酰酶Dac的分泌效率;针对目标蛋白在枯草芽孢杆菌表达***中的优化改良,多是从转录、翻译、折叠、转运以及菌株改造等方面进行模块化的改造及组装,其中蛋白的转运与信号肽这一分泌元件有着密不可分的关系,由于对分泌机制了解有限,准确预算出一个蛋白的最佳信号肽还较为困难,现如今对信号肽的应用仍然处于探索阶段。虽然研究人员开发了有助于信号肽选择的预测工具,但预测数值和蛋白的实际分泌量似乎不成线性关系。
本发明通过信号肽的筛选及优化,底盘细胞的优化:以Bacillus subtilis 168为出发菌株,引入CRISPR/Cpf1无痕编辑***对底盘细胞NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr 6种胞外蛋白酶进行无义突变,同时将底盘细胞生长的非必需基因comA、oppA基因进行敲除,通过提高生物量来进一步提高氨基葡萄糖GlcN的产量,提升几丁二糖脱乙酰酶酶活。
本发明提供了一种重组枯草芽孢杆菌,所述重组枯草芽孢杆菌以p43NMK为载体,融合表达了几丁二糖脱乙酰酶与NprB信号肽,并在几丁二糖脱乙酰酶基因的5’非翻译区引入SEQ ID NO.3所示的DNA片段,引入位点位于启动子P43的+1转录起始位点后的8个碱基之后;将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的C4基因***重组质粒中NprB信号肽的5’端。
在本发明的一种实施方式中,所述重组枯草芽孢杆菌以pP43NMKmut-C4-NprB-Dac为载体,所述载体是在pP43NMKmut-C4-yncM-Dac基础上,采用NprB信号肽替换yncM信号肽,所述pP43NMKmut-C4-yncM-Dac载体公开于“几丁二糖脱乙酰酶的克隆表达与生物转化合成氨基葡萄糖的研究,姜竹,江南大学”论文当中。
在本发明的一种实施方式中,所述NprB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中,所述NprB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(即NprB信号肽优化后的NprB5信号肽),其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在本发明的一种实施方式中,几丁二糖脱乙酰酶来源于极端嗜热古菌,编码所述几丁二糖脱乙酰酶的基因序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中,所述p43NMK载体上的RBS序列GTAAGAGAGGAATGTACAC突变为GGAAGGGAGGAATAGAGAC。
在本发明的一种实施方式中,所述重组枯草芽孢杆菌以Bacillus subtilisWB600为宿主。
在本发明的一种实施方式中,所述重组枯草芽孢杆菌的宿主细胞为:以Bacillussubtilis 168为出发菌株,敲除Bacillus subtilis 168基因组上的NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr 6个胞外蛋白酶及comA和oppA基因。
在本发明的一种实施方式中,所述NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr基因在NCBI的登录号分别为:935981、939313、936384、939695、938430、937332;所述comA和oppA基因在NCBI的登录号分别为:937179、936398。
本发明还提供了一种制备几丁二糖脱乙酰酶的方法,所述方法应用上述重组枯草芽孢杆菌进行发酵制备。
在本发明的一种实施方式中,以2~6%(v/v)的接种量将重组枯草芽孢杆菌的种子液接种到TB发酵培养基中,培养条件为:30-40℃、160-260rpm培养45-85h。
本发明还提供了构建上述重组枯草芽孢杆菌的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)制备重组载体,所述重组载体是在pP43NMKmut-C4-yncM-Dac基础上,采用NprB信号肽替换yncM信号肽;得到重组表达载体pP43NMKmut-C4-NprB-Dac;所述NprB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,或所述NprB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示
(2)将步骤(1)制备得到的重组载体转入枯草芽孢杆菌,得到重组枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中,所述重组载体pP43NMKmut-C4-NprB-Dac上的RBS序列GTAAGAGAGGAATGTACAC突变为GGAAGGGAGGAATAGAGAC。
在本发明的一种实施方式中,所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌WB600为宿主。
在本发明的一种实施方式中,所述重组枯草芽孢杆菌的宿主细胞为:以Bacillussubtilis 168为出发菌株,敲除NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr 6个胞外蛋白酶及comA和oppA基因。
本发明还提供了一种制备氨基葡萄糖的方法,所述方法采用上述重组枯草芽孢杆菌,或上述方法制备得到几丁二糖脱乙酰酶为催化剂,以N-乙酰氨基葡糖为底物,制备得到氨基葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中,所述底物终浓度为65~185g/L。
在本发明的一种实施方式中,所述方法的反应条件为:在30-60℃条件下反应2-62min。
