CN115725620B - 一种在三七细胞中合成竹节参皂苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在三七细胞中合成竹节参皂苷的方法，该方法是通过构建PnDS基因RNAi表达载体，并将其导入三七细胞中获得合成竹节参皂苷的三七细胞，其中RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；该方法从反向调控的角度出发，抑制三七皂苷生物合成途径中涉及达玛烷型三萜皂苷合成支路的第一个关键酶基因PnDS的表达，减少达玛烷型三萜皂苷的合成，从而促使三七细胞合成原本不含有的齐墩果烷型皂苷‑‑竹节参皂苷，本发明为三七细胞工业化大规模生产竹节参皂苷Ⅳa、竹节参皂苷Ⅳ提供了新途径。

Description

一种在三七细胞中合成竹节参皂苷的方法

技术领域

本发明属于皂苷合成技术领域，具体涉及一种在三七细胞中合成竹节参皂苷的方法。

背景技术

五加科(Araliaceae)人参属(Panax)包括多种药用植物，其中人参(Panaxginseng)、西洋参(Panax quinquefolius)、三七(Panax notoginseng)和珠子参(Panaxjaponicus)应用最为广泛。它们的主要活性成分为三萜皂苷，具有防治心脑血管疾病、抗疲劳、抗氧化、增强免疫力以及保肝护肝等多种药理功效。人参属药用植物三萜皂苷生物合成途径在起始阶段、骨架构建阶段基本相同，各物种间皂苷合成的主要差异在于2,3-氧化鲨烯形成后，以2,3-氧化鲨烯为共同前体，分别出现了两条独立的三萜皂苷合成支路。2,3-氧化鲨烯经达玛烯二醇合成酶(DS)催化，进入达玛烷型皂苷合成分支；经β-香树脂醇合成酶(β-AS)催化，则进入齐墩果烷型皂苷合成分支。

迄今为止，从人参属药材分离出的三萜皂苷主要为达玛烷型皂苷，人参、西洋参、珠子参均含有达玛烷型和齐墩果烷型两种类型的三萜皂苷，但三七只含达玛烷型皂苷，不能够合成齐墩果烷型皂苷，这是三七有别于其他人参属物种的特点。目前已知，竹节参皂苷Ⅳ、竹节参皂苷Ⅳa属于齐墩果烷型皂苷，自然状态下的三七不具有合成竹节参皂苷Ⅳ、竹节参皂苷Ⅳa的能力。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种在三七细胞中合成竹节参皂苷的方法，该方法通过构建PnDS基因RNAi表达载体，并将其转入三七细胞中，抑制三七中达玛烷型三萜皂苷合成支路的第一个关键酶PnDS基因的表达，弱化达玛烷型皂苷合成支路代谢流量，促使三七细胞合成竹节参皂苷，其中RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

本发明目的通过以下技术方案实现：

1、从三七根部提取总RNA，逆转录合成三七cDNA，以合成的第一链cDNA为模板，通过PCR扩增PnDS基因干扰片段，其中基因PnDS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

2、构建PnDS基因RNAi干扰载体pHellsagte-PnDS，转化农杆菌，通过PCR筛选出阳性单克隆；

3、利用农杆菌介导的遗传转化法，将pHellsagte-PnDS导入三七细胞表达，通过抗生素筛选和qRT-PCR筛选阳性转基因细胞系；

4、提取三七转基因细胞和非转基因细胞系中的皂苷，分析转基因细胞和非转基因细胞系间皂苷的种类和含量的差异。

本发明的优点和技术效果：

本发明为生产竹节参皂苷Ⅳa、竹节参皂苷Ⅳ提供了一种新方法，竹节参皂苷Ⅳa、竹节参皂苷Ⅳ是珠子参的主要活性成分，属于典型的齐墩果烷型皂苷，在三七药材中不含有。本发明通过基因调控方法在三七细胞中合成竹节参皂苷Ⅳa、竹节参皂苷Ⅳ，在种间实现了皂苷的异源表达，且本发明方法简单，易操作，具有工业化生产和市场推广应用的潜力。

