CN111235264A - 检测人tpmt基因和nudt15基因多态性的组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学检测领域,更具体的,涉及人TPMT基因和NUDT15基因多态性检测领域。提供了一种组合物,其检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性;与此同时,还提供了所述组合物用于检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性的用途、包含所述组合物的试剂盒以及用于检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性的方法,使用本发明的组合物以及方法,检测TPMT的3个SNP位点和NUDT15一个检测位点,使得检测巯嘌呤药物代谢能力更加全面,且灵敏度高,检测迅速。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域,更具体的,属于人TPMT基因和NUDT15基因多态性检测领域。
背景技术
巯嘌呤类药物如6-巯基嘌呤(mercaptopurine,6-MP)、6-硫鸟嘌呤(thioguanine,6-TG)和硫唑嘌呤(azathioprine,AZP)等是一类具有免疫抑制作用的抗代谢药。6-TG和6-MP常用于恶性肿瘤的化疗,AZP则主要用于自身免疫性疾病及器官移植患者。硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)活性表现出单基因共性遗传并分解代谢硫嘌呤。TPMT等位基因变异与酶活性低和硫嘌呤的明显药理作用有关。NUDT15基因中导致其功能丧失的等位基因在亚洲人和西班牙裔中很常见,其可降低活性硫嘌呤核苷酸代谢产物的降解。2018年CPIC指南推荐了基于TPMT和NUDT15基因型来调整巯基嘌呤的用药剂量。
巯嘌呤甲基转移酶(thiopurineS-methyltransferase,TPMT)是一种催化巯嘌呤类药物如6-巯嘌呤(6-mercatopurine,6-MP)硫代甲基化的胞浆酶。在体内6-MP代谢为硫鸟嘌呤核苷酸(6-TGN)掺入DNA而发挥细胞毒效应,但通过TPMT甲基化可生成无活性的代谢产物。TPMT活性与6-MP的疗效和毒性反应相关,TPMT的遗传多态性与嘌呤类药物的疗效和毒性有关,人体TPMT活性呈三态分布,约90%的个体为TPMT野生型的高酶活性者;10%的个体为TPMT杂合子变异者,表现出中等酶活性;0.3%的个体为TPMT纯合子变异者,导致TPMT活性低或无活性。TPMT杂合子变异者可耐受65%的6-MP标准剂量,纯合突变者仅能耐受5%~10%的标准剂量。现已发现20余种TPMT基因突变,其中TPMT*2、TPMT*3最为常见,占中等酶活性和低酶活性个体的90%以上。活性高的患者长期服用巯嘌呤类药物易产生耐受性,可能增加复发率;活性低的患者即使使用常规剂量的硫嘌呤类药物,也会增加发生严重的血液学不良反应的风险,甚至会导致患者死亡。FDA已批准在6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤和硫唑嘌呤的药品说明书中增加在用药前进行TPMT基因多态性检测的建议。
核苷二磷酸链接部分X型结构域基因15(NUDT15)基因编码的水解酶能使硫唑嘌呤的活性代谢物6-TGTP和6-TGDP去磷酸化而减少毒性,是硫嘌呤活化和毒性的负调节剂。NUDT15基因的突变导致硫嘌呤的代谢不良,并且与硫嘌呤诱导的早期白细胞减少有关。尽管目前尚缺乏多民族研究来检验这两种TPMT和NUDT15变体,实际上,TPMT与NUDT15活性降低功能的携带者对硫嘌呤的耐受程度(例如巯基嘌呤)在很大程度上相似。因此,CPIC对NUDT15多态性检测的建议与TPMT相似。对于NUDT15正常代谢者(NUDT15*1/*1),无需更改起始剂量。对于NUDT15中间代谢物(NUDT15*1/*3),应考虑减少起始剂量以尽量减少毒性,对于NUDT15弱代谢者(NUDT15*3/*3)应降低用药剂量大幅或考虑使用替代药物。
目前,存在一些可以检测两者的基因多态性的产品。例如中国发明公开CN109486932A公开了可以检测TPMT基因的rs1142345位点和NUDT15基因的rs116855232位点中的至少一种;中国发明公开CN107574239A也提及检测巯嘌呤药物SNP需要检测TPMT基因的rs1142345位点和NUDT15基因的rs116855232位点。但是由于TPMT所对应的SNP位点不只有这一个,CPIC指南建议检测TPMT基因和NUDT15基因四个多态性位点,因此,这两者都存在着检测巯嘌呤药物代谢能力的不准确和不全面的缺陷。
