CN116121358A - 用于精神药物基因检测的组合物、试剂盒及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于精神药物基因多态性位点检测的引物和探针组合物，以及相应的试剂盒和使用方法，属于基因检测技术领域。本发明的引物对和探针以及试剂盒可针对CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、CYP1A2*1F、CYP2C9*3、HLA‑B*1502以及ANKK1基因多态性位点同时进行检测，具有高灵敏度、低成本、高特异性、操作简便、检测周期短等特点，其检测灵敏度可达到0.1ng，可以快速精准的对精神类个体化用药相关基因多态性进行精准检测。

Description

用于精神药物基因检测的组合物、试剂盒及使用方法
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测精神药物基因多态性位点的引物和探针组合物，以及其相应的试剂盒和使用方法。
背景技术
精神疾病是指在各种生物学、心理学以及社会环境因素影响下，由大脑功能失调导致认知、情感、意志和行为等精神活动出现不同程度障碍为临床表现的疾病，包括抑郁症、双相情感障碍、精神***症、其他精神病、痴呆症、智力残疾和自闭症等在内的发育障碍。
药物治疗是目前精神疾病的主要临床手段，相关药物包括阿哌利唑、硫利达嗪、利培酮、奥氮平、丁本那嗪和帕利哌酮等，但是药物疗效和不良反应也呈现出巨大的个体差异，如在精神***症患者中，40％的患者对典型和非典型的抗精神药物的反应不佳。
药物基因组研究显示，药物个体差异大的最主要原因是患者的基因多态性。基因多态性促使相关药物代谢酶、转运体和受体发生遗传变异，改变了酶的功能和表达水平，以及药物转运体和受体的结合状态，从而使不同个体对药物的反应呈现差异。
有研究表明，细胞色素P4502D6(CYP2D6)基因作为细胞色素P450蛋白酶超家族中的一员，具有高度的基因多态性，且能参与利培酮等抗精神病药物的代谢反应。
阿米替林作为三环类抗抑郁药，具有多种不良反应如抗胆碱作用、中枢神经***不良反应和心血管不良反应，与治疗失败密切相关。细胞色素P450同工酶CYP2C19参与阿米替林的代谢，其遗传变异可导致酶活性个体差异，使人群出现超快代谢者(ultrarapidmetabolizer，UM)、快代谢者(extensive metabolizer，EM)、中间代谢者(intermediatemetabolizer，IM)和慢代谢者(poormetabolizer，PM)4种表型，CYP2C19*2和CYP2C19*3是中国人群中存在的两种导致CYP2C19酶缺陷的主要等位基因。阿米替林是一种前体药物，在体内代谢为活性代谢产物去甲替林，CYP2C19 PM个体血浆阿米替林与去甲替林浓度的比值显著升高，导致不良反应的发生，这不仅延误治疗，而且导致了医疗资源的浪费。
因此，根据个体药物治疗相关的代谢酶、转运体和受体的遗传变异指定不同的治疗方案，实现药物治疗个体化不仅是当今遗传药理学和临床药物治疗学的发展方向，而且具有十分重要的社会意义和经济意义。
人类基因多态性在阐明人体对疾病的易感性、对毒物的耐受性、对疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性都起着重要的作用。精神药物基因组学研究，也能够为精神疾病的个体化用药选择和预防不良反应的发生提供重要依据，从而提高精神药物处方的准确性，减少错误用药导致的治疗失败和不良反应。
目前针对人类基因多态性检测的技术有很多，最常用的有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP法)、序列特异性PCR、一代测序、二代测序和基因芯片法等技术，但是这些技术有各自的应用缺陷，有的操作繁琐，检测周期长，有的无法进行高通量多位点同时检测，使得目前在临床上对于多态性检测技术应用仍不理想，一直无法满足临床检测需求。
另外，现有的基于神经精神药物类基因多态性位点的检测引物和探针，大多存在检测灵敏度较低的问题。
如专利文献CN 109777870 B[1]提供了一种用于指导人精神疾病用药的试剂盒及其检测方法，该试剂盒可以通过一个反应同时对16个基因位点进行分型，可以很好地检测出精神疾病用药相关的人类基因组突变，但该试剂盒用于检测的DNA用量为10ng，其检出限较高，灵敏度有待提升。
如专利文献CN 110331214A[2]公开了一种用于指导人精神疾病用药的试剂盒及其检测方法，可以通过一个反应同时对16个基因位点进行分型，包括用于扩增16个基因片段的16对扩增引物和16条延伸引物，该方法基于多重PCR和质谱测序技术的分型，可以针对几乎所有的测试样本精准地检测出精神疾病用药相关的人类基因组突变，但是该试剂盒最低只能检测出10ng的人类基因组DNA，其检测灵敏度有待进一步提高。
如专利文献CN 111808943 B[3]提供了一种精神个体化用药基因检测方法，其筛选出与41种抗精神病药物密切相关基因的32个多态性位点，并制备出检测该32个多态性位点的引物组合物和使用该组合物的检测试剂，该方法的检测限为1-5ng，检测灵敏度有待进一步提高。
如济南大学硕士论文《精神***症易感基因突变检测》[4]中采用的PCR体系用于DISC1基因外显子序列的突变检测，该方法的检测限仅为5ng DNA，检测灵敏度有待提高。
吴等[5]建立了一种快速检测CYP2D6*10基因多态性的方法，通过采用几种不同的试剂盒(货号51104、货号YZYMT-028、货号56404、货号YZYMT-029、货号R013A)进行基因多态性检测，结果发现上述试剂盒对基因多态性的检测灵敏度仅能达到30copies/μL，基因组DNA的检出量在5ng左右，且存在一定的非特异性扩增风险，因此其检测灵敏度有待进一步提升。
因此，如何提供一种具有高灵敏度、低成本、高特异性、操作简便、检测周期短，可以快速精准对精神类药物相关的CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、CYP2C9*3、CYP1A2*1F、HLA-B*1502和ANKK1基因多态性进行检测的方法，成为本发明亟待解决的技术问题。
参考文献：
[1]CN 109777870 B，一种用于指导人精神疾病用药的试剂盒及其检测方法，申请人：上海康黎医学检验所有限公司，公开日：2019.5.21.
[2]CN 110331214A，一种用于指导人精神疾病用药的试剂盒及其检测方法，申请人：上海康黎医学检验所有限公司，公开日：2019.10.15.