附图说明

图1为RNAi片段序列扩增结果；

图2为带attB重组位点的RNAi片段扩增产物，其中1：RNAi片段，M：MarkerDL2501；

图3为pHellsagte-PnDS载体转入大肠杆菌DH5α的鉴定电泳图，其中1-8：菌液样品，M：MarkerDL2501，+：pHellsagte-PnDS质粒，-:阴性对照；

图4为pHellsagte-PnDS载体转入农杆菌LBA4404的鉴定电泳图，其中1-5：菌液样品；M：MarkerDL2502；-:阴性对照；

图5为PCR检测转基因三七细胞的电泳图，其中1-6：转基因三七细胞系，M：MarkerDL2502；

图6为实为时荧光定量PCR检测转基因三七细胞中PnDS基因以及5个与竹节参皂苷Ⅳa、竹节参皂苷Ⅳ合成相关的基因相对表达量的检测结果，其中WT为野生型细胞系，T1～T4为4个PnDS基因的转基因三七细胞系；

图7为转基因三七细胞系中皂苷含量图，其中WT为野生型三七参细胞系，T1-T4为转基因三七参细胞系)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：PnDS基因的RNAi片段的克隆

(1)三七总RNA的提取

本发明采用改良的异硫氰酸胍法提取三七愈伤组织总RNA，具体操作如下：将研钵、研钵棒进行去RNA酶、高温干热灭菌处理后，冷却至室温。称取适量三七愈伤组织细胞置于处理过的研砵中，利用液氮将三七愈伤组织研磨成粉末，加入10％(w/v)预冷的RNA提取缓冲液和1.0％(w/v)的β-巯基乙醇，充分研磨。取1.0mL研磨液转移至2mL的离心管中，加入500μL RNA提取酚、100μL氯仿以及1/10体积的2M醋酸钠溶液(pH为4.0)，剧烈振荡混匀，冰上静置5min后于4℃、12500g离心15min，缓慢吸取上清液转移至新的2mL离心管中，加入1:1等体积的RNA提取酚/氯仿，剧烈震荡混匀，冰上静置5min后，4℃、12500g离心15min(重复此步骤至中间层几乎消失)。缓慢吸取上清液转移至新的2mL离心管中，加入等体积的氯仿，剧烈震荡混匀，冰上静置5min，4℃、12500g离心15min，缓慢吸取上清液转移至新的1.5mL的离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠溶液(pH为5.2)，再加入等体积异丙醇，缓慢颠倒混匀，于-20℃静置1.5h充分沉淀后，4℃、12500g离心25min；弃上清液，用75％的乙醇溶液吹打洗涤沉淀，两次吹打洗涤后，使用移液枪吸掉液体并置于超净工作台进行风干，至乙醇挥发彻底后，加入15-30μL RNaes的水溶解RNA沉淀。琼脂糖凝胶电泳检测所提三七愈伤组织细胞总RNA完整性，然后用紫外分光光度计检测所提RNA的浓度和纯度。

(2)cDNA第一链的合成

选取质量较好的RNA利用Promega公司的GoScript反转录***合成cDNA第一链，首先将Oligo(dT)₁₅ 1.0μL、总RNA5.0μg、Nuclease-free Water补至10μL充分温和混匀，并将其置于70℃水浴锅中水浴5min进行预变性，然后立即置于冰上冰浴5min，再加入如下试剂：Nuclease-free Water 1.6μL、GoScript^TM5×Reaction Buffer 4.0μL、PCR NucleotideMix 1.0μL、MgCl₂(25mM)2.0μL、RecombinantRibonuclease Inhibitor 0.4μL、GoScript^TMReverse Transcriptase 1.0μL，混匀，瞬时离心，25℃退火5min，42℃水浴延伸90min，最后，放置70℃水浴锅中水浴15min，终止逆转录酶活性，即得三七cDNA第一链。

