CN116121288A - 一组克隆恶臭假单胞菌大片段dna的载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组克隆恶臭假单胞菌大片段DNA的载体及其应用。所述的质粒组合包含两个质粒pBCPP51和pBCPP52，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，能够有效地克隆细菌基因组中的特定的DNA区域，适用于10kb以上难以用PCR方法扩增的大片段。通过同源重组的方法，依次将携带同源臂的两个质粒***到基因组中待克隆大片段的上游和下游，提取基因组并选用合适的限制性核酸内切酶进行单酶切，再将片段进行自连环化，得到包含待克隆片段的质粒，完成克隆后所得到质粒可在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中复制。

Description

一组克隆恶臭假单胞菌大片段DNA的载体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一组克隆恶臭假单胞菌大片段DNA的质粒载体及其应用。
背景技术
细菌基因组中存在一些多基因紧密排列并共转录的基因簇，这些基因的产物可作为不同的亚基构成一种功能结构，或者参与某种物质转化的不同步骤，共同完成一项生物学功能。此外，还存在一些十分巨大的单个基因，例如恶臭假单胞菌中黏附蛋白基因lapA，其序列长度约为26kb。在研究基因功能时，通常需要将基因敲除，再将被敲除基因回补至敲除菌株中，观察表型变化以确定基因功能；除此之外，在合生生物学领域也需要将包含多个关键基因的大片段DNA进行克隆，并导入底盘细胞中进行表达。对于一般长度的基因可通过PCR的方法将基因扩增后连入质粒中，但是对于10kb以上的DNA片段，PCR往往难以有效地扩增目的片段，因此需要开发能有效克隆大片段DNA的新方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一组有效克隆恶臭假单胞菌基因组中大片段DNA的质粒。所述质粒组合包含两个质粒pBCPP51和pBCPP52，将两个质粒通过同源交换分别整合到恶臭假单胞菌基因组中待克隆大片段DNA的两端后，提取基因组并选用合适的限制性核酸内切酶进行单酶切，使两质粒连同待克隆DNA片段被切下，然后使用连接酶将片段进行连接形成环状DNA，该环状DNA具有质粒的关键元件，包括复制起点、复制蛋白基因和抗生素抗性基因等，可在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中复制。
所述的质粒pBCPP51的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，质粒pBCPP52的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，物理图谱如图1所示。
所述的质粒pBCPP51含有庆大霉素抗性基因，质粒pBCPP52含有四环素抗性基因。
所述的质粒pBCPP51和pBCPP52含R6K ori复制起点，可在含λpir的大肠杆菌中复制，但不能在恶臭假单胞菌中复制。
所述质粒pBCPP51还含有来自于质粒pBBR1MCS-5的复制起点pBBR1 oriV，其后加入多克隆位点，pBCPP52含有该复制起点所需的复制蛋白基因pBBR1 rep，其前加入多克隆位点，当两个质粒在多克隆酶切位点处连接后，所形成的环状DNA中含有复制起点pBBR1oriV和对应的复制蛋白基因pBBR1 rep，因此可在恶臭假单胞菌中复制。
所述多克隆位点MCS的限制性核酸内切酶识别位点顺序依次是HindIII、PstI、SalI、XbaI、BamHI、KpnI、XhoI和SacI。
所述质粒的构建方法包括以下步骤：
(1)从质粒pBBR1MCS-5的复制起点pBBR1 oriV与复制蛋白基因rep连接处反向扩增整个质粒，得到线性化质粒，从pUC19上扩增多克隆位点区域，并将EcoRI识别序列进行点突变，添加XhoI酶切位点，将两片段通过重组酶连接，得到质粒pBBR1MCS-5mcs。
(2)从pBBR1MCS-5mcs中扩增包含庆大霉素抗性基因、mob转移元件、pBBR1 oriV和多克隆位点的片段，从质粒pDS3.0上扩增复制起点R6K ori，此R6K ori片段前端含有EcoRI酶切位点，将两片段通过重组酶连接，得到质粒pBCPP51，宿主菌优选为大肠杆菌S17-1λpir；
(3)从pBBR1MCS-5mcs中扩增包含多克隆位点和rep的片段，从pDS3.0中扩增含R6Kori和RP4接合转移元件的片段，从pTRG上扩增四环素抗性基因片段，将三个片段通过重组酶连接，得到质粒pBCPP52，宿主菌优选大肠杆菌S17-1λpir。
所述质粒的构建方法具体步骤为：
(1)以pBBR1MCS-5为模板，使用引物BBR1-fanA1和BBR1-fanS1扩增得到线性化质粒；以pUC19为模板，使用引物19MCSs和19MCSa扩增得到多克隆位点，将两片段通过重组酶连接，得到质粒pBBR1MCS-5mcs；
BBR1-fanA1：5’-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTGCGGCACCATGCGCAATCA-3’；
BBR1-fanS1：5’-CCCGGGTACCGAGCTCGAGTGCGGCACCCTACCGCATGG-3’；
19MCSs：5’-CTCGAGCTCGGTACCCGGG-3’；
19MCSa：5’-AAGCTTGCATGCCTGCAGGT-3’；
(2)以pBBR1MCS-5mcs为模板，使用引物BBR1-fanS3和19MCSs扩增得到包含庆大霉素抗性基因、mob转移元件、pBBR1 oriV和多克隆位点的片段；以pDS3.0为模板，使用引物R6Ks1和R6Ka1扩增得到复制起点R6K ori的片段；将两片段通过重组酶连接，得到质粒pBCPP51；
BBR1-fanS3：5’-AACGGCTGACATGGGAATTCGGACGCACACCGTGGAAAC-3’；
19MCSs：5’-CTCGAGCTCGGTACCCGGG-3’；
R6Ks1：5’-GAATTCCCATGTCAGCCGTT-3’；
R6Ka1：5’-CCCGGGTACCGAGCTCGAGACGATGCGTCCGGCGTAGAG-3’；
(3)以pBBR1MCS-5mcs为模板，使用引物BBR1-fanA2和19MCSa扩增得到包含多克隆位点和rep的片段；以pDS3.0为模板，使用引物R6Ks2和RP4a2扩增得到含复制起点R6Kori和RP4接合转移元件的片段；以pTRG为模板，使用引物tetS和tetA扩增得到四环素抗性基因片段，将三个片段通过重组酶连接，得到质粒pBCPP52。
BBR1-fanA2：5’-CGTGCTCCTGTCGTTGAGGATTGCTCAGGCTCTCCCCGT-3’；
19MCSa：5’-AAGCTTGCATGCCTGCAGGT-3’；
R6Ks2：5’-GTCAAAAATAAGTGCCTTCCGAATTCCCATGTCAGCCGTT-3’；
RP4a2：5’-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTTCTGCTCTGATGCCGCATAG-3’；
