CN116121379A - 用于诊断肺癌的标志物、核酸产品及试剂盒 - Google Patents

用于诊断肺癌的标志物、核酸产品及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种用于诊断肺癌的标志物、核酸产品及试剂盒，标志物包括SCARA5、ZNF323和DLX1中的一种或多种，通过检测上述标志物的甲基化水平诊断肺癌。本申请通过研究发现SCARA5、ZNF323和DLX1能够作为生物标志物，对早期肺癌进行高灵敏度、高特异性的筛查诊断。

Description

用于诊断肺癌的标志物、核酸产品及试剂盒
技术领域
本申请涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种用于筛查肺癌的组合物、试剂盒、应用及其方法。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。2020年肺癌占所有新发肿瘤病例的11.4％，占所有肿瘤死亡病例的18％。肺癌存在发病率高、死亡率高、五年生存率低的特点。因此在肺癌早期进行筛查和诊断已成为延长患者生存期、挽救患者生命的关键。
早期肺癌筛查的方法主要依靠影像学(例如胸部X线和胸部CT)，胸部X线虽然具有穿透力高、使用方便、辐射剂量小的特点，但分辨率低，很难发现直径＜5mm～6mm的病变，且存在死角，因此，临床不建议胸部X线用于肺癌的筛查。胸部低剂量CT(LDCT)筛查目前是国际公认的检测肺结节和早期肺癌诊断最有效的方法，然而，由于其高灵敏度，也容易检测到许多非肿瘤性肺结节，所以假阳性结节的大量检出是LDCT筛查亟需解决的重要问题。
发明内容
本申请研究发现，SCARA5、ZNF323、DLX1基因的甲基化与肺癌极具相关性。基于此，本申请提供一种高灵敏度、高特异性的用于诊断肺癌的标志物、核酸产品及试剂盒。
根据本申请的一个方面，提供了一种用于诊断肺癌的标志物，其特征在于，所述标志物包括SCARA5、ZNF323和DLX1中的一种或多种，通过检测所述标志物的甲基化水平诊断肺癌。
在其中一个实施例中，以GRCh38.p14为参考，通过检测以下区域中的一个或多个的甲基化水平诊断肺癌：
区域1：Chr8:27990673～27994673；
区域2：Chr6:28354271～28358271；
区域3：Chr2:172085507～172089674。
根据本申请的另一方面，提供了检测上述标志物的甲基化水平的试剂在制备诊断肺癌的产品中的应用。
根据本申请的另一方面，提供了一种用于诊断肺癌的核酸产品，所述核酸产品包括用于检测上述标志物的甲基化水平的引物对。
在其中一个实施例中，所述核酸产品还包括与所述引物对对应的检测探针。
在其中一个实施例中，所述引物对包括以下的一组或多组：
核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的用于检测SCARA5基因甲基化水平的第一引物对；
核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的用于检测ZNF323基因甲基化水平的第二引物对；及
核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的用于检测DLX1基因甲基化水平的第三引物对。
在其中一个实施例中，与所述第一引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；和/或，
与所述第二引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；和/或
与所述第三引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
在其中一个实施例中，还包括内参引物对和与所述内参引物对对应的内参探针。
在其中一个实施例中，所述内参引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
根据本申请的另一方面，提供了一种用于诊断肺癌的试剂盒，包括用于检测上述的肺癌的标志物的试剂。
在其中一个实施例中，所述试剂通过以下方法中的一种或多种来检测所述标志物的甲基化水平：
甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法、甲基化荧光定量PCR法和质谱法。
在其中一个实施例中，包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的一种或者多种，以及上述的核酸产品。
本申请通过搜集分析TCGA和GEO数据库中肺癌相关的甲基化数据，经过大量研究筛选出与肺癌极具相关性的基因：SCARA5、ZNF323和DLX1，上述基因的能够作为标志物对早期肺癌进行高灵敏度、高特异性地筛查诊断。
通过构建基因甲基化检测体系，筛选得到检测性能佳的核酸产品，经实验证明，本申请的核酸产品用于筛查肺癌的灵敏度>95％：在176例肺癌患者样本中检出168例；特异性>98％：在192例健康人样本中检出3例。
附图说明
图1为本申请实施例4中各基因组合检测样本的灵敏度和特异性结果。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本申请的一些实施方式提供了一种用于诊断肺癌的标志物，包括SCARA5、ZNF323和DLX1中的一种或多种，通过检测上述标志物的甲基化水平诊断肺癌。
甲基化水平指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念，又代表定量的概念。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
DNA甲基化是公认的最具肿瘤早筛价值的生物标志物，目前已有基于DNA甲基化检测的结直肠癌、胃癌等肿瘤筛查诊断产品获得FDA或CFDA的认证。
循环肿瘤DNA(ctDNA)是患者血液中游离的来自肿瘤细胞的DNA，肿瘤细胞坏死或者凋亡后，细胞中的DNA释放进入循环***，游离地存在于血液当中。通过检测ctDNA的相关基因甲基化状态，就可以获知体内肿瘤组织信息，从而为肿瘤诊断提供依据。
在其中一个实施例中，以GRCh38.p14为参考，通过检测以下一个或多个区域的甲基化水平来诊断肺癌：