因此,本领域需要一种能够更加全面的检测巯嘌呤药物代谢能力满足CPIC指南建议,且灵敏度高,检测迅速的产品。
发明内容
有鉴于此,第一方面,本发明提供了一种能够检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性的组合物,所述组合物包括:
1)、如SEQ ID NO:1所示的TPMT基因238上游引物、如SEQ ID NO:2所示的TPMT基因238下游引物、如SEQ ID NO:3所示的TPMT基因238的探针和SEQ ID NO:4所示的TPMT基因238的探针;
2)、如SEQ ID NO:5所示的TPMT基因460上游引物、如SEQ ID NO:6所示的TPMT基因460下游引物和如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的TPMT基因460的探针;
3)、如SEQ ID NO:9所示的TPMT基因719上游引物、如SEQ ID NO:10所示的TPMT基因719下游引物和如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的TPMT基因719的探针;
4)、如SEQ ID NO:13所示的NUDT15基因415上游引物、如SEQ ID NO:14所示的NUDT15基因415下游引物和如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的NUDT15基因415的探针;
其中,上述1)-4)以任意两两组合的形式存在;
其中,所述一组内的4种探针的荧光报告基团彼此互不相同,并且另一组内的4种探针的荧光报告基团彼此互不相同。
在一个具体实施方式中,1)和2)为一组;3)和4)为另一组。
在一个具体实施方式中,1)和3)为一组;2)和4)为另一组。
在一个具体实施方式中,1)和4)为一组;2)和3)为另一组。
本发明的组合物能够检测人TPMT基因和NUDT15基因的多态性,特别地,能够检测TPMT基因rs1800462(238G>C)位点、rs1800460(460G>A)位点、rs1142345(719A>G)位点和NUDT15基因rs116855232位点(415C>T)的多态性,扩展了现有技术检测这两个基因多态性的范围,使得检测巯嘌呤药物代谢能力更加全面准确,且灵敏度高,可以检测浓度低至1ng/μL的核酸样品。使用本发明的组合物中,能够同时适用全血样本和口腔拭子样本。本发明基于荧光探针法设计了引物和探针,采用了4种不同的探针,实现一管试剂同时检测两个SNP位点,整个4个SNP使用两管试剂就能够实现检测,使得整个过程的操作都极其简单,结果读取过程通过扩增曲线和CT值即可以判定。本发明的组合物检测准确度高,每一种探针采用不一样的荧光报告基团,避免了背景信号之间的互相干扰叠加;而现有技术如熔解曲线法,多条探针仅采用一种荧光报告基团,使得背景信号之间的互相干扰叠加增加了背景值使得结果的准确性降低,而使用本发明的组合物克服了这一缺点,如实施例6所述,使用本发明组合物的检测结果与二代测序结果一致,表明本发明组合物具有很高的准确性。
在本发明中,探针的荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE,但不限于此。
在一个具体的实施方案中,如SEQ ID NO:3所示的TPMT基因238的探针的荧光报告基团为FAM;如SEQ ID NO:4所示的TPMT基因238的探针的荧光报告基团为HEX;如SEQ IDNO:7所示的TPMT基因460的探针的荧光报告基团为ROX;如SEQ ID NO:8所示的TPMT基因460的探针的荧光报告基团为CY5。
在一个具体的实施方案中,如SEQ ID NO:11所示的TPMT基因719的探针的荧光报告基团为FAM;如SEQ ID NO:12所示的TPMT基因719的探针的荧光报告基团为HEX;如SEQ IDNO:15所示的NUDT15基因415的探针的荧光报告基团为ROX;如SEQ ID NO:16所示的NUDT15基因415的探针的荧光报告基团为CY5。
进一步地,所述第一组和第二组以单独包装的形式存在。
进一步地,所述组合物进一步包括用于获得口腔拭子样本的物质或保存口腔拭子样本的装置。
进一步地,所述组合物中引物的用量为0.2~0.4μmol/L;所述组合物中探针的用量为0.2~0.4μmol/L。
第二方面,本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性的试剂盒中的用途。
第三方面,本发明提供了一种检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性的试剂盒,所述试剂盒包括上述本发明的组合物。
