CN116098201B - 营养组合物在改善骨密度和骨代谢中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种营养组合物在改善骨密度和骨代谢中的应用，所述组合物包括：i）N‑乙酰神经氨酸类物质，ii）透明质酸盐；其中，所述组合物中N‑乙酰神经氨酸类物质与透明质酸盐的用量比为大于1:4，并且，所述组合物任选地也包括其它营养成分。
Description
技术领域
本发明属于食品领域，涉及一种营养组合物的应用，更具体的，涉及一种保健或营养组合物在改善骨密度和骨代谢中的应用。
背景技术
骨是一种高活性***，可以通过骨代谢及骨重塑来修复自身微损伤，保持骨结构、荷载及钙含量的内稳态平衡，同时骨也作为内分泌器官调控代谢过程，是维持人体生命的重要器官。骨包含细胞外蛋白基质（类骨质），其中散布着骨细胞，且由钙盐和其它矿物质组成的矿物质成分位于细胞外基质内。骨经历重吸收过程的重塑，在这种情况下骨通过破骨细胞降解然后被成骨细胞所取代（再形成）。重塑的发生调节钙的体内平衡、修复日常应力损伤的骨、以及生长或机械应力模式变化时使骨成形。破骨细胞使特定区域内的骨降解然后经历细胞凋亡。成骨细胞重建新骨而且介导它的再矿化作用。在再矿化作用期间，一些成骨细胞被包在钙化物质内然后变成骨细胞。骨质疏松症是一种全身性骨代谢病，由多种因素引起，其特点是骨量、骨密度和骨组织的显微结构恶化，骨脆性增强和易发生骨折。骨质疏松症已严重威胁人类健康，最终将导致患者日常活动减少，生活质量降低，死亡率增加。
已知的是，N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）作为最常见的唾液酸的一种，是具有9个碳原子骨架的氨基单糖衍生物，其广泛存在于哺乳动物组织中，主要以低聚糖、糖蛋白或糖脂等结合的形式或游离态存在。人类以脑组织和母乳中Neu5Ac含量较为丰富，母乳中Neu5Ac水平为0.25~1.50g/L，此外，其还存在于奶及奶制品、畜肉类、鸡蛋等食品中。近年N-乙酰神经氨酸已被证明对体内多种生物学功能具有重要意义，现代医学认为N-乙酰神经氨酸和多种疾病有关，如肿瘤、癌症、冠心病、糖尿病等。以N-乙酰神经氨酸作为原料开发的一系列重要糖药物，在抗病毒、抗肿瘤、抗炎症、治疗老年性痴呆症上均有非常好的效果。此外，多国中，N-乙酰神经氨酸获批为新食品原料，未规定不适宜人群，可用于乳制品中。
透明质酸及其盐是广泛存在于人体内的生理活性物质，对人体的生理功能具有调节作用。透明质酸钠（Sodium Hyaluronate，SH）是透明质酸（Hyaluronic Acid，HA）的钠盐形式，构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节滑液等***的主要成分。以N-乙酰氨基葡糖与D-葡糖醛酸构成的二糖单元为基本单位，不断重复构成线性多糖。线性多糖链不断弯曲缠绕，形成不规则线性分子构型。每一个HA分子都由25-10000个双糖单元组成，HA分子量范围为10000～4000000。关节滑液中的透明质酸钠具有高度的黏弹性，对关节软骨起着减震和润滑的保护作用，同时可以在关节软骨表面形成保护屏障。关节软骨是由包含有透明质酸钠的蛋白多糖等物质构成，透明质酸钠赋予软骨特殊的多孔性和弹性，在维持软骨组织的完整性上起重要作用。此外，透明质酸钠也在多国获批为新资源食品，可应用于乳及乳制品中。
虽然一些实验结果显示透明质酸盐具有促进关节/骨骼健康的功效，但有关二者在食品等中的应用的研究并不充分；且针对N-乙酰神经氨酸的功能的研究主要集中在改善大脑发育、延缓皮肤老化、抗病毒等，例如：