在本发明的一种实施方式中,所述方法为,采用上述重组枯草芽孢杆菌的发酵上清液为催化剂,所述发酵上清液,是将种子培养液按照2~6%(v/v)的接种量接到发酵培养基中,37~40℃培养45-85h,经10000-16000rpm、4℃离心1-5min。
在本发明的一种实施方式中,所述种子培养液为,在30-40℃条件下培养至OD600为3.0-6.0的重组枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中,所述发酵培养基成分:蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油4mL,KH2PO4 2.31g/L和K2HPO412.54 g/L。
本发明还提供了上述重组枯草芽孢杆菌在制备药物或膳食补充剂中的应用。
本发明还提供了上述重组枯草芽孢杆菌在制备氨基葡萄糖或含氨基葡萄糖的产品中的应用。
本发明还提供了一种提高几丁二糖脱乙酰酶Dac分泌效率的方法。
本发明还提供了一种提高几丁二糖脱乙酰酶Dac表达量的方法。
本发明还提供了一种提高几丁二糖脱乙酰酶Dac工程菌株生长速率的方法。
本发明还提供了一种Bacillus subtilis ZR6AA/pP43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac工程菌株的构建方法及其应用。
有益效果
(1)本发明通过对几丁二糖脱乙酰酶Dac的表达载体pP43NMKmut-C4-yncM-Dac的信号肽进行筛选和优化,并且对底盘细胞进行了优化,提高几丁二糖脱乙酰酶Dac的分泌效率,提高酶活,构建了可以稳定高效表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的食品安全级工程菌株。与现有技术相比,几丁二糖脱乙酰酶胞外酶活得到了极大的提高。本转化方法简单易行,条件温和,高效环保,产物得率高。此法有利于解决传统合成法中污染严重,产率低下等问题,而且此法易于控制,利于推广应用。
(2)本发明在Bacillus subtilis WB600/pP43NMKmut-C4-yncM-Dac重组菌株的基础上进一步改造,替换原始信号肽,构建的Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-NprB-Dac重组菌株发酵60h胞外酶活最高达3168U/mL,通过对信号肽优化,构建的Bacillussubtilis WB600/p43NMKmut-C4-NprB5-Dac重组菌株发酵60h胞外酶活最高达3682.2U/mL。
(3)本发明在Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-NprB5-Dac重组菌株的基础上进一步改造,通过将所述重组载体pP43NMKmut-C4-NprB5-Dac上的RBS序列GTAAGAGAGGAATGTACAC突变为GGAAGGGAGGAATAGAGAC,获得Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac重组菌株,该菌株发酵60h胞外酶活达4012.3U/mL。
(4)本发明通过对宿主细胞进行改造,以Bacillus subtilis 168为出发菌株,对底盘细胞NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr 6种胞外蛋白酶进行无义突变,敲除影响菌株生长的comA、oppA基因,提高生物量,减缓发酵后期菌株的裂解死亡,构建得到重组菌株Bacillus subtilis ZR6AA/p43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac,该菌株发酵60h胞外酶活最高达4774.2U/mL,较原始菌株提升了2.08倍。
附图说明
图1:本发明中几丁二糖脱乙酰酶Dac催化反应过程。
图2:本发明中不同信号肽菌株构建示意图。
图3:本发明实施例1中不同信号肽引导几丁二糖脱乙酰酶Dac分泌到胞外,胞外酶活及氨糖产量的比较。
图4:本发明实施例2中信号肽NprB的功能区域划分。
图5:本发明实施例2中信号肽NprB不同突变体引导几丁二糖脱乙酰酶Dac分泌到胞外,胞外酶活及氨糖产量的比较。
图6:本发明实施例3中不同翻译强度的RBS序列对几丁二糖脱乙酰酶Dac胞外酶活及氨糖产量的影响。
图7:本发明实施例3中所构建Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac与不产几丁二糖脱乙酰酶Dac的Bacillus subtilis WB600/p43NMK及原始生产几丁二糖脱乙酰酶Dac的Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-YncM-Dac的发酵上清液的SDS-PAGE分析情况;其中,泳道1,重组Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac的发酵上清液;泳道2,Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-YncM-Dac的发酵上清液;泳道3:Bacillus subtilis WB600/p43NMK的发酵上清液。
图8:本发明实施例5中以构建的新型底盘细胞Bacillus subtilis ZR6AA为表达宿主时,与以Bacillus subtilis WB600为表达宿主时,几丁二糖脱乙酰酶Dac胞外酶活的比较。
图9:本发明实施例5中以构建的新型底盘细胞Bacillus subtilis ZR6AA为表达宿主时,与以Bacillus subtilis WB600为表达宿主时,细胞的生长情况比较。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的解释说明。