进一步地,所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种。
进一步地,dNTP的浓度为2~3mmol/L,PCR缓冲液为3~7μL。在一个具体的实施方案中,PCR反应缓冲液包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2%(体积/体积)曲拉通溶液和10%(体积/体积)甲酰胺溶液。
进一步地,所述试剂盒还可以包括Mg2+、糖基化酶、dUTP。
在一个具体的实施方案中,所述核酸释放试剂包括0.01~0.5mmol/L莎梵婷(surfactin)、100~200mmol/L氯化钾、50~200mmol/L氯化锂、质量/体积比为0.1%~1%十二烷基硫酸三乙醇胺、体积/体积比为0.1%~1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、质量/体积比为0.01%~2%十二烷基磺酸钠、体积/体积比为0.05%~1%乙醇等组分中的一种或几种。
通过使用这种核酸释放试剂,不需要进行核酸提取,方法及其简单,不需要纯化离心也不需要高温加热,仅需要加入核酸释放试剂进行吹打即可,同时使得核酸释放非常完全,便于后续的PCR扩增操作,提高了检测的准确度,并且也使得能够同时适用全血和口腔拭子的样本检测,可直接检测指尖血样本和口腔拭子样本,口腔拭子样本对人体没有伤害,仅用拭子刮取口腔内壁脱落细胞即可,样本常温保存,输送方便,可真正达到无创取样的目的。
在具体的实施方案中,所述DNA聚合酶为5U/μL~15U/μL;所述糖基化酶为0.05U/μL~0.2U/μL。
通过设置尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)+dUTP防污染体系,利用UNG酶将可能存在的PCR产物污染充分降解,以排除由此可能引起的假阳性结果,使检测结果更准确。
在具体的实施方案中,所述试剂盒还具有阴性对照和阳性对照,其中,阳性对照包含8种SNP靶序列在内的质粒DNA混合液,具体如下:
TPMT基因238G质粒序列(SEQ ID NO:17):
CCTCTAAATTAAAGAAAATATATGCTTACTCTAATATAACCCTCTATTTAGTCATTTGAAAACATAATTTAAGTGTAAATGTATGATTTTATGCAGGTTTGCAGACCGGGGACACAGTGTAGTTGGTGTGGAAATCAGTGAACTTGGGATACAAGAATTTTTTACAGAGCAGAATCTTTCTTACTCAGAAGAACCAATCACCG
TPMT基因238C质粒序列(SEQ ID NO:18):
CCTCTAAATTAAAGAAAATATATGCTTACTCTAATATAACCCTCTATTTAGTCATTTGAAAACATAATTTAAGTGTAAATGTATGATTTTATGCAGGTTTCCAGACCGGGGACACAGTGTAGTTGGTGTGGAAATCAGTGAACTTGGGATACAAGAATTTTTTACAGAGCAGAATCTTTCTTACTCAGAAGAACCAATCACCG
TPMT基因460G质粒序列(SEQ ID NO:19):
TGCTCATCTTCTTAAAGATTTGATTTTTCTCCCATAAAATGTTTTTTCTCTTTCTGGTAGGACAAATATTGGCAAATTTGACATGATTTGGGATAGAGGAGCATTAGTTGCCATCAATCCAGGTGATCGCAAATGGTAAGTAATTTTTCTTTTTTTGTTTAGCTGTCTTAATTTTTTAGTATACTATACTTTTTCTGGGTTCTAG
TPMT基因460A质粒序列(SEQ ID NO:20):
TGCTCATCTTCTTAAAGATTTGATTTTTCTCCCATAAAATGTTTTTTCTCTTTCTGGTAGGACAAATATTGGCAAATTTGACATGATTTGGGATAGAGGAACATTAGTTGCCATCAATCCAGGTGATCGCAAATGGTAAGTAATTTTTCTTTTTTTGTTTAGCTGTCTTAATTTTTTAGTATACTATACTTTTTCTGGGTTCTAG
TPMT基因719A质粒序列(SEQ ID NO:21):
GTTTCAGGTAAAATATGCAATATACGTTGTCTTGAGAAGGTTGATGCTTTTGAAGAACGACATAAAAGTTGGGGAATTGACTGTCTTTTTGAAAAGTTATATCTACTTACAGAAAAGTAAATGAGACATAGATAAAATAAAATCACACTGACATGTTTTTGAGGAATTGAAAATTATGCTAAAGCCTGAAAATGTAATGGATGAATTTTTAAAATTGTTTA
