CN116115759B - 联合抑制nat10/kif23的物质在制备防治结直肠癌药物中的应用 - Google Patents
联合抑制nat10/kif23的物质在制备防治结直肠癌药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开一种联合抑制NAT10/KIF23的物质在制备防治结直肠癌药物中的应用，即将NAT10抑制剂和KIF23抑制剂联合应用于防治结直肠癌药物；本申请首次证实结直肠癌中NAT10对KIF23的调控关系，NAT10可通过促进KIF23mRNA稳定性进而上调KIF23的表达水平，因此联合应用NAT10抑制剂和KIF23抑制剂可协同更好地抑制肿瘤增殖能力，从而开发并验证了联合抑制NAT10/KIF23的物质在制备治疗结直肠癌药物中的新应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及联合抑制NAT10/KIF23的物质在制备治疗结直肠癌药物中的应用。
背景技术
乙酰基转移酶10(N-acetyltransferase 10,NAT10)是乙酰化过程中的重要蛋白，能够催化RNA上的胞嘧啶(C)第4位氮原子发生乙酰化。近来越来越多的研究揭示了NAT10介导的ac4C修饰与RNA剪切、出核、降解和翻译之间的密切关系。
驱动蛋白家族23(Kinesin Family Member 23,KIF23)是驱动蛋白家族的重要一员，主要负责微管稳定、解聚、细胞内核转运和细胞***。KIF23在细胞运动过程中的骨架改变和细胞***过程纺锤体的形成发挥重要作用。
目前的研究显示以上两个蛋白在不同组织、不同细胞的不同生理或病理状态下，均有着不同的作用途径及功能。它们与肿瘤发生、发展的关系并不明确。
结直肠癌是恶性程度最高的肿瘤之一，据2022年最新的世界癌症数据显示肠癌发生率位居第三，而死亡率已上升至第二。尽管在肠癌治疗方面除传统的手术切除外还有着靶向治疗及免疫治疗的涌现，但考虑到肠癌生长快、侵袭能力强等特点，迫切需要识别出潜在的分子调控网络/调控机制以改善其治疗。目前未见结直肠癌中存在NAT10/KIF23联合调控调控的报道。
发明内容
针对现有技术中的不足，本申请在首次发现NAT10/KIF23联合调控基础上，提供一种联合抑制NAT10/KIF23的物质在制备治疗结直肠癌药物中的应用。NAT10/KIF23调控关系的发现将为结直肠癌诊断和治疗提供一种新的极有价值的潜在联合靶点，通过对两个节点的联合干预可以在一定程度上影响肿瘤进展的恶性循环，达到更好地抑制肿瘤进展的作用。
具体而言，本发明所采取的技术方案是：
首先，本申请提供了一种联合抑制NAT10/KIF23的物质在制备治疗结直肠癌药物中的应用；所述联合抑制NAT10/KIF23的物质由NAT10抑制剂和KIF23抑制剂组成；所述结直肠癌包括结肠癌和直肠癌。
进一步，上述NAT10抑制剂为以NAT10蛋白或其转录本为靶序列，且能够抑制NAT10蛋白表达或基因转录的小干扰RNA、shRNA，如shNAT10(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。
上述KIF23抑制剂为以KIF23蛋白或其转录本为靶序列，且能够抑制KIF23蛋白表达或基因转录的小干扰RNA、shRNA，如shKIF23(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。
其次，本申请提供了一种联合抑制结直肠肿瘤的组合物，该组合物包括NAT10抑制剂和KIF23抑制剂。进一步而言，除NAT10抑制剂和KIF23抑制剂这两种活性成分外，该组合物还可以含有药学上可接受的赋型剂，并配置成药学领域常规的制剂，例如锭剂、胶囊剂、片剂、溶液剂、混悬剂等口服给药剂型或非口服给药制剂。
本申请首次发现NAT10能够通过调控KIF23 mRNA上的ac4C修饰水平进而上调KIF23蛋白水平，从而促进肠癌进展。因此提供了一种新的潜在的针对NAT10功能的治疗策略，即利用联合抑制NAT10/KIF23的物质(联合使用NAT10抑制剂和KIF23抑制剂)作为结直肠癌药物，治疗结直肠癌，以有效抑制肠癌增殖侵袭转移。