[3]CN 111808943 B，一种精神类个体化用药基因检测方法，申请人：重庆浦洛通基因医学研究院有限公司，公开日：2020.10.23.
[4]济南大学硕士论文《精神***症易感基因突变检测》，作者：龙逢，2013.
[5]吴建元，章柏钰，蔡君龙等，CYP2D6*10基因多态性检测体系的建立与评价，国际检验医学杂志，2022年7月第43卷第14期.
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，从而提供一种用于检测精神药物基因多态性位点的引物和探针组合物，以及相应的试剂盒和使用方法。本发明的技术目的在于：针对现有技术中存在的检测CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、CYP2C9*3、CYP1A2*1F、HLA-B*1502和ANKK1基因多态性时对样本处理要求高、检测周期长、操作复杂、成本高、特异性不强和灵敏度较低等问题，提供一种精神药物基因检测的引物和探针组合物、试剂盒及其使用方法，针对全血样本和口腔拭子样本均具有高度的检测灵敏性和特异性，同时具备成本低、操作简便、检测周期短等特点。
为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案来实现：
本发明的第一目的是提供一种用于检测精神药物基因多态性位点的组合物，所述组合物包括针对不同多态性位点的引物对和探针组合中的至少一种：
(1)用于检测CYP2D6*10基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2-3所示的反向引物组成的引物对1，以及如SEQ ID NO.28所示的探针1；
(2)用于检测CYP2C19*2基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.4-5所示的正向引物和如SEQ ID NO.6所示的反向引物组成的引物对2，以及如SEQ ID NO.29所示的探针2；
(3)用于检测CYP2C19*3基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.7-8所示的正向引物和如SEQ ID NO.9所示的反向引物组成的引物对3，以及如SEQ ID NO.30所示的探针3；
(4)用于检测CYP2C19*17基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.10-11所示的正向引物和如SEQ ID NO.12所示的反向引物组成的引物对4，以及如SEQ ID NO.31所示的探针4；
(5)用于检测CYP1A2*1F基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.13-14所示的正向引物和如SEQ ID NO.15所示的反向引物组成的引物对5，以及如SEQ ID NO.32所示的探针5；
(6)用于检测CYP2C9*3基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.16-17所示的正向引物和如SEQ ID NO.18所示的反向引物组成的引物对6，以及如SEQ ID NO.33所示的探针6；
(7)用于检测HLA-B*1502(rs3909184)基因位点的引物对和探针组合：如SEQIDNO.19所示的正向引物和如SEQ ID NO.20-21所示的反向引物组成的引物对7，以及如SEQID NO.34所示的探针7；用于检测HLA-B*1502(rs2844682)基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.22-23所示的正向引物和如SEQ ID NO.24所示的反向引物组成的引物对8，以及如SEQ ID NO.35所示的探针8；
(8)用于检测ANKK1基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.25-26所示的正向引物和如SEQ ID NO.27所示的反向引物组成的引物对9，以及如SEQ ID NO.36所示的探针9。
本发明提供的上述引物对和探针组合物，能够显著提高现有PCR检测方法的灵敏度，增强反应特异性，提高体系稳定性。经过实验验证，本发明提供的上述引物对和探针组合物，在进行CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、CYP2C9*3、CYP1A2*1F、HLA-B*1502和ANKK1基因多态性检测时，具有高灵敏度、低成本、高特异性、操作简便、检测周期短等特点，可以快速精准的对精神类个体化用药基因多态性进行检测。如背景技术中记载，现有检测体系采用的引物检测限一般为5-10ng，而本发明的组合物组成的检测体系检测限可低至0.1ng，使对口腔拭子样本和血液样本这种复杂困难模板可以达到100％检出率，极大的提升了检测体系的灵敏度。
进一步的是，本发明提供的上述组合物中，所述探针1-9的5’端的荧光基团包括FAM、VIC、HEX、CY5或者ROX荧光报告基团，优选为FAM、VIC或CY5；3’端的淬灭基团包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1荧光淬灭基团，优选为TAMRA或BHQ1。
进一步的是，本发明提供的上述组合物中，还包括针对不同多态性位点的抑制剂，所述抑制剂具有以下序列组合中的至少一种：
(1)用于检测CYP2D6*10基因位点的抑制剂1：如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的序列组合；
(2)用于检测CYP2C19*2基因位点的抑制剂2：如SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示的序列组合；
(3)用于检测CYP2C19*3基因位点的抑制剂3：如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示的序列组合；
(4)用于检测CYP2C19*17基因位点的抑制剂4：如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的序列组合；
(5)用于检测CYP1A2*1F基因位点的抑制剂5：如SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示的序列组合；
(6)用于检测CYP2C9*3基因位点的抑制剂6：如SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的序列组合；
(7)用于检测HLA-B*1502基因位点的抑制剂7：如SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示的序列组合；以及如SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示的序列组合；
(8)用于检测ANKK1基因位点的抑制剂8：如SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54所示的序列组合。
本发明的引物、探针和抑制剂的组合，具有对样本处理要求低、检测周期短、操作简单、成本低、特异性强和灵敏度高的优点，可以快速精准的对精神类个体化用药基因多态性进行检测。
进一步的是，本发明的上述抑制剂1-9的3’端采用C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB或ddC修饰，优选为采用ddC修饰。
本发明的目的之二是提供一种用于检测精神药物基因多态性位点的试剂盒，其包括如上所述的引物对和探针组合，以及相应的抑制剂。
进一步的是，所述试剂盒还包括GAPDH内参基因引物和探针、PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品，其中：
所述GAPDH内参基因引物和探针序列为：
GAPDH-F：GTATGACTGGGGGTGTTGGG
GAPDH-R：GAGGGCCCAAGAGGTTGAAT
