CN116121144A - 一种白术促生细菌bz-29及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种白术促生细菌BZ‑29及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌BZ‑29，所述解淀粉芽孢杆菌BZ‑29的保藏编号为CCTCC NO：M 20221991。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BZ‑29能促进白术茎长增加91.67％，根长增加88.24％，鲜重增加175.99％，干重增加132.50％；同时解淀粉芽孢杆菌BZ‑29具有促进白术合成倍半萜内酯的作用，对白术合成倍半萜内酯关键基因DXR、FPPS、HMGR的表达有着显著的促进作用。本发明白术促生细菌BZ‑29的发现为白术促生菌肥的开发及其利用奠定了良好的基础。

Description

一种白术促生细菌BZ-29及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种白术促生细菌BZ-29及其应用。
背景技术
白术，菊科苍术属植物，是常见的大宗药材之一，以根状茎入药，具有健脾益气、燥湿利水之效，是“浙八味”之一，素有“十药九术”之说，现主要种植于浙江于潜、新昌、河北安国、安徽亳州、湖北等地区。
白术在自然条件下生长较为缓慢。为了追求白术的产量和提高白术的抗病能力，往往会施用大量的肥料和农药等，而化肥和农药的滥用，导致土壤酸化、水体污染和土壤微生态结构失衡等问题，不利于白术产业的可持续发展。为了提高白术的产量，分离筛选获得具有促进白术生长的生物菌剂并研制成生物菌肥加以应用对于白术产业发展具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一种能够促进白术生长的生物菌剂。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BZ-29，所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29的保藏编号为CCTCC NO：M 20221991。
优选的，所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了上述技术方案所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29的发酵菌液。
本发明提供了上述技术方案所述发酵菌液的制备方法，包括以下步骤：
将所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29在培养基中进行培养，得到发酵菌液。
本发明提供了上述技术方案所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29或上述技术方案所述发酵菌液在促进植物生长和/或防治病害中的应用。
优选的，所述植物包括白术、玉米和烟草中的任一种或两种以上。
优选的，促进植物生长包括以下(1)～(4)中的任一种或两种以上：
(1)促进植物对营养元素的吸收；
(2)促进茎的生长；
(3)促进根的伸长；
(4)提高植株的干重和鲜重。
优选的，所述防治病害包括防治花生白绢病菌、水稻立枯病菌、小麦全蚀病菌、水稻纹枯病菌、小麦茎基腐病菌和油菜菌核病菌中的一种或者两种以上真菌引起的植物病害。
本发明提供了上述技术方案所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29或上述技术方案所述发酵菌液在促进白术合成倍半萜内酯中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29或上述技术方案所述发酵菌液的使用方法，在植物种子露白期和/或植物生长至5～7叶时进行施用；施用量为1～5mL/株。
本发明的有益效果：
本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌BZ-29，所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29的保藏编号为CCTCC NO：M 20221991。本发明从大量白术内生细菌中筛选到一株具有产生长素、解磷、产纤维素酶、产铁载体和拮抗多种病原真菌特性，并对宿主白术具有生长促进功能的细菌菌株BZ-29，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。它产IAA能力可达到8.48μg/mL，定量测定其解磷含量，可达到3.47mol/L，有产生铁载体的能力，其活性为90％以上。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(即白术促生细菌)BZ-29能促进白术苗期的生长，同时具有促进白术合成倍半萜内酯的作用。