本申请的一个实施例通过免疫组化和qRT-PCR发现NAT10与KIF23的表达水平显著正相关。在验证NAT10及KIF23的敲低和过表达效率后，通过CCK-8、EdU、平板克隆、transwell和划痕实验发现NAT10及KIF23能够促进肠癌进展。进一步研究表面NAT10可通过结合KIF23mRNA促进其mRNA稳定性进而上调KIF23蛋白水平。进一步证明NAT10抑制剂(shNAT10)和KIF23抑制剂(shKIF23)的联合应用可协同更好地抑制肿瘤增殖能力，从而开发并验证了联合抑制NAT10/KIF23的物质在制备治疗结直肠癌药物中的新应用。
附图说明
图1为样本肿瘤组织(tumor)与正常肠组织(adjacent)的qRT-PCR检测结果；
图2为NAT10及KIF23的mRNA水平在肿瘤组织中的相关性分析结果；
图3为肠癌组织对NAT10的IHC检查结果；
图4为肠癌组织对KIF23的IHC检查结果；
图5为NAT10及KIF23的蛋白水平在肿瘤组织中的相关性分析结果；
图6为SW480和DLD-1细胞系进行NAT10敲低以及在HT-29细胞系进行NAT10过表达后的qRT-PCR及WB检测结果；
图7为SW480和DLD-1细胞系进行KIF23敲低以及在HT-29细胞系进行KIF23过表达后的qRT-PCR及WB检测结果；
图8为SW480和HT-29细胞系的CCK8检测结果；
图9为SW480和HT-29细胞平板克隆试验结果；
图10为SW480和HT-29细胞系的EdU检测结果；
图11为SW480细胞系Transwell实验和划痕实验检测结果；
图12为HT-29细胞系Transwell实验和划痕实验检测结果；
图13为SW480和HT-29细胞系RIP实验检测结果；
图14为SW480细胞系RIP实验后PCR检测结果；
图15为SW480和NAT10细胞系的qRT-PCR和WB试验结果；
图16为SW480和NAT10细胞系的qRT-PCR检测结果；
图17为SW480细胞系和HT-29细胞系的WB检测结果；
图18为裸鼠皮下成瘤实验结果；
图19为裸鼠皮下成瘤实验荷瘤体积分析结果；
图20为裸鼠皮下成瘤实验荷瘤重量分析结果。
具体实施方式
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
以下实施例中所用的组织样本来自江苏省人民医院结直肠癌手术患者，病人及家属术前被充分告知研究目的及流程，并签署知情同意书。本研究已通过本单位伦理委员会的批准。
实施例中所用的结直肠癌细胞系SW480、DLD-1和HT29均购自于中科院上海细胞库。
所用的细胞培养基配方：DMEM/F12中加入终浓度为10％胎牛血清、终浓度为1％的青霉素以及终浓度为1％链霉素。原料均购自维森特生物技术公司。
实施例中涉及的无血清培养基即为DMEM/F12培养基。
提取RNA所用TRIzol购自Invitrogen公司。
qRT-PCR所用试剂均购自南京诺为赞公司。
实施例1
一、实验方法
1.蛋白免疫印迹实验(WB)
1.1首先用去离子水清洗玻璃板，烘干，固定玻璃板，沿侧边灌入配制好的下层胶直至距上部大约2-3cm时，随后加入1ml异丙醇，静置30分钟，等下层胶完全凝固后，弃上边的异丙醇，加入已经配制好的上层胶，慢慢地将梳子***，注意避免产生气泡，静置20分钟，待上层胶凝固后轻轻拔出齿梳；
1.2将玻璃板***电泳槽，加满电泳缓冲液，在孔中依次加入marker和从直肠癌细胞样本中提取的蛋白样品。先将电压调至80V进行电泳，等待蛋白跑至分离胶后调整电压为120V继续电泳，当目的蛋白至底部时终止。按照分子量大小，裁切目的蛋白所在的部位的胶；
1.3裁剪适合大小的PVDF膜，首先经甲醇浸泡后置于切好的蛋白胶上，并置于转膜液中浸润，随后按照阳极至阴极的顺序安装好，加入转膜槽，放置冰袋，恒流转膜，250mA，在冰上转90分钟；
1.4封闭：将转好的膜放入配好的封闭液中，室温，摇床封闭2个小时后用TBST溶液清洗3次，每次5分钟。随后孵育一抗(购自abcam公司，NAT10检测使用的一抗货号：ab194297,检测KIF23使用的一抗货号为ab174304)，4℃摇床过夜；
1.5第二天用TBST溶液摇床上清洗3次，每次10分钟。室温孵育对应的二抗(购自abcam公司，货号ab6761)2小时；
1.6随后同样用TBST溶液清洗3次，每次10分钟，接着配制显影液(购自vazyme公司，货号E412-01/02)，在避光条件下放入显影仪进行曝光，保存图片。