GAPDH-P：CCAGCCTGGCAGGGAAGCTCAAG；
所述PCR反应液包含PCR反应所需要的热启动taq酶、UDG酶、缓冲液、镁离子和dNTP物质；所述阳性质控品的获取方法为：根据NCBI数据库公布的CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、CYP1A2*1F、CYP2C9*3、HLA-B*1502、ANKK1和GAPDH相关基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，然后把该片段***到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，将各质控品质粒等比例混合即为所述阳性质控品；所述阴性质控品为DEPC处理过的去离子水。
本发明的目的之三是提供一种如上所述用于检测精神药物基因多态性位点的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
S1：取含有EDTA抗凝剂的采集样本进行DNA提取；
S2：预混分装基因检测试剂分别得到针对多个不同多态性位点的PCR反应液1-8，共同组成PCR反应体系；
S3：将步骤S1得到的DNA加入步骤S2的PCR反应体系中，离心后进行PCR扩增；
S4：反应结束后进行基因型别判读；
其中，所述PCR反应液1-8的检测位点分别如下：
PCR反应液 FAM信号 VIC信号 CY5信号
PCR反应液1 CYP2D6*10野生型 CYP1A2*1F野生型 GAPDH基因
PCR反应液2 CYP2D6*10突变型 CYP1A2*1F突变型 GAPDH基因
PCR反应液3 CYP2C19*2野生型 CYP2C9*3野生型 GAPDH基因
PCR反应液4 CYP2C19*2突变型 CYP2C9*3突变型 GAPDH基因
PCR反应液5 CYP2C19*3野生型 HLA-B*1502野生型 GAPDH基因
PCR反应液6 CYP2C19*3突变型 HLA-B*1502突变型 GAPDH基因
PCR反应液7 CYP2C19*17野生型 ANKK1野生型 GAPDH基因
PCR反应液8 CYP2C19*17突变型 ANKK1突变型 GAPDH基因
进一步的是，步骤S3中所述PCR扩增的条件为：
UDG酶孵育的条件为：37℃，2分钟；
预变性的条件为：95℃，2分钟；
第一个阶段由5个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒；延伸：72℃，20秒；
第二阶段由35个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒，设置荧光信号采集；延伸：72℃，30秒。
进一步的是，所述基因型别判读的方法为：在PCR反应体系和循环程序条件下，各阳性质控品的FAM、VIC和CY5荧光检测信号应形成对数扩增“S”型曲线；各阴性质控品应无扩增曲线或者Ct值为0；各待测样本CY5荧光检测信号应形成对数扩增“S”型曲线；然后，观察待测样本反应管FAM和VIC荧光检测信号扩增曲线，如果形成对数扩增“S”型曲线，则该待检测样本含有相应的碱基多态位点；如果无对数扩增“S”型曲线或者Ct值为0，则无相应的碱基多态位点。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供了一种用于检测精神药物基因多态性位点的引物对和探针组合物，以及包含相应抑制剂的组合物，该组合物具有高度的检测灵敏性和特异性，大大改善了现有的引物和探针在精神药物基因多态性位点检测方面存在的灵敏度低的问题；
(2)本发明将6种相关基因和GAPDH内参基因组合物分装在一个8联PCR反应条中，预混包装，方便检测，实现了一个反应体系的多基因变异分析，降低成本的同时提升了检测效率；
(3)本发明的试剂盒具有高灵敏度、低成本、高特异性、操作简便、检测周期短等特点，其灵敏度可达到0.1ng，可以快速精准的对精神类个体化用药相关基因多态性进行检测。
附图说明
图1为本发明的探针(左)和引物(右)设计结构示意图。
图2为本发明的探针引物工作原理示意图。
图3为本发明一种精神药物基因检测试剂盒及使用方法的阳性质控品扩增曲线。
图4为本发明一种精神药物基因检测试剂盒及使用方法的阴性质控品扩增曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1：引物和探针的设计方法
以下首先阐述本发明的引物和探针的设计思路，并结合附图，以更好了解本发明中引物和探针的设计结构：
如图1和图2所示，本发明提供的引物和探针的技术方法如下：
一种改进的PCR扩增引物结构，其形状呈q型，长度26-44个碱基，从5’端到3’包括4个部分：
第一部分，其长度为4-10个碱基，其序列为深海物种序列，与人类基因组序列同源性低；优选的碱基序列为TAACATA；
第二部分，其长度为15-20个碱基，其序列与目的基因序列匹配；
第三部分，其序列与第一部分反向互补配对，其序列为TATGTTA；
第四部分，其长度为3-5个碱基,，其序列与目的基因序列匹配。
一种改进的探针结构，其形状呈环状，长度28-42个碱基，从5’端到3’包括五个部分：
第一部分，其长度为10-15个碱基，序列与目的基因序列匹配；
第二部分，其长度为4-6个碱基，其序列为深海物种序列，与人类基因组序列同源性低，优选的碱基序列为AGATGT；
第三部分，其长度为10-15个碱基,其序列与目的基因序列匹配；
第四部分，其序列与第二部分反向互补配对，其序列为ACATCT；
第五部分，其序列与第三部分序列相同；
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的FAM、VIC、HEX、CY5或者ROX荧光报告基团，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1荧光淬灭基团。
实施例2：用于检测神经精神药物基因多态性位点的引物、探针和抑制剂组合设计与使用
1、用于检测CYP2D6*10基因位点的引物、探针和抑制剂组合
(1)用于识别CYP2D6*10>C的引物、探针和抑制剂组合：
CYP2D-WR1：
TAACATACAACGCTGGGCTGCACGTATGTTACTACC(SEQ ID NO.2)
CYP2D-F1：
TAACATATCCCTCACCTGGTCGAATATGTTAGCAGT(SEQ ID NO.1)
CYP2D-P1：
FAM-AACCTGCTGCATAGATGTGTGGACTTCCAGAACATCTGTGGACTTCCAGA-TAMRA(SEQ IDNO.28)
CYP2D-WB：
CGCTGGGCTGCACGCTACTCACCAGGCCCCCTGCC-ddC(SEQ ID NO.37)
(2)用于识别CYP2D6*10>T的引物、探针和抑制剂组合：
CYP2D-MR1：
TAACATACAACGCTGGGCTGCACGTATGTTACTACT(SEQ ID NO.3)
CYP2D-F1：
TAACATATCCCTCACCTGGTCGAATATGTTAGCAGT(SEQ ID NO.1)
CYP2D-P1：
FAM-AACCTGCTGCATAGATGTGTGGACTTCCAGAACATCTGTGGACTTCCAGA-TAMRA(SEQ IDNO.28)
CYP2D-MB：
CGCTGGGCTGCACGCTACCCACCAGGCCCCCTGCC-ddC(SEQ ID NO.38)
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，可以是FAM、VIC、HEX、CY5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，可以是TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，优选方案为5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
2、用于检测CYP2C19*2基因位点的引物、探针和抑制剂组合
(1)用于识别CYP2C19*2>G的引物、探针和抑制剂组合：
CYP2C19*2-WF2：