引用文献1公开了一种含透明质酸钠的组合物及其制备方法，透明质酸钠复配作为主要组分，配合氨基酸、维生素、矿物元素及其络合物、蛋白质、葡萄糖胺、硫酸软骨素钠等，使得所述组合物集补钙和关节保护为一体，对关节炎、关节运动受损有良好的预防作用，同时还能促进发育、增强骨密度，提高骨骼的韧性和硬度。
引用文献2公开了一种N-乙酰神经氨酸单体、N-乙酰神经氨酸水合物或N-乙酰神经氨酸盐在个人护理用品中的应用，该文献利用N-乙酰神经氨酸的抑菌、促进细胞修复等的功效，将其应用于牙膏、漱口水、滴眼液、沐浴露等个人护理用品中。
引用文献3公开了一种大肠杆菌发酵来源的N-乙酰神经氨酸在食品中的应用，其中N-乙酰神经氨酸以N-乙酰神经氨酸单体、N-乙酰神经氨酸水合物或N-乙酰神经氨酸盐的形式存在，其安全无毒，在人体内有自身的代谢途径，具有参与细胞膜功能，有抗病毒和促进神经发育的功能。
引用文献4公开了一种美白抗衰老药物及生产方法，其主要通过谷胱甘肽与葫芦巴粉以及L-半胱氨酸干预皮肤黑色素的形成，通过胶原蛋白肽与月见草萃取物以及红藻粉有助于延缓皮肤的老化，其配方还包括大豆卵磷脂、脱氢异雄酮、透明质酸钠、N-乙酰神经氨酸以及添加剂等，其中，透明质酸钠的质量配比为5.5%~6.5%，N-乙酰神经氨酸的质量配比为2%~4%。
尽管进行了上述研究，但从开发一种新的对人体骨骼健康和骨骼发育有益的，尤其是有助于改善骨密度和骨代谢，增加血液中磷、骨骼中钙的吸收的食品的应用而言，仍然具有进一步研究和开发的空间。
引用文献：
引用文献1：CN109965104A
引用文献2：CN104586642A
引用文献3：CN104996986A
引用文献4：CN114470175A
发明内容
发明要解决的问题
如前所述，本领域中已经提出了透明质酸钠具有改善骨密度、保护骨关节、预防骨质疏松等作用；也提出了N-乙酰神经氨酸在抑菌、抗病毒、促进神经发育等方面的功效，虽然引用文献4同时使用了透明质酸钠、N-乙酰神经氨酸作为药物配方中的一部分，但其作用主要体现在延缓皮肤老化上，且二者均没有被作为主要成分，此外还添加了多种其他成分。因此，现有技术中对于N-乙酰神经氨酸与透明质酸盐之间是否存在协同效应，或者在哪方面具有协同效应，尤其是对于促进骨骼健康是否存在协同效应，有待进一步的研究。
进一步，虽然对于N-乙酰神经氨酸而言现有技术中并未提出其对骨骼发育与骨骼健康的积极影响，但本发明已经意外的发现，N-乙酰神经氨酸类物质与透明质酸盐组合使用时，证实了二者能够协同的改善骨密度和骨代谢，增加血液中磷、骨骼中钙的吸收，从而能够改善骨骼发育，有助于维护骨骼健康。
因此，针对现有技术中的上述研究状况，本发明所要解决的技术问题在于提供一种组成简单的、非药物类的营养组合物在改善骨密度和骨代谢方面的应用，该组合物包括N-乙酰神经氨酸类物质与透明质酸盐；当二者配合使用时，在改善骨密度和骨代谢方面能够获得协同增效作用。例如，二者在一定用量的配合下，能够意外的得到血清中的磷元素、骨钙素的含量以及骨骼中钙的含量显著增加，骨密度、骨小梁相对体积显著增加，血清中碱性磷酸酶水平降低等的作用，表明其对于骨质疏松的人群，有助于改善骨密度和骨代谢，针对健康人群以及处在生长发育中的青少年等，有助于骨骼健康生长，对于成年人，尤其是中老年人，可以预防骨质疏松等。
用于解决问题的方案
通过本发明发明人长期的研究，发现通过以下的技术方案能够解决上述技术问题：
[1]. 一种营养组合物在制备用于改善骨密度和骨代谢的可食用产品中的用途，其中，所述组合物包括：
i）N-乙酰神经氨酸类物质，
ii）透明质酸盐；
其中，所述组合物中N-乙酰神经氨酸类物质与透明质酸盐的用量比为大于1:4；并且，所述组合物任选地也包括其它营养成分。
