CN116121252B - 一种增强苹果斑点落叶病抗性的纳米复合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种增强苹果斑点落叶病抗性的纳米复合物及其应用。本发明通过比较苹果接种苹果斑点落叶病ALT1前后tsRNA的表达差异，得到了一个新的5’tsRNA，命名为mdm‑tsRMet。mdm‑tsRMet在ALT1接种后上调表达，并对抗病基因MdSTK1进行切割，从而降低苹果对斑点落叶病抗性。通过设计mdm‑tsRMet的沉默序列，进一步结合磁性纳米颗粒将其递送进苹果体内，沉默上调表达的mdm‑tsRMet，增强苹果对ALT1抗性。

Description

一种增强苹果斑点落叶病抗性的纳米复合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物纳米载药和递送领域，具体涉及于一种增强苹果斑点落叶病抗性的纳米复合物及其应用。
背景技术
转运RNAs(tRNAs)在细胞核中由前体tRNAs(pre-tRNAs)通过RNA聚合酶III的转录产生，除了在蛋白质合成中的经典功能外，tRNA可以被裂解产生tRNA衍生的小RNA，即tsRNAs。tsRNAs可以作为重要的调控因子在植物体内发挥作用，在植物生物胁迫、非生物胁迫等逆境下被诱导，然而tsRNAs在调控真菌病害抗性的相关研究较少。
苹果产业正受到真菌病害的严重威胁，苹果斑点落叶病是苹果最主要真菌性病害，不仅对苹果叶片产生危害，造成黑褐色斑点和落叶，而且使产量降低，果实失去商品价值，损失巨大，严重影响果实生产安全。传统的真菌病防治方法主要是化学防治，但该方式会对环境造成破坏，也会对人体健康产生影响。目前迫切需要一种新的方法来研究真菌病害及其防治。
纳米技术的出现，为有害生物可持续治理提供了新的思路。纳米材料作为植物运载工具(纳米载体)，凭借独特的优势，如用于化学修饰的大比表面积和生物相容性，可以保护负载的生物分子免受细胞代谢和降解的威胁，在植物基因工程中潜力巨大。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种增强苹果斑点落叶病抗性的纳米复合物及其应用。本发明通过比较苹果接种苹果斑点落叶病Alternariaalternata sp.mali(ALT1)前后tsRNA的表达差异，得到了一个新的5’tsRNA命名为mdm-tsRMet。研究发现，mdm-tsRMet在ALT1接种后上调表达，并对抗病基因Malus domesticaSerine/Threonine kinases 1(MdSTK1)进行切割，从而降低苹果对斑点落叶病抗性。通过设计mdm-tsRMet的沉默序列，进一步结合磁性纳米颗粒(Magnetic nanoparticles)将其递送进苹果体内，增强苹果对ALT1抗性。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种增强苹果斑点落叶病抗性的纳米复合物，其特征在于：包括磁纳米颗粒载体和质粒DNA；
所述质粒DNA为一种重组植物表达载体，上述重组植物表达载体为含有人工miRNA的pFGC5941载体；
所述人工miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在上述方案的基础上，所述人工miRNA中包含一种用于沉默tsRNA的反向互补序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
一种tsRNA，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述tsRNA用于调控苹果斑点落叶病。
一种上述tsRNA的前体序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
一种工程菌，其特征在于：所述工程菌中含有上述重组植物表达载体。
一种参与苹果斑点落叶病调控的基因，其特征在于，被上述tsRNA靶向，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
一种制备上述纳米复合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，使用聚乙烯亚胺对磁纳米颗粒表面进行修饰，获得纳米颗粒载体；
步骤2，将纳米颗粒载体与质粒DNA共孵育得到纳米复合物。
在上述方案的基础上，所述磁纳米颗粒为10nm Fe3O4微球。
在上述方案的基础上，步骤2具体为：