tetS：5’-GGAAGGCACTTATTTTTGAC-3’；
tetA：5’-TCCTCAACGACAGGAGCACG-3’。
本发明的质粒组合可应用于克隆恶臭假单胞菌基因组中大片段DNA。
使用所述质粒组合克隆恶臭假单胞菌基因组中大片段DNA的方法，包括以下步骤：
(1)将待克隆DNA区域的前段和后端分别扩增，作为上游和下游的同源交换的同源臂，并分别连入使用EcoRI酶切的pBCPP51和pBCPP52中，转化大肠杆菌S17-1λpir，分别得到质粒pBCPP51up和pBCPP52dn。
(2)将pBCPP51up通过接合转移导入恶臭假单胞菌中，通过同源交换整合到基因组中上游同源臂所在位置，此时恶臭假单胞菌获得庆大霉素抗性，在抗性平板上筛选获得一次整合菌株。
(3)将pBCPP52dn通过接合转移导入到一次整合菌株中，通过同源交换整合到基因组中下游同源臂所在位置，此时一次整合菌株获得四环素抗性，在抗性平板上筛选获得二次整合菌株。
(4)提取二次整合菌株的基因组，选用pBCPP51和pBCPP52上的多克隆位点MCS中的一种酶切位点进行酶切，此酶切位点不可存在于待克隆大片段DNA上，通过琼脂糖凝胶电泳和切胶回收大片段DNA酶切产物，去除小片段酶切产物有助于后续实验的顺利进行。
(5)使用T4连接酶对切胶回收的大片段DNA进行连接，优选地，酶连条件为先在16℃孵育12h，再置于4℃孵育12h。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，优选适合大质粒和珍贵连接产物转化的大肠杆菌XL10-Gold热激感受态细胞，涂布含庆大霉素和四环素的抗性平板，挑取单菌落进行验证，得到的质粒依次包含元件pBBR1 oriV、mob、庆大霉素抗性基因、待克隆大片段DNA、四环素抗性基因和pBBR1 oriV复制所依赖的pBBR1 rep(图2)；该质粒还可在恶臭假单胞菌中复制，可通过电转化将质粒导入恶臭假单胞菌中。
附图说明
图1是质粒pBCPP51和pBCPP52的图谱。
图2是使用质粒pBCPP51和pBCPP52克隆基因组大片段DNA的步骤和原理示意图。
图3是pBCPP-lapA转化大肠杆菌XL10-Gold后得到的转化子。XbaI酶切的双***恶臭假单胞菌KT2440基因组DNA经过T4连接酶连接后转化大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞，涂布含20μg/mL庆大霉素和20μg/mL四环素的LB固体平板。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：质粒pBCPP51和pBCPP52的构建
(1)设计引物BBR1-fanA1和BBR1-fanS1，以pBBR1MCS-5(GenBank：U25061.1)为模板，使用保真酶按照以下程序扩增出约4.8kb的线性化质粒：95℃1min；95℃20s，55℃20s，72℃3min，30个循环；72℃5min。设计引物19MCSs和19MCSa，以pUC19(GenBank:M77789.2)为模板，使用保真酶按照以下程序扩增出54bp的多克隆位点：95℃1min；95℃20s，56℃20s，34个循环。将两个扩增产物进行琼脂糖电泳和切胶回收，然后使用重组克隆试剂盒(诺唯赞)对片段进行连接，热激转化大肠杆菌S17-1λpir感受态细胞，涂布含20μg/mL的LB固体平板，置于37℃培养，挑取单菌落后对多克隆位点位置进行测序鉴定，最终得到pBBR1MCS-5mcs。
引物序列为：
BBR1-fanA1：5’-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTGCGGCACCATGCGCAATCA-3’；
BBR1-fanS1：5’-CCCGGGTACCGAGCTCGAGTGCGGCACCCTACCGCATGG-3’；
19MCSs：5’-CTCGAGCTCGGTACCCGGG-3’；
19MCSa：5’-AAGCTTGCATGCCTGCAGGT-3’。
(2)使用引物BBR1-fanS3和19MCSs以pBBR1MCS-5mcs为模板，使用保真酶按照以下程序扩增出约2.9kb的片段：95℃1min；95℃20s，55℃20s，72℃2min，30个循环；72℃5min。使用引物R6Ks1和R6Ka1以pDS3.0(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)为模板，使用保真酶按照以下程序扩增出约0.4kb的片段：95℃1min；95℃20s，55℃20s，72℃20s，34个循环；72℃5min。将两个扩增产物进行琼脂糖电泳和切胶回收，然后使用重组克隆试剂盒(诺唯赞)对片段进行连接，热激转化大肠杆菌S17-1λpir感受态细胞，涂布含20μg/mL庆大霉素的LB固体平板，置于37℃培养，挑取单菌落后进行PCR检测，并对正确的克隆进行测序鉴定，最终得到pBCPP51(图1)，序列如SEQ ID NO.1所示。
引物序列为：
BBR1-fanS3：5’-AACGGCTGACATGGGAATTCGGACGCACACCGTGGAAAC-3’；
19MCSs：5’-CTCGAGCTCGGTACCCGGG-3’；
R6Ks1：5’-GAATTCCCATGTCAGCCGTT-3’；
R6Ka1：5’-CCCGGGTACCGAGCTCGAGACGATGCGTCCGGCGTAGAG-3’。
pDS3.0的序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
TTGTTATCCGCTCACAATTCCACATGTGGAATTCCACATGTGGAATTCCCATGTCAGCCGTTAAGTGTTCCTGTGTCACTCAAAATTGCTTTGAGAGGCTCTAAGGGCTTCTCAGTGCGTTACATCCCTGGCTTGTTGTCCACAACCGTTAAACCTTAAAAGCTTTAAAAGCCTTATATATTCTTTTTTTTCTTATAAAACTTAAAACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGATTTATATTAATTTTATTGTTCAAACATGAGAGCTTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGGGTTTAGTTCGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACGTACTATCAACAGGTTGAACTGCTGATCTTCAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGATCCAGCCGACCAGGCTTTCCACGCCCGCGTGCCGCTCCATGTCGTTCGCGCGGTTCTCGGAAACGCGCTGCCGCGTTTCGTGATTGTCACGCTCAAGCCCGTAGTCCCGTTCGAGCGTCGCGCAGAGGTCAGCGAGGGCGCGGTAGGCCCGATACGGCTCATGGATGGTGTTTCGGGTCGGGTGAATCTTGTTGATGGCGATATGGATGTGCAGGTTGTCGGTGTCGTGATGCACGGCACTGACGCGCTGATGCTCGGCGAAGCCAAGCCCAGCGCAGATGCGGTCCTCAATCGCGCGCAACGTCTCCGCGTCGGGCTTCTCTCCCGCGCGGAAGCTAACCAGCAGGTGATAGGTCTTGTCGGCCTCGGAACGGGTGTTGCCGTGCTGGGTCGCCATCACCTCGGCCATGACAGCGGGCAGGGTGTTTGCCTCGCAGTTCGTGACGCGCACGTGACCCAGGCGCTCGGTCTTGCCTTGCTCGTCGGTGATGTACTTCACCAGCTCCGCGAAGTCGCTCTTCTTGATGGAGCGCATGGGGACGTGCTTGGCAATCACGCGCACCCCCCGGCCGTTTTAGCGGCTAAAAAAGTCATGGCTCTGCCCTCGGGCGGACCACGCCCATCATGACCTTGCCAAGCTCGTCCTGCTTCTCTTCGATCTTCGCCAGCAGGGCGAGGATCGTGGCATCACCGAACCGCGCCGTGCGCGGGTCGTCGGTGAGCCAGAGTTTCAGCAGGCCGCCCAGGCGGCCCAGGTCGCCATTGATGCGGGCCAGCTCGCGGACGTGCTCATAGTCCACGACGCCCGTGATTTTGTAGCCCTGGCCGACGGCCAGCAGGTAGGCCGACAGGCTCATGCCGGCCGCCGCCGCCTTTTCCTCAATCGCTCTTCGTTCGTCTGGAAGGCAGTACACCTTGATAGGTGG
GCTGCCCTTCCTGGTTGGCTTGGTTTCATCAGCCATCCGCTTGCCCTCATCTGTTAC
GCCGGCGGTAGCCGGCCAGCCTCGCAGAGCAGGATTCCCGTTGAGCACCGCCAGG
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CTATCCTGCCCGGCTGACGCCGTTGGATACACCAAGGAAAGTCTACACGAACCCTT
TGGCAAAATCCTGTATATCGTGCGAAAAAGGATGGATATACCGAAAAAATCGCTA
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TCTTTGACAACAGATGTTTTCTTGCCTTTGATGTTCAGCAGGAAGCTTGGCGCAAA
CGTTGATTGTTTGTCTGCGTAGAATCCTCTGTTTGTCATATAGCTTGTAATCACGAC
ATTGTTTCCTTTCGCTTGAGGTACAGCGAAGTGTGAGTAAGTAAAGGTTACATCGT
TAGGATCAAGATCCATTTTTAACACAAGGCCAGTTTTGTTCAGCGGCTTGTATGGG
CCAGTTAAAGAATTAGAAACATAACCAAGCATGTAAATATCGTTAGACGTAATGC
CGTCAATCGTCATTTTTGATCCGCGGGAGTCAGTGAACAGGTACCATTTGCCGTTC
ATTTTAAAGACGTTCGCGCGTTCAATTTCATCTGTTACTGTGTTAGATGCAATCAGC
GGTTTCATCACTTTTTTCAGTGTGTAATCATCGTTTAGCTCAATCATACCGAGAGCG
CCGTTTGCTAACTCAGCCGTGCGTTTTTTATCGCTTTGCAGAAGTTTTTGACTTTCT
TGACGGAAGAATGATGTGCTTTTGCCATAGTATGCTTTGTTAAATAAAGATTCTTC
GCCTTGGTAGCCATCTTCAGTTCCAGTGTTTGCTTCAAATACTAAGTATTTGTGGCC
TTTATCTTCTACGTAGTGAGGATCTCTCAGCGTATGGTTGTCGCCTGAGCTGTAGTT
GCCTTCATCGATGAACTGCTGTACATTTTGATACGTTTTTCCGTCACCGTCAAAGAT
TGATTTATAATCCTCTACACCGTTGATGTTCAAAGAGCTGTCTGATGCTGATACGTT
AACTTGTGCAGTTGTCAGTGTTTGTTTGCCGTAATGTTTACCGGAGAAATCAGTGT
AGAATAAACGGATTTTTCCGTCAGATGTAAATGTGGCTGAACCTGACCATTCTTGT
GTTTGGTCTTTTAGGATAGAATCATTTGCATCGAATTTGTCGCTGTCTTTAAAGACG
CGGCCAGCGTTTTTCCAGCTGTCAATAGAAGTTTCGCCGACTTTTTGATAGAACAT
GTAAATCGATGTGTCATCCGCATTTTTAGGATCTCCGGCTAATGCAAAGACGATGT
GGTAGCCGTGATAGTTTGCGACAGTGCCGTCAGCGTTTTGTAATGGCCAGCTGTCC
CAAACGTCCAGGCCTTTTGCAGAAGAGATATTTTTAATTGTGGACGAATCGAATTC
AGGAACTTGATATTTTTCATTTTTTTGCTGTTCAGGGATTTGCAGCATATCATGGCG
TGTAATATGGGAAATGCCGTATGTTTCCTTATATGGCTTTTGGTTCGTTTCTTTCGC
AAACGCTTGAGTTGCGCCTCCTGCCAGCAGTGCGGTAGTAAAGGTTAATACTGTTG
CTTGTTTTGCAAACTTTTTGATGTTCATCGTTCATGTCTCCTTTTTTATGTACTGTGT
TAGCGGTCTGCTTCTTCCAGCCCTCCTGTTTGAAGATGGCAAGTTAGTTACGCACA
ATAAAAAAAGACCTAAAATATGTAAGGGGTGACGCCAAAGTATACACTTTGCCCT
TTACACATTTTAGGTCTTGCCTGCTTTATCAGTAACAAACCCGCGCGATTTACTTTT
CGACCTCATTCTATTAGACTCTCGTTTGGATTGCAACTGGTCTATTTTCCTCTTTTGT
TTGATAGAAAATCATAAAAGGATTTGCAGACTACGGGCCTAAAGAACTAAAAAAT
CTATCTGTTTCTTTTCATTCTCTGTATTTTTTATAGTTTCTGTTGCATGGGCATAAAG
TTGCCTTTTTAATCACAATTCAGAAAATATCATAATATCTCATTTCACTAAATAATA
GTGAACGGCAGGTATATGTGATGGGTTAAAAAGGATCGATCCTCTAGAGTCGACG
CGTCGATCCGGTGATTGATTGAGCAAGCTAGCTTTATGCTTGTAAACCGTTTTGTG
AAAAAATTTTTAAAATAAAAAAGGGGACCTCTAGGGTCCCCAATTAATTAGTAAT
ATAATCTATTAAAGGTCATTCAAAAGGTCATCCACCGGATCAATTCCCCTGCTCGC
GCAGGCTGGGTGCCAAGCTCTCGGGTAACATCAAGGCCCGATCCTTGGAGCCCTTG
CCCTCCCGCACGATGATCGTGCCGTGATCGAAATCCAGATCCTTGACCCGCAGTTG