[2]. 根据[1]所述的用途，其中，所述N-乙酰神经氨酸类物质以N-乙酰神经氨酸无水物、N-乙酰神经氨酸水合物或N-乙酰神经氨酸盐中的一种或多种形式存在。
[3]. 根据[1]或[2]所述的用途，其中，所述组合物中，所述N-乙酰神经氨酸类物质与所述透明质酸盐的用量比为5：1以下。
[4]. 根据[1]或[2]所述的用途，其中，所述N-乙酰神经氨酸类物质选自来源于天然原料提取物、化学合成、酶催化或者微生物发酵液中的一种或多种；所述透明质酸盐选自来源于动物提取物、化学合成或者人工发酵液中的一种或多种。
[5]. 根据[1]或[2]所述的用途，其中，以组合物的总质量计，所述N-乙酰神经氨酸类物质的含量为0.04质量%以上；所述透明质酸盐的含量为0.01质量%以上。
[6]. 根据[1]或[2]所述的用途，其中，所述N-乙酰神经氨酸类物质与所述透明质酸盐的用量比为1:2至2:1。
[7]. 根据[1]或[2]所述的用途，其中，所述其它营养成分包括蛋白质、维生素、单糖、多糖或植物提取物中的一种或多种；所述组合物为液体、半固体或固体。
[8]. 根据[1]或[2]所述的用途，其中，所述可食用产品包括乳制品，并且，所述乳制品包括儿童乳粉制品、孕产妇、中老年乳粉制品。
发明的效果
通过上述技术方案的实施，本发明具有如下优势以及能够获得如下的技术效果：
1）本发明的组合物首次提出通过将N-乙酰神经氨酸类物质与透明质酸盐，尤其是透明质酸钠复配，能够在改善骨密度和骨代谢方面得到协同增效作用；
2）本发明提供营养组合物在制备用于改善骨密度和骨代谢中的应用，该营养组合物组成简单明确，更有利于方便的复配，也更有利于便利地添加或制备各种食品，有利于根据实际应用需求，调整工艺和辅料成分，加工成各类食品，尤其适用于包括中老年乳粉制品在内的可冲调食品；
3）本发明的组合物中的N-乙酰神经氨酸类物质与透明质酸盐均在安全用量范围内，因此可以长期使用，同时适用于各种不特定的人群。
具体实施方式
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是：
本说明书中，使用“数值A~数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，使用“以上”或“以下”表示的数值范围是指包含本数的数值范围。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，使用“任选”或“任选的”表示某些物质、组分、执行步骤、施加条件等因素使用或者不使用。
本说明书中，所使用的“儿童”表示年龄大于3岁，且小于18岁或年龄大于18岁，但仍处于生长发育期的人类生活群体。
本说明书中，所使用的“中老年”表示年龄在45岁以上的人类群体。
本说明书中，所使用的“室温”表示“23±2℃”的室内环境温度。
本说明书中，所使用的单位名称均为国际标准单位名称，并且如果没有特别声明，所使用的“%”均表示重量或质量百分含量。
本说明书中，使用“基本上”表示与理论模型或理论数据的标准偏差在5%、优选为3%、更优选为1%范围以内。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素（例如，特征、结构、性质和/或特性）包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。本发明提供了一种包括：i）N-乙酰神经氨酸类物质和ii）透明质酸盐的营养组合物在制备用于改善骨密度和骨代谢的可食用产品中的用途，并且该组合物任选地也包括其它营养成分，该组合物表现出了明显的协同增效作用，其具有如下的一种或多种的功能或效果：能够显著增加血清中的磷元素、骨钙素以及骨骼中钙的含量，显著增加骨密度、骨小梁相对体积、以及能够降低血清中碱性磷酸酶水平等，有助于改善骨密度和骨代谢，对人体的骨骼健康有正向的辅助保护作用。