将纳米颗粒载体与质粒DNA以1:1的质量比例混合，在25℃下孵育30min。
一种上述纳米复合物的应用，其特征在于：将纳米复合物与表面活性剂混合后均匀喷施在苹果叶片上，纳米复合物中的重组植物表达载体以上述方式递送进苹果植株体内，增强苹果感病品种对斑点落叶病抗性。
基于磁纳米颗粒的基因递送体系，选用10nm聚乙烯亚胺(PEI)修饰的Fe3O4颗粒，结合含有artificial miRNA的质粒DNA。将MNP-DNA复合物与表面活性剂Silwet L-77以5000:1混合，通过喷雾方式喷施在金冠组培苗叶片上，三天后检测苹果mdm-tsRMet和MdSTK1表达水平，接菌检测苹果对ALT1的抗病性。
本发明所述的一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的纳米载体及其应用，其有益效果为：
本发明提供一种用于防治苹果斑点落叶病的新方法，使用Fe3O4磁性纳米粒子作为载体将含有artificial miRNA的质粒DNA递送入苹果体内沉默mdm-tsRMet。它具有高比表面积和高正表面电荷，可吸附带负电的DNA，而且安全环保无污染。与以往的基因传递方式不同，通过磁纳米颗粒将基因传递到苹果细胞中，安全无害，持续时间长，顺利达到了预防苹果斑点落叶病的效果，对提高苹果产业的发展具有很大的潜力。
附图说明
本发明有如下附图：
图1为本发明中mdm-tsRMet的前体MdtRNA-MetCAT结构图：A为sRNA测序中金冠体内接菌后与未接菌的tsRNA含量；B为MdtRNA-MetCAT结构图；
图2为本发明中PCR扩增的MdtRNA-MetCAT和MdSTK1琼脂糖凝胶电泳图：A为MdtRNA-MetCAT扩增条带；B为靶基因MdSTK1扩增条带；
图3为mdm-tsRMet对其靶基因MdSTK1的切割位点图；
图4为接菌ALT12天后，northen检测mdm-tsRMet的含量，mdm-tsRMet含量上升，对照组为WT，H20；
图5为过表达前体MdtRNA-MetCAT在感病品种金冠和抗病品种寒富中对ALT1抗性的影响：A为过表达MdtRNA-MetCAT后4天后荧光定量检测金冠和寒富的MdSTK1的表达量，相对于野生型(WT)，pFGC5941空载(EV)降低；B为过表达MdtRNA-MetCAT后四天接菌ALT12天后金冠和寒富的表型图；C为金冠寒富中过表达MdtRNA-MetCAT4天后接菌ALT12天后病斑面积统计；
图6为si-mdm-tsRMet载体模式设计：A为preMIR319a与改造后的artificialmiRNA结构图；B为沉默mdm-tsRMet载体模式示意图；
图7为磁纳米颗粒结合DNA后的透射电镜观察图：A为磁纳米颗粒；B为结合DNA后的磁纳米颗粒；
图8为MNP-DNA复合物的叶面施用对苹果抗性的影响：A为Northern blot检测了mdm-tsRMet在WT、EV、si-mdm-tsRMet和MNP-si-mdm-tsRMet中的表达水平，u6被作为对照；B为RT-qPCR检测了叶面处理三天后WT、EV、si-mdm-tsRMet和MNP-si-mdm-tsRMet中MdSTK1的表达水平；
图9为苹果对MNP-si-mdm-tsRMet的吸收：透射电镜可观察到苹果体内的MNP-DNA复合物；
图10为不同处理后苹果叶片对于ALT1的抗性，具体体现在病斑面积上：A为施用si-mdm-tsRMet和MNP-si-mdm-tsRMet的表型图，对照组为WT,EV；B为接菌后7天，14天WT,EV，si-mdm-tsRMet和MNP-si-mdm-tsRMet病斑面积统计。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1tsRNA及其靶基因的发现
以感病品种‘金冠’为试材筛选接种苹果斑点落叶病ALT1前后表达差异2倍以上的tsRNA，与miR Base(http://www.mirbase.org/)和苹果基因组(https://www.rosaceae.org/)中比对，获得一个新的tsRNA，将其命名为mdm-tsRMet(SEQ ID NO:1)，通过苹果基因组网站(https://www.rosaceae.org/)比对到其前体为MdtRNA-MetCAT，序列如SEQ ID NO:2所示，进一步通过psRNAtarget(https://www.zhaolab.org/psRNATarget/)预测靶基因，预测靶基因为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，将其命名为MdSTK1(SEQ ID NO:5)。