TPMT基因719G质粒序列(SEQ ID NO:22):
GTTTCAGGTAAAATATGCAATATACGTTGTCTTGAGAAGGTTGATGCTTTTGAAGAACGACATAAAAGTTGGGGAATTGACTGTCTTTTTGAAAAGTTATGTCTACTTACAGAAAAGTAAATGAGACATAGATAAAATAAAATCACACTGACATGTTTTTGAGGAATTGAAAATTATGCTAAAGCCTGAAAATGTAATGGATGAATTTTTAAAATTGTTTA
NUDT15基因415C质粒序列(SEQ ID NO:23):
TAATTTTTTCTAAATATAGGTTAGCTTACCCAAATAAACACCCTTTGTTTTCTGTTATCTAAATAAATTGATTTAGCATCTTTCTTTTCTAGGTTGGGAGTGGGTTCCTTGGGAAGAACTACCTCCCCTGGACCAGCTTTTCTGGGGACTGCGTTGTTTAAAAGAACAAGGCTATGATCCATTTAAAGAAGATCTGAACCATCTGGTGGGATACAAAGGAAATCATCTCTAGGTGGCCGAGAAGATTTGATTTTCTTTAAAAAGACAAGAATAAGGTCTGGTTAGGGAATGAAAAATGTATA
NUDT15基因415T质粒序列(SEQ ID NO:24):
TAATTTTTTCTAAATATAGGTTAGCTTACCCAAATAAACACCCTTTGTTTTCTGTTATCTAAATAAATTGATTTAGCATCTTTCTTTTCTAGGTTGGGAGTGGGTTCCTTGGGAAGAACTACCTCCCCTGGACCAGCTTTTCTGGGGACTGTGTTGTTTAAAAGAACAAGGCTATGATCCATTTAAAGAAGATCTGAACCATCTGGTGGGATACAAAGGAAATCATCTCTAGGTGGCCGAGAAGATTTGATTTTCTTTAAAAAGACAAGAATAAGGTCTGGTTAGGGAATGAAAAATGTATA
阴性对照:0.9%生理盐水。
第四方面,提供了一种用于检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性的方法,所述方法包括以下步骤:
1)释放待测样本的核酸;
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR;
3)获得并分析结果。
在本发明中,用于检测的样本可以是全血、口腔拭子等,但不限于此。
进一步地,所述荧光定量PCR的反应条件为:
,前十个循环不采集荧光,后三十个循环采集荧光,这样可以是荧光PCR的曲线更为挺拔,分析结果更加准确。
附图说明
图1为本发明组合物检测阳性质粒扩增图;
图2为本发明组合物检测阳性质粒扩增图;
图3为本发明组合物检测TPMT野生型和NUDT15杂合型的口腔拭子样本扩增图;
图4为本发明组合物检测TPMT野生型和NUDT15杂合型的口腔拭子样本扩增图;
图5为本发明组合物检测TPMT 719杂合子和NUDT15野生型的外周血样本扩增图;
图6为本发明组合物检测TPMT 719杂合子和NUDT15野生型的外周血样本扩增图;
图7为本发明组合物检测阳性质粒扩增图;
图8为本发明组合物检测阳性质粒扩增图;
图9为本发明组合物检测阳性质粒扩增图;
图10为本发明组合物检测阳性质粒扩增图;
图11为本发明组合物灵敏度的测试结果;
图12为本发明组合物灵敏度的测试结果;
图13为本发明对比例组合物的检测结果;
图14为本发明对比例组合物的检测结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明,本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明,而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针是源于TPMT基因rs1800462(238G>C)位点、rs1800460(460G>A)位点、rs1142345(719A>G)位点和NUDT15基因rs116855232位点(415C>T)前后150bp分别作为靶区域。
1)确定TPMT基因G238C引物探针序列如下:
TPMT-238-F:5'-CGCATAATTTAAGTGTAAATGTATGATTT-3'(SEQ ID NO:1);
TPMT-238-R:5'-GATTTCCACACCAACTACACTGTGTC-3'(SEQ ID NO:2);
TPMT-238G-P:5'-ATGCAGGTTTGCAGAC-3'(SEQ ID NO:3);