本发明的技术方案主要是基于如下见解得到：
本发明通过动物实验，研究了N-乙酰神经氨酸类物质和透明质酸盐按照一定比例进行复配得到的组合物的应用，基于该组合物的使用对大鼠血清以及骨骼中的相关指标的影响，意外的发现二者复配形成的营养组合物的使用，能够改善骨密度和骨代谢、增加血液中磷以及骨骼中钙的吸收，以及在辅助保护骨骼健康等方面产生了明显的协同增效的作用。
（N-乙酰神经氨酸类物质）
本发明中，N-乙酰神经氨酸类物质作为必要组分而使用。
N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）又称为唾液酸，是酸性糖神经氨酸的乙酰化衍生物，在生物识别、细胞免疫和疾病方面具有重要作用，是唾液酸化人乳低聚糖（唾液酸化HMOs或唾液酸乳糖）的最重要单体之一。各国已经广泛批准Neu5Ac为新食品原料，允许其作为食品原料使用，推荐食用量为≤500毫克/天，并且未规定不适宜人群。
本发明对于N-乙酰神经氨酸类物质的生产方法及来源没有特别限制，可以选自来源于天然原料提取物、化学合成、酶催化、微生物发酵液等中的一种或多种。对于来源于天然原料提取物，可以列举的为：从燕窝、酪蛋白、鸡蛋、牛奶、血浆等天然原料中提取；对于化学合成的生产方法，可以列举的为：以N-乙酰甘露糖胺作为出发物质，可以在碱催化下脱羧形成N-乙酰神经氨酸，也可以在酸性醇溶液中经过铟催化和臭氧分解得到；对于酶催化法，可以列举的为：通过N-乙酰神经氨酸醛缩酶催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸钠转化为N-乙酰神经氨酸等；对于来源于微生物发酵液，可以列举的为：以食品级葡萄糖和玉米浆为原料，经大肠埃希氏菌（菌株号SA-8）发酵、过滤、灭菌、水解、提纯等工艺制备等。在本发明一些具体的实施方式中，N-乙酰神经氨酸可以自行制备，也可以通过商购获得。
对于N-乙酰神经氨酸类物质的存在或使用形式，本发明没有特别限制，可以以N-乙酰神经氨酸无水物、N-乙酰神经氨酸水合物或N-乙酰神经氨酸盐中的一种或多种形式存在。其中，N-乙酰神经氨酸水合物可以为N-乙酰神经氨酸二水合物，其与N-乙酰神经氨酸水合物的生物学功效基本一致，二者除了在固体状态下由于结晶水存在少许不同，在液体状态下由于二水合物两个结晶水与N-乙酰神经氨酸连接的氢键断裂，使得二者性质相同。另外也可以使用N-乙酰神经氨酸盐形式，可以列举的为N-乙酰神经氨酸钠盐、N-乙酰神经氨酸钾盐或N-乙酰神经氨酸铵盐等。对于N-乙酰神经氨酸盐的制备方法，本发明没有限制，可以为向pH为3.0~9.0的含钠、钾或铵的N-乙酰神经氨酸水溶液中加入酮类或醇类组成的溶剂，最终析出晶体。
在本发明一些优选的实施方式中，N-乙酰神经氨酸类物质可以直接使用，也可以制成水溶液使用，或在其他食品类制品可接受的溶剂的辅助下使用。
（透明质酸盐）
本发明中，透明质酸盐作为必要组分与上述N-乙酰神经氨酸类物质进行复配以实现本发明的技术效果。其中，对于透明质酸盐的种类原则上没有特别限制，可以使用通常的透明质酸的金属盐或多种金属盐的混合物，优选地，可以使用透明质酸的碱金属盐，例如钠盐（以下也简称透明质酸钠）。