下述实施例中所涉及的载体pP43NMKmut-C4-yncM-Dac公开于“几丁二糖脱乙酰酶的克隆表达与生物转化合成氨基葡萄糖的研究,姜竹,江南大学”论文当中。
下述实施例中所涉及的检测方法:
几丁二糖脱乙酰酶酶酶活力检测方法:
通过邻苯二甲醛显色法进行粗酶液酶活检测,具体方式如下:
取发酵60h的发酵液1mL,以1200rpm,4℃,2min条件离心,上清液即为粗酶液,底物为100g/L的N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc溶液。将待测粗酶液与底物各100μL分装于1.5mL EP管中,40℃预热5min。将预热后的100μL粗酶液加入100μL底物中,40℃震荡反应2min,精确计时,加入0.5mol/L HCl终止剂终止反应。以1200rpm,2min条件离心,取上清50μL于950μLPB1中,稀释20倍,混合均匀后取5μL加入100μL 1×OPA检测试剂中,震荡2min。利用酶标仪检测其在330nm处的吸光值。以失活后的酶液为反应空白对照。
氨基葡萄糖盐酸盐的标准曲线绘制,精确称取标准品(精确到0.0001g)配制0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L氨基葡萄糖盐酸盐溶液,取5μL加入100μL OPA检测试剂中,震荡1min,30℃保温2min。利用酶标仪检测其在330nm处的吸光值,绘制标准曲线。
酶活力计算公式如下所示:
式中:X:粗酶液酶活力(U/mL);A:粗酶液体积0.1(mL);B:底物溶液体积0.1(mL);M:加入终止剂后样品稀释倍数1.5;C:反应液GlcN浓度(g/L);D:空白液GlcN浓度(g/L)。T:反应时间2(min);60:1h为60min;215.6:标准样品氨基葡萄糖盐酸盐摩尔质量(g/mol);0.1:底物溶液体积数(mL)x:酶液稀释倍数20。
所涉及的检测试剂如下:
底物N-乙酰氨基葡萄糖溶液(100g/L):5g N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc溶于PB1中,用PB1定容至50mL。
PB1磷酸钠缓冲液(200mmol/L,pH 8.0):配制浓度为200mmol/L的NaH2PO4溶液和Na2HPO4溶液。18mL NaH2PO4溶液与390mL Na2HPO4溶液混匀。用pH测定仪测定pH值,确定pH8.0,室温储存。
PB2碳酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 10.5):配制浓度为100mmol/L的NaCO3溶液和NaHCO3溶液。18mL NaH2PO4溶液与390mL Na2HPO4溶液混匀。用pH测定仪测定pH值,确定pH10.5,室温储存。
DTT二硫苏糖醇(2mol/L):称取308.5mg二硫苏糖醇于1mL dd H2O中,混合均匀,密封低温保存。
10×OPA检测试剂:500mg邻苯二甲醛OPA加入100mL PB2中,混合均匀,密封低温避光保存。
1×OPA检测试剂:3mL 10×OPA,300μL无水乙醇,15μLDTT,加PB2定容到30mL,混匀后,密封低温避光保存。现用现配。
HCl终止剂(0.5mol/L):取1800μL盐酸于40mL dd H2O中。
几丁二糖脱乙酰酶酶活力定义:在40℃反应条件下,1h能转化1μmol底物N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc为1μmol产物氨基葡萄糖GlcN所需的酶量,称为一个酶活力单位,即1U=1μmol/h。
下述实施例中所涉及的培养基如下:
LB液体培养基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 10,121℃灭菌15min。
LB固体培养基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 10,琼脂粉20,121℃灭菌15min。
TB发酵培养基(g/L):酵母粉24,蛋白胨12,甘油4,KH2PO4 2.31,K2HPO4 12.54,115℃灭菌20min。
实施例1:重组枯草芽孢杆菌的构建、几丁二糖脱乙酰酶Dac的表达及信号肽的筛选具体步骤如下:
(1)选择同分泌途径的12条枯草芽孢杆菌内源信号肽,具体信号肽及其序列如表1所示:
表1:不同的信号肽及序列
(2)通过Simple cloning法,如图2所示,以重组质粒pP43NMKmut-C4-yncM-Dac(具体构建方法公开于“几丁二糖脱乙酰酶的克隆表达与生物转化合成氨基葡萄糖的研究,姜竹,江南大学”论文中)为模板,引物序列如表2所示,通过PCR扩增,经核酸电泳胶验证后转化大肠杆菌Escherichia coli DH5α并送测,测序结果正确的转化子提质粒后,转入表达宿主枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600。
表2:不同信号肽的引物序列
(3)使用接种环挑取携带不同信号肽的转化子在50mL离心管中进行种子培养。每管含有5mL添加卡那抗生素(10mg/mL)的LB液体培养基,抗生素添加体积为液体培养基体积的1‰,于37℃,220rpm,培养12h得到种子液;在500mL锥形瓶中,将制备得到的种子液以4%(v/v)的接种量转接至96mL添加卡那抗生素(10mg/mL)的TB液体培养基进行发酵培养,37℃、220rpm条件下培养60h,制备得到发酵液,将发酵液经4℃、12000rpm离心2min得到发酵上清液,即为粗酶液。
(4)对步骤(3)制备得到的粗酶液进行酶活的检测,结果如表3和图3所示。