mdm-tsRMet前体tRNA结构如图1所示。
实施例2tRNA及靶基因的克隆
具体方法如下：
1、植物总RNA提取
(1)苹果‘金冠’组织样品在液氮中快速研磨；
(2)往植物组织中加入990μL预热后的CTAB溶液和10μL的β-巯基乙醇，涡旋30s后65℃水浴10min；
(3)加入1000μL CI(氯仿/异戊醇体积比＝24:1)，上下颠倒混匀；
(4)4℃12000rpm 10min；
(5)吸取800μL上清，加入等体积的CI，上下颠倒混匀；
(6)4℃12000rpm 10min；
(7)吸取上清约650μL，加入1000μL异丙醇；
(8)-20℃沉淀30min；
(9)4℃12000rpm 10min；
(10)倒净上清，加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀；
(11)4℃12000rpm 10min；
(12)倒净上清，4℃12000rpm 2min；
(13)吸干上清，加入40μL RNase-free H2O溶解沉淀；
(14)1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性，紫外分光光度计测260nm处吸光度计算RNA浓度；
(15)RNA样品于-80℃保存。
2、逆转录反应体系及步骤(1st Strand cDNA Synthesis Kit,gDNA Purge,E042)
(1)按顺序加入以下反应物：
轻轻混匀，离心。
(2)42℃孵育15-30分钟(如果RNA模板中不含poly A结构，25℃先孵育5分钟，随后42℃孵育15-30分钟)。
(3)置于冰上。
根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上提供的Md-STK1和MdtRNA-MetCAT序列设计引物。
MdSTK1使用的引物序列如下：
上游引物：5’-ATGAAAAACATGACTTCCGTTCTTT-3’
下游引物：5’-TCAACGGGCC ACAACATTAG-3’
MdtRNA-MetCAT使用的引物序列如下：
上游引物：5’-ATCAGAGTGGCGCAGCG-3’
下游引物：5’-TGGTGTCTGTGCCTGGTTT-3’
PCR反应体系(CW0682L):
PCR反应程序如下：
94℃预变性2min；94℃30s，61℃30s，72℃1min，共34个循环；最后72℃延伸2min。
PCR产物检测：根据目标片段大小制作1％琼脂糖凝胶，0.1％TAE电泳缓冲液，70-110v电压电泳约15min，溴化乙啶染色，紫外灯下检测PCR产物片段大小，结果见图2。
实施例3tsRNA靶基因5'RACE分析
根据tsRNA预测到的靶基因进行5'RACE实验验证。
具体方法如下：
(1)提取金冠总RNA
(2)总RNA使用特异性引物逆转录，获得cDNA。
(3)往cDNA中加入乙醇沉淀1小时，4℃12000rpm离心，DEPC水溶解，将cDNA纯化。
(4)纯化后的cDNA进行末端磷酸化酶(TdT)处理。
体系如下:
混匀后37℃处理30min。
(5)加入150μL无RNase水后，再加入等体积200μL CI混匀，4℃12000rpm离心10min。
(6)取上清加入等体积CI颠倒混匀，4℃12000rpm离心10min。
(7)取上清，加入5μL的3M NaOAC(PH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1小时。
(8)4℃12000rpm离心20min；
(9)弃上清，用75％的预冷乙醇清洗沉淀，吹干后溶于20μL无菌水中，-70℃保存备用。
(10)TdT处理后的加C尾产物为模板进行PCR反应，引物使用3’锚定引物和逆转录时使用的特性引物。
Adaptor：5’-TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGG-3’
F:5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’
PCR反应体系：
8)PCR产物进行下一轮的巢式PCR反应，引物为锚定引物中的保守部分及逆转录引物内侧的基因特异性引物。
MdSTK1-R1:5’-TAGAAGTCGTCCCCCTTGTTGTATTCTGG-3’
MdSTK1-R2:5’-GTCGTCCCCCTTGTTGTATTCTG-3’