透明质酸钠又被称为玻璃酸钠，其干燥品为白色颗粒或粉末，无臭味。其是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖双糖单元构成的糖胺聚糖的钠盐，是一种直链大分子多糖。一些国家或地区已经批准透明质酸钠为新食品原料，例如，推荐食用量≤200毫克/天。透明质酸钠可溶于水，在水中形成一种稠粘弹性的溶液，具有生理酸碱度及离子强度。其分子形态可变，属于非药物类的中性介质。
本发明中对于透明质酸钠的来源没有特别限制，可以是以葡萄糖、酵母粉、蛋白胨等为培养基，由马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus）经发酵生产而成，也可通过鸡冠的发酵液人工提取。由于透明质酸普遍存在于动物和人体内，如皮肤、肌肉、软骨、脑、鸡冠、动脉和静脉壁等。因此，常用提取原料有雄鸡冠、脐带、牛眼等。
进一步，本发明中对于透明质酸钠的使用方式没有特别限制，优选地，可以将其制备为水溶液使用。
（协同增效）
如上述现有技术中，对于透明质酸盐已经确认了其具有辅助保护骨关节、对关节软骨起着减震和润滑等功效，而对于N-乙酰神经氨酸类物质，鉴于其明确的生物活性机理，其可验证的功效主要在于调节神经***的发育、有利于大脑功能的维持、抗肿瘤以及美白功效等。
而本发明首次发现了当二者进行复配时，所得到的营养性组合物能够起到协同的改善骨骼健康状况，增加血液中磷、骨骼中钙的吸收，特别有助于协同的改善骨密度和骨代谢等。
从改善骨密度和骨代谢功效良好的方面考虑，在本发明一些优选的实施方案中，N-乙酰神经氨酸类物质和透明质酸盐的用量比以质量计可以为大于1:4，优选为1:3以上，更优选为1:2以上，最优选为1:1以上，例如，（1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9等）：1以上。另外，对于该比例的上限，可以在5:1以下，优选为4:1以下或者3.5:1以下，更优选为3:1以下，例如，（2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1等）：1以下。
通过上述含量的匹配，可以降低透明质酸盐的使用量，在N-乙酰神经氨酸类物质的配合下，相对较低的透明质酸盐的用量也能表现出改善骨密度和骨代谢，增加血液中磷、骨骼中钙的吸收的功效。
（组合物）
本发明的营养组合物至少包括了上文所描述的N-乙酰神经氨酸类物质和透明质酸盐。对于组合物的形成方式，没有特别的限定，可以由上文所述的包含这些成分的提取物、人工发酵、化学合成的这些成分等混合而成，也可以是将高纯度的两种提取物进行混合。
此外，对于本发明的组合物中还可以使用的其他组分或其它营养成分，没有特别限定，在不损害本发明效果的前提下，可以使用本领域常用的其他可食用成分、食品添加剂或溶剂组分等，其它营养成分包括蛋白质、维生素、单糖、多糖或植物提取物中的一种或多种。
本发明的营养组合物可以为液态方式存在，也可以为半固态或固态方式而存在。
进一步，本发明的上述组合物通过动物实验验证，能够显著增加血清中的磷元素、骨钙素以及骨骼中钙的含量，显著增加骨密度、骨小梁相对体积，以及能够降低血清中碱性磷酸酶水平等，有助于改善骨密度和骨代谢，对人体的骨骼健康有正向的辅助保护作用。因此，可以应用在一种功能性保健品或功能性保健添加物中而被使用（食用）。
此外，本发明提供的营养组合物的用途中，N-乙酰神经氨酸类物质和透明质酸盐的用量（尤其是最高用量）在原则上没有限制。但考虑到不同食品类型以及针对不同食品类型的功能性物质的添加量的食品安全法律法规，因此，在一些具体的实施方案中，以组合物的总质量计，从保证协同效果以及用量安全性的角度考虑，所述N-乙酰神经氨酸类物质的含量可以为0.04质量%以上，优选为0.08质量%以上、0.1质量%以上、0.15质量%以上、0.20质量%以上等，更进一步优选为0.25质量%以上，并且为1质量%以下，优选为0.95质量%以下、更优选为0.9质量%以下等；所述透明质酸盐的含量可以为0.01质量%以上，优选为0.07质量%以上，进一步优选为0.1质量%以上、0.20质量%以上等，更进一步优选为0.25质量%以上，并且为1质量%以下，优选为0.95质量%以下，更优选为0.9质量%以下等。
（可食用产品）
本发明提供的营养组合物在制备用于改善骨密度和骨代谢的可食用产品的用途中，在一些具体的实施方案中，该可食用产品可以为功能性食品、保健类食品等，尤其的，可以为适合于处在生长发育中的儿童、青少年、孕产妇以及中老年人的食品。所述可食用产品可经由上述营养组合物得到，或对上述营养组合物进行进一步加工得到。
对于本发明的可食用产品，没有特别限制，可以为液体、半固体或固体形态的食品，通常可以列举的包括面食、饮料、可冲调食品、烘焙糕点、酱料或功能性营养补充食品。尤其的，本发明的可食用产品特别是适合于儿童乳粉制品、中老年乳粉制品。
对于本发明的可食用产品，除了包括或使用了上述营养组合物以外，任选地，还可以使用或包括如下的组分：
水果或蔬菜的汁液、或它们的固体成分等；
功能性的各种维生素以及其他功能性成分，具体可以例如包括白砂糖、各种益生菌、甜蜜素、单糖、多糖或植物提取物、山梨酸钾、维生素A、β-胡萝卜素、维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、泛酸、叶酸、烟酸、胆碱、肌醇、生物素中的一种或多种等；
蛋白质/肽/氨基酸成分，所述蛋白质选自乳清蛋白粉、大豆分离蛋白、全脂奶粉、全蛋粉、乳铁蛋白、牛初乳、氨基酸、蛋白肽中的至少一种；并且，所述氨基酸选自L-赖氨酸-L-谷氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酰胺、牛磺酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸中的至少一种；所述蛋白肽选自大豆低聚肽、小麦蛋白肽、蚕蛹蛋白肽、海洋鱼低聚肽粉、可乐肽、氨基肽、卵白蛋白肽中的一种或多种；
膳食纤维成分，包含菊粉、魔芋粉、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆多糖、环糊精、抗性糊精、大豆纤维中的一种或多种；
补充元素成分，可以选自有机酸类的金属离子盐，例如柠檬酸钙、L-乳酸钙、磷酸氢钙、葡萄糖酸钾、柠檬酸钠、葡萄糖酸亚铁、碘化钾、葡萄糖酸锌、***钠、葡萄糖酸铜、硫酸铬、葡萄糖酸锰和葡萄糖酸镁中的一种或多种。
实施例
以下，将通过具体的实施例对本发明进行进一步具体说明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规的试剂、方法和设备。
在以下实施例部分中，除非另有说明，否则所使用的原料如下。
原料
主要试剂
N-乙酰神经氨酸、透明质酸钠、1%戊巴比妥钠（德国Merck公司）、大鼠骨钙素(OC)酶联免疫吸附检测试剂盒（ELK2391）科鹿（武汉）生物科技有限公司
主要仪器和设备
小动物活体断层扫描成像***（荷兰Milabs）、万分之一电子天平（北京赛多利斯仪器***有限公司）、电热恒温水浴锅（天津莱斯特仪器有限公司）、电冰箱（青岛海尔股份有限公司）、涡旋振荡器（惟沃索科技术（北京）有限公司）、离心机（上海化工机械公司）、超低温冰箱（美国ThermoFisher公司）、全自动生化分析仪（日本日立公司）生化培养箱（SPX-150B-Z型上海***实业有限公司）洗板机（1575 BIO-RAD）酶标仪（VARIOSKAN FLASHThermo）