TAACATACCCACTATCATTGATTATTTATGTTATCCCG(SEQ ID NO.4)
CYP2C19*2-R：
TAACATATTTTGTTAACATTTTACCTATGTTATTCTC(SEQ ID NO.6)
CYP2C19*2-P1：
FAM-ATTACTTAAAAACCAGATGTTTGCTTTTATGGAAACATCTTTGCTTTTATGGAA-TAMRA(SEQID NO.29)
CYP2C19*2-WB：
TTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCAGGAAC-ddC(SEQ ID NO.39)
(2)用于识别CYP2C19*2>A的引物、探针和抑制剂组合：
CYP2C19*2-MF4：
TAACATACCCACTATCATTGATTATTTATGTTATCCCA(SEQ ID NO.5)
CYP2C19*2-R：
TAACATATTTTGTTAACATTTTACCTATGTTATTCTC(SEQ ID NO.6)
CYP2C19*2-P1：
FAM-ATTACTTAAAAACCAGATGTTTGCTTTTATGGAAACATCTTTGCTTTTATGGAA-TAMRA(SEQID NO.29)
CYP2C19*2-MB：
TTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCGGGAAC-ddC(SEQ ID NO.40)
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、CY5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
3、用于检测CYP2C19*3基因位点的引物、探针和抑制剂组合
(1)用于识别CYP2C19*3>G的引物、探针和抑制剂组合：
CYP2C19*3-WF3：
TAACATAGGATTGTAAGCACCCTATGTTACCTGG(SEQ ID NO.7)
CYP2C19*3-R：
TAACATATTTGCCATCTTTTCCAGATATATGTTATTCAC(SEQ ID NO.9)
CYP2C19*3-P1：
FAM-ACAGTCTTTTTTTCAGATGTTGGGAAATCCAAAAACATCTTGGGAAATCCAAAA-TAMRA(SEQID NO.30)
CYP2C19*3-WB：
TCAGGATTGTAAGCACCCCCTGAATCCAGG-ddC(SEQ ID NO.41)
(2)用于识别CYP2C19*3>A的引物、探针和抑制剂组合：
CYP2C19*3-MF3：
TAACATAGGATTGTAAGCACCCTATGTTACCTGA(SEQ ID NO.8)
CYP2C19*3-R：
TAACATATTTGCCATCTTTTCCAGATATATGTTATTCAC(SEQ ID NO.9)
CYP2C19*3-P1：
FAM-ACAGTCTTTTTTTCAGATGTTGGGAAATCCAAAAACATCTTGGGAAATCCAAAA-TAMRA(SEQID NO.30)
CYP2C19*3-MB：
TCAGGATTGTAAGCACCCCCTGGATCCAGG-ddC(SEQ ID NO.42)
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、CY5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
4、用于检测CYP2C19*17基因位点的引物、探针和抑制剂组合
(1)用于识别CYP2C19*17>C的引物、探针和抑制剂组合：
CYP2C19*17-WF：
TAACATAATTTGTGTCTTCTGTTCTCTATGTTAAAAGC(SEQ ID NO.10)
CYP2C19*17-R：
TAACATATAGCAGATATAAACACCTTTTATGTTAACCAT(SEQ ID NO.12)
CYP2C19*17-P：
FAM-TCAGAAGACCTCAGATGTAGCTCAAATCCCAACATCTAGCTCAAATCCCA-TAMRA(SEQ IDNO.31)
CYP2C19*17-WB：
GTTCTCAAAGTATCTCTGATGTAAGAG-ddC(SEQ ID NO.43)
(2)用于识别CYP2C19*17>T的引物、探针和抑制剂组合：
CYP2C19*17-MF：
TAACATAATTTGTGTCTTCTGTTCTCTATGTTAAAAGT(SEQ ID NO.11)
CYP2C19*17-R：
TAACATATAGCAGATATAAACACCTTTTATGTTAACCAT(SEQ ID NO.12)
CYP2C19*17-P：
FAM-TCAGAAGACCTCAGATGTAGCTCAAATCCCAACATCTAGCTCAAATCCCA-TAMRA(SEQ IDNO.31)
CYP2C19*17-MB：
GTTCTCAAAGCATCTCTGATGTAAGAG-ddC(SEQ ID NO.44)
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、CY5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
5、用于检测CYP1A2*1F基因位点的引物、探针和抑制剂组合
(1)用于识别CYP1A2*1F>C的引物、探针和抑制剂组合：
CYP1A2*1F-WF：
TAACATAAAGGGTGAGCTCTGTTATGTTAGGGCC(SEQ ID NO.13)
CYP1A2*1F-R：
TAACATAGCTGAGGGTTGAGATGGTATGTTAAGACA(SEQ ID NO.15)
CYP1A2*1F-P：
VIC-GATGGAGCTTAGTAGATGTCTTTCTGGTATCCACATCTCTTTCTGGTATCC-TAMRA(SEQ IDNO.32)
CYP1A2*1F-WB：
GTGGGCACAGGACGCATGGTAGATGGAG-ddC(SEQ ID NO.45)
(2)用于识别CYP1A2*1F>A的引物、探针和抑制剂组合：
CYP1A2*1F-MF：
TAACATAAAGGGTGAGCTCTGTTATGTTAGGGCA(SEQ ID NO.14)
CYP1A2*1F-R：
TAACATAGCTGAGGGTTGAGATGGTATGTTAAGACA(SEQ ID NO.15)
CYP1A2*1F-P：
VIC-GATGGAGCTTAGTAGATGTCTTTCTGGTATCCACATCTCTTTCTGGTATCC-TAMRA(SEQ IDNO.32)
CYP1A2*1F-MB：
GTGGGCCCAGGACGCATGGTAGATGGAG-ddC(SEQ ID NO.46)
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、CY5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
6、用于检测CYP2C9*3基因位点的引物、探针和抑制剂组合
(1)用于识别CYP2C9*3>A的引物、探针和抑制剂组合：
CYP2C9-WF4：
TAACATAGTGCACGAGGTCCAGAGTATGTTAATACA(SEQ ID NO.16)
CYP2C9-R：
TAACATAACATGGAGTTGCAGTGTTATGTTAAGGAG(SEQ ID NO.18)
CYP2C9-P1：
VIC-CATGCAGTGACCTGAGATGTTGACATTAAATTCACATCTTGACATTAAATTC-TAMRA(SEQ IDNO.33)
CYP2C9-WB：
ACGAGGTCCAGAGATACCTTGACCTTCTCCCCACCAG-ddC(SEQ ID NO.47)(2)用于识别CYP2C9*3>C的引物、探针和抑制剂组合：
CYP2C9-MF3：
TAACATAGTGCACGAGGTCCAGAGTATGTTAATACC(SEQ ID NO.17)
CYP2C9-R：
TAACATAACATGGAGTTGCAGTGTTATGTTAAGGAG(SEQ ID NO.18)
CYP2C9-P1：
VIC-CATGCAGTGACCTGAGATGTTGACATTAAATTCACATCTTGACATTAAATTC-TAMRA(SEQ IDNO.33)
CYP2C9-MB：
ACGAGGTCCAGAGATACATTGACCTTCTCCCCACCAG-ddC(SEQ ID NO.48)
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、CY5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
7、用于检测HLA-B*1502基因位点的引物、探针和抑制剂组合
(1)用于识别HLA-B*1502(rs3909184)>G的引物、探针和抑制剂组合：
HLA-B*1502-WR1：
TAACATATATACTCTAGAAGGGGGTATGTTACACAC(SEQ ID NO.20)
HLA-B*1502-F1：
TAACATAATTGCTTGAACCTGGGAGTATGTTAGCGAA(SEQ ID NO.19)
HLA-B*1502-P1：
VIC-AAACGGGGGCTCATCAGATGTAGAGAAACACTGGAACATCTAGAGAAACACTGGA-TAMRA(SEQID NO.34)
HLA-B*1502-WB1：
GCACAGGTGGGAAAAATAGATTAAACGGGG-ddC(SEQ ID NO.49)
(2)用于识别HLA-B*1502(rs3909184)>C的引物、探针和抑制剂组合：
HLA-B*1502-MR1：
TAACATATATACTCTAGAAGGGGGTATGTTACACAG(SEQ ID NO.21)
HLA-B*1502-F1：
TAACATAATTGCTTGAACCTGGGAGTATGTTAGCGAA(SEQ ID NO.19)
HLA-B*1502-P1：
VIC-AAACGGGGGCTCATCAGATGTAGAGAAACACTGGAACATCTAGAGAAACACTGGA-TAMRA(SEQID NO.34)
HLA-B*1502-MB1：
GCACACGTGGGAAAAATAGATTAAACGGGG-ddC(SEQ ID NO.50)
(3)用于识别HLA-B*1502(rs2844682)>G的引物、探针和抑制剂组合：
HLA-B*1502-WF2：
TAACATAGCTTCTCTGAGGTCTCCTATGTTAAAGGG(SEQ ID NO.22)
HLA-B*1502-R2：
TAACATACTCCTCCCCACAAGAGTTGGTATGTTAAACCA(SEQ ID NO.24)
HLA-B*1502-P2：
VIC-GGAGTGGTTCTGGAAGATGTGGAGACCTGCAGCCACATCTGGAGACCTGCAGCC-TAMRA(SEQID NO.35)
HLA-B*1502-WB2：
CTTCTCTGAGGTCTCCAAGGAATTGGCCAT-ddC(SEQ ID NO.51)
(4)用于识别HLA-B*1502(rs2844682)>A的引物、探针和抑制剂组合：
HLA-B*1502-MF2：
TAACATAGCTTCTCTGAGGTCTCCTATGTTAAAGGA(SEQ ID NO.23)
HLA-B*1502-R2：
TAACATACTCCTCCCCACAAGAGTTGGTATGTTAAACCA(SEQ ID NO.24)
HLA-B*1502-P2：
VIC-GGAGTGGTTCTGGAAGATGTGGAGACCTGCAGCCACATCTGGAGACCTGCAGCC-TAMRA(SEQID NO.35)
HLA-B*1502-MB2：
CTTCTCTGAGGTCTCCAAGGGATTGGCCAT-ddC(SEQ ID NO.52)
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、CY5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
8、用于检测ANKK1基因的引物、探针和抑制剂组合
(1)用于识别ANKK1>G的引物、探针和抑制剂组合：
ANKK1-WF3：
TAACATACATCCTCAAAGTGCTTATGTTAGGTCG(SEQ ID NO.25)
ANKK1-R：
TAACATAGCTGGCCAAGTTGTCTATATGTTAAATTT(SEQ ID NO.27)
ANKK1-P1：
VIC-TGGCCCTCCGCAGCCAGATGTGAAAGCAGGGCATCAACATCTGAAAGCAGGGCATCA-TAMRA(SEQ ID NO.36)
ANKK1-WB：
CACAGCCATCCTCAAAGTGCTGGTCAAGG-ddC(SEQ ID NO.53)
(2)用于识别ANKK1>A的引物、探针和抑制剂组合：
ANKK1-MF4：
TAACATACATCCTCAAAGTGCTTATGTTAGGTCA(SEQ ID NO.26)
ANKK1-R：
TAACATAGCTGGCCAAGTTGTCTATATGTTAAATTT(SEQ ID NO.27)
ANKK1-P1：
VIC-TGGCCCTCCGCAGCCAGATGTGAAAGCAGGGCATCAACATCTGAAAGCAGGGCATCA-TAMRA(SEQ ID NO.36)
ANKK1-MB：
CACAGCCATCCTCAAAGTGCTGGTCGAGG-ddC(SEQ ID NO.54)
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、CY5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
9、用于识别GAPDH的引物和探针组合：
GAPDH-F：GTATGACTGGGGGTGTTGGG
GAPDH-R：GAGGGCCCAAGAGGTTGAAT
GAPDH-P：CY5-CCAGCCTGGCAGGGAAGCTCAAG-BHQ1。
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、CY5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为CY5，3’端的淬灭基团为BHQ1。
本发明提供的上述引物对和探针可用于特异性检测样本中CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、CYP1A2*1F、CYP2C9*3、HLA-B*1502、ANKK1的基因多态性，如下表1所示。
表1
实施例3：阳性质控品的获取
阳性质控品的获取方法为：根据NCBI数据库公布的CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、CYP2C9*3、CYP1A2*1F、HLA-B*1502、ANKK1和GAPDH共9个基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，然后把该片段***到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，将各质控品质粒等比例混合即为阳性质控品。
各质控品序列如下：
CYP2D6*10>C质控品序列如SEQ ID NO.55所示，CYP2D6*10>T质控品序列如SEQ IDNO.56所示，CYP2C19*2>G质控品序列如SEQ ID NO.57所示，CYP2C19*2>A质控品序列如SEQID NO.58所示，CYP2C19*3>G质控品序列如SEQ ID NO.59所示，CYP2C19*3>A质控品序列如SEQ ID NO.60所示，CYP2C19*17>C质控品序列如SEQ ID NO.61所示，CYP2C19*17>T质控品序列如SEQ ID NO.62所示，CYP1A2*1F>C质控品序列如SEQ ID NO.63所示，CYP1A2*1F>A质控品序列如SEQ ID NO.64所示，CYP2C9*3>A质控品序列如SEQ ID NO.65所示，CYP2C9*3>C质控品序列如SEQ ID NO.66所示，HLA-B*1502(rs3909184)>G质控品序列如SEQ ID NO.67所示，HLA-B*1502(rs3909184)>C质控品序列如SEQ ID NO.68所示，HLA-B*1502(rs2844682)>G质控品序列如SEQ ID NO.69所示，HLA-B*1502(rs2844682)>A质控品序列如SEQ ID NO.70所示，ANKK1>G质控品序列如SEQ ID NO.71所示，ANKK1>A质控品序列如SEQID NO.72所示。
CYP2D6*10>C质控品序列(SEQ ID NO.55)：
TCCAGGACCTCCTCCCTCACCTGGTCGAAGCAGTATGGTGTGTTCTGGAAGTCCACATGCAGCAGGTTGCCCAGCCCGGGCAGTGGCAGGGGGCCTGGTGGGTAGCGTGCAGCCCAGCGTTGGCGCCGGTGCATCAGGTCCACCAGGAGCAGGAAGATGGCCACTATCACGGCCAGGGGCACCAGTGCTTCTAGCCCCAT
CYP2D6*10>T质控品序列(SEQ ID NO.56)：
TCCAGGACCTCCTCCCTCACCTGGTCGAAGCAGTATGGTGTGTTCTGGAAGTCCACATGCAGCAGGTTGCCCAGCCCGGGCAGTGGCAGGGGGCCTGGTGAGTAGCGTGCAGCCCAGCGTTGGCGCCGGTGCATCAGGTCCACCAGGAGCAGGAAGATGGCCACTATCACGGCCAGGGGCACCAGTGCTTCTAGCCCCAT
CYP2C19*2>G质控品序列(SEQ ID NO.57)：
GCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCGGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCT
CYP2C19*2>A质控品序列(SEQ ID NO.58)：
GCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCAGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCT
CYP2C19*3>G质控品序列(SEQ ID NO.59)：
GCTCCATTATTTTCCAGAAACGTTTCGATTATAAAGATCAGCAATTTCTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGGATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCTGAGAAACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGAAATCCAAAATTCTATATTGACCAAGCCCTGAAGTACAT
CYP2C19*3>A质控品序列(SEQ ID NO.60)：
GCTCCATTATTTTCCAGAAACGTTTCGATTATAAAGATCAGCAATTTCTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGAATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCTGAGAAACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGAAATCCAAAATTCTATATTGACCAAGCCCTGAAGTACAT
CYP2C19*17>C质控品序列(SEQ ID NO.61)：
ATATTCAGAATAACTAATGTTTGGAAGTTGTTTTGTTTTGCTAAAACAAAGTTTTAGCAAACGATTTTTTTTTTCAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGCATCTCTGATGTAAGAGATAATGCGCCACGATGGGCATCAGAAGACCTCAGCTCAAATCCCAGTTCTGCCAGCTATGAGCTGTGTGGCACCAACAGGTGT
CYP2C19*17>T质控品序列(SEQ ID NO.62)：
ATATTCAGAATAACTAATGTTTGGAAGTTGTTTTGTTTTGCTAAAACAAAGTTTTAGCAAACGATTTTTTTTTTCAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGTATCTCTGATGTAAGAGATAATGCGCCACGATGGGCATCAGAAGACCTCAGCTCAAATCCCAGTTCTGCCAGCTATGAGCTGTGTGGCACCAACAGGTGT
CYP1A2*1F>C质控品序列(SEQ ID NO.63)：
GATGATGTGTGGAGGAGAGAGCCAGCGTTCATGTTGGGAATCTTGAGGCTCCTTTCCAGCTCTCAGATTCTGTGATGCTCAAAGGGTGAGCTCTGTGGGCCCAGGACGCATGGTAGATGGAGCTTAGTCTTTCTGGTATCCAGCTGGGAGCCAAGCACAGAACACGCATCAGTGTTTATCAAATGACTGAGGAAATGAAT
CYP1A2*1F>A质控品序列(SEQ ID NO.64)：
GATGATGTGTGGAGGAGAGAGCCAGCGTTCATGTTGGGAATCTTGAGGCTCCTTTCCAGCTCTCAGATTCTGTGATGCTCAAAGGGTGAGCTCTGTGGGCACAGGACGCATGGTAGATGGAGCTTAGTCTTTCTGGTATCCAGCTGGGAGCCAAGCACAGAACACGCATCAGTGTTTATCAAATGACTGAGGAAATGAAT
CYP2C9*3>A质控品序列(SEQ ID NO.65)：
AGAGATTGAACGTGTGATTGGCAGAAACCGGAGCCCCTGCATGCAAGACAGGAGCCACATGCCCTACACAGATGCTGTGGTGCACGAGGTCCAGAGATACATTGACCTTCTCCCCACCAGCCTGCCCCATGCAGTGACCTGTGACATTAAATTCAGAAACTATCTCATTCCCAAGGTAAGTTTGTTTCTCCTACACTGCA
CYP2C9*3>C质控品序列(SEQ ID NO.66)：
AGAGATTGAACGTGTGATTGGCAGAAACCGGAGCCCCTGCATGCAAGACAGGAGCCACATGCCCTACACAGATGCTGTGGTGCACGAGGTCCAGAGATACCTTGACCTTCTCCCCACCAGCCTGCCCCATGCAGTGACCTGTGACATTAAATTCAGAAACTATCTCATTCCCAAGGTAAGTTTGTTTCTCCTACACTGCA
HLA-B*1502(rs3909184)>G质控品序列(SEQ ID NO.67)：
GGAGCAGGTGCATGAAGGTGGGTTCCCTCCTGTCTGCTTGGCCAGTCCAGTGGAGTCCAGTGTTTCTCTGATGAGCCCCCGTTTAATCTATTTTTCCCACGTGTGCCCCCTTCTAGAGTATAAATACCTTGAGGGCACTGAGCACATGTTGGCTTTCTGCTATCTCCAGTCTTGCTCAAATCCCCCCACTGTTGCTGCGA
HLA-B*1502(rs3909184)>C质控品序列(SEQ ID NO.68)：
GGAGCAGGTGCATGAAGGTGGGTTCCCTCCTGTCTGCTTGGCCAGTCCAGTGGAGTCCAGTGTTTCTCTGATGAGCCCCCGTTTAATCTATTTTTCCCACCTGTGCCCCCTTCTAGAGTATAAATACCTTGAGGGCACTGAGCACATGTTGGCTTTCTGCTATCTCCAGTCTTGCTCAAATCCCCCCACTGTTGCTGCGA
HLA-B*1502(rs2844682)>G质控品序列(SEQ ID NO.69)：
GTGCTATGGAAAAGAAAATCTTGGGGAAGAAGGGGGATCATGGAGGAGAAGGTAGTGACCATAAAATGGGTCAGGATGGGCTTCTCTGAGGTCTCCAAGGGATTGGCCATAGAGATGGTCATGATCAAAATCAAGAAAAGAACCAGAGAAAAGAGCACAGAGGGTTTGGCCAACGGGACAGTCAGAAAAATAGGGAGTGG
HLA-B*1502(rs2844682)>A质控品序列(SEQ ID NO.70)：
GTGCTATGGAAAAGAAAATCTTGGGGAAGAAGGGGGATCATGGAGGAGAAGGTAGTGACCATAAAATGGGTCAGGATGGGCTTCTCTGAGGTCTCCAAGGAATTGGCCATAGAGATGGTCATGATCAAAATCAAGAAAAGAACCAGAGAAAAGAGCACAGAGGGTTTGGCCAACGGGACAGTCAGAAAAATAGGGAGTGG
ANKK1>G质控品序列(SEQ ID NO.71)：
AGAACATCACGCAAATGTCCACGCCCGCAACAAGGTGGGCTGGACACCCGCCCACCTGGCCGCCCTCAAGGGCAACACAGCCATCCTCAAAGTGCTGGTCGAGGCAGGCGCCCAGCTGGACGTCCAGGATGGAGTGAGCTGCACACCCCTGCAACTGGCCCTCCGCAGCCGAAAGCAGGGCATCATGTCCTTCCTAGAGG
ANKK1>A质控品序列(SEQ ID NO.72)：
AGAACATCACGCAAATGTCCACGCCCGCAACAAGGTGGGCTGGACACCCGCCCACCTGGCCGCCCTCAAGGGCAACACAGCCATCCTCAAAGTGCTGGTCAAGGCAGGCGCCCAGCTGGACGTCCAGGATGGAGTGAGCTGCACACCCCTGCAACTGGCCCTCCGCAGCCGAAAGCAGGGCATCATGTCCTTCCTAGAGG
实施例4：PCR反应液的配置
本发明的试剂盒采用8联PCR反应条设计，1-8号管由基因检测试剂组成，分别指示CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、CYP1A2*1F、CYP2C9*3、HLA-B*1502和ANKK1不同基因多态位点，且每管都含有检测GAPDH内参基因的试剂组分。1-8号管的反应液分别对应PCR反应液1-8，PCR反应液1-8的组成如下表2-表9。
表2 PCR反应液1
表3 PCR反应液2
表4 PCR反应液3
表5PCR反应液4
表6 PCR反应液5
表7 PCR反应液6
表8 PCR反应液7
表9 PCR反应液8
仪器通道及反应体积选择：
①选择FAM通道(Reporter：FAM，Quencher：TAMRA)、VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：TAMRA)和CY5通道(Reporter：CY5，Quencher：BHQ1)检测扩增情况；
②反应体积(SampleVolume)为20μL。
③参考荧光(Reference Dye)：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passivereference选择“none”；具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。
实验例1：基因检测试剂盒的使用
1、样本收集
本实验例收集了10例患者口腔拭子，分别编号为1-10。
样本置于含有生理盐水的保存管中，洗脱形成细胞悬浮液。
2、样本处理
将1-10号样本用裂解液和稳定剂进行核酸提取。
在1.5mL离心管中，加入2μL口腔拭子样本细胞悬浮液，加入15μL裂解液，涡旋混匀，瞬时离心，90℃孵育2min，加入15μL稳定剂，涡旋混匀，瞬时离心即可，裂解后的DNA溶液可在4℃保存1个月，长期保存置于-20℃。
3、反应体系配制
反应体系配制按照实施例4中的PCR反应液1-8配制反应体系。
4、PCR反应
将1-10号样本提取的DNA加入配制好的反应体系中，加入的模板量0.1-200ng。在进行PCR反应时需要将待测样本、阳性质控品和阴性质控品一起平行上机检测，每个样本需要同时加入1-8号管进行反应。
5、仪器通道及反应体积选择
①选择FAM通道(Reporter：FAM，Quencher：TAMRA)、VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：TAMRA)和CY5(Reporter：CY5，Quencher：BHQ1)通道检测扩增情况；
②反应体积(SampleVolume)为20μL。
③参考荧光(Reference Dye)：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passivereference选择“none”；具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。
6、PCR反应程序
UDG酶孵育的条件为：37℃，2分钟；
预变性的条件为：95℃，2分钟；
第一个阶段由5个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒；延伸：72℃，20秒；
第二阶段由35个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒，设置荧光信号采集；延伸：72℃，30秒。
7、实验结果
反应程序结束后保存结果并进行判读。
阳性质控品1-8号反应管中FAM和VIC荧光检测信号形成对数扩增“S”型曲线(见图3)；阴性质控品1-8号管无扩增曲线(见图4)。
实验例2：样本检测结果比对
选择10例患者的外周血样本，提取核酸，进行Sanger测序，收集样本基因型检测数据，同时取0.1ng基因组DNA用荧光定量体系检测基因型，荧光定量体系包括常规引物探针和新型引物探针两种体系，常规引物探针荧光定量体系所用引物是指仅包含新型引物第二部分和第四部分，所用探针是指仅包含新型探针第一部分和第三部分(或第五部分)，引物和探针均不设计二级结构，1-10号样本检测结果如下表10所示。
Sanger测序结果是样本基因型检测金标准，荧光定量体系检测结果与其作比对，CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、CYP1A2*1F、CYP2C9*3、HLA-B*1502(rs3909184、rs2844682)和ANKK1的9个位点用新型引物探针荧光定量体系检出率均为100％，CYP2C19*3、CYP2C19*17、HLA-B*1502(rs3909184、rs2844682)四个位点常规引物探针荧光定量体系检出率为90％，CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP1A2*1F、CYP2C9*3四个位点常规引物探针荧光定量体系检出率为80％，ANKK1位点常规引物探针荧光定量体系检出率仅达70％。
表10
从表10可以看出，本发明提供的新型引物探针构成的检测体系的检测限可低至0.1ng，使口腔拭子样本和血液样本等复杂困难模板可以达到100％检出率，极大的提升了检测体系的灵敏度。

Claims (10)

1.一种用于检测精神药物基因多态性位点的组合物，其特征在于，所述组合物包括针对不同多态性位点的引物对和探针组合中的至少一种：
(1)用于检测CYP2D6*10基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2-3所示的反向引物组成的引物对1，以及如SEQ ID NO.28所示的探针1；
(2)用于检测CYP2C19*2基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.4-5所示的正向引物和如SEQ ID NO.6所示的反向引物组成的引物对2，以及如SEQ ID NO.29所示的探针2；