本步骤涉及的蛋白免疫印迹实验为本领域常规检测方法。
2.于肠癌细胞中敲低或者过表达NAT10或KIF23
2.1接种细胞至70-90％汇合度时转染；
2.2使用Opti-MEM培养基(市售)稀释Lipofectamine3000试剂并充分混匀；
2.3使用Opti-MEM培养基稀释已***NAT10表达序列(其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示)、NAT10-shRNA序列(即shNAT10，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)、KIF23表达序列(其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)或KIF23-shRNA序列(即shKIF23，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)的DNA溶液，制成DNA预混液，充分混匀；
2.4每管以稀释的Lipofectamine3000试剂中加入稀释的DNA；
2.5加入DNA-脂质复合物至细胞中。
3.定量实时PCR(qPCR)实验
提取结直肠组织和细胞RNA，并利用qRT-PCR实验(本领域常规实验方法，具体可参见文献“Real-time reverse transcription PCR(qRT-PCR)and its potential use inclinical diagnosis”)进行验证NAT10和KIF23的表达量。
实验所用NAT10的上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物R核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。KIF23的上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物R核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.CCK-8实验
4.1制备细胞悬液(利用细胞培养基将肿瘤细胞重悬)，计数；
4.2在96孔板中接种细胞悬液，每孔约100μl，做3个重复；
4.3将培养板放入培养箱中预培养一段时间(37℃,5％CO2)；
4.4每孔各加入10μl CCK-8溶液；
4.5将培养板放入培养箱中孵育2小时；
4.6酶标仪测定450nm处的吸光值(OD)。
5.平板克隆实验
取转染后处于对数生长期的相对应处理组的细胞，消化计数，在6孔板中以500细胞/孔的密度接种细胞，每个处理组设3个副孔，混匀。放入培养箱培养两周，正常换液，培养液为RMPI1640。两周后弃去上清，用PBS清洗两遍，每孔加入75％酒精固定2分钟。最后吸弃酒精，用结晶紫染色20分钟，观察集落形成情况。
6.EdU实验(该实验试剂盒购自碧云天公司，货号C0075S，步骤详见试剂盒说明书)
6.1在6孔板中培养适当数量的细胞；
6.2根据试剂盒说明书配制2X的EdU工作液；
6.3将37℃预热的2X的EdU工作液(20μM)，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EdU终浓度变为1X；
6.4继续孵育细胞2小时；
6.5EdU标记细胞完成后，去除培养液，并加入1ml固定液，室温固定15分钟；
6.6去除固定液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5分钟；
6.7去除洗涤液，每孔用1ml通透液，室温孵育10-15分钟；
6.8去除通透液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞1-2次，每次3-5分钟。
7.Transwell实验
将3×104/孔转染后的细胞悬浮于200ul无血清培养基中，并接种到含有未铺(transwell迁移实验)或铺有基质胶(transwell侵袭实验)的膜的上室中，然后将完全培养基(700ul)加入下室中。培养箱中孵育48小时后，使用0.1％结晶紫染色侵入或迁移至底层膜的细胞。在显微镜下进行观察拍照，并分析结果。
8.划痕实验(wound healing)