(5)采用步骤(3)制备得到的发酵上清液为催化剂,取1mL发酵上清液,以终浓度为100g/L的N-乙酰氨基葡糖为底物,在40℃条件下反应2min,制备得到氨基葡萄糖盐酸盐,检测氨基葡萄糖盐酸盐的含量如表3和图3所示,其中Control代表信号肽为yncM的实验结果(具体催化反应原理如图1所示)。
表3:含有不同信号肽的重组菌发酵制备得到几丁二糖脱乙酰酶的酶活及采用含有不同信号肽的重组菌株制备氨基葡萄糖(简称氨糖)的产量
通过锥形瓶发酵验证,信号肽NprB为本次筛选所得到的最优信号肽,如图3,在发酵60h后上清液的酶活峰值达3168U/mL,氨糖的产量高达158.4mol/L,为所有重组菌株的最高水平。
实施例2:几丁二糖脱乙酰酶Dac优势信号肽的优化
对信号肽NprB进行优化,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的信号肽第1位的甲硫氨酸突变为赖氨酸,得到突变体M1K,命名为NprB1;
将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的信号肽第1位的甲硫氨酸突变为赖氨酸,第3位的天冬酰胺突变为赖氨酸,得到突变体M1K-N3K,命名为NprB2;
将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的信号肽第1位的甲硫氨酸突变为赖氨酸,第3位的天冬酰胺突变为赖氨酸,第5位的苏氨酸突变为赖氨酸,得到突变体M1K-N3K-T5K,命名为NprB3;
将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的信号肽第1位的甲硫氨酸突变为赖氨酸,第3位的天冬酰胺突变为赖氨酸,第5位的苏氨酸突变为赖氨酸,第9位的亮氨酸突变为谷氨酰胺,得到突变体M1K-N3K-T5K-L9Q,命名为NprB4;
将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的信号肽第1位的甲硫氨酸突变为赖氨酸,第3位的天冬酰胺突变为赖氨酸,第5位的苏氨酸突变为赖氨酸,第9位的亮氨酸突变为谷氨酰胺,第11位的亮氨酸突变为天冬氨酸,得到突变体M1K-N3K-T5K-L9Q-L11D,命名为NprB5;
涉及的引物序列如表4所示:
表4:不同突变体的引物序列
以pP43NMKmut-C4-NprB-Dac为模板,采用上述引物序列,通过PCR扩增,分别构建得到含有5种突变体NprB1、NprB2、NprB3、NprB4、NprB5的重组载体pP43NMKmut-C4-NprB1-Dac,pP43NMKmut-C4-NprB2-Dac,pP43NMKmut-C4-NprB3-Dac,pP43NMKmut-C4-NprB4-Dac,pP43NMKmut-C4-NprB5-Dac。
分别将上述重组载体按照实施例1的方法,以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisWB600为表达宿主,构建重组菌,并进行发酵培养并进行酶活检测及检测制备得到的氨基葡萄糖的含量。
通过锥形瓶发酵验证,如图5和表5所示,其中Control代表含有突变前的信号肽NprB的重组菌的实验数据。
表5:含有不同信号肽突变体的重组菌发酵制备得到几丁二糖脱乙酰酶的酶活及采用含有不同信号肽突变体的重组菌株制备氨基葡萄糖(简称氨糖)的产量
结果可以看出,含有信号肽突变体M1K-N3K-T5K-L9Q-L11D,即NprB5的重组菌株在发酵60h后上清液的酶活峰值达3682.2U/mL,氨糖的产量高达184.11mol/L。
实施例3:RBS序列优化
对重组载体上的RBS进行优化,具体步骤如下:
以实施例2制备得到的pP43NMKmut-C4-NprB5-R0-Dac(为了描述方便,将未优化之前的重组载体pP43NMKmut-C4-NprB5-Dac,记为pP43NMKmut-C4-NprB5-R0-Dac)为模板,引物如表6,进行PCR扩增,分别得到重组载体pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac,pP43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac,pP43NMKmut-C4-NprB5-R3-Dac,pP43NMKmut-C4-NprB5-R4-Dac,pP43NMKmut-C4-NprB5-R5-Dac。
表6引物序列
分别将上述重组载体按照实施例1的方法,以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisWB600为表达宿主,构建重组菌,并进行发酵培养并进行酶活检测,结果如图6和表7所示,其中Control代表含有原始RBS序列的重组菌的实验数据。
表7:含有不同RBS序列的重组菌发酵制备得到几丁二糖脱乙酰酶的酶活及采用含有不同RBS序列的重组菌株制备氨基葡萄糖(简称氨糖)的产量
如图6所示,重组菌株Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac发酵60h胞外酶活最高,达4012.3U/mL,氨糖的产量高达200.615mol/L。
所获菌株Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac与原始生产几丁二糖脱乙酰酶Dac的Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-YncM-Dac及不产几丁二糖脱乙酰酶Dac的Bacillus subtilis WB600/p43NMK的SDS-PAGE分析情况如图7所示,其中1、2、3三条泳道分别对应Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac、Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-YncM-Dac及Bacillus subtilis WB600/p43NMK,从图7可以看到在31.8kDa处有明显目的蛋白条带,证明几丁二糖脱乙酰酶Dac得到了表达。