PCR产物经琼脂糖凝胶回收，T-A克隆到Pmd19-T中，进行测序。
RACE位点如图3所示。
实施例4tsRNA表达量接菌前后验证
在感病品种金冠中接菌ALT1验证tsRNA的含量变化。
具体操作如下：
1、接菌ALT1后48h，提取金冠总RNA；
2、tsRNA Northern法检测
合成5’端修饰地高辛标记的mdm-tsRMet-probe(5’-TCCGCTGCGCCACTCTGAT-3’)和U6-probe,取20μg RNA(CTAB提取)加入2×loading buffer，95℃5min，然后4℃冷却，上样于15％聚丙烯酰胺凝胶(含7M尿素)，1×TBS buffer中220V电泳1h；1×TBS buffer中220mA，冰上电转于尼龙膜上；1200mJ紫外交联3mins，利用地高辛杂交检测试剂盒(Mylabcorporation)进行预杂交、杂交、洗膜和信号检测。
Northen结果显示接种苹果斑点落叶病病原(ALT1)后，mdm-tsRMet的含量在金冠中上调，如图4所示。
实施例5过表达MdtRNA-MetCAT对苹果ALTl抗性影响
将MdtRNA-MetCAT序列构建到pFGC5941载体上(NcoI和BamHI酶切位点之间)，将重组质粒转化GV3101农杆菌株，瞬时转化金冠和寒富组培苗。
具体操作如下：
1、农杆菌转化(上海唯地生物，CAT#:AC1001)
(1)取一管感受态细胞，冰上完全溶解后轻轻悬浮细胞；
(2)加入5μL植物表达载体质粒，轻轻混匀，冰上放置5min；
(3)液氮中冷激5min；
(4)37℃热激5min；
(5)冰上放置5min。
(6)加入500μLYEP培养基，于28℃180rpm振荡培养2-3h；
(7)室温10000rpm离心1min，去除约400μL上清液，用剩余的培养基悬浮细胞。
(8)将细菌涂布在加有抗生素(50mg/L Kana，20mg/L Rif)的固体YEP培养基上。
(9)将平板于28℃倒置培养(24-48h)。
2、农杆菌介导的瞬时表达
苹果金冠和寒富组培苗培养于25±1℃，60％湿度的光照培养箱中，昼夜长度保持为16-8h，光照强度为200μmol·m-2·s-1。待植株5-6片真叶展开时进行农杆菌注射。农杆菌注射方法参见Bai等(Bai et al.2011)。
(1)预培养：农杆菌菌斑或甘油菌加入YEP 2ml(50mg/L Km，20mg/L Rif)，28℃，180rpm培养过夜；
(2)本培养：YEP培养基4ml(加对应的抗生素和10μM乙酰丁香酮)，加入1/50体积的菌液(80μL)，28℃180rpm培养12-16h；
(3)室温10000rpm，1min离心，除去培养基，用1-2ml悬浊液悬浮菌体(可以涡旋震荡)。取10μL菌液加入990μL悬浊液中，用分光光度计测定OD600，将菌体悬浊液调整至OD600＝1.0。室温静置2-5h；
悬浊液：(10mM MES-KOH(pH5.2)，10mM MgCl2,100μM乙酰丁香酮)。
(4)菌液使用前涡旋震荡或用枪吸打悬浮菌体，用没有针头的1ml注射器吸取菌液；
(5)避开叶脉，用注射器针在叶片上开小孔后，用装有菌液的注射器压住小孔，另一只手的手指在叶片反方向压住小孔，慢慢用力，将菌液注射入叶片中，每个叶片注射2个孔；
(6)培养4天后检测MdSTK1和mdm-tsRMet表达量；
具体操作如下：
1、ctab提取金冠总RNA
2、逆转录反应体系及步骤
逆转录反应体系如下：
(1)总RNA中的DNA去除
RNA 2μg
gDNA purge 1μL
DEPC水 补足至10μL
冰上加样并混匀，短暂离心，42℃5min，然后马上置于冰上。
cDNA的第一链合成
上述体系加入10μL 2×Mix，50℃15min，75℃5min，冷却后于-80℃保存。
3、荧光定量反应体系
设计Md-STK1特异引物(F：5’-TGCTTCCGAGTTGTAGCGTT-3’，R：5’-TTGCACTCGTCAGTGGAGAC-3’)，用SYBR Green荧光定量预混液(Vazyme,Q341V21.1)在Applied Biosystems 7500进行荧光定量，PCR反应程序如下：95℃，3mins；95℃10sec，60℃30sec，共40个循环。结果利用2-ΔΔCt方法进行统计分析(Livak and Schmittgen,2001)。
(6)4天后接菌ALT1；
(7)黑暗培养2天后观察表型。
过表达MdtRNA-MetCAT后，金冠和寒富的MdSTK1表达量下降，在金冠中为WT和EV的0.1倍，在寒富中为0.3倍，对于ALT1的抗性降低，如图5所示。
在金冠中，WT和EV处理的病斑面积大小为30％左右，过表达MdtRNA-MetCAT的病斑面积为60％左右，在寒富中，WT和EV处理的病斑面积大小为14％左右，过表达MdtRNA-MetCAT的病斑面积为43％左右，如图5所示。
实施例6沉默tsRMet序列设计
设计沉默mdm-tsRMet序列，以拟南芥成熟MIR319a为骨架，构建为artificialmiRNA，序列经合成构建到pFGC5941载体上(NcoI和BamHI酶切位点之间)，转入大肠杆菌DH5α中。
转化方法如下：
(1)DH5α感受态细胞从-80℃拿出，迅速***冰中，5分钟后待菌块融化，加入质粒并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟；
(2)42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟；
(3)向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。
(4)5000rpm离心1分钟收集菌体，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
(5)将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
(6)将拟南芥preMIR319a的前体改造前后结构，沉默mdm-tsRMet载体模式图如图6所示。
实施例7MNP-DNA的构建
纯化提取包含人工miRNA的质粒DNA将其与磁纳米颗粒(MNP)结合。
具体操作如下：
1、质粒的提取(Vazyme,FastPure Plasmid Mini Kit,DC201)
(1)取1-5ml过夜培养(12-16h)的菌液，加入2ml离心管中，10000rpm离心1min。弃培养基，吸尽残液；
(2)向离心管中加入250μl Buffer P1(已加入RNase A)，涡旋振荡混匀；
(3)向步骤2中加入250μl Buffer P2，温和的上下颠倒混匀8-10次；
(4)向步骤3中加入350μl Buffer P3，立即温和地上下颠倒8-10次，12000rpm离心10min；
(5)将FastPure DNA Mini Columns吸附柱置于Collection Tube2ml收集管中。将步骤4上清用移液器小心转移至吸附柱中，12000rpm离心30sec。倒掉收集管中的废液，把吸附柱重新放回收集管中；
(6)加入600μl Buffer PW2(已用无水乙醇稀释)至吸附柱中。12000rpm离心30sec。弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(7)重复步骤6；
(8)将吸附柱放回收集管中12000rpm离心1min干燥吸附柱；
(9)把吸附柱置于一个新的灭菌的1.5ml离心管中。加入30-100μl ElutionBuffer至柱吸附柱的膜中央。室温静置2min，12000rpm离心1min洗脱DNA；
(10)弃去吸附柱，DNA产物保存于-20℃，
2、磁纳米颗粒修饰聚乙烯亚胺(PEI)
将去离子水清洗后的10nm磁性纳米颗粒在草酸溶液(5g/L)中超声分散60min表面修饰负电荷，清洗重悬后，滴入20％ PEI溶液2.0ml，得到表面修饰PEI的磁性纳米颗粒。
3、MNP与DNA的结合
将纯化后的DNA与MNP以质量比1:1比例混合，涡旋震荡1分钟，室温25℃静置30min结合。
未结合DNA的MNP与结合DNA后的MNP电镜图如图7所示。
实施例8MNP-DNA喷施苹果组培苗
将实施例7中的MNP-DNA复合物以100ng/μl的浓度与表面活性剂Silwet L-77以5000:1的比例混合，均匀喷施在金冠组培苗上，每株施用约200μl，三天后通过透射电镜观察苹果体内MNP-DNA复合物，同时northen检测mdm-tsRMet的含量，实时荧光定量检测MdSTK1的表达量。
具体操作如下：
1、ctab提取金冠总RNA
2、逆转录反应体系及步骤
逆转录反应体系如下：
(1)总RNA中的DNA去除
RNA 2μg
gDNA purge 1μL
DEPC水 补足至10μL
冰上加样并混匀，短暂离心，42℃5min，然后马上置于冰上。
(2)cDNA的第一链合成
上述体系加入10μL 2×Mix，50℃15min，75℃5min，冷却后于-80℃保存。
3、荧光定量反应体系
设计Md-STK1特异引物(F：5’-TGCTTCCGAGTTGTAGCGTT-3’，R：5’-TTGCACTCGTCAGTGGAGAC-3’)，
用SYBR Green荧光定量预混液(Vazyme,Q341V21.1)在Applied Biosystems 7500进行荧光定量，PCR反应程序如下：95℃，3mins；95℃10sec，60℃30sec，共40个循环。结果利用2-ΔΔCt方法进行统计分析(Livak and Schmittgen,2001)。
4、Northen检测mdm-tsRMet的表达
在喷施si-mdm-tsRMet和MNP-si-mdm-tsRMet，3天后检测mdm-tsRMet的含量，相对于WT和EV，其含量显著下降，如图8所示，实时荧光定量检测MdSTK1的表达水平，沉默mdm-tsRMet后MdSTK1表达量上升，如图8所示。
5、透射电镜观察苹果叶片
样品在2.5％的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用1％的锇酸溶液固定样品1-2h；小心取出锇酸废液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用梯度浓度(包括30％，50％，70％，80％，90％和95％五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100％的乙醇处理20min；最后过度到纯丙酮处理20min。用Spurr包埋剂与丙酮的混合液(V/V＝1/1)处理样品1h；用Spurr包埋剂与丙酮的混合液(V/V＝3/1)处理样品3h；纯包埋剂处理样品过夜；将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在LEICA EM UC7型超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液各染色5-10min，即可在Hitachi H-7650型透射电镜中观察。
透过TEM观察苹果内部MNP-DNA复合物，观察到在苹果体内的复合物，证明其被成功吸收，如图9。
实施例9接菌ALT1验证沉默mdm-tsRMet对斑点落叶病抗性影响
具体方法如下：
对实施例8中叶面处理三天后的金冠苹果组培苗接种ALT1，避开叶脉，用注射器针在叶片上开小孔后，往叶片背部喷洒ALT1孢子悬浮液，每株约200μl，7天，14天观察表型，统计病斑面积，在第7天，WT和EV处理病斑面积为40-50％左右，而si-mdm-tsRMet和MNP-si-mdm-tsRMet仅为10％一下，第14天，WT和EV发病面积为100％，si-mdm-tsRMet为50％左右，而MNP-si-mdm-tsRMet仍未出现大面积病斑，如图10所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (7)

1.一种增强苹果斑点落叶病抗性的纳米复合物，其特征在于：包括磁纳米颗粒载体和质粒DNA；
所述质粒DNA为一种重组植物表达载体，上述重组植物表达载体为含有人工miRNA的pFGC5941载体；
所述人工miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.如权利要求1所述一种增强苹果斑点落叶病抗性的纳米复合物，其特征在于：所述人工miRNA中包含一种用于沉默tsRNA的反向互补序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一种工程菌，其特征在于：所述工程菌中含有权利要求1所述的重组植物表达载体。
4.一种制备如权利要求1所述纳米复合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，使用聚乙烯亚胺对磁纳米颗粒表面进行修饰，获得纳米颗粒载体；
步骤2，将纳米颗粒载体与质粒DNA共孵育得到纳米复合物。
5.如权利要求4所述一种制备纳米复合物的方法，其特征在于，所述磁纳米颗粒为10nmFe3O4微球。
6.如权利要求4所述的一种制备纳米复合物的方法，其特征在于：步骤2具体为：
将纳米颗粒载体与质粒DNA以1:1的质量比例混合，在25℃下孵育30min。
7.一种如权利要求1所述纳米复合物的应用，其特征在于：将纳米复合物与表面活性剂混合后均匀喷施在苹果叶片上，纳米复合物中的重组植物表达载体以上述方式递送进苹果植株体内，增强苹果感病品种对斑点落叶病抗性。
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