CAAACCCTCACTGATCCGCGCGTCGAATTGCCGGGAAGCCGATCTCGGCTTGAACG
AATTGTTAGGTGGCGGTACTTGGGTCGATATCAAAGTGCATCACTTCTTCCCGTAT
GCCCAACTTTGTATAGAGAGCCACTGCGGGATCGTCACCGTAATCTGCTTGCACGT
AGATCACATAAGCACCAAGCGCGTTGGCCTCATGCTTGAGGAGATTGATGAGCGC
GGTGGCAATGCCCTGCCTCCGGTGCTCGCCGGAGACTGCGAGATCATAGATATAG
ATCTCACTACGCGGCTGCTCAAACCTGGGCAGAACGTAAGCCGCGAGAGCGCCAA
CAACCGCTTCTTGGTCGAAGGCAGCAAGCGCGATGAATGTCTTACTACGGAGCAA
GTTCCCGAGGTAATCGGAGTCCGGCTGATGTTGGGAGTAGGTGGCTACGTCTCCGA
ACTCACGACCGAAAAGATCAAGAGCAGCCCGCATGGATTTGACTTGGTCAGGGCC
GAGCCTACATGTGCGAATGATGCCCATACTTGAGCCACCTAACTTTGTTTTAGGGC
GACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAA
CATCAAACATCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGAGGCATA
GACTGTACAAAAAAACAGTCATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTAC
CACCGCTGCGTTCGGTCAAGGTTCTGGACCAGTTGCGTGAGCGCATACGCTACTTG
CATTACAGTTTACGAACCGAACAGGCTTATGTCAATTCGAGAATTAATTCGACGCG
CAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGT
CGGCAAATAATGTCTAACAATTCGTTCAAGCCGACGCCGCTTCGCGGCGCGGCTTA
ACTCAAGCGTTAGATGCACTAAGCACATAATTGCTCACAGCCAAACTATCAGGTCA
AGTCTGCTTTTATTATTTTTAAGCGTGCATAATAAGCCCTACACAAATTGGGAGAT
ATATCATGAAAGGCTGGCTTTTTCTTGTTATCGCAATAGTTGGCGAAGTAATCGCA
ACATCCGCATTAAAATCTAGCGAGGGCTTTACTAAGCTGATCCGGTGGATGACCTT
TTGAATGACCTTTAATAGATTATATTACTAATTAATTGGGGACCCTAGAGGTCCCC
TTTTTTATTTTAAAAATTTTTTCACAAAACGGTTTACAAGCATAAAGCTAGCTTGCT
CAATCAATCACCGGATCGACGCGTCGACGGATCCCAAGCTTCTTCTAGAGGTACCGCATGCGATATCGAGCTCTCCCGGGAATTCCACAAA。
pBCPP51的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
CTCGGGCCGTCTCTTGGGCTTGATCGGCCTTCTTGCGCATCTCACGCGCTCCTGCGG
CGGCCTGTAGGGCAGGCTCATACCCCTGCCGAACCGCTTTTGTCAGCCGGTCGGCCACG
GCTTCCGGCGTCTCAACGCGCTTTGAGATTCCCAGCTTTTCGGCCAATCCCTGCGGTGCA
TAGGCGCGTGGCTCGACCGCTTGCGGGCTGATGGTGACGTGGCCCACTGGTGGCCGCTC
CAGGGCCTCGTAGAACGCCTGAATGCGCGTGTGACGTGCCTTGCTGCCCTCGATGCCCC
GTTGCAGCCCTAGATCGGCCACAGCGGCCGCAAACGTGGTCTGGTCGCGGGTCATCTGC
GCTTTGTTGCCGATGAACTCCTTGGCCGACAGCCTGCCGTCCTGCGTCAGCGGCACCAC
GAACGCGGTCATGTGCGGGCTGGTTTCGTCACGGTGGATGCTGGCCGTCACGATGCGAT
CCGCCCCGTACTTGTCCGCCAGCCACTTGTGCGCCTTCTCGAAGAACGCCGCCTGCTGT
TCTTGGCTGGCCGACTTCCACCATTCCGGGCTGGCCGTCATGACGTACTCGACCGCCAA
CACAGCGTCCTTGCGCCGCTTCTCTGGCAGCAACTCGCGCAGTCGGCCCATCGCTTCAT
CGGTGCTGCTGGCCGCCCAGTGCTCGTTCTCTGGCGTCCTGCTGGCGTCAGCGTTGGGC
GTCTCGCGCTCGCGGTAGGCGTGCTTGAGACTGGCCGCCACGTTGCCCATTTTCGCCAG
CTTCTTGCATCGCATGATCGCGTATGCCGCCATGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTGTCCAACC
GGCTCGACGGGGGCAGCGCAAGGCGGTGCCTCCGGCGGGCCACTCAATGCTTGAGTAT
ACTCACTAGACTTTGCTTCGCAAAGTCGTGACCGCCTACGGCGGCTGCGGCGCCCTACG
GGCTTGCTCTCCGGGCTTCGCCCTGCGCGGTCGCTGCGCTCCCTTGCCAGCCCGTGGATA
TGTGGACGATGGCCGCGAGCGGCCACCGGCTGGCTCGCTTCGCTCGGCCCGTGGACAA
CCCTGCTGGACAAGCTGATGGACAGGCTGCGCCTGCCCACGAGCTTGACCACAGGGAT
TGCCCACCGGCTACCCAGCCTTCGACCACATACCCACCGGCTCCAACTGCGCGGCCTGC
GGCCTTGCCCCATCAATTTTTTTAATTTTCTCTGGGGAAAAGCCTCCGGCCTGCGGCCTG
CGCGCTTCGCTTGCCGGTTGGACACCAAGTGGAAGGCGGGTCAAGGCTCGCGCAGCGA
CCGCGCAGCGGCTTGGCCTTGACGCGCCTGGAACGACCCAAGCCTATGCGAGTGGGGG
CAGTCGAAGGCGAAGCCCGCCCGCCTGCCCCCCGAGCCTCACGGCGGCGAGTGCGGGG
GTTCCAAGGGGGCAGCGCCACCTTGGGCAAGGCCGAAGGCCGCGCAGTCGATCAACAA
GCCCCGGAGGGGCCACTTTTTGCCGGAGGGGGAGCCGCGCCGAAGGCGTGGGGGAAC
CCCGCAGGGGTGCCCTTCTTTGGGCACCAAAGAACTAGATATAGGGCGAAATGCGAAAG