区域1：Chr8:27990673～27994673；
区域2：Chr6:28354271～28358271；
区域3：Chr2:172085507～172089674。
本申请的一实施方式还提供了检测上述标志物甲基化水平的试剂在制备诊断肺癌的产品中的应用。
此外，本申请的一实施方式还提供了一种用于诊断肺癌的核酸产品，包括用于检测上述标志物甲基化水平的引物对。
在其中一个实施例中，上述核酸产品还包括与上述引物对对应的检测探针。
在其中一个实施例中，上述引物对包括以下的一组或多组：
核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的用于检测SCARA5基因甲基化水平的第一引物对；核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的用于检测ZNF323基因甲基化水平的第二引物对；及核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的用于检测DLX1基因甲基化水平的第三引物对。具体地，SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为5’-TTAGATTTTATTGTAGAAGT-3’；SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为5’-TCTAAATACTACCTAAAATA-3’；SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为5’-AGTTTTAATAGAGTATAATAGT-3’；SEQ ID No.5所示的核苷酸序列为5’-TTAAAACTATTTAAACACTTTC-3’；SEQ ID No.7所示的核苷酸序列为5’-TATTGGAGGTGAGGAAGA-3’；SEQ ID No.8所示的核苷酸序列为5’-CAAACCCAAACCTATAAT-3’。
在其中一个实施例中，与第一引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；与第二引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；与第三引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。具体地，SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为5’-TGGCGGCGAGAGTAGTTGTAG-3’；SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为5’-TAATCGTAATAGAGTTTAACGGTTTTA-3’；SEQ ID No.9所示的核苷酸序列为5’-TGGTAACGAGAGACGTTTATATATAG-3’。
在其中一个实施例中，上述核酸产品还包括内参引物对和与之对应的内参探针。
在其中一个实施例中，内参基因选自ACTB、GAPDH、ALDOA、PGK1中的一种或几种。
进一步地，内参基因选自ACTB。
在其中一个实施例中，上述内参引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11所示，上述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
具体地，SEQ ID No.10所示的核苷酸序列为5’-TAGGTAAAGATGAGTTTATATAAGGA-3’；SEQ ID No.11所示的核苷酸序列为5’-CAAACTATAACCTCTACAACCTTCAA-3’；SEQ IDNo.12所示的核苷酸序列为5’-TGGAATTTGTGGTTAGGAAGGAGGTTG-3’。
上述核酸产品能够在临床上高灵敏度、高特异性地对早期肺癌进行筛查。
另外，本申请的一实施方式还提供了一种用于诊断肺癌的试剂盒，包括用于检测上述标志物的试剂。
在其中一个实施例中，上述试剂通过以下方法中的一种或多种来检测标志物的甲基化水平：甲基化特异性PCR、甲基化芯片检测法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法、甲基化荧光定量PCR法和质谱法。
在其中一个实施例中，上述试剂盒包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的一种或者多种，以及上述用于诊断肺癌的核酸产品。
在其中一个实施例中，PCR反应试剂包括上述核酸产品、PCR缓冲液、dNTP、MgCl2和Taq DNA聚合酶。
在其中一个实施例中，核酸产品的浓度为8μM～12μM；PCR缓冲液的浓度可以是1×、2×、5×或10×；dNTP的浓度为8mM～12mM；MgCl2为20mM～30mM；Taq DNA聚合酶为4U/μL～6U/μL。
在一个具体示例中，核酸产品的浓度为10μM；PCR缓冲液为5×；dNTP的浓度为10mM；MgCl2为25mM；Taq DNA聚合酶为5U/μL。
上述用于诊断肺癌的试剂盒至少具有以下优点：快速、简便、高灵敏性、高特异性。
本申请还提供了一种检测上述标志物的甲基化水平的方法，包括步骤S10、S20和S30。具体地：
步骤S10：提取样本DNA。
在其中一个实施例中，上述样本为选自个体的生物样本，包括但不限于以下的一种或多种：细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、痰液、肺泡灌洗液、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞。
进一步地，上述样本为血浆。血浆中的游离DNA能用作检测肿瘤，具有对病人伤害小，特异性高等特点。
步骤S20：将提取得到的DNA进行甲基化转化，得到转化样本。
在其中一个实施例中，甲基化转化为亚硫酸盐转化或酶法转化。
步骤S30：以步骤S20得到的转化样本为模板，使用上述核酸产品对转化模板进行检测。
在其中一个实施例中，通过甲基化特异性PCR、甲基化芯片检测法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法、甲基化荧光定量PCR法和质谱法中的一种或多种对转化模板进行检测。