TPMT-238C-P:5'-ATGCAGGTTTCCAGAC-3'(SEQ ID NO:4);
2)确定TPMT基因G460A引物探针序列如下:
TPMT-460-F:5'-ATTGGCAAATTTGACATGATTTG-3'(SEQ ID NO:5);
TPMT-460-R:5'-CGATCACCTGGATTGATGGCA-3'(SEQ ID NO:6);
TPMT-460G-P:5'-GGATAGAGGAGCATTAG-3'(SEQ ID NO:7);
TPMT-460A-P:5'-GGATAGAGGAACATTAG-3'(SEQ ID NO:8);
3)确定TPMT基因A719G引物探针序列如下:
TPMT-719-F:5'-GCAGTTGGGGAATTGACTGTCT-3'(SEQ ID NO:9);
TPMT-719-R:5'-GCCATGTCAGTGTGATTTTATTTTATC-3'(SEQ ID NO:10);
TPMT-719A-P:5'-GAAAAGTTATATCTACTTACA-3'(SEQ ID NO:11);
TPMT-719G-P:5'-GAAAAGTTATGTCTACTTACA-3'(SEQ ID NO:12);
4)确定NUDT15基因C415T引物探针序列如下:
NUDT15-415-F:5'-TGGGAAGAACTACCTCCCCTGGA-3'(SEQ ID NO:13);
NUDT15-415-R:5'-CACCAGATGGTTCAGATCTTCTTTAA-3'(SEQ ID NO:14);
NUDT15-415C-P:5'-TCTGGGGACTGCGTTGT-3'(SEQ ID NO:15);
NUDT15-415T-P:5'-TCTGGGGACTGTGTTGT-3'(SEQ ID NO:16);
其中,如SEQ ID NO:3所示的TPMT基因G238C的探针的荧光报告基团为FAM;如SEQID NO:4所示的TPMT基因G238C的探针的荧光报告基团为HEX;如SEQ ID NO:7所示的TPMT基因G460A的探针的荧光报告基团为ROX;如SEQ ID NO:8所示的TPMT基因G460A的探针的荧光报告基团为CY5;如SEQ ID NO:11所示的TPMT基因A719G的探针的荧光报告基团为FAM;如SEQ ID NO:12所示的TPMT基因A719G的探针的荧光报告基团为HEX;如SEQ ID NO:15所示的NUDT15基因C415T的探针的荧光报告基团为ROX;如SEQ ID NO:16所示的NUDT15基因C415T的探针的荧光报告基团为CY5,探针的3'端还连有MGB。
其中,1)~4)可以任意两两组合成两组,对待测样本进行检测。
实施例2、检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性的方法
1试剂准备:
根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量,按比例取两种相应量的PCR反应液(42~46μL/人份)和酶混合液(2~3μL/人份),分别充分混匀成PCR反应液1(随后加入组合物中的一组)和PCR反应液2(随后加入组合物中的另一组),瞬时离心后备用。
2样本处理
(2)根据待测样本数量取PCR反应管若干,每个PCR反应管中加入核酸释放剂3~7μL(建议深吸浅打,避免出现气泡),并依次3~7μL加入待测样本(外周血或口腔拭子)、阴性对照、阳性对照各,吸打混匀3-5次;
(3)取1~6μL释放剂-样品、释放剂-阳性对照、释放剂-阴性对照混合液至对应的两个PCR反应管中,然后分别依次加入44~49μL PCR反应液,盖上管盖,2000rpm离心30秒。
3荧光PCR反应与结果分析
(1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽,按对应顺序设置待测样本名称。
(2)荧光检测通道选择:选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测TPMT238G和TPMT 719A;选择HEX通道(Reportere:CY5,Quencher:None)检测TPMT 238C和TPMT719G;选择ROX通道(Reportere:HEX,Quencher:None)检测TPMT 460G和NUDT15 415C;选择CY5通道(Reportere:ROX,Quencher:None)检测TPMT 460A和NUDT15 415T。
(3)荧光定量PCR反应条件为:
结果分析
反应结束后,仪器自动保存结果,也可以利用仪器自带的结果解读软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析),然后记录样本Ct值从而得出分型结果。仪器软件可根据各样本Ct值自动判读分型结果。具体如下表:
阴阳性判断方法
实施例3、本发明组合物测试阳性对照的检测结果
按照本发明提供的组合物的一种组合方式(具体地,1)和2);3)和4))检测阳性对照质粒,阳性对照为包含四个SNP位点的8种质粒混合液,其检测的方法按照实施例2中所述的检测方法,除不需要进行核酸提取。其PCR反应液1和PCR反应液2的扩增结果分别如图1和图2所示,从图中可以看出,本发明的组合物能够很好的检测出阳性对照质粒,表明本发明的组合物能够用于检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性。
实施例4、本发明组合物测试口腔拭子样本的检测结果
按照本发明提供的实施例3所述的组合物检测TPMT野生型和NUDT15杂合型的口腔拭子样本,其检测的方法按照实施例2中所述的检测方法。其PCR反应液1(检测TPMT 238GG和460GG双野生样本)和PCR反应液2(检测TPMT 719AA和NUDT15 415CT样本)的扩增结果分别如图3和图4所示,从图中可以看出,本发明的组合物能够很好的检测出口腔拭子样本中人TPMT基因和NUDT15基因多态性。
实施例5、本发明组合物测试外周血样本的检测结果
按照本发明提供的实施例3所述的组合物检测TPMT 719杂合子和NUDT15野生型外周血样本,其检测的方法按照实施例2中所述的检测方法。其PCR反应液1(检测TPMT 238GG和460GG双野生样本)和PCR反应液2(检测TPMT 719AG和NUDT15 415CC样本)的扩增结果分别如图5和图6所示,从图中可以看出,本发明的组合物能够很好的检测出全血样本中人TPMT基因和NUDT15基因多态性。
实施例6、本发明组合物的其他组合方式测试阳性对照的检测结果
按照本发明提供的组合物的其他组合方式(具体地,方式一:1)和3);2)和4)以及方式二:1)和4);2)和3))检测阳性对照质粒,阳性对照为包含四个SNP位点的8种质粒混合液,其检测的方法按照实施例2中所述的检测方法,除不需要进行核酸提取。其PCR反应液1和PCR反应液2的扩增结果分别如图7和图8以及图9和图10所示,从图中可以看出,本发明的组合物的另一组合也能够很好的检测出阳性对照质粒,表明本发明的组合物能够用于检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性。
实施例7、检测结果与二代测序结果对比测试
按照实施例2所述的方法测试检测结果未知的8例外周血样本,并将其与Sanger测序结果进行对比,结果如下:
结论:本发明测试外周血及口腔拭子样品各种基因型均能很好地检出,人巯嘌呤类药物代谢相关的TPMT基因和NUDT15基因多态性核酸检测试剂盒检测结果与TPMT基因rs1800462(238G>C)位点、rs1800460(460G>A)位点、rs1142345(719A>G)位点和NUDT15基因rs116855232位点(415C>T)基因Sanger测序检测结果完全一致。
实施例8、本发明组合物的灵敏度测试
用核酸提取与纯化试剂提取样本8的核酸,并稀释至浓度为1ng/μL,用本发明中的组合物按照是实施例2中所述的方法进行检测,测试结果如下图11和图12所示,从图中我们可以看出,当样本中的核酸浓度为1ng/μL时,本发明的组合物仍能够很好的检测出样本。
对比例1、对比引物和探针的检测结果
在引物和探针设计过程中,发明人还设计了其余的引物和探针同样用于检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性。具体如以下序列所示:
TPMT基因G238C其他引物探针组合如下:
TPMT-238-F:5'-CGCATAATTTAAGTGTAAATGTATGA-3'(SEQ ID NO:1);
TPMT-238-R:5'-GATTTCCACACCAACTACACTGTGT-3'(SEQ ID NO:2);
TPMT-238G-P:5'-FAM-TGTATGATTTTATGCAGGTTTGCA-MGB-3'(SEQ ID NO:25);
TPMT-238C-P:5'-HEX-TGTATGATTTTATGCAGGTTTCCA-MGB-3'(SEQ ID NO:26);
TPMT基因G460A其他引物探针组合如下:
TPMT-460-F:5'-ATTGGCAAATTTGACATGATTTG-3'(SEQ ID NO:5);
TPMT-460-R:5'-CGATCACCTGGATTGATGGCA-3'(SEQ ID NO:6);
TPMT-460G-P:5'-ROX-TTTGGGATAGAGGAGCA-MGB-3'(SEQ ID NO:27);
TPMT-460A-P:5'-CY5-CTTTGGGATAGAGGAACA-MGB-3'(SEQ ID NO:28);
TPMT基因A719G其他引物探针组合如下:
TPMT-719-F:5'-GCAGTTGGGGAATTGACTGTCT-3'(SEQ ID NO:9);
TPMT-719-R:5'-GCCATGTCAGTGTGATTTTATTTTA-3'(SEQ ID NO:10);
TPMT-719A-P:5'-FAM-TTGAAAAGTTATATCTACT-MGB-3'(SEQ ID NO:29);
TPMT-719G-P:5'-HEX-TTGAAAAGTTATGTCTACT-MGB-3'(SEQ ID NO:30);
NUDT15基因C415T其他引物探针组合序列如下:
NUDT15-415-F:5'-TGGGAAGAACTACCTCCCCTGG-3'(SEQ ID NO:13);
NUDT15-415-R:5'-CACCAGATGGTTCAGATCTTCTT-3'(SEQ ID NO:14);
NUDT15-415C-P:5'-ROX-GCTTTTCTGGGGACTGCGT-MGB-3'(SEQ ID NO:31);
NUDT15-415T-P:5'-CY5-GCTTTTCTGGGGACTGTGT-MGB-3'(SEQ ID NO:32);
上述组合物按照实施例2所述的方法检测8种混合质粒结果如图13和图14所示,从图中可以看出,对比例的引物和探针不能很好的对阳性质粒进行检测,证明对比例所述的引物和探针不能用于检测人巯嘌呤类药物代谢相关的TPMT基因和NUDT15基因多态性。
Claims (10)
1.一种能够检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性的组合物,所述组合物包括:
1)、如SEQ ID NO:1所示的TPMT基因238上游引物、如SEQ ID NO:2所示的TPMT基因238下游引物、如SEQ ID NO:3所示的TPMT基因238的探针和SEQ ID NO:4所示的TPMT基因238的探针;
2)、如SEQ ID NO:5所示的TPMT基因460上游引物、如SEQ ID NO:6所示的TPMT基因460下游引物和如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的TPMT基因460的探针;
3)、如SEQ ID NO:9所示的TPMT基因719上游引物、如SEQ ID NO:10所示的TPMT基因719下游引物和如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的TPMT基因719的探针;
4)、如SEQ ID NO:13所示的NUDT15基因415上游引物、如SEQ ID NO:14所示的NUDT15基因415下游引物和如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的NUDT15基因415的探针;
其中,上述1)~4)以任意两两组合的形式存在;
其中,所述一组内的4种探针的荧光报告基团彼此互不相同,并且另一组内的4种探针的荧光报告基团彼此互不相同。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中,1)和2)为一组;3)和4)为另一组。
3.根据权利要求1所述的组合物,其中,1)和3)为一组;2)和4)为另一组。
4.根据权利要求1所述的组合物,其中,1)和4)为一组;2)和3)为另一组。
5.权利要求1~4中任一项所述的组合物,其中,所述一组和另一组以单独包装的形式存在。
6.权利要求1~5中任一项所述的组合物在制备检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性的试剂盒中的用途。
7.一种用于检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性的试剂盒,所述试剂盒包括权利要求1~5中任一项所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种;优选的,dNTP为2~3mmol/L、PCR缓冲液为3~7μL、DNA聚合酶为5U/μL~15U/μL。
9.一种用于检测人TPMT基因和NUDT15基因多态性的方法,所述方法包括以下步骤:
1)释放待测样本的核酸;优选地,所述样本为全血或者口腔拭子;
2)使用如权利要求1~5中任一项所述的组合物或权利要求7或8所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR;
3)获得并分析结果。
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