实施例4:枯草芽孢杆菌底盘细胞Bacillus subtilis ZR6AA的构建
具体步骤如下:
通过Cas蛋白Cpf1的DNA内切酶活性实现CRISPR编辑,在引导RNA(crRNA)的介导下Cpf1蛋白会在基因组的特定位点进行切割,造成双链断裂。
1、crRNA载体构建
借助crRNA在线设计网站CRISPR-DT设计特异性高的crRNA,以减少脱靶现象的发生。以表8所列引物扩增待敲除基因comA、oppA的crRNA片段,然后与载体pcrF17NM(载体pcrF17NM的构建方法公开于CAMERS-B:CRISPR/Cpf1 assisted multiple-genes editingand regulation system for Bacillus subtilis,Yaokang Wu,Jiangnan University论文中)分别进行golden gate组装,转化至Escherichia coli DH5α,测序验证后表明成功构建4种crRNA载体。
表8:引物序列
2、同源修复模板载体构建
扩增待敲除基因comA和oppA的上下游同源臂(序列如表9所示),借助碧云天一步克隆连接酶将上下游同源臂与步骤1中构建的对应crRNA载体相连,构建敲除基因comA和oppA的同源修复模板载体,转化至Escherichia coli DH5α,测序验证。
表9:comA和oppA的上下游同源臂
3、Cas蛋白Cpf1感受态细胞制备
质粒pHT-XCR6(所述质粒pHT-XCR6的构建方法公开CAMERS-B:CRISPR/Cpf1assisted multiple-genes editing and regulation system for Bacillussubtilis,Yaokang Wu,Jiangnan University论文中)为Cas蛋白Cpf1表达载体,其中Cpf1受木糖的诱导调控。
将质粒pHT-XCR6转化至BSZR600(BSZR600的构建方法公开于CAMERS-B:CRISPR/Cpf1 assisted multiple-genes editing and regulation system for Bacillussubtilis,Yaokang Wu,Jiangnan University论文中,是一株以枯草芽孢杆菌168为出发菌株,敲除NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr 6个胞外蛋白酶,构建的一株6种胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌底盘细胞),然后再将阳性转化子制成感受态,具体步骤为:接种环挑取单菌落于2mL含有氯霉素(5mg/mL)抗性的液体LB培养基中,抗生素的添加体积为液体培养基体积的1‰,37℃,220rpm培养12h;测量OD600,以液体培养基LB和木糖稀释至OD600=1.0,木糖终浓度控制在3%,37℃,220rpm培养2h;此时菌株呈感受态状态,添加终浓度为10%的甘油后存于-80℃备用。
4、同源修复模板质粒转化
将步骤2中同源修复模板载体加入到步骤3中制备得到的Cas蛋白Cpf1感受态细胞中,37℃,220rpm培养2h;将菌液离心重悬于500μL含有氯霉素、卡那霉素和3%木糖的LB液体培养基中,37℃,220rpm培养12h,然后离心浓缩到150μL涂布添加有氯霉素、卡那霉素和3%木糖的LB固体培养基中,待LB固体培养基长出单菌落后进行菌落PCR验证是否完成基因编辑。
5、质粒的消除
以接种环挑取步骤4中制备得到的阳性菌落到添加有0.005%-0.006%十二烷基硫酸钠的无抗LB液体培养基中,37℃,220rpm培养6h后,进行无抗LB固体培养基划线,置于37℃培养箱培养12h后,挑取单菌落于含有氯霉素和卡那霉素的LB固体培养基上,进行质粒消除验证。质粒成功消除后获得新的枯草芽孢杆菌底盘细胞Bacillus subtilis ZR6AA;所述Bacillus subtilis ZR6AA菌株是以枯草芽孢杆菌168为出发菌株,敲除NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr 6个胞外蛋白酶,并且敲除comA和oppA基因。
实施例5:底盘细胞改造菌株发酵验证
具体步骤如下:
1、底盘细胞改造菌株感受态的制备
将实施例4中获得的新枯草芽孢杆菌底盘细胞Bacillus subtilis ZR6AA,参照实施例4的步骤3中Cas蛋白Cpf1感受态细胞制备方法,制备成感受态。
2、底盘细胞改造菌株发酵验证
将实施例3中制备得到的重组载体p43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac,转化至Bacillussubtilis ZR6AA,获得Bacillus subtilis ZR6AA/p43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac重组菌株;