上述检测标志物的甲基化水平的方法至少具有以下优点：简单方便、灵敏度高、特异性高、能够在临床上辅助诊断早期肺癌。
具体实施例
下面将结合具体实施例和对比例对本申请作进一步说明，但不应将其理解为对本申请保护范围的限制。
实施例1：甲基化基因的筛选以及引物对、探针的设计
本申请通过在TCGA数据库挖掘数据以及对临床样本高通量甲基化测序构建肺癌相关的甲基化大数据集，采用生物信息学方法构建不同甲基化位点的分析模型，筛选出具有应用价值的血浆游离DNA甲基化生物标志物，通过对临床样本验证进一步筛选出具有高特异性、高灵敏度的甲基化标志物。
具体地，本申请通过如下步骤筛选适用于血浆游离DNA甲基化的候选靶标：基于TCGA数据库及临床样本高通量甲基化测序数据中肺癌患者和健康人群甲基化数据进行差异分析，筛选得到肺癌患者呈高甲基化而健康人群呈低甲基化的甲基化差异位点；进一步，对上述获得的甲基化差异位点在TCGA数据库其他18种癌症中进行甲基化差异分析，并提取在其他癌症呈低甲基化的甲基化差异位点；进一步，对筛选到的甲基化差异位点进行临床验证，最终确定了以SCARA5、ZNF323、DLX1基因甲基化为最佳检测靶标，设计了一种用于早期筛查诊断肺癌的核酸产品。
引物对和探针根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)公开的人类全基因组序列GRCh38.p14，使用Primer Express 3.0软件及Methyl Primer Express v1.0软件设计。分别包括用于检测SCARA5(以GRCh38.p14为参考，区域为Chr8:27990673～27994673)、ZNF323(区域为Chr6:28354271～28358271)、DLX1(区域为Chr2:172085507～172089674)基因甲基化的引物对和探针以及检测内参基因ACTB的引物对和探针。引物对及探针的核苷酸序列如表1所示。
表1引物和探针的核苷酸序列表
Figure BDA0003929379110000091
Figure BDA0003929379110000101
其中，用于检测SCARA5的探针SEQ ID No.3其5’端标记有报告荧光基团FAM，3’端标记有淬灭荧光基团BHQ；用于检测ZNF323的探针SEQ ID No.6其5’端标记有报告荧光基团FAM，3’端标记有淬灭荧光基团BHQ；用于检测DLX1的探针SEQ ID No.9其5’端标记有报告荧光基团FAM，3’端标记有淬灭荧光基团BHQ；用于检测ACTB的探针SEQ ID No.12其5’端标记有报告荧光基团JOE，3’端标记有淬灭荧光基团BHQ。
实施例2：一种用于肺癌筛查诊断的试剂盒
包括如表1所示的引物对和探针的用于肺癌筛查诊断的试剂盒。试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；其中，PCR反应液包括如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的引物和探针、如SEQ ID No.4～SEQ ID No.6所示的引物和探针、如SEQ ID No.7～SEQ ID No.9所示的引物和探针、如SEQ ID No.10～SEQ IDNo.12所示的引物和探针、PCR缓冲液、dNTP、MgCl2和Taq DNA聚合酶，引物和探针的对应关系具体如表1所示；引物和探针的浓度为10μM；PCR缓冲液为5×；dNTP的浓度为10mM；MgCl2为25mM；Taq DNA聚合酶为5U/μL；阳性质控品采用人甲基化基因组DNA，阴性质控品采用人非甲基化基因组DNA。
实施例3：试剂盒在筛查诊断肺癌中的应用
一、材料、试剂、仪器
核酸提取试剂和甲基化转化试剂盒均为本公司自研试剂；PCR缓冲液、dNTP、TaqDNA聚合酶购于Takara公司；MgCl2购于Sigma公司；引物和探针由上海生工有限公司合成；荧光定量PCR仪为ABI7500。
二、样本准备
阳性参考品为人甲基化基因组DNA，阴性参考品为人非甲基化基因组DNA，灵敏度参考品为10ng/mL人非甲基化基因组DNA中含有0.1％人甲基化基因组DNA；待处理样本为1例确诊肺癌患者的血浆样本和1例正常健康人的血浆样本。
三、DNA提取
1.在15mL离心管中加入2mL血浆样本，5mL核酸裂解吸附液和100μL磁珠，涡旋混匀，离心管于56℃放置10分钟；
2.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入1mL洗液A，混匀确保磁珠彻底重悬；
3.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，用10μL～100μL枪头尽量吸除残余液体，将离心管移至无磁性试管架上，打开管盖，室温干燥5min；
4.加入40μL洗脱液，盖紧管盖涡旋混匀、重悬磁珠，离心管置于56℃中孵育5min；
5.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，将洗脱液全部移至新的0.2mL PCR管中。
四、亚硫酸盐转化
1.在含有40μL DNA的0.2mL PCR管中加入110μL亚硫酸盐溶液，盖紧离心管后，涡旋混匀后短暂离心，将离心管置于普通PCR仪中进行反应，反应条件设置为95℃5min、60℃10min、95℃5min、60℃10min；
2.将反应结束后的DNA溶液转移到新的1.5mL离心管中，加入600μL结合液和10μL磁珠涡旋混匀，室温静置5min；
3.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500μL洗液A，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；
4.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入200μL脱磺液，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬，室温静置15min；
5.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500μL洗液B，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；