ACTTAAAAATCAACAACTTAAAAAAGGGGGGTACGCAACAGCTCATTGCGGCACCCCC
CGCAATAGCTCATTGCGTAGGTTAAAGAAAATCTGTAATTGACTGCCACTTTTACGCAAC
GCATAATTGTTGTCGCGCTGCCGAAAAGTTGCAGCTGATTGCGCATGGTGCCGCAAGCT
TGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAGACGATGCGTC
CGGCGTAGAGGATCTGAAGATCAGCAGTTCAACCTGTTGATAGTACGTACTAAGCTCTCA
TGTTTCACGTACTAAGCTCTCATGTTTAACGTACTAAGCTCTCATGTTTAACGAACTAAA
CCCTCATGGCTAACGTACTAAGCTCTCATGGCTAACGTACTAAGCTCTCATGTTTCACGT
ACTAAGCTCTCATGTTTGAACAATAAAATTAATATAAATCAGCAACTTAAATAGCCTCTAA
GGTTTTAAGTTTTATAAGAAAAAAAAGAATATATAAGGCTTTTAAAGCTTTTAAGGTTTA
ACGGTTGTGGACAACAAGCCAGGGATGTAACGCACTGAGAAGCCCTTAGAGCCTCTCA
AAGCAATTTTGAGTGACACAGGAACACTTAACGGCTGACATGGGAATTCGGACGCACA
CCGTGGAAACGGATGAAGGCACGAACCCAGTTGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAACT
GTAATGCAAGTAGCGTATGCGCTCACGCAACTGGTCCAGAACCTTGACCGAACGCAGCG
GTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGTACAGTCTAT
GCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGA
GCAGCAACGATGTTACGCAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAA
CAAAGTTAGGTGGCTCAAGTATGGGCATCATTCGCACATGTAGGCTCGGCCCTGACCAA
GTCAAATCCATGCGGGCTGCTCTTGATCTTTTCGGTCGTGAGTTCGGAGACGTAGCCACC
TACTCCCAACATCAGCCGGACTCCGATTACCTCGGGAACTTGCTCCGTAGTAAGACATTC
ATCGCGCTTGCTGCCTTCGACCAAGAAGCGGTTGTTGGCGCTCTCGCGGCTTACGTTCT
GCCCAGGTTTGAGCAGCCGCGTAGTGAGATCTATATCTATGATCTCGCAGTCTCCGGCGA
GCACCGGAGGCAGGGCATTGCCACCGCGCTCATCAATCTCCTCAAGCATGAGGCCAACG
CGCTTGGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATCCCGCAGTGGCTC
TCTATACAAAGTTGGGCATACGGGAAGAAGTGATGCACTTTGATATCGACCCAAGTACC
GCCACCTAACAATTCGTTCAAGCCGAGATCGGCTTCCCGGCCGCGGAGTTGTTCGGTAA
ATTGTCACAACGCCGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGCCCGCGTTCCTGC
TGGCGCTGGGCCTGTTTCTGGCGCTGGACTTCCCGCTGTTCCGTCAGCAGCTTTTCGCC
CACGGCCTTGATGATCGCGGCGGCCTTGGCCTGCATATCCCGATTCAACGGCCCCAGGGCGTCCAGAACGGGCTTCAGGCGCTCCCGAAGGT。
(3)使用引物BBR1-fanA2和19MCSa以pBBR1MCS-5mcs为模板，使用保真酶按照以下程序扩增出约1kb的片段：95℃1min；95℃20s，55℃20s，72℃1min，34个循环；72℃5min。使用引物R6Ks2和RP4a2以pDS3.0为模板，使用保真酶按照以下程序扩增出约2.5kb的片段：95℃1min；95℃20s，55℃20s，72℃2min，30个循环；72℃5min。使用引物tetS和tetA以pTRG(GenBank:AF361441.1)为模板，使用保真酶按照以下程序扩增出约1.5kb的四环素抗性片段：95℃1min；95℃20s，55℃20s，72℃1min，34个循环；72℃5min。将三个扩增产物进行琼脂糖电泳和切胶回收，然后使用重组克隆试剂盒(诺唯赞)对片段进行连接，热激转化大肠杆菌S17-1λpir感受态细胞，涂布含20μg/mL四环素的LB固体平板，置于37℃培养，挑取单菌落后进行PCR检测，并对正确的克隆进行测序鉴定，最终得到pBCPP52(图1)，序列如SEQ IDNO.2所示。
引物序列为：
BBR1-fanA2：5’-CGTGCTCCTGTCGTTGAGGATTGCTCAGGCTCTCCCCGT-3’；
19MCSa：5’-AAGCTTGCATGCCTGCAGGT-3’；
R6Ks2：5’-GTCAAAAATAAGTGCCTTCCGAATTCCCATGTCAGCCGTT-3’；
RP4a2：5’-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTTCTGCTCTGATGCCGCATAG-3’；
tetS：5’-GGAAGGCACTTATTTTTGAC-3’；
tetA：5’-TCCTCAACGACAGGAGCACG-3’。
pBCPP52的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAGTGCGGCACCCTACCGCATGGAGATAAGCATGGCCACGCAGTCCAGAGAAATCGGCATTCAAGCCAAGAACAAGCCCGGTCACTGGGTGCAAACGGAACGCAAAGCGCATGAGGCGTGGGCCGGGCTTATTGCGAGGAAACCCACGGCGGCAATGCTGCTGCATCACCTCGTGGCGCAGATGGGCCACCAGAACGCCGTGGTGGTCAGCCAGAAGACACTTTCCAAGCTCATCGGACGTTCTTTGCGGACGGTCCAATACGCAGTCAAGGACTTGGTGGCCGAGCGCTGGATCTCCGTCGTGAAGCTCAACGGCCCCGGCACCGTGTCGGCCTACGTGGTCAATGACCGCGTG
GCGTGGGGCCAGCCCCGCGACCAGTTGCGCCTGTCGGTGTTCAGTGCCGCCGTGGTGG
TTGATCACGACGACCAGGACGAATCGCTGTTGGGGCATGGCGACCTGCGCCGCATCCCG
ACCCTGTATCCGGGCGAGCAGCAACTACCGACCGGCCCCGGCGAGGAGCCGCCCAGCC
AGCCCGGCATTCCGGGCATGGAACCAGACCTGCCAGCCTTGACCGAAACGGAGGAATG
GGAACGGCGCGGGCAGCAGCGCCTGCCGATGCCCGATGAGCCGTGTTTTCTGGACGAT
GGCGAGCCGTTGGAGCCGCCGACACGGGTCACGCTGCCGCGCCGGTAGCACTTGGGTT
GCGCAGCAACCCGTAAGTGCGCTGTTCCAGACTATCGGCTGTAGCCGCCTCGCCGCCCT
ATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCT
GAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCGTTTTTATCAGGCTCTGGGAGG
CAGAATAAATGATCATATCGTCAATTATTACCTCCACGGGGAGAGCCTGAGCAATCCTCA
ACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGCCAGGACCCAACGCTGCCCGAGATGCG
CCGCGTGCGGCTGCTGGAGATGGCGGACGCGATGGATATGTTCTGCCAAGGGTTGGTTT
GCGCATTCACAGTTCTCCGCAAGAATTGATTGGCTCCAATTCTTGGAGTGGTGAATCCGT
TAGCGAGGTGCCGCCGGCTTCCATTCAGGTCGAGGTGGCCCGGCTCCATGCACCTCGAC
GCAACGCGGGGAGGCAGACAAGGTATAGGGCGGCGCCTACAATCCATGCCAACCCGTT
CCATGTGCTCGCCGAGGCGGCATAAATCGCCGTGACGATCAGCGGTCCAATGATCGAAG
TTAGGCTGGTAAGAGCCGCGAGCGATCCTTGAAGCTGTCCCTGATGGTCGTCATCTACCT
GCCTGGACAGCATGGCCTGCAACGCGGGCATCCCGATGCCGCCGGAAGCGAGAAGAAT
CATAATGGGGAAGGCCATCCAGCCTCGCGTCGCGAACGCCAGCAAGACGTAGCCCAGC
GCGTCGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGG
ACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGG
CCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTG
CCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATA
GTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATGG
GTCGGCGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGG
CCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGTAAGGAGATGGCGCCCAACAGTC
CCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAA
GTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCAC
CTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGAATCCACAGGACGGG
TGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTG
GGCGGCGGCCAAAGCGGTCGGACAGTGCTCCGAGAACGGGTGCGCATAGAAATTGCAT
CAACGCATATAGCGCTAGCAGCACGCCATAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGA
TATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTACCGGCATAACCAAGCCTATGCCTACAGCATCCAGG
GTGACGGTGCCGAGGATGACGATGAGCGCATTGTTAGATTTCATACACGGTGCCTGACT
GCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCATTAAAGCTAATCGATGATAAGCTGTCA
AACATGAGAATTGAGCGAACGTCAAAAATAAGTGCCTTCCGAATTCCCATGTCAGCCGT
TAAGTGTTCCTGTGTCACTCAAAATTGCTTTGAGAGGCTCTAAGGGCTTCTCAGTGCGTT
ACATCCCTGGCTTGTTGTCCACAACCGTTAAACCTTAAAAGCTTTAAAAGCCTTATATATT
CTTTTTTTTCTTATAAAACTTAAAACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGATTTATATTAATT
TTATTGTTCAAACATGAGAGCTTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATG
AGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGGGTTTAGTTCGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTTA
AACATGAGAGCTTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACGTACTATCAACAGGTTGAA
CTGCTGATCTTCAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGATCCAGCCGACCAGGC
TTTCCACGCCCGCGTGCCGCTCCATGTCGTTCGCGCGGTTCTCGGAAACGCGCTGCCGC
GTTTCGTGATTGTCACGCTCAAGCCCGTAGTCCCGTTCGAGCGTCGCGCAGAGGTCAGC
GAGGGCGCGGTAGGCCCGATACGGCTCATGGATGGTGTTTCGGGTCGGGTGAATCTTGT
TGATGGCGATATGGATGTGCAGGTTGTCGGTGTCGTGATGCACGGCACTGACGCGCTGA
TGCTCGGCGAAGCCAAGCCCAGCGCAGATGCGGTCCTCAATCGCGCGCAACGTCTCCG
CGTCGGGCTTCTCTCCCGCGCGGAAGCTAACCAGCAGGTGATAGGTCTTGTCGGCCTCG
GAACGGGTGTTGCCGTGCTGGGTCGCCATCACCTCGGCCATGACAGCGGGCAGGGTGT
TTGCCTCGCAGTTCGTGACGCGCACGTGACCCAGGCGCTCGGTCTTGCCTTGCTCGTCG
GTGATGTACTTCACCAGCTCCGCGAAGTCGCTCTTCTTGATGGAGCGCATGGGGACGTG
CTTGGCAATCACGCGCACCCCCCGGCCGTTTTAGCGGCTAAAAAAGTCATGGCTCTGCC
CTCGGGCGGACCACGCCCATCATGACCTTGCCAAGCTCGTCCTGCTTCTCTTCGATCTTC
GCCAGCAGGGCGAGGATCGTGGCATCACCGAACCGCGCCGTGCGCGGGTCGTCGGTGA
GCCAGAGTTTCAGCAGGCCGCCCAGGCGGCCCAGGTCGCCATTGATGCGGGCCAGCTC
GCGGACGTGCTCATAGTCCACGACGCCCGTGATTTTGTAGCCCTGGCCGACGGCCAGCA
GGTAGGCCGACAGGCTCATGCCGGCCGCCGCCGCCTTTTCCTCAATCGCTCTTCGTTCGT
CTGGAAGGCAGTACACCTTGATAGGTGGGCTGCCCTTCCTGGTTGGCTTGGTTTCATCA
GCCATCCGCTTGCCCTCATCTGTTACGCCGGCGGTAGCCGGCCAGCCTCGCAGAGCAGG
ATTCCCGTTGAGCACCGCCAGGTGCGAATAAGGGACAGTGAAGAAGGAACACCCGCTC
GCGGGTGGGCCTACTTCACCTATCCTGCCCGGCTGACGCCGTTGGATACACCAAGGAAA
GTCTACACGAACCCTTTGGCAAAATCCTGTATATCGTGCGAAAAAGGATGGATATACCGA
AAAAATCGCTATAATGACCCCGAAGCAGGGTTATGCAGCGGAAAAGCGCTGCTTCCCTG
CTGTTTTGTGGAATATCTACCGACTGGAAACAGGCAAATGCAGGAAATTACTGAACTGA
GGGGACAGGCGAGAGACGATGCCAAAGAGCTACACCGACGAGCTGGCCGAGTGGGTT
GAATCCCGCGCGGCCAAGAAGCGCCGGCGTGATGAGGCTGCGGTTGCGTTCCTGGCGG
TGAGGGCGGATGTCGAGGCGGCGTTAGCGTCCGGCTATGCGCTCGTCACCATTTGGGAG
CACATGCGGGAAACGGGGAAGGTCAAGTTCTCCTACGAGACGTTCCGCTCGCACGCCA
GGCGGCACATCAAGGCCAAGCCCGCCGATGTGCCCGCACCGCAGGCCAAGGCTGCGGA
ACCCGCGCCGGCACCCAAGACGCCGGAGCCACGGCGGCCGAAGCAGGGGGGCAAGGC
TGAAAAGCCGGCCCCCGCTGCGGCCCCGACCGGCTTCACCTTCAACCCAACACCGGAC
AAAAAGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCG
GTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGG
GCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGT
TGGGCGCCATCTCCTTGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACA
CATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAA
GCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGA。
实施例2：克隆恶臭假单胞KT2440基因组中粘附蛋白基因lapA所在的DNA区域使用质粒pBCPP51和pBCPP52克隆基因组大片段DNA的步骤和原理示意图见图2所示。
(1)恶臭假单胞菌KT2440的基因组序列从NCBI数据库获取(NC_002947.4)，lapA基因大小为26kb，为增加本实施例中克隆片段的长度，向lapA前后延伸至片段总长度约为53kb，分别使用引物对lapAupS/lapAupA和lapAdnS/lapAdnA以KT2440基因组DNA为模板，使用保真酶按照以下程序扩增出约0.8kb的上游和下游同源臂片段：95℃1min；95℃20s，55℃20s，72℃1min，34个循环；72℃5min。使用EcoRI对pBCPP51和pBCPP52进行单酶切，将上述PCR产物和酶切产物进行切胶回收，再使用重组克隆试剂盒(诺唯赞)将上游同源臂连入pBCPP51中，将下游同源臂连入pBCPP52中，热激转化大肠杆菌S17-1λpir感受态细胞，分别涂布含20μg/mL庆大霉素和含20μg/mL四环素的LB固体平板，置于37℃培养，挑取单菌落后进行PCR验证，分别得到pBCPP51-lapAup和pBCPP52-lapAdn。
引物序列为：
lapAupS：5’-TCCACGGTGTGCGTCCGAATTCCAAGGAAAAGCGCCACTGGT-3’；
lapAupA：5’-TTAACGGCTGACATGGGAATTCCCCTGACCACCAAGAAGCCA-3’；
lapAdnS：5’-TTAACGGCTGACATGGGAATTCCTTGGGGGATTAGCGAGACG-3’；
lapAdnA：5’-AAAATAAGTGCCTTCCGAATTCCAAGCTGCTGGGCTTTGAAG-3’。
(2)活化含pBCPP51-lapAup的大肠杆菌S17-1λpir(供体菌)与恶臭假单胞菌KT2440(受体菌)后，分别离心收集菌体，悬浮至无抗生素的LB液体培养基中，将供体菌和受体菌以体积比3:1混合，并在28℃培养箱中孵育12h，取100μL涂布于含25μg/mL氯霉素和40μg/mL庆大霉素的LB固体平板上，置于28℃培养，挑取单菌落后，使用引物lapAupyzS和lapAupyzA进行PCR验证，无扩增产物的菌落则是pBCPP51-lapAup整合到上游目标区域，是正确的一次整合菌株。
引物序列为：
lapAupyzS：5’-GGTAGAGCACTCCAGCCCG-3’；
lapAupyzA：5’-CGGCACCTACAGCACCATG-3’。
(3)活化培养含pBCPP52-lapAdn的大肠杆菌S17-1λpir(供体菌)与一次整合的恶臭假单胞菌KT2440菌株(受体菌)后，分别离心收集菌体，悬浮至无抗生素的LB液体培养基中，将供体菌和受体菌以体积比3:1混合，并在28℃培养箱中孵育12h，取100μL涂布于含25μg/mL氯霉素、40μg/mL庆大霉素和20μg/mL四环素的LB固体平板上，置于28℃培养，挑取单菌落后，使用引物lapAdnyzS和lapAdnyzA进行PCR验证，无扩增产物的菌落则是pBCPP52-lapAdn整合到下游目标区域，是正确的二次整合菌株。
引物序列为：
lapAdnyzS：5’-GGTCTGCACCGTTTTTGAAA-3’；
lapAdnyzA：5’-CTATGAGCGCCTGGTCGACT-3’。
(4)培养二次整合的恶臭假单胞菌KT2440菌株，收集5mL菌液，使用细菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物)提取基因组DNA，使用以下体系对基因组进行酶切：50μL基因组DNA，4μLXbaI限制性核酸内切酶(Takara)，6μL酶切缓冲液，37℃孵育6h。对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将胶块上端较宽范围的大片段DNA切下进行纯化回收以去除较小的酶切DNA片段。使用以下体系对回收的酶切产物进行酶连：20μL酶切的基因组DNA(约2μg)，4μL T4连接酶(Takara)，4μL10×连接酶缓冲液，12μL ddH2O，16℃孵育12h后转入4℃再孵育12h。取4管高效的大肠杆菌XL10-Gold热激感受态细胞(唯地生物)，每管加入10μL连接产物，混合后冰上孵育30min，在42℃水浴锅热激35s，迅速放回冰上并静置2分钟，加入700μL新鲜LB培养基复苏培养1.5h后，涂布含20μg/mL庆大霉素和20μg/mL四环素的LB固体平板上(图3)，置于37℃培养，挑取单菌落培养并进行PCR验证，引物为lapAyzS和lapAyzA，产物约为2kb，得到质粒pBCPP-lapA。该质粒pBCPP-lapA可在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中复制。
引物序列为：
lapAyzS：5'-CGTTCAACATCGCTACCCTC-3'；
lapAyzA：5'-GCTCTTGCCATTCTTCCACA-3'。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种质粒组合，其特征在于，包含序列如SEQ ID NO.1所示的质粒pBCPP51和序列如SEQ ID NO.2所示的质粒pBCPP52。
2.根据权利要求1所述的质粒组合，其特征在于，质粒pBCPP51含有R6K ori复制起点、庆大霉素抗性基因、接合转移元件mob和来自于pBBR1MCS-5的复制起点pBBR1 oriV，pBBR1oriV后连接多克隆位点MCS；质粒pBCPP52含有四环素抗性基因、R6K ori复制起点、接合转移元件RP4、pBBR1 oriV复制所需的复制蛋白基因pBBR1 rep，pBBR1 rep前连接多克隆位点MCS。
3.根据权利要求2所述的质粒组合，其特征在于，所述多克隆位点MCS包含的限制性核酸内切酶识别位点顺序依次是HindIII、PstI、SalI、XbaI、BamHI、KpnI、XhoI和SacI。
4.含有权利要求1所述质粒组合的重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主菌为大肠杆菌S17-1λpir。
6.一种权利要求1所述的质粒组合的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以pBBR1MCS-5为模板，使用引物BBR1-fanA1和BBR1-fanS1扩增得到线性化质粒；以pUC19为模板，使用引物19MCSs和19MCSa扩增得到多克隆位点，将两片段通过重组酶连接，得到质粒pBBR1MCS-5mcs；
(2)以pBBR1MCS-5mcs为模板，使用引物BBR1-fanS3和19MCSs扩增得到包含庆大霉素抗性基因、mob转移元件、pBBR1 oriV和多克隆位点的片段；以pDS3.0为模板，使用引物R6Ks1和R6Ka1扩增得到复制起点R6K ori的片段；将两片段通过重组酶连接，得到质粒pBCPP51；
(3)以pBBR1MCS-5mcs为模板，使用引物BBR1-fanA2和19MCSa扩增得到包含多克隆位点和rep的片段；以pDS3.0为模板，使用引物R6Ks2和RP4a2扩增得到含复制起点R6Kori和RP4接合转移元件的片段；以pTRG为模板，使用引物tetS和tetA扩增得到四环素抗性基因片段，将三个片段通过重组酶连接，得到质粒pBCPP52。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，
步骤(1)中所述引物具体为：
BBR1-fanA1：5’-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTGCGGCACCATGCGCAATCA-3’；
BBR1-fanS1：5’-CCCGGGTACCGAGCTCGAGTGCGGCACCCTACCGCATGG-3’；
19MCSs：5’-CTCGAGCTCGGTACCCGGG-3’；
19MCSa：5’-AAGCTTGCATGCCTGCAGGT-3’；
步骤(2)中所述引物具体为：
BBR1-fanS3：5’-AACGGCTGACATGGGAATTCGGACGCACACCGTGGAAAC-3’；
19MCSs：5’-CTCGAGCTCGGTACCCGGG-3’；
R6Ks1：5’-GAATTCCCATGTCAGCCGTT-3’；
R6Ka1：5’-CCCGGGTACCGAGCTCGAGACGATGCGTCCGGCGTAGAG-3’
步骤(3)中所述引物具体为：
BBR1-fanA2：5’-CGTGCTCCTGTCGTTGAGGATTGCTCAGGCTCTCCCCGT-3’；
19MCSa：5’-AAGCTTGCATGCCTGCAGGT-3’；
R6Ks2：5’-GTCAAAAATAAGTGCCTTCCGAATTCCCATGTCAGCCGTT-3’；
RP4a2：5’-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTTCTGCTCTGATGCCGCATAG-3’；
tetS：5’-GGAAGGCACTTATTTTTGAC-3’；
tetA：5’-TCCTCAACGACAGGAGCACG-3’。
8.权利要求1所述的质粒组合在克隆恶臭假单胞菌基因组中大片段DNA中的应用。
9.一种利用权利要求1所述的质粒组合克隆恶臭假单胞菌基因组中大片段DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待克隆DNA区域的前段和后端分别扩增，作为上游和下游同源交换的同源臂，并分别连入使用EcoRI酶切的pBCPP51和pBCPP52中，转化大肠杆菌S17-1λpir，分别得到质粒pBCPP51up和pBCPP52dn；
(2)将pBCPP51up通过接合转移导入到恶臭假单胞菌中，通过同源交换整合到基因组中的上游同源臂所在位置，得到具有庆大霉素抗性的一次整合菌株；
(3)将pBCPP52dn通过接合转移导入步骤(2)中的一次整合菌株中，通过同源交换整合到基因组中的下游同源臂所在位置，得到获得四环素抗性的二次整合菌株；
(4)提取二次整合菌株的基因组，选用pBCPP51和pBCPP52上的多克隆位点MCS中的一种酶切位点进行酶切，此酶切位点不可存在于待克隆大片段DNA上；
(5)使用T4连接酶对酶切后的基因组片段进行连接环化，并转化大肠杆菌，涂布含庆大霉素和四环素的抗性平板，得到的质粒依次包含pBBR1 oriV、mob、庆大霉素抗性基因、待克隆大片段DNA、四环素抗性基因和pBBR1 oriV复制所依赖的pBBR1 rep。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的大肠杆菌为大肠杆菌XL10-Gold。
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