通过实施例结果表明：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BZ-29能促进白术茎长增加91.67％，根长增加88.24％，鲜重增加175.99％，干重增加132.50％；所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29对白术合成倍半萜内酯关键基因DXR、FPPS、HMGR的表达有着显著的促进作用。本发明白术促生细菌BZ-29的发现为白术促生菌肥的开发和利用奠定了良好的基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为BZ-29菌株在LB、GS、PDA、V8、OA固体培养基上的菌落形态图；
图2为扫描电镜下观察的BZ-29菌株的菌体形态图；
图3为BZ-29菌株的分子鉴定聚类图谱图；
图4为BZ-29菌株产生IAA图；
图5为IAA标准曲线图；
图6为磷含量标准曲线图；
图7为BZ-29菌株解磷图；
图8为BZ-29菌株产纤维素酶图；
图9为BZ-29菌株产铁载体能力图；
图10为BZ-29菌株拮抗病原真菌图；
图11为BZ-29菌株的生理生化实验结果图；
图12为BZ-29菌株对白术生长的促生作用图；
图13为BZ-29菌株对白术生长的促生作用结果图；
图14为BZ-29菌株对烟草生长的促生作用图；
图15为BZ-29菌株对烟草生长的促生作用结果图；
图16为BZ-29菌株对玉米生长的促生作用图；
图17为BZ-29菌株对玉米生长的促生作用结果图；
图18为BZ-29菌株对白术合成倍半萜关键基因的影响结果图。
具体实施方式
本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BZ-29，所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29的保藏编号为CCTCC NO：M 20221991。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29分离自白术体内，为白术内生菌。本发明所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29于2022年12月19日保藏在中国典型培养物保藏中心。
在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29的培养基可选择LB培养基、GS培养基、PDA培养基或V8培养基，不能选择OA培养基。本发明所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29的形态特征如图1所示，具体为：所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29在LB固体培养基上呈淡灰色、表面粘稠，光滑或褶皱，有凸起；所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29在GS固体培养基上呈亮白色、表面粘稠光滑，有凸起；所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29在PDA固体培养基上呈灰白色、表面粘稠光滑，有明显凸起；所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29在V8固体培养基上呈淡灰白色、表面粘稠，光滑或褶皱，有明显凸起；所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29在OA固体培养基上几乎不能生长。本发明所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29电镜图像显示如图2所示，所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29在电镜下呈现长短不一的棒杆状，菌体间有较多丝线状结构，菌体尾端有明显芽管。在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29发酵葡萄糖产酸产气，能够利用柠檬酸盐，不能发酵肌醇、甘油，V-P试验阳性，甲基红试验阴性，不能产生明胶酶，不能分解尿素，能够产生过氧化氢酶，能产铁载体，能产生IAA，具有解磷能力。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29的16S rDNA序列共1396bp，如SEQ IDNO.1所示。
SEQ ID NO.1：
ATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTACCTTTAGGAGCCAGCC。
获得解淀粉芽孢杆菌BZ-29的16S rDNA序列与GenBank数据库中序列进行BLAST分析比对，构建的分子鉴定聚类图谱如图3所示。在NCBI的数据库对比显示，解淀粉芽孢杆菌BZ-29的16S rDNA序列与Bacillus amyloliquefaciens聚于同一分支中，相似性达到99％以上。
本发明提供了上述解淀粉芽孢杆菌BZ-29的发酵液。
本发明提供了上述发酵液的制备方法，包括以下步骤：
将所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29在培养基中进行培养，得到发酵菌液。
本发明将所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29在培养基中进行培养，得到发酵菌液。在本发明中，所述培养基优选为LB培养基、GS培养基、PDA培养基或V8培养基，更优选为LB培养基。本发明所述培养的温度优选为25℃～30℃，更优选为28℃；所述培养的时间优选为3～7d，更优选为5d。在本发明中，所述培养优选在摇床中进行，所述摇床的转速优选为150～200rpm，更优选为180rpm。在本发明中，所述培养优选在黑暗条件下进行。本发明培养得到的发酵菌液的浓度优选为1×109～1×1010CFU/mL，更优选为1×1010CFU/mL。
本发明还提供了一种上述所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29或上述所述发酵菌液在促进植物生长和/或防治病害中的应用。
在本发明中，所述植物优选包括白术、玉米和烟草中的任一种或两种以上。在本发明中，所述促进植物生长优选包括以下(1)～(4)中的任一种或两种以上：
(1)促进植物对营养元素的吸收；
(2)促进茎的生长；
(3)促进根的伸长；
(4)提高植株的干重和鲜重。
在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29能够促进植物生长，更优选能够促进植物苗期生长。在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29能够促进植物对营养元素的吸收，所述营养元素优选包括磷元素。本发明所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29优选能够促进植物茎的生长，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BZ-29能促进白术茎长增加91.67％；能促进烟草茎长增加287.5％；能促进玉米茎长增加39.6％。本发明所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29优选能够促进植物根的伸长，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BZ-29能促进白术根长增加88.24％；能促进烟草根长增加41.7％；能促进玉米根长增加23.7％。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BZ-29优选能够提高植物的干重和鲜重，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BZ-29能促进白术鲜重增加175.99％，干重增加132.50％；能促进烟草鲜重增加291.5％，干重增加393.9％；能促进玉米鲜重增加42.6％，干重增加6.3％。
在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29能够防治病害。本发明所述防治病害优选包括防治病原微生物。在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29对花生白绢病菌、水稻立枯病菌、小麦全蚀病菌、水稻纹枯病菌、小麦茎基腐病菌和油菜菌核病菌等多种病原真菌具有拮抗效果。
本发明还提供了一种上述所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29或上述所述发酵菌液在促进白术合成倍半萜内酯中的应用。本发明所述促进白术合成倍半萜内酯优选包括通过对白术合成倍半萜内酯关键基因DXR、FPPS、HMGR的变达有着显著的促进作用而实现。
本发明还提供了上述所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29或上述所述发酵菌液的使用方法，在植物种子露白期和/或植物生长至5～7叶时进行施用；施用量为1～5mL/株。
在本发明中，所述植物生长至5～7叶时进行施用时株高优选为5～20cm，更优选为15cm。本发明进行施用时优选施用于种子和/或植株附近。本发明进行施用时的施用量优选为1～5mL/株，更优选为1mL/株。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.菌株分离