按照实施例1的方法,将制备得到的重组菌株进行发酵并进行酶活检测,在发酵60h时,胞外酶活最高达4774.2U/mL,较原始菌株Bacillus subtilis WB600/pP43NMKmut-C4-yncM-Dac(图8中的空白对照1,其酶活为1548.7U/mL)提升了2.08倍,较实施例3中所获菌株Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac(图8中的空白对照2,其酶活为4012.3U/mL)提升了18.98%,结果如图8或表10所示,其中Control-1表示:Bacillussubtilis WB600/pP43NMKmut-C4-yncM-Dac重组菌;Control-2表示:Bacillus subtilisWB600/p43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac重组菌;△comA△oppA表示:Bacillus subtilisZR6AA/p43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac重组菌。
表10:不同重组菌发酵制备得到几丁二糖脱乙酰酶的酶活及其制备氨基葡萄糖(简称氨糖)的产量
重构底盘细胞后,重组菌株生长情况也得以改善,结果如图9所示,其中图9中的control代表Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac重组菌;△comA△oppA表示:Bacillus subtilis ZR6AA/p43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac重组菌。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用
<130> BAA210594A
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Arg Asn Leu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys Thr
1 5 10 15
Ala Ala Gln Met Val Phe Val Thr His Ala Ser Ala
20 25
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Lys Arg Lys Leu Lys Lys Thr Ser Gln Leu Asp Ala Gly Leu Cys Thr
1 5 10 15
Ala Ala Gln Met Val Phe Val Thr His Ala Ser Ala
20 25
<210> 3
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggtaccatta taggtaagag aggaatgtac acatggtcgt caacatgttc gaggacatcg 60
acacgttcga gga 73
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgaaaaaaa tcacaacaaa cgaacaattt aatgaactga ttcaa 45
<210> 5
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggtcgtca acatgttcga ggacatcgac acgttcgagg aagcgtttaa caagctgctg 60
cgcgaagtcc tggaatttga tctgcaaaat ccgttcaaag acgcgaagaa agtcctttgc 120
atcgaaccgc atccggacga ttgcgttatt ggaatgggcg gcacaatcaa aaaactgagc 180
gatatgggcg tcgaagtcat ctacgtttgc atgacagacg gctatatggg cacaacagac 240
gaaagcctgt caggacacga attagcagca atccgccgca aagaagaaga agaaagcgca 300
cgcctgctgg gcgttaaaaa gatctattgg ctgaactacc gcgatacaga actgccgtat 360
tcacgcgaag tccgcaaaga tctgacgaaa attctgcgca aagaacaacc ggacggagtt 420
tttgcaccag atccttggct tccgtacgaa tcacatccgg atcatagacg cacaggcttt 480
ctggcgattg aatcagttgc gtttagccag ctgccgaatt ttagcaacac ggatctggac 540
attggcctga atccgtataa cagcggaagc tttatcgcgc tgtactacac gcacaaaccg 600
aactacatcg tcgacatcac ggacctgatg gaactgaaac tgaaggcgat tcgcgtccat 660
agaagccagt ttccggacga tatttgggag aaatgggaac cgttcctgag aacaatcgcg 720
atgttctacg gcgaaaaaat cggcgttcgc tacggagaag gctttagaat tatgccgggc 780
ctgttctacc acatcacacc gtttacggac ctgatctga 819
<210> 6
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttgcgcaact tgaccaagac atctctatta ctggccggct tatgcacagc ggcccaaatg 60
gtttttgtaa cacatgcctc agct 84
<210> 7
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aaacgcaaat tgaaaaagac atctcagtta gacgccggct tatgcacagc ggcccaaatg 60
gtttttgtaa cacatgcctc agct 84