8.1先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线；
8.2在孔中加入约5X105个细胞；
8.3第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕；
8.4用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基；
8.4放入37度5％CO2培养箱，培养。按0，24，48，72小时取样，拍照。
9.裸鼠皮下成瘤实验:
9.1从南京医科大学动物中心购买6周龄大小的雌性裸鼠，饲养于动物中心；
9.2将细胞取出，将培养液吸弃，用PBS清洗两遍后用胰酶消化细胞，将细胞转移至10ml EP管中，后放入离心机离心，离心完成后弃上层培液；
9.3用PBS重悬细胞，并计数，调整细胞终浓度为10万/100ul；
9.4在裸鼠的腋窝皮下注射100ul细胞悬液。注射细胞后每五天定期测量记录荷瘤体积；9.525天后脱颈处死裸鼠，获得小鼠肿瘤样本。拍照记录后将肿瘤样本进行保存。
10.组织芯片(TMA)免疫组化(IHC)及IHC评分
10.1水化石蜡切片：
1)按顺序放置由蜡块所得切片：二甲苯中放置15min，100％酒精中放置5min，95％酒精中放置5min，70％酒精中放置5min，最后在清水中放置5min；2)用PBS清洗一次后浸泡5min。
10.2抗原重恢复：
1)将切片放置在片架上，并将片架放入10mM柠檬酸钠溶液中(储存液为100mM，pH6.0)，沸水中蒸煮2h；
2)取出片架，自然冷却至室温，用清水清洗3次，每次5min，之后浸泡于PBS至少5min。
10.3封闭内源性过氧化酶：
1)将切片置于90ml甲醇/10ml30％H2O2中室温浸泡20min(不可超过30min)；2)PBS清洗3次，每次5min；3)用卫生纸吸去多余的PBS，并用PAP笔在组织周围画圈。
10.4封闭、一抗孵育过夜：
1)将封闭液(5％BSA+1％goat serum+0.1％Tween 20)加置组织上，封闭至少1h；2)用封闭液稀释一抗(购自abcam公司，NAT10检测使用的一抗货号为ab194297,KIF23检测使用的一抗货号为ab235955)；3)吸去组织上的封闭液，并将稀释的一抗加置组织上，4℃过夜。
10.5二抗、DAB显色：
1)洗去一抗；2)用PBS清洗3次，每次5min；3)用封闭液稀释二抗(购自碧云天公司，货号A0277)(生物素标记，1：1000体积比稀释)，室温孵育1h；4)用PBS清洗切片3次，每次5min；5)配制ABC试剂(含亲和素)(购自赛默飞公司，货号PK-4000,详见试剂盒说明书)：在2.5ml PBS中加入一滴试剂A，混匀，再加入一滴试剂B，混匀，室温静置30min；6)将ABC试剂加至组织切片上，室温孵育30min；7)PBS清洗3次，每次5min；8)准备DAB试剂：2.5ml蒸馏水中加入1滴DAB Buffer，混匀，再加入2滴DAB，混匀，最后加入一滴H2O2，混匀后待用；9)将DAB试剂加至组织切片上，检测DAB反应，适当反应后将切片浸浴于清水中以终止反应。
10.6反染切片：
1)将切片置入苏木精4.5min；2)清水中浸3次；3)换掉清水，再浸5次；4)将切片放入bluing试剂中1min；5)清水中浸10次；6)100％酒精中浸20次；7)二甲苯中浸15次；8)二甲苯中浸泡15-20min；9)用盖玻片封片。
按常规评价标准进行免疫组化评分(H-score)，即染色强度(i)和染色区域(pi)的乘积。染色强度的分数定为：阴性0分；弱1分；中等2分；强阳性3分。
H-score＝∑(pi×i)；
该评价方法为本领域常规方法，具体可参照文献“Fallopian tube epithelialcells express androgen receptor and have a distinct hormonal responsivenesswhen compared with endometrial epithelium”所公开的内容。
11.RNA免疫沉淀(RIP)
使用RIP试剂盒，购自吉赛生物公司，货号No.P0101,检测方法详见试剂盒说明书本实施例所使用的RIP抗体购自abcam公司(货号ab194297，ab252215)。
二、实验结果
1、NAT10与KIF23表达水平显著正相关