从来自于安徽省岳西县头陀镇健康白术植株体内，采用平板涂布法分离、纯化、筛选获得了白术内生细菌BZ-29。
具体操作如下：
将采集的新鲜白术根状茎用自来水冲去表面泥土，去除须根部分，于无菌超净工作台中将根状茎切成边长约5mm的正方体样品块，再将样品块置于75％酒精溶液中灭菌10min，随之转至体积分数30％H2O2溶液中灭菌30s，最后用无菌水冲洗3次，并用最后一次冲洗的无菌水涂板，作为对照；将样品置于无菌离心管内，同时添加适量无菌水，并加入大小不同的2个钢珠(直径分别为2mm和4mm)，60Hz震荡2min，从离心管内吸取100μL溶液于LB固体平板培养基上，用无菌涂布器均匀涂布，密封保存在黑暗28℃恒温培养箱中，及时观察，待有细菌长出后，挑至新的固体培养基平板上，通过划线法在LB固体培养基上反复操作，直至得到稳定生长的细菌单菌落，贮存于50％甘油溶液中，得到菌株BZ-29。
2.菌株性能测定
(1)分泌IAA能力的测定
将菌株BZ-29划线接种于LB固体培养基上，28℃黑暗条件下第一培养24h。
第一培养结束后，挑取单菌落至0.5g/L色氨酸的NB液体培养基中，于28℃，180r/min黑暗条件下第二培养72h。
第二培养结束后，吸取1mL菌液，10000r/min离心10min，取上清，加入约2倍体积的IAA指示剂，遮光显色30min，观察是否有红色产生，并使用紫外分光光度计测定显色溶液530nm波长处吸光值，根据绘制的IAA标准曲线计算菌液中IAA浓度。
IAA标准曲线的绘制采用IAA梯度稀释测定方法进行绘制。使用IAA标准品配制0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL的标准样，测定在OD530nm下的吸光值，IAA浓度和吸光值如表1所示，以IAA浓度作为x轴，吸光值作为y轴，标准曲线如图5所示，所得标准曲线的公式为：y＝0.0408x-0.003，R2＝0.9836。
表1 IAA浓度及其吸光值
IAA浓度(μg/mL) 吸光值(OD值)
0.1 0.001
0.5 0.016
1.0 0.034
1.5 0.064
2.0 0.084
2.5 0.093
定性结果如图4所示，菌株BZ-29产生明显的红色，具有产IAA能力。定量结果检查得到的吸光值为0.343，根据绘制的IAA标准曲线计算菌液中IAA浓度。得到BZ-29产IAA能力可达到8.48μg/mL。
(2)解磷能力的测定
定性检测：使用5mm打孔器将菌株BZ-29单菌落整个挑取于NBRIP固体培养基上，于28℃恒温培养箱，黑暗条件下培养2～3d，观察菌落周围是否有透明解磷圈产生，并测定溶磷圈即解磷圈的直径D和菌落直径d。
定量检测：采用钼锑抗比色法测定供试菌株的解磷能力，将菌株BZ-29的种子液以体积百分比为1％的接种量转接NBRIP液体培养基中，28℃，180rpm黑暗条件下培养7d，取发酵菌液于8000r/min离心10min，取上清液100μL，用蒸馏水定容至10mL，依次加入0.1g/mL抗坏血酸溶液和钼酸铵-硫酸混合溶液各200μL，充分振荡混匀后静置5min，采用分光光度计测定OD822nm波长处吸光值，测前调零。
用KH2PO4(使用前置于105℃烘至重量不变)配置1、2、3、4、5mg/L标准液(现用现配)，并采用上述方法测定标准液OD822nm处吸光值，磷含量和吸光值如表2所示，再以吸光值为x轴，磷含量为y轴，绘制磷标准曲线。标准曲线如图6所示，所得标准曲线的公式为：y＝75.718x-182.2，R2＝0.9805。
钼酸铵-硫酸混合溶液配制：0.14g/mL钼酸铵溶液、6.0mol/L H2SO4溶液和0.03g/mL酒石酸锑钾溶液按照体积比为9:40:1的比例混合(现用现配)
表2磷含量及其吸光值
磷含量(mmol/L) 吸光值
2 2.438
4 2.459
6 2.476
8 2.516
10 2.539
定性结果如图7所示，菌落周围有透明解磷圈产生，溶磷圈的直径D为2.867±0.058cm，菌落直径d为d＝0.933±0.153cm。定量结果检查得到的吸光值为48.200，根据绘制的磷含量标准曲线计算菌液中磷含量。得到菌株BZ-29的解磷能力可达到3.47mol/L。
(3)产纤维素酶的检测
将菌株BZ-29在LB培养基上在黑暗条件下进行培养，培养的温度为28℃，180r/min培养24h，直至长出单菌落。
使用5mm打孔器将菌株BZ-29单菌落整个挑取于羟基纤维素纳固体培养基上，于28℃恒温培养箱，黑暗条件下培养3d，用刚果红溶液对培养基染色30min，用纯水缓缓冲洗，再用1mol/L的NaCl溶液脱色10min，观察到菌株BZ-29生长的周围是否出现淡黄色透明圈。
结果如图8所示，观察到菌株BZ-29生长的周围出现淡黄色透明圈，表明菌株能够产生纤维素酶。
(4)产铁载体能力的检测
将菌株BZ-29在LB培养基上在黑暗条件下进行培养，培养的温度为28℃，180r/min培养24h，直至长出单菌落。