Claims (10)
1.一种重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,以p43NMK为载体,融合表达了几丁二糖脱乙酰酶与NprB信号肽,并在几丁二糖脱乙酰酶基因的5’非翻译区引入SEQ ID NO.3所示的DNA片段,引入位点位于启动子P43的+1转录起始位点后的8个碱基之后;将核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的C4基因***重组质粒中NprB信号肽的5’端。
2.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述NprB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示,编码所述几丁二糖脱乙酰酶的基因序列如SEQID NO.5所示。
3.如权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述p43NMK载体上的RBS序列GTAAGAGAGGAATGTACAC突变为GGAAGGGAGGAATAGAGAC。
4.如权利要求1~3任一所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,以枯草芽孢杆菌WB600为宿主。
5.如权利要求1~3任一所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述重组枯草芽孢杆菌的宿主细胞为:以Bacillus subtilis 168为出发菌株,敲除Bacillus subtilis 168基因组上的NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr 6个胞外蛋白酶及comA和oppA基因。
6.一种制备几丁二糖脱乙酰酶的方法,其特征在于,采用权利要求1~5任一所述重组枯草芽孢杆菌进行发酵制备。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,以2~6%的接种量将重组枯草芽孢杆菌的种子液接种到TB发酵培养基中,培养条件为:30-40℃、160-260rpm培养45-85h。
8.一种制备氨基葡萄糖的方法,其特征在于,采用权利要求1~5任一所述的重组枯草芽孢杆菌,或采用权利要求6或7的方法制备得到几丁二糖脱乙酰酶为催化剂,以N-乙酰氨基葡糖为底物,制备得到氨基葡萄糖。
9.权利要求1~5任一所述的重组枯草芽孢杆菌在制备药物或膳食补充剂中的应用。
10.权利要求1~5任一所述的重组枯草芽孢杆菌在制备氨基葡萄糖或含氨基葡萄糖的产品中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110536143.4A CN113151135A (zh) | 2021-05-17 | 2021-05-17 | 一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110536143.4A CN113151135A (zh) | 2021-05-17 | 2021-05-17 | 一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113151135A true CN113151135A (zh) | 2021-07-23 |
Family
ID=76876389
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110536143.4A Pending CN113151135A (zh) | 2021-05-17 | 2021-05-17 | 一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113151135A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114561386A (zh) * | 2022-02-21 | 2022-05-31 | 湖南农业大学 | 一种具有分子内伴侣特性的基因元件及其应用 |
CN114591881A (zh) * | 2022-03-17 | 2022-06-07 | 山东润德生物科技有限公司 | 一种分泌几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109777761A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-05-21 | 江南大学 | 一种分泌表达几丁二糖脱乙酰酶的工程菌构建及其应用 |
CN112553134A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-03-26 | 江南大学 | 一种在枯草芽孢杆菌中表达α-淀粉酶的方法 |
CN112680434A (zh) * | 2021-02-01 | 2021-04-20 | 江南大学 | 一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法 |
-
2021
- 2021-05-17 CN CN202110536143.4A patent/CN113151135A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109777761A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-05-21 | 江南大学 | 一种分泌表达几丁二糖脱乙酰酶的工程菌构建及其应用 |