(3)用于检测CYP2C19*3基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.7-8所示的正向引物和如SEQ ID NO.9所示的反向引物组成的引物对3，以及如SEQ ID NO.30所示的探针3；
(4)用于检测CYP2C19*17基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.10-11所示的正向引物和如SEQ ID NO.12所示的反向引物组成的引物对4，以及如SEQ ID NO.31所示的探针4；
(5)用于检测CYP1A2*1F基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.13-14所示的正向引物和如SEQ ID NO.15所示的反向引物组成的引物对5，以及如SEQ ID NO.32所示的探针5；
(6)用于检测CYP2C9*3基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.16-17所示的正向引物和如SEQ ID NO.18所示的反向引物组成的引物对6，以及如SEQ ID NO.33所示的探针6；
(7)用于检测HLA-B*1502基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.19所示的正向引物和如SEQ ID NO.20-21所示的反向引物组成的引物对7，和如SEQ ID NO.22-23所示的正向引物和如SEQ ID NO.24所示的反向引物组成的引物对8；以及如SEQ ID NO.34所示的探针7和如SEQ ID NO.35所示的探针8；
(8)用于检测ANKK1基因位点的引物对和探针组合：如SEQ ID NO.25-26所示的正向引物和如SEQ ID NO.27所示的反向引物组成的引物对9，以及如SEQ ID NO.36所示的探针9。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述探针1-9的5’端的荧光基团包括FAM、VIC、HEX、CY5或者ROX荧光报告基团，优选为FAM、VIC或CY5；3’端的淬灭基团包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1荧光淬灭基团，优选为TAMRA或BHQ1。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括针对不同多态性位点的抑制剂，所述抑制剂具有以下序列组合中的至少一种：
(1)用于检测CYP2D6*10基因位点的抑制剂1：如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的序列组合；
(2)用于检测CYP2C19*2基因位点的抑制剂2：如SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示的序列组合；
(3)用于检测CYP2C19*3基因位点的抑制剂3：如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示的序列组合；
(4)用于检测CYP2C19*17基因位点的抑制剂4：如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的序列组合；
(5)用于检测CYP1A2*1F基因位点的抑制剂5：如SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示的序列组合；
(6)用于检测CYP2C9*3基因位点的抑制剂6：如SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的序列组合；
(7)用于检测HLA-B*1502基因位点的抑制剂7：如SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示的序列组合；以及如SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示的序列组合；
(8)用于检测ANKK1基因位点的抑制剂8：如SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54所示的序列组合。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述抑制剂1-9的3’端采用C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB或ddC修饰，优选为采用ddC修饰。
5.一种用于检测精神药物基因多态性位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2中所述的引物和探针以及如权利要求3或4中所述的抑制剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括GAPDH内参基因引物和探针，所述GAPDH内参基因引物和探针序列为：
GAPDH-F：GTATGACTGGGGGTGTTGGG
GAPDH-R：GAGGGCCCAAGAGGTTGAAT
GAPDH-P：CCAGCCTGGCAGGGAAGCTCAAG。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品，所述PCR反应液包含PCR反应所需要的热启动taq酶、UDG酶、缓冲液、镁离子和dNTP物质；所述阳性质控品的获取方法为：根据NCBI数据库公布的CYP2D6*10、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、CYP1A2*1F、CYP2C9*3、HLA-B*1502、ANKK1和GAPDH相关基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，然后把该片段***到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，将各质控品质粒等比例混合即为所述阳性质控品；所述阴性质控品为DEPC处理过的去离子水。
8.如权利要求5-7任一项所述用于检测精神药物基因多态性位点的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：取含有EDTA抗凝剂的采集样本进行DNA提取；
S2：预混分装基因检测试剂分别得到针对不同多态性位点的PCR反应液1-8，共同组成PCR反应体系；
S3：将步骤S1得到的DNA加入步骤S2的PCR反应体系中，离心后进行PCR扩增；
S4：反应结束后进行基因型别判读；
其中，所述PCR反应液1-8的检测位点分别如下：
。
9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，步骤S3中所述PCR扩增的条件为：
UDG酶孵育的条件为：37℃，2分钟；
预变性的条件为：95℃，2分钟；
第一个阶段由5个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒；延伸：72℃，20秒；
第二阶段由35个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒，设置荧光信号采集；延伸：72℃，30秒。
10.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述基因型别判读的方法为：在PCR反应体系和循环程序条件下，各阳性质控品的FAM、VIC和CY5荧光检测信号应形成对数扩增“S”型曲线；各阴性质控品应无扩增曲线或者Ct值为0；各待测样本CY5荧光检测信号应形成对数扩增“S”型曲线；然后，观察待测样本反应管FAM和VIC荧光检测信号扩增曲线，如果形成对数扩增“S”型曲线，则该待检测样本含有相应的碱基多态位点；如果无对数扩增“S”型曲线或者Ct值为0，则无相应的碱基多态位点。
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