6.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500μL洗液C，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；
7.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500μL洗液D，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；
8.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，用10μL～100μL枪头尽量除去残余液体，将离心管移至无磁性试管架上，打开管盖，室温干燥5min；
9.加入50μL洗脱液，盖紧管盖涡旋混匀重悬磁珠，离心管置于56℃中孵育5min；
10.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，将全部洗脱液移至新的离心管中备用。
五、PCR流程
1.PCR反应液体系如表2～8所示；
表2.SCARA5基因甲基化反应液
Figure BDA0003929379110000121
Figure BDA0003929379110000131
表3.ZNF323基因甲基化反应液
单个PCR反应的组份 单个PCR反应的量
SEQ ID No.4(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.5(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.6(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.10(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.11(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.12(10μM) 0.25μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL
dNTP(10mM) 0.5μL
<![CDATA[MgCl<sub>2</sub>(25mM)]]> 5μL
PCR缓冲液(5×) 5μL
<![CDATA[dd H<sub>2</sub>O]]> 2.5μL
Total 15μL
表4.DLX1基因甲基化反应液
单个PCR反应的组份 单个PCR反应的量
SEQ ID No.7(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.8(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.9(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.10(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.11(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.12(10μM) 0.25μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL
dNTP(10mM) 0.5μL
<![CDATA[MgCl<sub>2</sub>(25mM)]]> 5μL
PCR缓冲液(5×) 5μL
<![CDATA[dd H<sub>2</sub>O]]> 2.5μL
Total 15μL
表5.SCARA5/ZNF323基因甲基化反应液
单个PCR反应的组份 单个PCR反应的量
SEQ ID No.1(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.2(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.3(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.4(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.5(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.6(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.10(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.11(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.12(10μM) 0.25μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL
dNTP(10mM) 0.5μL
<![CDATA[MgCl<sub>2</sub>(25mM)]]> 5μL
PCR缓冲液(5×) 5μL
<![CDATA[dd H<sub>2</sub>O]]> 1.75μL
Total 15μL
表6.SCARA5/DLX1基因甲基化反应液
单个PCR反应的组份 单个PCR反应的量
SEQ ID No.1(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.2(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.3(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.7(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.8(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.9(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.10(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.11(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.12(10μM) 0.25μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL
dNTP(10mM) 0.5μL
<![CDATA[MgCl<sub>2</sub>(25mM)]]> 5μL
PCR缓冲液(5×) 5μL
<![CDATA[dd H<sub>2</sub>O]]> 1.75μL
Total 15μL
表7.ZNF323/DLX1基因甲基化反应液
单个PCR反应的组份 单个PCR反应的量
SEQ ID No.4(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.5(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.6(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.7(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.8(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.9(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.10(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.11(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.12(10μM) 0.25μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL
dNTP(10mM) 0.5μL
<![CDATA[MgCl<sub>2</sub>(25mM)]]> 5μL
PCR缓冲液(5×) 5μL
<![CDATA[dd H<sub>2</sub>O]]> 1.75μL
Total 15μL
表8.SCARA5/ZNF323/DLX1基因甲基化反应液
单个PCR反应的组份 单个PCR反应的量
SEQ ID No.1(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.2(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.3(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.4(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.5(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.6(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.7(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.8(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.9(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.10(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.11(10μM) 0.25μL
SEQ ID No.12(10μM) 0.25μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL
dNTP(10mM) 0.5μL
<![CDATA[MgCl<sub>2</sub>(25mM)]]> 5μL
PCR缓冲液(5×) 5μL
<![CDATA[dd H<sub>2</sub>O]]> 1μL
Total 15μL
2.加样
在准备好的PCR反应管中分别加入15μL的PCR反应液和10μL样本DNA，盖紧管盖后，瞬时低速离心。阴性质控和阳性质控的加样与待测样本相同。
3.荧光定量PCR检测
(1)荧光通道选择：每个样本选择FAM、JOE共2个通道。参比荧光(PassiveReference)设置为none；
(2)反应条件设定如表9(反应体系为25μL)；
表9荧光PCR反应条件
Figure BDA0003929379110000161
六、结果分析
1.PCR结果分析
反应结束后自动保存结果，使用仪器配套软件自动分析结果，如果PCR扩增中任一通道有扩增曲线，则计算其Ct值(Cycle threshold，阈值循环数)，Ct值的大小反映所检基因的相对含量。
2.检测结果判定
以ACTB基因的Ct≦32时结果为有效结果，说明样本中的DNA含量足够，否则为无效结果；当FAM通道的Ct≦43时结果为阳性，说明具有肺癌风险高，当FAM通道的Ct>43或N.D.时结果为阴性，说明具有肺癌风险低，其中N.D.为“Not Detected”的缩写，意思是“未检出”。
3.检测结果
(1)SCARA5基因甲基化在阴性参考品和正常样本中均未检出，结果为阴性，在阳性参考品、灵敏度参考品和肺癌样本中均检出，结果为阳性。结果如下表：
表10.SCARA5基因甲基化检测结果
Figure BDA0003929379110000171
(2)ZNF323基因甲基化在阴性参考品和正常样本中均未检出，结果为阴性，在阳性参考品、灵敏度参考品和肺癌样本中均检出，结果为阳性。结果如下表：
表11.ZNF323基因甲基化检测结果
Figure BDA0003929379110000172
(3)DLX1基因甲基化在阴性参考品和正常样本中均未检出，结果为阴性，在阳性参考品、灵敏度参考品和肺癌样本中均检出，结果为阳性。结果如下表：
表12.DLX1基因甲基化检测结果
Figure BDA0003929379110000181
(4)SCARA5/ZNF323基因甲基化在阴性参考品和正常样本中均未检出，结果为阴性，在阳性参考品、灵敏度参考品和肺癌样本中均检出，结果为阳性。结果如下表：
表13.SCARA5/ZNF323基因甲基化检测结果
Figure BDA0003929379110000182
(5)SCARA5/DLX1基因甲基化在阴性参考品和正常样本中均未检出，结果为阴性，在阳性参考品、灵敏度参考品和肺癌样本中均检出，结果为阳性。结果如下表：
表14.SCARA5/DLX1基因甲基化检测结果
Figure BDA0003929379110000191
(6)ZNF323/DLX1基因甲基化在阴性参考品和正常样本中均未检出，结果为阴性，在阳性参考品、灵敏度参考品和肺癌样本中均检出，结果为阳性。结果如下表：
表15.ZNF323/DLX1基因甲基化检测结果
Figure BDA0003929379110000192
Figure BDA0003929379110000201
(7)SCARA5/ZNF323/DLX1基因甲基化在阴性参考品和正常样本中均未检出，结果为阴性，在阳性参考品、灵敏度参考品和肺癌样本中均检出，结果为阳性。结果如下表：
表16.SCARA5/ZNF323/DLX1基因甲基化检测结果
Figure BDA0003929379110000202
实施例4：引物和探针用于检测临床样本
收集临床血浆样本若干，其中初诊肺癌患者176例，健康人血浆样本192例。采用实施例3所示的试剂盒进行临床样本检测。具体步骤与实施例3一致，检测结果如下表所示：
表17.SCARA5基因甲基化临床样本检测结果
Figure BDA0003929379110000203
表18.ZNF323基因甲基化临床样本检测结果
Figure BDA0003929379110000211
表19.DLX1基因甲基化临床样本检测结果
Figure BDA0003929379110000212
表20.SCARA5/ZNF323基因甲基化检测结果
Figure BDA0003929379110000213
表21.SCARA5/DLX1基因甲基化检测结果
Figure BDA0003929379110000214
表22.ZNF323/DLX1基因甲基化检测结果
Figure BDA0003929379110000215
表23.SCARA5/ZNF323/DLX1基因甲基化检测结果
Figure BDA0003929379110000221
如图1所示，本申请的引物、探针用于检测SCARA5、ZNF323、DLX1任一基因甲基化状态的灵敏度均在84％以上，特异性均在98％以上。检测上述任意两个基因甲基化状态的灵敏度在89％以上，特异性在98％以上。而三个基因甲基化组合检测的灵敏度>95％：在176例肺癌患者样本中检出168例；特异性>98％：在192例健康人样本中检出3例。上述结果表明SCARA5、ZNF323、DLX1作为标志物均能够高特异性、高灵敏度地检测出早期肺癌。
由上述实施例可知，本申请的引物和探针、试剂盒能够高特异性、高灵敏度地检测出样本中SCARA5、ZNF323、DLX1基因甲基化水平，为早期肺癌的筛查诊断提供参考。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (12)

1.一种用于诊断肺癌的标志物，其特征在于，所述标志物包括SCARA5、ZNF323和DLX1中的一种或多种，通过检测所述标志物的甲基化水平诊断肺癌。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，以GRCh38.p14为参考，通过检测以下区域中的一个或多个的甲基化水平诊断肺癌：
区域1：Chr8:27990673～27994673；
区域2：Chr6:28354271～28358271；
区域3：Chr2:172085507～172089674。
3.检测权利要求1或2所述标志物的甲基化水平的试剂在制备诊断肺癌的产品中的应用。
4.一种用于诊断肺癌的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括用于检测权利要求1或2所述标志物的甲基化水平的引物对。
5.根据权利要求4所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品还包括与所述引物对对应的检测探针。
6.根据权利要求4所述的核酸产品，其特征在于，所述引物对包括以下的一组或多组：
核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的用于检测SCARA5基因甲基化水平的第一引物对；
核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的用于检测ZNF323基因甲基化水平的第二引物对；及
核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的用于检测DLX1基因甲基化水平的第三引物对。
7.根据权利要求6所述的核酸产品，其特征在于，与所述第一引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；和/或，
与所述第二引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；和/或
与所述第三引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
8.根据权利要求5～7任一项所述的核酸产品，其特征在于，还包括内参引物对和与所述内参引物对对应的内参探针。
9.根据权利要求8所述的核酸产品，其特征在于，所述内参引物对的核苷酸序列如SEQID No.10和SEQ ID No.11所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
10.一种用于诊断肺癌的试剂盒，其特征在于，包括用于检测权利要求1或2所述的肺癌的标志物的试剂。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂通过以下方法中的一种或多种来检测所述标志物的甲基化水平：
甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法、甲基化荧光定量PCR法和质谱法。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的一种或者多种，以及权利要求4～9任一项所述的核酸产品。
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