使用5mm打孔器将菌株BZ-29单菌落整个挑取于CAS固体培养基上，于28℃恒温培养箱，黑暗条件下培养1～2d，观察看到菌落周围是否有黄色产生。
结果如图9所示，观察看到菌落周围有黄色产生，表明菌株BZ-29具有产铁载体的能力。
(5)拮抗病原真菌能力的测定
将菌株BZ-29在LB培养基上培养在黑暗条件下进行培养，培养的温度为28℃，180r/min培养24h，直至长出单菌落。
使用5mm打孔器将菌株BZ-29单菌落整个挑取于接种了病原真菌的PDA固体培养基上，作为实验组。同时设置对照组，仅在PDA培养基上接种病原真菌，不接种菌株BZ-29。实验组和对照组分别于28℃恒温培养箱，黑暗条件下培养数2～5d，观察对照组长满整个平板培养基时，实验组病原真菌的生长情况。
观察发现菌株BZ-29对花生白绢病菌、水稻立枯病菌，小麦全蚀病菌、水稻纹枯病菌、小麦茎基腐病菌和油菜菌核病菌等多种病原真菌具有拮抗效果，其中，菌株BZ-29对花生白绢病菌、水稻立枯病菌、小麦全蚀病菌和水稻纹枯病菌病原真菌的拮抗作用如图10所示。
3.菌株鉴定
(1)菌落形态观察
将BZ-29菌株划线接种分别接种在LB、GS、PDA、V8、OA固体培养基上，28℃，黑暗条件下培养16h，观察记录单菌落形态。
其中LB固体培养基、GS固体培养基和OA固体培养基购自于青岛高科技工业园海博生物科技有限公司；PDA固体培养基购自于杭州百思生物技术有限公司；V8自行配制：V8蔬菜汁(Campbell Soup Company)100mL，CaCO3(西陇化工股份有限公司)0.2g，纯水定容至1L。以上所有培养基配制完成后均121℃灭菌20min。
单菌落形态如图1所示，菌株BZ-29在LB固体培养基上呈淡灰色、表面粘稠，光滑或褶皱，有凸起；在GS固体培养基上呈亮白色、表面粘稠光滑，有凸起；在PDA固体培养基上呈灰白色、表面粘稠光滑，有明显凸起；在V8固体培养基上呈淡灰白色、表面粘稠，光滑或褶皱，有明显凸起；在OA固体培养基上几乎不能生长。
(2)菌体形态观察
取在LB液体培养基中培养24h的BZ-29菌株菌液，进行离心；用无菌水反复冲洗后离心。在沉淀的菌体上加入适量体积分数为2.5％戊二醛固定液(用0.1M的磷酸缓冲液配制)中，于4℃下储存12h，使用0.1M磷酸缓冲液浸泡冲洗3次，离心沉淀，吸弃上清液，加入体积分数为30％乙醇水溶液，4℃静置20min，离心沉淀，然后将沉淀依次再用体积分数为50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、80％乙醇溶液、90％乙醇溶液和100％的乙醇溶液进行清洗，使菌体脱水，具体清洗步骤同体积分数为30％乙醇溶液的清洗步骤；最后吸弃上清液，置换到100％丙酮，4℃静置20min，重复两次；吸取菌体，使用临界点干燥仪进行干燥样品，取出干燥后的样品，置于扫描电镜中观察。
扫描电镜观察结果如图2所示，菌株BZ-29在电镜下呈现长短不一的棒杆状，菌体间有较多丝线状结构，菌体尾端有明显芽管。
(3)生理生化特性
参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版中推荐的部分方法测定BZ-29菌株的生理生化特性。检测结果如表3所示。
表3菌株的生理生化特性
注：+：阳性反应；-：阴性反应
生理生化特性结果如表3和图11所示，生理生化特性检测结果表明菌株BZ-29为革兰氏染色阴性菌；发酵葡萄糖产酸产气，不能发酵肌醇、甘油，V-P试验阳性，甲基红试验阴性，不能产生明胶酶，不能分解尿素，能够产生过氧化氢酶。
(4)分子鉴定
菌株BZ-29的DNA提取采用常用的CTAB法。
提取得到菌株BZ-29的DNA后，进行PCR反应。
PCR反应体系：2×RapidTaq MasterMix 25μL，Primer1和Primer2各2μL，TemplateDNA 5μL，加ddH2O至50μL。Rapid Taq MasterMix购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，51℃退火15s，72℃延伸30s，循环35次；72℃终延伸5min。
使用引物序列为：Primer1为27F的序列为SEQ ID NO.2，具体为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R的序列为SEQ ID NO.3，具体为5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。
测序是将扩增的PCR原液送至南京擎科生物科技有限公司进行DNA测序。
获得菌株16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。将获得的SEQ ID NO.1序列与GenBank数据库中序列进行BLAST分析比对，构建分子鉴定聚类图谱，如图3所示。
由图3可得，菌株BZ-29与Bacillus amyloliquefaciens聚于同一分支中，NCBI对比显示其相似性达到99％以上。