样本肿瘤组织(tumor)与正常肠组织(adjacent)的qRT-PCR检测结果如图1所示。其中,A为样本肿瘤组织(tumor)与正常肠组织(adjacent)中
NAT10的qRT-PCR检测结果；B为样本肿瘤组织(tumor)与正常肠组织(adjacent)中KIF23的qRT-PCR检测结果，由图1可见，NAT10及KIF23的mRNA水平相较于正常肠组织，于肿瘤组织中的表达水平显著更高。
图2为依据图1中的NAT10及KIF23的mRNA水平在肿瘤组织中的相关性分析结果，显示了NAT10与KIF23的mRNA水平于肠癌组织中显著正相关。
图3为肠癌组织对NAT10的IHC检查结果，其中A为染色结果，B为NAT10染色的评分结果。图4为肠癌组织对KIF23的IHC检查结果，其中A为染色结果，B为KIF23染色的评分结果。由图3和图4可见，对染色的评分进行分析后说明了NAT10及KIF23的蛋白水平相较于正常肠组织，于肿瘤组织中的表达水平显著更高。
图5为依据图3和图4和中的NAT10及KIF23的蛋白水平进行两者在肿瘤组织中的相关性分析结果。图5分析结果说明NAT10与KIF23的蛋白水平于肠癌组织中显著正相关。
以上qRT-PCR及IHC结果显示NAT10及KIF23在mRNA水平及蛋白水平均显著正相关。
2、NAT10及KIF23的敲低过和表达效率验证
在SW480和DLD-1两个肠癌细胞系进行NAT10敲低以及在HT-29细胞系进行NAT10过表达后的qRT-PCR及WB结果如图6所示。其中，A为SW48肠癌细胞系进行NAT10敲低后的qRT-PCR检测结果；B为DLD-1肠癌细胞系进行NAT10敲低后的qRT-PCR检测结果；C为HT-29细胞系进行NAT10过表达后的qRT-PCR检测结果；D为对应的SW48肠癌细胞系进行NAT10敲低后的WB检测结果；E为对应的DLD-1肠癌细胞系进行NAT10敲低后的WB检测结果；F为对应的HT-29细胞系进行NAT10过表达后的WB检测结果。图6检测结果说明了NAT10的mRNA及蛋白水平在SW480和DLD-1中可被显著成功敲低，在HT-29中可被显著成功过表达。
在SW480和DLD-1两个肠癌细胞系进行KIF23敲低以及在HT-29细胞系进行KIF23过表达后的qRT-PCR及WB结果如图7所示。其中，A为SW480和DLD-1两个肠癌细胞系进行KIF23敲低后的qRT-PCR检测结果；B为对应的SW480和DLD-1两个肠癌细胞系进行KIF23敲低后的WB检测结果；C为HT-29细胞系进行KIF23过表达后的qRT-PCR检测结果；D为对应的HT-29细胞系进行KIF23过表达后的WB检测结果。由图7可见，KIF23的mRNA及蛋白水平在SW480和DLD-1中可被显著成功敲低，在HT-29中可被显著成功过表达。
以上qRT-PCR和WB检测结果显示NAT10及KIF23的表达水平可显著被shRNA降低。
3、NAT10及KIF23促进肠癌细胞增殖迁移侵袭
对SW480和HT-29细胞系进行CCK8检测，其结果如图8所示。其中，A为SW480细胞系分别在未处理NAT10(shControl)、敲低NAT10(shNAT10-2)、敲低NAT10并未处理KIF23(shNAT10-2+oeVector)、敲低NAT10并过表达KIF23(shNAT10-2+oeKIF23)状态下的CCK8检测结果；B为HT-29细胞系分别在未处理NAT10(oeVector)、过表达NAT10(oeNAT10)、过表达NAT10并未处理KIF23(oeNAT10+shControl)、过表达NAT10并敲低KIF23状态下(oeNAT10+shKIF23-2)的CCK8检测结果。
对SW480和HT-29细胞平板克隆试验的结果如图9所示。其中，A为SW480细胞系分别在未处理NAT10(shControl)、敲低NAT10(shNAT10-2)、敲低NAT10并未处理KIF23(shNAT10-2+oeVector)、敲低NAT10并过表达KIF23(shNAT10-2+oeKIF23)状态下的平板克隆实验照片；B为HT-29细胞系分别在未处理NAT10(oeVector)、过表达NAT10(oeNAT10)、过表达NAT10并未处理KIF23(oeNAT10+shControl)、过表达NAT10并敲低KIF23(oeNAT10+shKIF23-2)状态下的平板克隆实验照片；C为对SW480细胞系平板克隆的计数结果分析结果；D为对HT-29细胞系平板克隆的计数结果分析。