(3)RNAi片段的合成

根据三七PnDS基因全长序列(KJ804174.1)，利用PrimerPremier5.0设计其特异性引物PnDS_F：5’-TCCCCTTATCATTGCCCT-3’和PnDS_R：5’-GCTTTTTCCCCATTTCCT-3’，以上述获得的三七cDNA第一链为模板，在DNA聚合酶Ex Taq的作用下进行高保真PCR扩增，PCR反应条件：98℃、3min；98℃、10s，60℃、15s，72℃、15s，35cycles；72℃、5min；将获得的扩增产物于1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收片段为基因PnDS的第503-1246位核苷酸序列；

目的片段回收后与pGEM T-easy载体连接，转入大肠杆菌DH5α，随机挑选平板上的单菌落，进行菌液PCR扩增，检测阳性克隆。将菌液PCR检测为阳性的单克隆送测序，利用NCBI中Blast软件将测序后的序列和三七PnDS基因序列进行比对，结果见图1，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，比对结果正确，将结果正确的大肠杆菌单克隆接种于含有壮观霉素的液体LB培养基中扩培，37℃、200rpm振荡培养15h，使用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒提取质粒(T-PnDS)。

实施例2：PnDS基因RNAi表达载体的构建

(1)连有attB重组位点的RNAi片段的克隆

根据GatewayTM的技术原理，设计引物BP-C_F(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGG CTTCCCCTTATCATTGCCCT-3’)和BP-C_R(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCTTTTTCCCCATTTCCT-3’)(下划线部分为attB重组位点)，采用PCR手段将接头加到RNAi片段两端，使得目的片段与载体发生同源重组反应，以上述抽提的质粒为模板，BP-C_F/BP-C_R为引物，用Ex Taq进行attB-PCR扩增，PCR反应条件与实施例1步骤(3)中相同，此次扩增后，RNAi片段两侧均接上了attB重组位点；胶回收PCR产物，结果见图2；

(2)PnDS基因RNAi表达载体的构建

依据BP Clonase^TMII Enzyme Mix试剂盒说明书进行RNAi载体的构建，反应体系设置如下：attB-PCR胶回收产物0.15μg、pHellsagte 2载体质粒0.15μg、BPClonase^TMII Enzyme Mix 2.00μL、TE缓冲液(pH＝8.0)补至10μL；依次加入上述溶液，用移液枪吹打混匀，置于25℃水浴锅中水浴，反应4h，然后向反应液中加入1μL蛋白酶K，37℃水浴锅中水浴10min，终止反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，单克隆PCR验证结果见图3，对其进行扩大培养，随后进行质粒(pHellsgate-PnDS)抽提；对得到的质粒分别用限制性内切酶XbaI和XhoI进行单酶切，酶切体系如下：pHellsagte-PnDS质粒5.0μg、10×Buffer2.0μL、限制性内切酶XbaⅠ/XhoⅠ1.5μL、ddH₂O水补至20μL；

酶切体系置于37℃水浴锅中进行5h的酶切反应，反应结束后，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，根据两种酶的酶切产物跑胶条带大小判断PnDS基因RNAi表达载体pHellsagte-PnDS构建成功；然后通过液氮冻融法将载体转入农杆菌LBA4404感受态细胞中，同时将空载pHellsagte 2也转化到LBA4404感受态细胞中，作为空载对照，结果见图4，从图中可以看出所扩增出来的条带约为750bp，符合预期，表明PnDS因的RNAi片段已经成功转化到农杆菌中。

实施例3：根癌农杆菌介导的三七遗传转化

1、三七细胞预培养

(1)采集三七茎叶，使用三七愈伤组织培养基(MS培养基+2,4-D 2mg/L+KT 1mg/L，培养基pH5.6)，培养条件为固体培养，温度25±1℃，避光培养，培养周期28天，获得的三七愈伤组织；将获得的三七愈伤组织采用含2,4-D 2mg/L、KT 2mg/L的MS固体培养基继代培养15天，获得三七继代培养细胞；