通过形态特征、培养特征、生理生化特征和分子生物学鉴定结果，BZ-29菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BZ-29菌株，已于2022年12月19日送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 20221991。保藏中心地址：中国武汉市武汉大学，邮编：430072。
实施例2
解淀粉芽孢杆菌BZ-29的发酵菌液，制备方法为：
将解淀粉芽孢杆菌BZ-29接种到LB培养液中进行培养，培养条件为180rpm，28℃摇床培养发酵5d。培养得到的发酵菌液的浓度为1×1010CFU/mL。
应用例1
菌株BZ-29对白术生长的影响
设置22℃温室环境进行植株培养。将白术种子用清水洗净后，用体积分数为75％酒精消毒10min，温水浸泡2h，取出并用无菌水冲洗干净，撒播于育苗盘中，喷适量清水，表面覆土约1cm，并覆盖保鲜膜；待种子露白后，挑选露白同一程度的种子随机分组，分为试验组和对照组。其中试验组5株，对照组5株，每组进行3个平行实验。实验组于露白至同一程度的种子附近添加实施例2所述发酵菌液1mL/株。对照组添加不接菌的LB培养基1mL/株。实验组和对照组生长30d后，将白术植株从土中取出，测量茎高、根长、干重和鲜重分别取平均值，观察植株生长情况。
其中，干重的处理方式是将植物放在提前称重的玻璃培养皿中，于80℃的烘箱中持续烘干5d，取出称量总质量，减去培养皿的质量，得到样品干重。
实验组和对照组白术生长情况如表4和图12及图13所示。
表4实验组和对照组白术生长情况，均值
组 茎高(cm) 根长(cm) 鲜重(mg) 干重(mg)
试验组 6.9 6.4 313.8 18.6
对照组 3.6 3.4 113.7 8.0
由表4和图12～图13可得，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BZ-29能够促进白术生长。所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29能促进白术茎长增加91.67％，根长增加88.24％，鲜重增加175.99％，干重增加132.50％。
应用例2
菌株BZ-29对烟草生长的影响
设置22℃温室环境进行植株培养。将烟草种子用清水洗净后，用体积分数75％酒精消毒10min，温水浸泡2h，取出并用无菌水冲洗干净，撒播于育苗盘中，喷适量清水，表面覆土约1cm，并覆盖保鲜膜；待种子露白后，挑选露白同一程度的种子随机分组，分为试验组和对照组。其中试验组5株，对照组5株，每组进行3个平行实验。实验组于露白至同一程度的种子附近添加实施例2所述发酵菌液1mL/株。对照组添加不接菌的LB培养基1mL/株。实验组和对照组生长30d后，将烟草植株从土中取出，测量茎高、根长、干重和鲜重分别取平均值，观察植株生长情况。
实验组和对照组烟草生长情况如表5和图14及图15所示。
表5实验组和对照组烟草生长情况，均值
组 茎高(cm) 根长(cm) 鲜重(mg) 干重(mg)
试验组 9.3 5.44 1084.0 32.1
对照组 2.4 3.84 276.9 6.5
由表5和图14～图15可得，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BZ-29能够促进烟草生长。所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29能促进烟草茎长增加茎高增长了287.5％，根长增长了41.7％，鲜重增长了291.5％，干重增长了393.9％。
应用例3
菌株BZ-29对玉米生长的影响
设置22℃温室环境进行植株培养。将玉米种子用清水洗净后，用体积分数75％酒精消毒10min，温水浸泡2h，取出并用无菌水冲洗干净，撒播于育苗盘中，喷适量清水，表面覆土约1cm，并覆盖保鲜膜；待种子露白后，挑选露白同一程度的种子随机分组，分为试验组和对照组。其中试验组5株，对照组5株，每组进行3个平行实验。实验组于露白至同一程度的种子附近添加实施例2所述发酵菌液1mL/株。对照组添加不接菌的LB培养基1mL/株。实验组和对照组生长15d后，将玉米植株从土中取出，测量茎高、根长、干重和鲜重分别取平均值，观察植株生长情况。
实验组和对照组玉米生长情况如表6和图16～图17所示。
表6实验组和对照组玉米生长情况，均值
组 茎高(cm) 根长(cm) 鲜重(mg) 干重(mg)
试验组 26.53 20.75 2241.7 216.9
对照组 19.00 16.78 1572.6 204
由表6和图16～图17可得，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BZ-29能够促进玉米生长。所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29能促进玉米茎高增长了39.6％，根长增长了23.7％，鲜重增长了42.6％，干重增长了6.3％。
应用例4
菌株BZ-29对白术合成倍半萜内酯关键基因DXR、FPPS、HMGR的变达量的影响。
设置22℃温室环境进行植株培养。将白术种子用清水洗净后，用体积分数75％酒精消毒10min，温水浸泡2h，取出并用无菌水冲洗干净，撒播于育苗盘中，喷适量清水，表面覆土约1cm，并覆盖保鲜膜；待植株生长至5叶，株高15cm左右的白术随机分为两组分别为实验组和对照组。其中试验组5株，对照组5株，每组进行3个平行实验。实验组白术根际附近添加实施例2所述发酵菌液1mL/株。对照组添加不接菌的LB液体培养基1mL/株。
在第0d、3d、7d、12d时分别随机取顶部叶片，使用Vazyme RC411 RNA提取试剂盒提取RNA，使用Monad MonScriptTM RTIII All-in-One Mix with dsDNase将RNA反转录成cDNA作为模板DNA，使用Monad MonAmpTM ChemoHS qPCRMix进行qPCR试验，对DXR、FPPS、HMGR的相对表达量进行定量，具体引物如表7所示。
Vazyme RC411 RNA提取试剂盒购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；MonadMonScriptTM RTIIIAll-in-One Mix with dsDNase购自于莫纳(苏州)生物科技有限公司；Monad MonAmpTM ChemoHS qPCR Mix购自于莫纳(苏州)生物科技有限公司。
表7qPCR试验所使用的引物
qPCR试验结果如图18所示，其中图中实验组各个基因的表达量均为减去对照组表达量的结果，在添加解淀粉芽孢杆菌BZ-29发酵液第3天时，DXR、FPPS、HMGR的相对表达量均发生明显上调，之后上调幅度缓慢降低，在第15天，DXR、FPPS、HMGR的相对表达量仍明显高于培养基对照组。说明菌株BZ-29对白术合成倍半萜内酯关键基因DXR、FPPS、HMGR的变达有着显著的促进作用。
综上，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BZ-29能够促进白术、烟草和玉米等多种植株生长，同时菌株BZ-29对白术合成倍半萜内酯关键基因DXR、FPPS、HMGR的变达有着显著的促进作用，能够促进倍半萜内酯的合成。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BZ-29，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29的保藏编号为CCTCC NO:M 20221991。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌BZ-29，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述的解淀粉芽孢杆菌BZ-29的发酵菌液。
4.权利要求3所述发酵菌液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29在培养基中进行培养，得到发酵菌液。
5.权利要求1或2所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29、权利要求3所述发酵菌液或权利要求4所述制备方法制备得到的发酵菌液在促进植物生长和/或防治病害中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物包括白术、玉米和烟草中的任一种或两种以上。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，促进植物生长包括以下(1)～(4)中的任一种或两种以上：
(1)促进植物对营养元素的吸收；
(2)促进茎的生长；
(3)促进根的伸长；
(4)提高植株的干重和鲜重。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述防治病害包括防治花生白绢病菌、水稻立枯病菌、小麦全蚀病菌、水稻纹枯病菌、小麦茎基腐病菌和油菜菌核病菌中的一种或者两种以上真菌引起的植物病害。
9.权利要求1或2所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29、权利要求3所述发酵菌液或权利要求4所述制备方法制备得到的发酵菌液在促进白术合成倍半萜内酯中的应用。
10.权利要求1或2所述解淀粉芽孢杆菌BZ-29、权利要求3所述发酵菌液或权利要求4所述制备方法制备得到的发酵菌液的使用方法，在植物种子露白期和/或植物生长至5～7叶时进行施用；施用量为1～5mL/株。
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