SW480和HT-29细胞系的EdU检测结果如图10所示。其中，A为SW480细胞系分别在未处理NAT10(shControl)、敲低NAT10(shNAT10-2)、敲低NAT10并未处理KIF23(shNAT10-2+oeVector)、敲低NAT10并过表达KIF23(shNAT10-2+oeKIF23)状态下的EdU实验检测结果；B为对SW480细胞系系内EdU细胞阳性比例的计数分析结果；C为HT-29细胞系分别在未处理NAT10(oeVector)、过表达NAT10(oeNAT10)、过表达NAT10并未处理KIF23(oeNAT10+shControl)、过表达NAT10并敲低KIF23(oeNAT10+shKIF23-2)状态下的EdU实验检测结果；D为HT-29细胞系内EdU细胞阳性比例的计数分析结果。
由图8-10的CCK-8、平板克隆及EdU检测三个实验均说明了肠癌细胞的细胞增殖能力在敲低NAT10后会被显著抑制，进一步过表达KIF23后促肿瘤作用得以显著恢复，而在过表达NAT10后肿瘤细胞增殖能力显著进一步增强，进一步敲低KIF23后促肿瘤作用显著被抑制。
SW480细胞系Transwell实验和划痕实验检测结果如图11所示，其中A为SW480细胞系分别在未处理NAT10(shControl)、敲低NAT10(shNAT10-2)、敲低NAT10并未处理KIF23(shNAT10-2+oeVector)、敲低NAT10并过表达KIF23(shNAT10-2+oeKIF23)状态下的Transwell实验迁移实验结果；B为SW480细胞系分别在未处理NAT10(shControl)、敲低NAT10(shNAT10-2)、敲低NAT10并未处理KIF23(shNAT10-2+oeVector)、敲低NAT10并过表达KIF23(shNAT10-2+oeKIF23)状态下的Transwell实验侵袭实验结果；C为SW480细胞系分别在未处理NAT10(shControl)、敲低NAT10(shNAT10-2)、敲低NAT10并未处理KIF23(shNAT10-2+oeVector)、敲低NAT10并过表达KIF23(shNAT10-2+oeKIF23)状态下的0H划痕实验照片；D为SW480细胞系分别在未处理NAT10(shControl)、敲低NAT10(shNAT10-2)、敲低NAT10并未处理KIF23(shNAT10-2+oeVector)、敲低NAT10并过表达KIF23(shNAT10-2+oeKIF23)状态下的72H划痕实验镜检照片；E为SW480细胞系迁移侵袭实验细胞数量统计结果，F为SW480细胞系细胞迁移率统计结果。
HT-29细胞系Transwell实验和划痕实验检测结果如图12所示。其中，A为HT-29细胞系分别在未处理NAT10(oeVector)、过表达NAT10(oeNAT10)、过表达NAT10并未处理KIF23(oeNAT10+shControl)、过表达NAT10并敲低KIF23(oeNAT10+shKIF23-2)状态下的Transwell实验迁移实验结果；B为HT-29细胞系分别在未处理NAT10(oeVector)、过表达NAT10(oeNAT10)、过表达NAT10并未处理KIF23(oeNAT10+shControl)、过表达NAT10并敲低KIF23(oeNAT10+shKIF23-2)状态下的Transwell实验侵袭实验结果；C为HT-29细胞系分别在未处理NAT10(oeVector)、过表达NAT10(oeNAT10)、过表达NAT10并未处理KIF23(oeNAT10+shControl)、过表达NAT10并敲低KIF23(oeNAT10+shKIF23-2)状态下0H划痕实验照片；D为HT-29细胞系分别在未处理NAT10(oeVector)、过表达NAT10(oeNAT10)、过表达NAT10并未处理KIF23(oeNAT10+shControl)、过表达NAT10并敲低KIF23(oeNAT10+shKIF23-2)状态下的72H划痕实验镜检照片；E为HT-29细胞系迁移侵袭实验细胞数量统计结果；F为HT-29细胞系迁移率统计结果。
图11和图12的Transwell和划痕实验结果均说明了肠癌细胞的迁移侵袭能力在敲低NAT10后会被显著抑制，进一步过表达KIF23后促肿瘤细胞迁移侵袭作用得以显著恢复，而在过表达NAT10后肿瘤细胞迁移侵袭能力显著进一步增强，进一步敲低KIF23后促肿瘤迁移侵袭作用被显著抑制。
以上实验结果显示NAT10可促进肠癌细胞增殖，且该促进作用可被KIF23的敲低所抑制；Transwell及划痕实验结果显示NAT10可促进肠癌细胞的迁移侵袭，且该促进作用可被KIF23的敲低所抑制。
4、NAT10调控KIF23 mRNA稳定性进而促进KIF23蛋白水平上调
SW480和HT-29两个细胞系RIP实验检测结果如图13所示。其中，A为SW480和HT-29细胞系RIP后的PCR结果；B为SW480和HT-29细胞系RIP验证成功的WB试验检测结果；C为SW480和HT-29细胞系使用ac4C抗体RIP后的PCR结果。图13说明NAT10蛋白在SW480及HT-29两种肠癌细胞系中均可结合KIF23 mRNA，且KIF23 mRNA上确实存在ac4c修饰。
SW480细胞系RIP实验后PCR检测结果如图14所示。其中，A为SW480细胞系分别在未处理NAT10(shControl)、敲低NAT10(shNAT10-1)、敲低NAT10(shNAT10-2)后进行RIP实验后的PCR结果；B为HT-29细胞系在未处理NAT10(oeVector)、过表达NAT10(oeNAT10)后进行RIP实验后的PCR结果；C为在SW480细胞系分别在未处理NAT10(shControl)、敲低NAT10(shNAT10-1)、敲低NAT10(shNAT10-2)后使用ac4C抗体进行RIP实验后的PCR结果；D为HT-29细胞系在未处理NAT10(oeVector)、过表达NAT10(oeNAT10)后使用ac4C抗体进行RIP实验后的PCR结果。图14试验结果说明KIF23 mRNA上的ac4C修饰及其自身与NAT10蛋白的结合受NAT10调控：NAT10敲低后NAT10蛋白结合的KIF23 mRNA显著减少，KIF23 mRNA上存在的ac4C修饰显著减少，NAT10过表达后NAT10蛋白结合的KIF23 mRNA显著增多，KIF23 mRNA上存在的ac4C修饰显著增多。
图15为SW480和NAT10细胞系的qRT-PCR和WB试验结果。其中，A为在SW480细胞系中未处理NAT10(shControl)、敲低NAT10(shNAT10-1)、敲低NAT10(shNAT10-2)后的相关mRNAqRT-PCR试验结果；B为在SW480细胞系中未处理NAT10(shControl)、敲低NAT10(shNAT10-1)、敲低NAT10(shNAT10-2)后的NAT10和KIF23蛋白WB试验结果；C为在HT-29细胞系中未处理NAT10(oeVector)、过表达NAT10(oeNAT10)后相关mRNA的qRT-PCR试验结果；D为在HT-29细胞系中未处理NAT10(oeVector)、过表达NAT10(oeNAT10)后的NAT10和KIF23的蛋白WB试验结果。图15试验结果说明敲低NAT10后KIF23的mRNA及蛋白水平同样降低，过表达NAT10后KIF23的mRNA及蛋白水平同样升高。
图16为SW480和NAT10细胞系的qRT-PCR检测结果，其中，A为SW480细胞系未处理NAT10(shControl)、敲低NAT10(shNAT10-1)、敲低NAT10(shNAT10-2)后的qRT-PCR(KIF23mRNA的稳定性)检测结果；B为HT-29细胞系中未处理NAT10(oeVector)、过表达NAT10(oeNAT10)后的qRT-PCR(KIF23 mRNA的稳定性)检测结果。可见敲低NAT10后的KIF23 mRNA的稳定性显著下降，过表达NAT10后KIF23 mRNA的稳定性显著升高。
图17为SW480细胞系和HT-29细胞系的WB检测结果。其中，A为SW480细胞系未处理NAT10(shControl)、敲低NAT10(shNAT10-2)后的WB检测结果；B为SW480细胞系未处理NAT10(oeVector)、过表达NAT10(oeNAT10)后的WB检测结果。实验结果说明不论敲低或过表达NAT10，KIF23蛋白的稳定性无显著变化。
以上实验结果证明NAT10可通过结合KIF23 mRNA以调控其mRNA上的ac4C修饰进而促进其RNA稳定性进而上调KIF23蛋白水平。
5、NAT10抑制剂(shNAT10)和KIF23抑制剂(shKIF23)的联合应用可协同抑制肿瘤增殖能力
分别将无处理(shControl)、敲低NAT10(shNAT10)、敲低KIF23(shKIF23)、同时敲低NAT10和KIF23的肠癌细胞(shNAT10+shKIF23)注入裸鼠皮下进行成瘤实验，每个处理重复4次。其结果如图18所示。图18展现的成瘤结果说明了NAT10抑制剂(shNAT10)和KIF23抑制剂(shKIF23)的联合应用可显著协同抑制小鼠皮下荷瘤的增殖能力。
图19为裸鼠皮下成瘤实验中无处理(shControl)、敲低NAT10(shNAT10)、敲低KIF23(shKIF23)、同时敲低NAT10和KIF23的肠癌细胞(shNAT10+shKIF23)的荷瘤体积分析结果。
图20为裸鼠皮下成瘤实验中无处理(shControl)、敲低NAT10(shNAT10)、敲低KIF23(shKIF23)、同时敲低NAT10和KIF23的肠癌细胞(shNAT10+shKIF23)的荷瘤重量分析结果。
图19显示同时敲低NAT10和KIF23后的肠癌细胞在裸鼠皮下的荷瘤体积增长显著更慢更小，图20显示同时敲低NAT10和KIF23后的肠癌细胞在裸鼠皮下的荷瘤重量显著最轻。
图18-20的实验结果说明NAT10抑制剂(shNAT10)和KIF23抑制剂(shKIF23)的联合应用可协同抑制小鼠皮下荷瘤的增殖能力。
以上试验结果证明，可以将NAT10抑制剂，即以NAT10蛋白或其转录本为靶序列，且能够抑制NAT10蛋白表达或基因转录的小干扰RNA或shRNA(如shNAT10)和KIF23抑制剂，即以KIF23蛋白或其转录本为靶序列，且能够抑制KIF23蛋白表达或基因转录的小干扰RNA或shRNA(如shKIF23)联合应用，共同作为防治结直肠癌药物的活性成分，应用于结直肠癌治疗。
以上所述仅是本发明的优选实施方法，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种联合抑制NAT10/KIF23的物质在制备防治结直肠癌药物中的应用，所述联合抑制NAT10/KIF23的物质由NAT10抑制剂和KIF23抑制剂组成；所述结直肠癌包括结肠癌和直肠癌；所述NAT10抑制剂为核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示的shNAT10；所述KIF23抑制剂为核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的shKIF23。
2. 一种抑制结直肠肿瘤的组合物，其特征在于，所述组合物包括NAT10抑制剂和KIF23抑制剂；所述NAT10抑制剂为核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示的shNAT10；所述KIF23抑制剂为核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的shKIF23。
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| Aberrant KIF23 expression is associated with adverse clinical outcome and promotes cellular malignant behavior through the Wnt/β-catenin signaling pathway in Colorectal Cancer;Zhiyu Ji等;Journal of Cancer;20210202;第12卷(第7期);第2030-2040页 * |
| GSK-3b–Regulated N-Acetyltransferase 10 Is Involved in Colorectal Cancer Invasion;Hong Zhang等;Clin Cancer Res;20140901;第20卷(第17期);第4717-4729页 * |
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