(2)选取生长状态良好的三七参愈伤组织细胞转接于三七愈伤组织细胞预培养基(在三七愈伤组织培养基中添加乙酰丁香酮至40mg/L)上，平铺覆盖培养基整个表面，并置于25℃条件下暗培养3天；

(2)三七细胞侵染

吸取100-200μL携带PnDS基因RNAi表达载体质粒pHellsagte-PnDS的活化好的LBA4404农杆菌菌液涂布于含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB固体培养基平板上(该步骤可与三七愈伤组织细胞预培养同时进行)，在28℃培养箱中倒置培养2-3天，至平板长满一层厚厚的菌。用接种针刮取一定大小的生长好的菌团于含40mg/L乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，于28℃、200rpm摇床振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.6-0.8，接入上述预培养3天的三七愈伤组织细胞中，使三七愈伤组织细胞完全浸没于菌液中，于25℃、105rpm摇床上振荡培养20min；

(3)细胞收集与共培养

侵染结束后，用布氏漏斗对三七愈伤组织细胞进行抽滤，去除菌液，然后用无菌滤纸吸干三七愈伤组织细胞表面残余菌液，后将三七愈伤组织细胞转接至表面铺有无菌滤纸的三七共培养基上(防止农杆菌与培养基直接接触，导致农杆菌过度生长)，放置于25℃黑暗条件下共培养3天，其中三七共培养基与三七愈伤组织细胞预培养基相同。

(4)除菌培养

共培养结束后，将三七愈伤组织细胞转移至已灭菌的烧杯中，用含有400mg/L头孢霉素的无菌水清洗5-6次，以充分去除农杆菌，清洗结束后用布氏漏斗对三七愈伤组织细胞进行抽滤，去除液体，然后用无菌滤纸吸干三七愈伤组织细胞表面残余液体。将三七愈伤组织细胞转接至除菌培养基(在三七愈伤组织培养基中添加头孢霉素和卡那霉素至终浓度为400mg/L和50mg/L)中，置于25℃、黑暗条件下进行15天的除菌培养。

(5)筛选培养和继代

除菌培养15天后，将三七愈伤组织细胞转接至三七愈伤组织筛选培养基(在三七愈伤组织培养基中添加卡那霉素至终浓度为50mg/L)上，大约35天左右继代一次(可根据生长情况调整继代周期)，经过4-5次继代筛选，可获得具有卡那霉素抗性的PnDS基因RNAi转基因三七细胞系。

实施例4：转基因三七细胞中PnDS基因以及与竹节参皂苷合成相关的基因表达水平检测

(1)转基因三七细胞系基因组DNA水平检测

采用改良的CTAB法提取转基因三七细胞系基因组DNA，根据pHellsagte 2载体中的T-DNA上卡那霉素npt II抗性基因序列设计上下游引物npt-F(5’-CTCTGATGCCGCCGTGTT-3’)和npt-R(5’-CCCTGATGCTCTTCGTCCA-3’)，以所提三七基因组DNA为模板进行PCR检测，筛选阳性转基因的三七细胞，结果如图5，图中均扩增出一条大小约为430bp的特异性条带，与预期大小相符，表明这六株三七转基因细胞系均已导入外源DNA并整合到了基因组DNA上稳定遗传，初步确定获得了PnDS基因RNAi转基因细胞系。