CN112553134A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-03-26 | 江南大学 | 一种在枯草芽孢杆菌中表达α-淀粉酶的方法 |
CN112680434A (zh) * | 2021-02-01 | 2021-04-20 | 江南大学 | 一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
姜竹: "几丁二糖脱乙酰酶的克隆表达与生物转化合成氨基葡萄糖的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)基础科学辑》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114561386A (zh) * | 2022-02-21 | 2022-05-31 | 湖南农业大学 | 一种具有分子内伴侣特性的基因元件及其应用 |
CN114561386B (zh) * | 2022-02-21 | 2024-05-28 | 湖南农业大学 | 一种具有分子内伴侣特性的基因元件及其应用 |
CN114591881A (zh) * | 2022-03-17 | 2022-06-07 | 山东润德生物科技有限公司 | 一种分泌几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其应用 |
CN114591881B (zh) * | 2022-03-17 | 2023-07-21 | 山东润德生物科技有限公司 | 一种分泌几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112877272B (zh) | 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法 | |
CN108795916B (zh) | 一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用 | |
CN109486734B (zh) | 一种生产软骨素的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
CN113122490B (zh) | 双基因缺陷型工程菌及其在提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的应用 | |
CN113151135A (zh) | 一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用 | |
CN114874964B (zh) | 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用 | |
CN112301012B (zh) | 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法 | |
US20230272443A1 (en) | N-Acetylglucosamine-Producing Bacterial Strain As Well As Method Of Construction And Use Thereof | |
US10233439B2 (en) | Directed modification of glucosamine synthase mutant and application thereof | |
CN117363553A (zh) | 一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
CN113122527B (zh) | 一种酶活提高及最适pH改变的天冬氨酸酶突变体 | |
CN113073074B (zh) | 一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用 | |
JP4235262B2 (ja) | 組換え細菌宿主における非生来細菌性エキソ多糖の産生 | |
CN111411066B (zh) | 一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法 | |
CN111394410B (zh) | 一种高催化活性神经氨酸合酶及应用 | |
CN113528495A (zh) | 一种稳定表达几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 | |
CN108103049B (zh) | 一种嗜热l-天冬酰胺酶突变体及其筛选和发酵方法 | |
CN113430127B (zh) | 一种产l-乳酸的重组菌及其应用 | |
CN115948265A (zh) | 一种马克斯克鲁维单倍体酵母及其构建方法与应用 | |
CN110872595B (zh) | 抗酸表达盒及其在发酵产有机酸中的应用 | |
CN114107148B (zh) | 一种高产透明质酸的基因工程菌株及其应用 | |
CN112210544B (zh) | 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用 | |
CN117946984B (zh) | 泛酸合成酶突变体及其制备方法、构建体及其构建方法、泛酸生产菌株和应用及泛酸的制备方法 | |
CN115011536B (zh) | 一株双厌氧启动子诱导产高光学纯d-乳酸的工程菌及其制备方法与应用 | |
CN114591881B (zh) | 一种分泌几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210723 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |