CN115976058B - 毒素基因及其在重组和/或基因编辑的工程菌构建中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种毒素基因及其在重组和/或基因编辑的工程菌构建中的应用。毒素基因选自SEQ ID NO.1～5任一所示。将该组可相互通用的毒素作为负筛标记，可以应用在质粒的有效克隆和快速获得无编辑质粒的基因工程菌株中，即能够应用在重组表达质粒的阳性克隆筛选和质粒丢失菌株筛选过程中，能够降低质粒构建过程中的假阳性，可快速获得正确的阳性克隆，节省重组表达及基因编辑质粒构建的时间和成本。
Description
技术领域
本申请涉及毒素基因技术领域，具体涉及毒素基因及其在基因工程菌或者基因编辑微生物构建过程中的应用，尤其涉及来自于运动发酵单胞菌或大肠杆菌的毒素基因，以及其在构建运动发酵单胞菌或大肠杆菌的基因工程菌或者基因编辑的基因工程菌中的应用。
背景技术
目前，基因编辑是一种能对生物体内特定目标进行修饰的微生物改造的重要方式，其包括了同源重组、核酸酶介导的锌指酶、转录激活样效应因子核酸酶以及CRISPR-Cas等技术。其中CRISPR-Cas编辑技术是目前最常用且效率高的基因编辑方法。然而基因编辑仍在编辑质粒构建和编辑质粒快速丢失两方面存在技术瓶颈。质粒作为基因工程改造的工具，已经应用到生命科学研究的各个方面，如蛋白表达和基因编辑等的过程中。然而在目的DNA片段***到目的质粒载体的分子克隆过程中，由于载体获得过程中限制性内切酶处理不完全或PCR后模板质粒未消除等原因，导致质粒构建结果中除阳性克隆外，还存在大量的假阳性克隆，极大的影响了质粒构建和筛选的效率。基因编辑成功后编辑质粒的丢失也是一个需要解决的问题，因为每一次遗传操作均需要引入特定的筛选标记，会存在可用选择标记有限、引入抗生素标记而产生生物安全隐患等问题。
发明内容
本申请实施例鉴别并表征了一组运动发酵单胞菌ZM4的毒素基因，并验证了来自大肠杆菌和集胞藻的毒素对ZM4的毒性作用，将该组毒素基因可相互通用并作为负筛标记应用在质粒的有效克隆和快速获得无编辑质粒的基因工程菌株中，即可以应用在重组表达质粒的阳性克隆筛选、和基因编辑质粒的阳性克隆筛选过程中，并公开了其构建过程、及应用方法。
为此，本申请实施例至少公共了以下技术方案：
第一方面，本申请实施例公开了分离的DNA分子，编码对运动发酵单胞菌菌株或大肠杆菌具有毒性的毒素蛋白，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5任一所示。
第二方面，本申请实施例公开了一种表达质粒，包含第一方面所述的分离的DNA分子的核苷酸序列以及载体。
第三方面，本申请实施例公开了一种基因编辑质粒，包含对运动发酵单胞菌菌株、大肠杆菌和/或集胞藻中具有毒性的毒素基因，所述毒素基因包括第一方面所述的分离的DNA分子的核苷酸序列；用于敲除ZMO0038的内源I-F型CRISPR-Cas表达盒；以及载体序列。
第四方面，本申请实施例公开了包含第二方面的表达质粒的基因工程菌，所述基因工程菌为运动发酵单胞菌菌株或者大肠杆菌。
第五方面，本申请实施例公开了包含第三方面的基因编辑质粒的基因工程菌，所述基因工程菌为运动发酵单胞菌菌株或者大肠杆菌。
第六方面，本申请实施例公开了所述的分离的DNA分子的应用，所述应用选自如下(1)～(4)任一项：
(1)利用所述的分离的DNA分子作为负筛选标记以降低表达质粒或者基因编辑质粒构建过程中的假阳性克隆；
(2)利用所述的分离的DNA分子作为负筛选标记以降低包含所述表达质粒的基因工程菌假阳性克隆；
(3)利用所述的分离的DNA分子作为负筛选标记以降低包含所述基因编辑质粒的基因工程菌假阳性克隆；
(4)利用权利要求1所述的分离的DNA分子作为负筛选标记构建质粒丢失的基因工程菌株的应用；
(1)～(4)中，所述基因工程菌为运动发酵单胞菌菌株或者大肠杆菌的基因工程菌。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：
(1)本申请实施例提供的毒素基因具有使得运动发酵单胞菌菌株或者大肠杆菌的生物延迟期明显增长和最终生物量下降的作用，并且其毒素表达量与其对运动发酵单胞菌菌株或者大肠杆菌的生物量成负相关，充分说明其毒性作用。
(2)通过将该毒素基因与启动子组合构建进入重组表达质粒，以作为负向筛选标签，能够降低质粒构建过程中的假阳性，使得可以快速获得正确的阳性克隆，节省了质粒构建的时间和成本。
(3)通过将该毒素基因与启动子组合构建进入基因编辑质粒，以作为负向筛选标签，帮助快速获得基因编辑质粒丢失的基因工程菌株，相对于传统编辑质粒丢失的基因工程菌株的构建过程，具有时间和效率成本大幅降低的明显优势。
(4)该组毒素基因可以在运动发酵单胞菌、大肠杆菌和集胞藻中相互通用，减少毒素利用过程中的复杂性。
附图说明
图1为本申请实施例提供的转入有毒素表达质粒的运动发酵单胞菌ZM4菌株,图1a为ZM4(pEZT32_008)、图1b为ZM4(pEZT33_002)、图1c为ZM4(pEZT33_036)、图1d为ZM4(pEZT32_002-33_036)、图1e为ZM4(pEZ15A))的生长曲线图以及此五种重组ZM4菌株的生长速率结果图(图1f)。
图2为本申请实施例提供的转入有毒素表达质粒的大肠杆菌T1的生长生物量。图2a为T1(pEZT32_008)、图2b为T1(pEZT33_002)、图2c为T1(pEZT33_036)；毒性较强的ZMOp33×002和毒性较弱的ZMOp33×036处于一个操纵子下的T1菌株(图2d)，图2e为对照菌株T1(pEZ15Asp)。
图3为本申请实施例提供的转入MazF表达质粒的ZM4的生长生物量结果图，图3a为ZM4(pEZ15Asp)作为对照菌株，图3b为ZM4(pEZTMazF)菌株。
图4为本申请实施例提供的转入ssl7039表达质粒的ZM4的生长生物量结果图，图4a为ZM4(pEZ15Asp)作为对照菌株，图4b为ZM4(pEZTssl7039)菌株。
图5为本申请实施例提供的转入ssl7039表达质粒的T1的生长生物量结果图，图5a为T1(pEZ15Asp)作为对照菌株，图5b为T1(pEZTssl7039)菌株。
图6为本申请实施例提供的ZMOp33×002毒素基因在构建重组表达载体过程中降低假阳性克隆的应用结果图。图6a为ZMOp33×002表达质粒pEZT33_002，以及***mCherry的ZMOp33×002表达质粒pEZT33_002D-mCH的结构示意图。图6b为采用不同引物进行菌落PCR验证的阳性克隆T1(pEZT33_002D-mCH)正确率。图6c为T1(pEZT33_002)、T1(pEZT33_002D-mCH)和T1(pEZ15A)分别在LS和LSTc-0.8平板上的菌落平板图。
图7为本申请实施例提供的MazF毒素基因在构建重组表达载体过程中降低假阳性克隆的应用结果图。图7a为MazF表达质粒pEZTMazF，以及***mCherry的MazF表达质粒pEZTMazFD-mCH的结构示意图。图7b为T1(pEZTMazFD-mCH)分别在LS和LSTc-0.8平板上的菌落平板图。图7c为采用不同引物进行菌落PCR验证阳性克隆T1(pEZTMazFD-mCH)正确率。
图8为本申请实施例提供的ssl7039毒素基因在构建重组表达载体过程中降低假阳性克隆的应用结果图。图8a为ssl7039表达质粒pEZTssl7039，以及***mCherry的ssl7039表达质粒pEZTssl7039D-mCH的结构示意图。图8b为T1(pEZTssl7039D-mCH)分别在LS和LSTc-0.8平板上的菌落平板图。图8c为采用不同引物进行菌落PCR验证阳性克隆T1(pEZTssl7039D-mCH)正确率。
图9为本申请实施例提供的ZMOp32×008毒素在快速获得质粒丢失菌株的应用结果图。图9a为转入pEZT32_008后传代的第2代菌在RMG5和RMTc-0.8平板涂布生长的菌落PCR验证结果图。图9b为转入pEZT32_008后传代的第4代菌在RMG5和RMTc-0.8平板涂布生长的菌落PCR验证结果图。
图10为本申请实施例提供的ZMOp33×002毒素在快速获得质粒丢失菌株的应用结果图。图10a为转入pEZT33_002后传代的第2代菌在RMG5和RMTc-0.8平板涂布生长的菌落PCR验证结果图。图10b为转入pEZT33_002后传代的第4代菌在RMG5和RMTc-0.8平板涂布生长的菌落PCR验证结果图。
图11为本申请实施例提供的ZMOp33×036毒素在快速获得质粒丢失菌株的应用结果图。图11a为转入pEZT33_036后传代的第2代菌在RMG5和RMTc-0.8平板涂布生长的菌落PCR验证结果图。图11b为转入pEZT33_036后传代的第4代菌在RMG5和RMTc-0.8平板涂布生长的菌落PCR验证结果图。
图12为本申请实施例提供的MazF毒素在快速获得质粒丢失菌株的应用结果图。图12a为转入pEZTMazF后传代的第2代菌在RMG5和RMTc-0.8平板涂布生长的菌落PCR验证结果图。图12b为转入pEZTMazF后传代的第4代菌在RMG5和RMTc-0.8平板涂布生长的菌落PCR验证结果图。
图13为本申请实施例提供的ssl7039毒素在快速获得质粒丢失菌株的应用结果图。图13a为转入pEZTssl7039后传代的第2代菌落在RMG5和RMTc-0.8平板涂布生长的菌落PCR验证结果图。图13b为转入pEZTssl7039后传代的第4代菌落在RMG5和RMTc-0.8平板涂布生长的菌落PCR验证结果图。
图14为本申请实施例提供的ZMOp33×002毒素在快速获得基因编辑质粒丢失菌株的应用结果图。图14a为基因编辑质粒pNEZKO-0038T33_002的结构示意图。图14b为pNEZKO-0038T33_002对ZM4菌株ZMO0038基因敲除原理示意图。图14c为pNEZKO-0038T33_002电转入ZM4菌后单菌落培养传代及稀释涂平板过程示意图。图14d为ZMO0038基因敲除PCR验证结果图。图14e代表基因编辑质粒PCR验证结果图。
图15为本申请实施例提供的串联表达基因ZMOp33×002和ZMOp33×036质粒的结构示意图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、***、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
毒素基因及其筛选过程
本申请实施例中，以运动发酵单胞菌ZM4为研究菌株，通过生物信息学技术手段挖掘其中的毒素基因，并通过基因工程技术手段对该组可能的毒素基因进行表征，确定其毒素功能，以得到具有抑制生长作用的毒素。进一步将来自大肠杆菌和集胞藻中的毒素在运动发酵单胞菌ZM4和大肠杆菌中进行表征，验证其对ZM4和大肠杆菌的毒性作用。最后，将这些具有生长抑制作用的毒素基因分别应用在质粒构建过程中假阳性克隆的降低，以及运动发酵单胞菌基因编辑后编辑质粒快速丢失中。
为此，本申请实施例公开了分离的DNA分子，编码对运动发酵单胞菌ZM4菌株或大肠杆菌具有毒性的毒素蛋白，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5任一所示。
在一些实施例中，这些毒素基因的发现是通过以生物信息学方法发现的。例如，以运动发酵单胞菌ZM4为研究菌株，将ZM4全基因组蛋白信息和毒素-抗毒素数据库(TADB)进行蛋白序列相似性多序列比对，得到可能的候选毒素基因；将这些候选毒素基因构建在以诱导型启动子Ptet诱导表达的载体上，通过不同浓度的四环素诱导物调控表达，使其在ZM4菌株中呈不同程度的表达状态；将表达状态下抑制ZM4生长的候选毒素基因确定为毒素基因。
另外，在一些实施例中，还确定了这些毒素基因在不同菌株中的通用性，例如通过研究来自运动发酵单胞菌和集胞藻的毒素在大肠杆菌K12中的表达、来自大肠杆菌K12的毒素和来自集胞藻的毒素在ZM4中的表达，研究不同来源的毒素基因在不同宿主下表达时，是否具有毒性会抑制菌株生长。不同来源的毒素应用在质粒构建中：将不同来源的毒素构建在Ptet启动子诱导表达的载体上，获得基础质粒，通过将一个红色荧光蛋白基因表达框PlacUV5-mCherry***基础质粒的毒素基因并分别涂布在添加有/无四环素诱导的平板上，来模拟有负筛标记和无负筛标记情况下质粒构建过程中阳性克隆的获得率。不同来源的毒素应用在编辑质粒丢失中：将Ptet启动子诱导表达的毒素基因构建在编辑质粒中，当菌株被成功基因编辑后，分别涂布在添加有四环素诱导的平板和没有四环素诱导的平板上，来模拟有负筛标记和无负筛标记情况下丢失编辑质粒的基因工程菌株的获得率。
在一个运动发酵单胞菌ZM4菌株中毒素基因的筛选实施例中，将运动发酵单胞菌ZM4的全基因组蛋白序列和一个毒素-抗毒素***数据库TADB(https://bioinfo-mml.sjtu.edu.cn/TADB2/browse_org.php)进行序列比对，得到了11个候选毒素基因(ZMOp32×003、ZMOp32×008、ZMOp32×021、ZMOp33×002、ZMOp33×026、ZMOp33×036、ZMOp33×040、ZMOp36×023、ZMOp36×030、ZMOp39×006、ZMOp39×021)，且这些基因都属于Ⅱ型毒素-抗毒素***中的毒素基因。这些毒素基因主要功能为切割mRNA或与核糖体结合的mRNA、切割16S rRNA、磷酸化UDP-N-乙酰氨基葡萄糖、抑制翻译延长等，从而影响了细胞的翻译及肽聚糖合成。运动发酵单胞菌ZM4中预测的毒素基因及其作用位点、影响细胞的生命过程如表1所示。
表1运动发酵单胞菌ZM4候选毒素基因、作用活性位点及影响的细胞生命过程
在一个运动发酵单胞菌ZM4菌株中毒素基因的功能表征实施例中：
构建毒素表达质粒：用诱导型启动子Ptet诱导表达ZM4中预测的可能的毒素基因，并构建到pEZ15A质粒上。将各毒素表达质粒分别电转到ZM4中，得到可诱导表达毒素的ZM4菌株。本实施例中，pEZT32_008(表达毒素基因ZMOp32×008)、pEZT33_002(表达毒素基因ZMOp32×002)、pEZT33_036(表达毒素基因ZMOp33×036)、pEZT32_002-33_036(表达毒素基因ZMOp32×002和ZMOp33×036)四种毒素表达质粒，其与空载质粒pEZ15A分别转入ZM4得到的菌株分别命名为ZM4(pEZT32_008)、ZM4(pEZT33_002)、ZM4(pEZT33_036)、ZM4(pEZT32_002-33_036)和ZM4(pEZ15A)。
同时构建一个对照菌株：空载质粒pEZ15A(pEZ15A参照“Metabolic engineeringof Zymomonas mobilis for 2,3-butanediol production from lignocellulosicbiomass sugars[J]Biotechnol Biofuels.2016；9(1):189.Published online 2016Sep2.doi:10.1186/s13068-016-0606-y.”获得。“pEZ15Asp”代表获得了壮观霉素的pEZ15A质粒，为获得不同抗性基因，可以参照“质粒pUC19-CM-D的构建及应用[J]安徽农业科学，2010年，公开的方法，第19期”在其中***不同标记基因)电转到ZM4(ATCC31821，购自美国ATCC菌种保藏中心)。将各毒素表达菌株和对照菌株分别在Tc(添加有100μg/mL壮观霉素的RMG5培养基)、Tc-0.4(添加有0.4μg/mL四环素的RS培养基)、RSTc-0.8(添加有0.8μg/mL四环素的RS培养基)培养基下培养，控制初始OD600 nm为0.1，测试其生长曲线，并计算其比生长速率，结果见图1。
如图1所示，在四环素浓度为0.8μg/mL时，相对对照菌株ZM4(pEZ15A)(图1e)生长延迟期为2h，ZM4(pEZT32_008)(图1a)、ZM4(pEZT33_002)(图1b)和ZM4(pEZT33_036)(图1c)的延迟期分别延长到18h、35h和22h。在四环素浓度为0.8μg/mL时，相对对照菌株ZM4(pEZ15Asp)最大生物量为1.6(OD600nm)，ZM4(pEZT32_008)、ZM4(pEZT33_002)和ZM4(pEZT33_036)的最大生物量OD600nm数值分别为1.2(，1.0和1.0。并且当毒性较强的ZMOp33×002和毒性较弱的ZMOp33×036处于一个操纵子下，受Ptet启动子诱导串联表达时(pEZT32_002-33_036)，对细菌生长的抑制作用更强，表现为生长延迟期延长到35h，最大生物量(OD600nm)降低到1.0(图1d)，且各毒素在四环素诱导表达下菌株的比生长速率明显下降(图1f)。结果显示，仅有ZMOp32×008、ZMOp33×002和ZMOp33×036在表达时可以抑制细菌的生长，具有毒素的功能，具体表现为生长延迟期增长和最终生物量降低。由此说明，ZMOp32×008(如SEQ ID NO.1所示)、ZMOp33×002(如SEQ ID NO.2所示)和ZMOp33×036(如SEQ ID NO.3所示)可作为毒素基因。
在一个实施例中，验证了ZMOp32×008、ZMOp33×002和ZMOp33×036三个毒素基因对大肠杆菌T1的毒性作用。具体过程包括：将毒素表达质粒pEZT32_008、pEZT33_002和pEZT33_036分别转入大肠杆菌T1中，得到可在大肠杆菌中诱导表达毒素的T1(pEZT32_008)、T1(pEZT33_002)和T1(pEZT33_036)菌株。同时构建对照菌株：空载质粒pEZ15Asp转到T1中。将各毒素表达菌株和对照菌株分别在LS(添加100μg/mL壮观霉素的LB培养基)和LSTc-0.8μg/mL的培养基下培养，控制初始OD600 nm为0.1，测试其生长曲线，结果见图2。如图2所示，在四环素浓度为0.8μg/mL时，相较于对照菌株T1(pEZ15Asp)(图2e)，T1(pEZT32_008)(图2a)、T1(pEZT33_002)(图2b)和T1(pEZT33_036)(图2c)直到24h仍未生长。并且当毒性较强的ZMOp33×002和毒性较弱的ZMOp33×036处于一个操纵子下，受Ptet启动子诱导串联表达时，大肠杆菌T1仍至24h未生长(图2d)；但以上所有菌株在不添加四环素诱导，即毒素不表达时，不影响大肠杆菌T1的生长。结果显示，ZMOp32×008、ZMOp33×002和ZMOp33×036在T1中表达时比在ZM4中的毒性更强。
另外，一些实施例还筛选了来自大肠杆菌的毒素基因，以证明其对大肠杆菌中的毒素对运动发酵单胞菌的毒性作用。在这些实施例中，将来自大肠杆菌K12中的毒素基因MazF(如SEQ ID NO.4所示)构建在Ptet启动子诱导的pEZ15Asp载体上，得到毒株表达质粒pEZTMazF，电转到ZM4菌株中，得到转入MazF表达质粒的ZM4菌株，ZM4(pEZTMazF)菌株。以ZM4(pEZ15Asp)作为对照，分别在RS、RSTc-0.4、RSTc-0.8培养基中进行生长测试，控制初始OD600 nm为0.1，其生长曲线结果如图3。相对于对照(图3a)，MazF在ZM4中表达时对ZM4具有毒性，且到90h仍没有生长(图3b)。
另外，一些实施例还筛选了来自集胞藻Synechocystis sp.PCC6803中的毒素基因ssl7039(如SEQ ID NO.5所示)，并证明了其对运动发酵单胞菌的毒性作用。在这些实施例中，将来自集胞藻Synechocystis sp.PCC6803中的毒素基因ssl7039构建在Ptet启动子诱导的pEZ15Asp载体上，得到ssl7039表达质粒pEZTssl7039，将其电转到ZM4菌株中，得到ZM4(pEZTssl7039)菌株。以ZM4(pEZ15Asp)作为对照，分别在四环素为RS、RSTc-0.4、RSTc-0.8培养基中进行生长测试，控制初始OD600 nm为0.1，其生长曲线结果如图4。相对于对照(图4a)，ssl7039在ZM4中表达时对ZM4具有毒性，但毒性较低，生长抑制作用较差(图4b)。
另外，在一些实施例中，还验证了ssl7039对大肠杆菌的毒性作用。具体验证过程包括：将毒素基因ssl7039构建在Ptet启动子诱导的pEZ15Asp载体上，得到ssl7039表达质粒pEZTssl7039，转到大肠杆菌T1菌株中，得到T1(pEZTssl7039)菌株。以T1(pEZ15Asp)作为对照，分别在四环素为LS和LSTc-0.8培养基中进行生长测试，控制初始OD600 nm为0.1，其生长曲线结果如图5。相对于对照(图5a)，ssl7039在T1中表达时对T1具有毒性，但毒性较低，生长抑制作用较差，13h时抑制作用逐渐解除，菌株开始生长(图5b)。
降低假阳性应用
1、ZMOp33×002毒素基因在构建重组表达载体过程中降低假阳性克隆的应用
本应用实施例中，如图6a所示，将来自运动发酵单胞菌的毒素基因ZMOp33×002构建在Ptet启动子诱导的pEZ15A载体上，得到pEZT33_002。将PlacUV5启动子启动的红色荧光报告基因mCherry***pEZT33_002的毒素基因ZMOp33×002中，导致毒素基因被***失活，得到质粒命名为pEZT33_002D-mCH。
将分别转入pEZT33_002、pEZT33_002D-mCH和pEZ15A(对照)的大肠杆菌T1克隆产物分别命名为T1(pEZT33_002)、T1(pEZT33_002D-mCH)和T1(pEZ15A)。将这些重组大肠杆菌分别涂布在LS和LSTc-0.8平板上。结果如图6b所示，T1(pEZ15A)在两种平板上的菌落数相当，说明四环素的添加不影响正常菌株的生长。T1(pEZT33_002)在LS平板上菌落数正常，而LSTc-0.8平板上几乎没有菌落，说明毒素ZMOp33×002表达时菌落不能在平板上生长。T1(pEZT33_002D-mCH)在LSTc-0.8平板的菌落数比LS平板少，说明有一部分没有***PlacUV5-mCherry片段的假阳性克隆由于没有筛选压力仍能生长在LS平板上，而由于这些假阳性克隆在LSTc-0.8平板上能够表达毒素，因此无法在该平板上生长，说明此基础质粒可以用于质粒构建过程中假阳性的降低。
设计引物F1(如SEQ ID NO.6所示)/R(如SEQ ID NO.7所示)(一条PlacUV5-mCherry片段上的引物，一条载体上的引物)通过菌落PCR验证LS平板上克隆是否有荧光报告基因***，设计引物F2(如SEQ ID NO.8所示)/R(如SEQ IDNO.7所示)(两条载体上的引物)通过菌落PCR验证LS平板上克隆是否有荧光报告基因***，菌落PCR结果如图6c所示，LS平板上的阳性克隆正确率为1/8，LSTc-0.8平板上的阳性克隆正确率为8/8。
2、MazF毒素基因在构建重组表达载体过程中降低假阳性克隆的应用
本应用实施例中，如图7a所示，将来自大肠杆菌的毒素基因MazF构建在Ptet启动子诱导的pEZ15Asp载体上，得到基础质粒pEZTMazF。将PlacUV5启动子启动的红色荧光报告基因mCherry***pEZTMazF的毒素基因MazF中，导致毒素基因被***失活，得到质粒命名为pEZTMazFD-mCH。
将转入pEZTMazFD-mCH大肠杆菌T1分别涂布在LS和LSTc-0.8平板上，如图7b所示，克隆构建产物分别涂布在LS和LSTc-0.8，平板上菌落数LSTc-0.8相对LS少，说明具有毒素表达的假阳性克隆不能在LSTc-0.8平板上生长。
对两种平板上的单菌落分别用两对引物进行菌落PCR验证：引物F1/R，一条PlacUV5-mCherry片段上的引物，一条载体上的引物；引物F3(如SEQ ID NO.9所示)/R，两条载体上的引物。菌落PCR结果如图6c所示。LS平板上PlacUV5-mCherry成功***的阳性克隆正确率为1/8，LSTc-0.8平板上的阳性克隆正确率为7/8。
3、ssl7039毒素基因在构建重组表达载体过程中降低假阳性克隆的应用
本应用实施例中，如图8a所示，将来自集胞藻的毒素基因ssl7039构建在Ptet启动子诱导的pEZ15Asp载体上，得到毒素表达质粒pEZTssl7039。将PlacUV5启动子启动的红色荧光报告基因mCherry***基础质粒pEZTssl7039中的毒素基因ssl7039，导致毒素基因被***失活，得到质粒命名为pEZTssl7039D-mCH。
将转入pEZTssl7039D-mCH的大肠杆菌T1克隆产物分别涂布在LS和LSTc-0.8平板上，平板结果如图8b所示。克隆构建产物分别涂布在LS和LSTc-0.8，平板上菌落数LSTc-0.8相对LS少，说明具有毒素表达的假阳性克隆不能在LSTc-0.8平板上生长。
对两种平板上的单菌落分别用两对引物进行菌落PCR验证：引物F1/R，一条PlacUV5-mCherry片段上的引物，一条载体上的引物；引物F4(如SEQ ID NO.10所示)/R，两条载体上的引物。菌落PCR结果如图8C所示。LS平板上PlacUV5-mCherry成功***的阳性克隆正确率为0/8，LSTc-0.8平板上的阳性克隆正确率为7/7。
4、ZMOp32×008毒素在快速获得质粒丢失菌株的应用
依照其他实施例中提供的方法构建ZMOp32×008表达质粒pEZT32_008，将其电转到ZM4后，转化后的单菌落在RS液体培养基中培养一代后，按照1:100的体积比转接到RMG5培养基中，连续传代4代，其中取第2代和第4代的菌液稀释涂平板，分别涂布在RMG5和RMTc-0.8平板上。对两个平板上的单菌落进行菌落PCR验证，确定质粒是否存在。结果如图9所示。传代2代和传代4代的菌落PCR结果都为RM平板上质粒丢失率为0/8，RMTc-0.8平板上质粒丢失率为8/8，证明携带有ZMOp32×008毒素的质粒在无抗性的培养基中只需传代2代就可以在筛选平板RMTc-0.8上得到质粒丢失质粒的菌株，效率为100％。
5、ZMOp33×002毒素在快速获得质粒丢失菌株的应用
依照其他实施例中提供的方法构建ZMOp32×008表达质粒pEZT33_002电转到ZM4后，单菌落在RS液体培养基中培养一代后，按照1：100的体积比转接到RMG5培养基中，连续传代4代，其中取第2代和第4代的菌液稀释涂平板，分别涂布在RMG5和RMTc-0.8平板上。对两个平板上的单菌落进行菌落PCR验证，确定质粒是否存在。结果如图10所示，传代2代和传代4代的菌落PCR结果都为RM平板上质粒丢失率为0/8，RMTc-0.8平板上质粒丢失率为8/8，证明携带有ZMOp33×002毒素基因的质粒在无抗性的培养基中只需传代2代就可以在筛选平板RMTc-0.8上得到丢失质粒的菌株，效率为100％。
6、ZMOp33×036毒素在快速获得质粒丢失菌株的应用
依照其他实施例中提供的方法构建ZMOp32×008表达质粒pEZT33_036质粒电转到ZM4后，单菌落在RS液体培养基中培养一代后，按照1：100的体积比转接到RMG5培养基中，连续传代4代，其中取第2代和第4代的菌液稀释涂平板，分别涂布在RMG5和RMTc-0.8平板上。对两个平板上的单菌落进行菌落PCR验证，确定质粒是否存在。结果如图11所示，传代2代的菌落PCR结果都为RM平板上质粒丢失率为0/8，RMTc-0.8平板上质粒丢失率为8/8，传代4代的菌落PCR结果为RM平板上质粒丢失率为1/8，RMTc-0.8平板上质粒丢失率为8/8，证明携带有ZMOp33×036毒素基因的质粒在无抗性的培养基中只需传代2代就可以在筛选平板RMTc-0.8上得到丢失质粒的菌株，效率为100％。
7、MazF毒素在快速获得质粒丢失菌株的应用
依照其他实施例中提供的方法构建ZMOp32×008表达质粒pEZTMazF，电转到ZM4后，单菌落在RS液体培养基中培养一代后，按照1：100的体积比转接到RMG5培养基中，连续传代4代，其中取第2代和第4代的菌液稀释涂平板，分别涂布在RMG5和RMTc-0.8平板上。对两个平板上的单菌落进行菌落PCR验证，确定质粒是否存在。如图12所示，传代2代的菌落PCR结果都为RM平板上质粒丢失率为4/8，RMTc-0.8平板上质粒丢失率为1/1，传代4代的菌落PCR结果都为RM平板上质粒丢失率为1/8，RMTc-0.8平板上质粒丢失率为8/8，证明携带有编码MazF毒素基因的质粒在无抗性的培养基中只需传代2代就可以在筛选平板RMTc-0.8上得到丢失质粒的菌株，效率为100％。
8、ssl7039毒素在快速获得质粒丢失菌株的应用
依照其他实施例中提供的方法构建ZMOp32×008表达质粒pEZTssl7039，电转到ZM4后，单菌落在RS液体培养基中培养一代后，按照1：100的体积比转接到RMG5培养基中，连续传代4代，其中取第2代和第4代的菌液稀释涂平板，分别涂布在RMG5和RMTc-0.8平板上。对两个平板上的单菌落进行菌落PCR验证，确定质粒是否存在。如图13所示，传代2代的菌落PCR结果都为RM平板上质粒丢失率为2/8，RMTc-0.8平板上质粒丢失率为8/8，传代4代的菌落PCR结果都为RM平板上质粒丢失率为3/8，RMTc-0.8平板上质粒丢失率为8/8，证明携带有ssl7039毒素基因的质粒在无抗性的培养基中只需传代2代就可以在筛选平板RMTc-0.8上得到丢失质粒的菌株，效率为100％。
9、ZMOp33×002毒素在快速获得基因编辑质粒丢失菌株的应用
如图14a，提供了一个用于敲除ZMO0038基因的基因编辑质粒(命名为pNEZKO-0038T33_002)，该基因编辑质量上***了一个Ptet-ZMOp33×002表达框。该质粒可利用ZMOp33×002毒素获得敲除ZMO0038基因的基因编辑质粒丢失菌株。
图14a中，基于内源性CRISPR-IF表达盒包括：Donor为用于敲除ZMO0038基因的供体序列(如SEQ ID NO.11所示)，Leader为先导序列(如SEQ ID NO.12所示)，R1和R2为两个重复序列(如SEQ ID NO.13所示)，靶向ZMO0038基因的gRNA为向导序列(如SEQ ID NO.14所示)。
图14a/b，将pNEZKO-0038T33_002转入ZM4菌株，随后将单菌落接种于RS液体培养基培养一代后，转接到RMG5培养基中，培养一代后稀释分别涂在RMG5和RMTC-0.8平板上。分别对两个平板进行菌落PCR，验证ZMO0038是否敲除，以及传代后编辑质粒是否消除。图14c代表电转后单菌落培养传代及稀释涂平板过程，图14d代表ZMO0038基因敲除PCR验证结果图，图14e代表编辑质粒PCR验证结果图。结果显示从两种平板上挑选的单菌落中ZMO0038都被成功敲除(敲除大小：～2kb，野生型大小：～3kb)，其中RM TC-0.8平板上所选单菌落的编辑质粒都已丢失，且丢失率为100％，而RMG5平板上挑选的单菌落中编辑质粒都未丢失，丢失率为0％。本申请证明了ZMOp33×002毒素可应用在快速获得基因编辑质粒丢失菌株的构建中。
毒素表达质粒构建
根据蛋白序列比对结果，对筛选出的3个候选毒素基因(ZMOp32×008、ZMOp33×002和ZMOp33×036)进行功能表征，构建这些候选毒素基因的表达质粒，并验证其毒性作用。
在一个毒素基因表达质粒的构建过程实施例中，包括：
1)提取ZM4基因组：收取2mL过夜培养的ZM4菌液，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组。
2)毒素基因片段的获取：设计带有与Ptet启动子和pEZ15Asp质粒同源的引物，以ZM4基因组为模板，PCR扩增各毒素基因，并胶回收。其中，ZMOp32×008、ZMOp33×002和ZMOp33×036的扩增上下引物依次为，32-008-F(SEQ IDNO.15)/32-008-R(SEQ ID NO.16)，33-002-F(SEQ ID NO.17)/33-002-R(SEQ ID NO.18)，33-036-F(SEQ ID NO.19)/33-036-R(SEQ ID NO.20)所示。
3)Ptet启动子及其调控蛋白TetR的DNA片段的获取(TetR-Ptet片段)：设计一侧带有与pEZ15Asp质粒同源的引物：tetR-F(SEQ ID NO.21)/tetR-R(SEQ IDNO.22)，从ZM4-Cas12a菌株(CN110358767A)的基因组上扩增Ptet启动子及其调控蛋白TetR，并胶回收。
4)pEZ15Asp反扩载体的获取：设计引物：pEZ-FK-F(SEQ ID NO.23)/pEZ-FK-R(SEQID NO.24)，反向扩增pEZ15Asp质粒，得到线性化载体，并胶回收。
5)候选毒素基因和Ptet启动子及其调控蛋白TetR(Gene ID:69452453)融合产物的获得：通过Overlap PCR，将候选毒素基因和TetR-Ptet片段连接成一个长片段，并通过胶回收得到产物。Overlap PCR的反应体系及程序见表2和表3。
6)表达内源毒素质粒的获得：将4)和5)中的最终片段用T5外切酶进行Gibson组装，反应体系以5μL总体积计，包括0.12pM步骤5)的融合产物、0.04pM的步骤4)的线性化载体片段，0.5μL10×Buffer 4(Thermo)和0.5U T5 Exonuclease，补水至5μL，反应后产物转化到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒(质粒提取按照质粒提取试剂盒标准步骤)。即可得到，pEZT32_008(表达毒素基因ZMOp32×008)、pEZT33_002(表达毒素基因ZMOp32×002)和pEZT33_036(表达毒素基因ZMOp33×036)。
表2Overlap PCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| tetR-F(10μM) | 2.4μL |
| 32-008-R或33-002-R或33-036-R(10μM) | 2.4μL |
| 2×PrimerSTAR(Takara) | 30μL |
| TetR-Ptet片段 | 80ng |
| 毒素基因片段 | 80ng |
| ddH2O | Up to 60μL |
| 总体积 | 60μL |
表3PCR程序
在本申请中，mazF和ssl7039基因的表达质粒构建方法参照上述进行，其中设计的目的基因片段扩增所用引物依次为MazF-F(SEQ ID NO.25所示)/MazF-R(SEQ IDNO.26所示)，ssl7039-F(SEQ ID NO.27所示)/ssl7039-R(SEQ ID NO.28所示)。
毒素串联表达质粒构建
在一个实施例中，运动发酵单胞菌ZM4内源毒素串联表达质粒pEZT33_002-33_036构建方法包括：
①提取ZM4基因组：收取2mL过夜培养的ZM4菌液，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组。
②ZMOp33×036基因的获取：设计带有与ZMOp33×036和pEZ15Asp质粒同源的引物：002-036-F(SEQ ID NO.29所示)/002-036-R(SEQ ID NO.30所示)，以pEZT33_036为模板，PCR扩增Ptet-ZMOp33×036毒素基因，并胶回收。
③pEZT33_002反扩载体的获取：设计引物33_002-FK-F(SEQ ID NO.31所示)/pEZ-FK-R(SEQ ID NO.32所示)，反向扩增pEZT33_002质粒，得到线性化载体，并胶回收。
④表达内源毒素质粒的获得：将②和③中的最终片段用T5外切酶处理(表4)，并转化到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒(质粒提取按照质粒提取试剂盒标准步骤)。即可得到运动发酵单胞菌ZM4内源毒素串联表达质粒pEZT33_002-33_036。
本申请中用于构建串联表达基因ZMOp33×002和ZMOp33×036质粒的引物如下：毒 素表达质粒的转化
在本申请实施例中，涉及的表达质粒转化过程大致包括以下步骤：
①感受态制备：
将冻存菌从-80℃冰箱中取出，取100μL接种在装有1mL RMG5的冻存管中，于30℃培养箱静置培养以活化菌株。待培养至浑浊后，转接至装有200mL RMG5液体培养基的250mL蓝盖瓶中，使初始OD600 nm在0.025～0.3范围内，于30℃培养箱静置培养，待OD600 nm超过0.3时，常温100rpm收集菌体，随后用无菌水洗1次，10％甘油洗两次，最终用1～2mL 10％甘油缓慢重悬菌体，分装55μL感受态到1.5mL EP管中。
②质粒电转方法：
将200ng毒素表达质粒加入到装有55μL感受态的1.5mL EP管中，轻轻混匀后转移到1mm电转杯中。电转仪程序设置：200Ω，电容：25μF，电压：1.6KV。将电转杯放入电转仪中进行电转，电转后立即加入1mL RMG5液体培养基，混匀后转移到无菌EP管中，用封口膜封好后于30℃恒温培养箱中孵育4-6h。取100μL菌液，均匀涂布到RS平板上。用封口膜将平板封好后放在30℃培养箱中倒置。
③菌落PCR验证方法：
平板上长出单菌落后，用毒素表达质粒验证引物对单菌落进行PCR验证。PCR体系(表4)和PCR程序(表5)如下。获得的正确阳性克隆在RS(添加有100μg mL-1壮观霉素的RMG5培养基)培养基中活化后，甘油保菌。实施例中用到的菌落PCR验证引物包括Origin-pez-F:gaaggtggttctaagcctcg，SEQ ID NO.33所示和pEZ15A-R:cacttcactgacaccctcat，SEQ IDNO.34所示。
表4菌落PCR体系
| 试剂 | 体积 |
| Origin-pez-F(10μM) | 0.4μL |
| pEZ15A-R(10μM) | 0.4μL |
| 2×T5 Super PCR Mix(Tsingke) | 5μL |
| Template(单菌落溶于10μL ddH2O) | 1μL |
| ddH2O | 3.2μL |
| 总体积 | 10μL |
表5PCR程序
PlacUV5-mCherry***毒素表达质粒效率的测试
①毒素表达质粒反扩载体的获取：
质粒pEZT33_002、pEZTMazF、pEZTssl7039分别用其对应的反扩引物33-002-fk-F(SEQ IDNO.35所示)/33-002-fk-R(SEQ ID NO.36所示)、mazF-fk-F:(SEQ ID NO.37所示)/mazF-fk-R:(SEQ ID NO.38所示)和ssl7039-fk-F:(SEQ ID NO.39所示)/ssl7039-fk-R:(SEQ IDNO.40所示)进行PCR，得到线性化载体，并胶回收。反扩引物设计在毒素内部。
②PlacUV5-mCherry片段的获取：从专利CN110358767A中替换ZMO0028为mCherry的靶质粒上扩增得到，设计两侧与载体带有同源臂的引物用于扩增，扩增产物胶回收后待用。本步骤中，构建PlacUV5-mCherry***质粒pEZT33_002、pEZTMazF、pEZTssl7039的片段PCR引物如下：002-mCh-F:SEQ ID NO.41所示；002-mCh-R:SEQ IDNO.42所示；mazF-mCh-F:SEQ IDNO.43所示；mazF-mCh-R:SEQ ID NO.44所示；ssl7039-mCh-F:SEQ ID NO.45所示；ssl7039-mCh-R:SEQ ID NO.46所示。
③PlacUV5-mCherry***毒素表达质粒的构建：将①和②中的最终片段用T5外切酶进行Gibson组装，反应体系参照上述实施例，反应产物转化到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，复苏产物一半涂布在LS平板上，一半涂布在LS Tc-0.8平板上。菌落PCR分别验证两个平板上的克隆，每个平板挑8个单菌落进行PCR验证，并计算每个平板的阳性克隆率。
毒素用于编辑质粒丢失菌株的快速筛选
上述实施例提供的用于敲除ZMO0038的编辑质粒pNEZKO-0038T33_002的构建过程如下：
(1)构建pNEZKO-0038T33_002编辑质粒
①设计引物：pL2R-FK-F(SEQ ID NO.47所示)和pL2R-FK-R(SEQ ID NO.48所示)，反向扩增专利CN110358768A中的pKO-ZMO0038，得到获得pKO-ZMO0038质粒反扩线性化载体，并胶回收。
②利用tetR-F(SEQ ID NO.21所示)和33-002-R(SEQ ID NO.18所示)扩增得到两侧有同源臂的Ptet-ZMOp33×002片段，并胶回收。
③表达内源毒素质粒的获得：将②和③中的最终片段用T5外切酶进行Gibson组装，反应体系参照上述实施例，反应产物转化到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒(质粒提取按照质粒提取试剂盒标准步骤)。
(2)pEZ-sgr-0028-T33_002编辑质粒的转化
将200ng编辑质粒加入到装有55μL感受态的1.5mL EP管中，轻轻混匀后转移到1mm电转杯中。电转仪程序设置：200Ω，电容：25μF，电压：1.6KV。将电转杯放入电转仪中进行电转，电转后立即加入1mL RMG5液体培养基，混匀后转移到无菌EP管中，用封口膜封好后于30℃恒温培养箱中孵育4-6h。取100μL菌液，均匀涂布到RS平板上。用封口膜将平板封好后放在30℃培养箱中倒置。
(4)突变株培养及编辑质粒丢失
挑选成功编辑的单菌落接种在装有1mL RS液体培养基的2mL冻存管中，于30℃培养箱中静置培养。待长到浑浊后，取100μL菌液转接入装有1mL RMG5液体培养基的2mL冻存管中，于30℃培养箱中静置培养。待长到浑浊后，取100μL菌液置入900μL RMG5液体培养基中，充分混匀后取100μL置入新的900μL RMG5液体培养基中，连续按此操作重复5次稀释过程，稀释10^5后取100μL稀释后菌液分别涂布在RM和RMTc-0.8平板上。待平板长出单菌落后，在两种平板上分别挑8个单菌落进行菌落PCR验证。菌落PCR验证引物如下：
0038-out-F:aggatggtcgatcttcagctattgtg，SEQ ID NO.49所示；
0038-out-R:gtgaaccgccaaaaactcgg，SEQ ID NO.50所示；
pEZ15A-F:ggcaaagccaccctatttttag，SEQ ID NO.51所示；
pEZ15A-R:cacttcactgacaccctcat，SEQ ID NO.34所示。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种表达质粒，包含编码对运动发酵单胞菌菌株、大肠杆菌具有毒性的毒素基因的核苷酸序列以及载体，所述毒素基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2~3两种核苷酸序列的串联序列。
2.根据权利要求1所述的表达质粒，所述表达质粒还包含Ptet启动子和调控基因TetR。
3.一种分离的DNA分子的应用，所述分离的DNA分子编码对运动发酵单胞菌菌株或大肠杆菌具有毒性的毒素蛋白，所述DNA分子的核苷酸序列为如SEQ ID NO.2和3形成的串联序列，所述应用选自如下（1）~（4）任一项：
（1）分离的DNA分子作为负筛选标记以降低表达质粒或者基因编辑质粒构建过程中的假阳性克隆；
（2）分离的DNA分子作为负筛选标记以降低包含所述表达质粒的基因工程菌假阳性克隆；
（3）分离的DNA分子作为负筛选标记以降低包含所述基因编辑质粒的基因工程菌假阳性克隆；
（4）分离的DNA分子作为负筛选标记构建质粒丢失的基因工程菌株的应用；
所述基因工程菌为运动发酵单胞菌菌株或者大肠杆菌的基因工程菌。
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