(2)转基因三七细胞荧光定量PCR检测

提取阳性转基因三七细胞株和非转基因三七细胞株的总RNA，反转录成cDNA，具体操作步骤与实施例1中相同；

根据18S rRNA基因(登录号：D85171.1)、β-香树脂醇合成酶(β-amysyrinsynthase，β-AS)基因(登录号：KP658156)、齐墩果酸合酶(Oleanic acidsynthase，CYP716A52v2)基因(登录号：JX036032.1)、齐墩果酸葡萄糖醛酸基转移酶(oleanolic acid glucuronosyltra nsferase，OAGT)基因(登录号：MH819287.1)、PjmUGT1基因和PjmUGT2基因设计用于荧光定量PCR的引物：18S-F：5’-GGGGAGTATGGTCGCAAGG-3’，18S-R：5’-CAGAACAT CTAAGGGCATCACAG-3’；β-AS-F：5’-GTATTCCCTGTAGAGCATCGCAT-3’，β-AS-R：5’-GGCACAGGCGTTGTTTTCAC-3’；CYP716A52v2-F：5’-AGGAGCAAATGGAGATAGTGA-3’，CYP716A52v2-R：5’-GATTGAGAAACCGTTGTAGG-3’；OAGT-F：5’-GCATAATCTCGGACA AGTAC-3’，OAGT-R：5’-AAAGGTTGGGAGTCTGAAGT-3’；PjmUGT1-F：5’-TCACATAAA TCCGATGGTCC-3’，PjmUGT1-R：5’-AGAAATCCCTGAAATCCTCC-3’；PjmUGT2-F：5’-GC ATTCTCCCTTTGTTTCAG-3’，PjmUGT2-R：5’-CGACTTGCCTCACTCTTCCT-3’。反转录合成的cDNA稀释5倍，即将20μL cDNA稀释至100μL。以系稀释后的cDNA为模板，采用上述荧光定量PCR的引物进行荧光定量PCR，根据qPCRMaster Mix说明书进行操作，每个样品对应的每个基因重复检测3次。利用2^-ΔΔCt法对荧光定量数据进行处理，分析检测PnDS基因在转基因三七细胞系中相对于未转基因三七细胞系中的相对表达量，结果见图6，结果显示，在选取的T1-T4四株转基因三七细胞株系中关键酶PnDS基因的表达量明显低于普通三七细胞系，而与竹节参皂苷Ⅳa、竹节参皂苷Ⅳ合成相关的基因β-AS、CYP716A52v2、OAGT、PjmUGT1和PjmUGT2相对表达量明显高于普通三七细胞系。

实施例5：转基因三七细胞中皂苷含量检测

(1)样品溶液的制备

收集实施例4步骤(1)的转基因三七细胞株系和普通三七细胞系的愈伤组织细胞，分别标上号后置于55℃烘箱中烘干(约12h)，烘干后将其充分研磨成粉末，各称取0.5g的转基因和普通三七细胞系粉末，分别放置于50mL离心管中，各加入50mL的70％甲醇溶液并浸泡过夜，再利用超声波进行破碎处理(60W，超声4s，间歇2s)1.5～2.0h，直至三七细胞粉末充分破碎完毕，超声结束后，转移至离心机中4000rpm离心30min，收集上清液，并将上清液放置于50～55℃烘箱中进行烘干，烘干后，用10mL蒸馏水进行溶解，并用等体积的水饱合正丁醇萃取3次。收集萃取液，并将萃取液放置于50～55℃烘箱中进行烘干，烘干后用70％甲醇溶液进行溶解并定容至25mL，经0.45μM的微孔滤膜过滤后即为皂苷溶液。

(2)高效液相色谱分析

利用HPLC检测转基因三七细胞中皂苷的种类及其含量，HPLC检测条件如下：色谱柱为Waters-XTerra-MS-C18(5μm，250mm×4.6mm，USA)。流动相为水和乙腈。梯度洗脱：0-20min，20％乙腈；20-30min，20％-35％乙腈；30-40min，35％乙腈；40-50min，35-40％乙腈；50-60min，40-100％乙腈。流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长设置为203nm；结果见图7，结果显示经过转基因操作后的三七细胞中含有齐墩果烷型皂苷(竹节参皂苷Ⅳa、竹节参皂苷Ⅳ)，而未改造的野生型三七细胞中不产生齐墩果烷型皂苷(竹节参皂苷Ⅳa、竹节参皂苷Ⅳ)。

Claims (1)

1.一种在三七细胞中合成竹节参皂苷的方法，其特征在于：将干扰基因PnDS的RNAi片段转入三七细胞中获得合成竹节参皂苷的三七细胞，其中干扰基因PnDS的RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

转基因三七细胞能合成了竹节参皂苷Ⅳ、竹节参皂苷Ⅳa。