实验动物
预定购入健康状况稳定的SD雌性（8周龄）SPF级大鼠96只。饲养环境：室温20-25℃，每12小时光照明暗交替，相对湿度约50%，饲料、饮水等均统一匹配，保持室内环境良好通风，每天清洁，维持笼内良好卫生环境。动物福利：在进行实验的全部处理过程中，对大鼠进行合理手段，符合实验动物伦理委员会的相关规定，具体按IAC类及其他相关标准操作规程（SOP）进行；处死方法：实验结束及剔除的大鼠均先进行麻醉腹动脉放血处死，然后将尸体存放专用冰柜容器，最后无害化统一处理。
在以下部分中，除非另有说明，否则在提及营养组合物中的成分的质量份和比率时，该质量份指的是作为活性成分的N-乙酰神经氨酸、透明质酸钠的质量份，该比率指的是作为活性成分的N-乙酰神经氨酸、透明质酸钠的质量比。
动物实验
1. 实验方法
大鼠按体重随机分为对照组（假手术组）和去卵巢组，空白对照组6只大鼠；去卵巢组90只大鼠，用于制备骨质疏松大鼠模型。去卵巢组90只大鼠摘除双侧卵巢后缝合，对照组（假手术组）进行相应的操作，手术结束后进行消毒处理。造模第5天，将去卵巢组大鼠按体重随机分为13组（1组为模型组，其余12组为实验组），给予不同的灌胃处理，每只大鼠分别按照各自的给药剂量灌胃给予受试物，受试物采用纯化水配制成对应剂量；对照组、模型组灌胃纯化水，实验组（实验例1~6和对比例1~6）灌胃成分与剂量按照动物实验的分组信息示于表1，各组小鼠持续灌胃12周，每日灌胃1次。
表1：
实验过程中，每周对各组大鼠体重进行定期监测分析，并于结束后处死，对大鼠进行解剖，称取其相关脏器重量。
2. 指标检测
2.1 骨骼中钙含量的测定方法
无菌条件下取出左侧股骨，剔净软组织，无菌生理盐水冲洗后，置于-80℃冰箱保存。样品粉碎后采用硝酸消解处理后，经过原子吸收火焰原子化，在422.7nm处测定吸光度，根据标准曲线换算浓度。
2.2 血清中磷含量的测定
将大鼠血样在转速为3000r/min下离心，离心15min后，分管-80℃保存，待用。取制备后血清上层液，用相应试剂盒进行血清中磷含量的测定。
2.3 骨密度测定
采用1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，将其固定于小动物活体断层扫描成像仪上，分辨率为20μm，扫描结束后进行图像重建，采用Inveon Research Workplace 2.2 软件分析各组大鼠骨密度情况。
与骨代谢相关指标的测定
2.4 血清中碱性磷酸酶（ALP）含量的测定
将大鼠血样在转速为3000r/min下离心，离心15min后，分管-80℃保存，待用。取制备后血清上层液，用相应试剂盒进行碱性磷酸酶（ALP）含量指标检测，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。
2.5 血清中骨钙素（BGP）含量的测定
将大鼠血样在转速为3000r/min下离心，离心15min后，分管-80℃保存，待用。取制备后血清上层液，用相应试剂盒进行骨钙素（BGP）含量指标检测，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。
2.6 骨小梁相对体积（Tb.BV/TV）的检测
采用1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，将其固定于小动物活体断层扫描成像仪上，分辨率为20μm，扫描结束后进行图像重建，采用Inveon Research Workplace 2.2 软件分析各组大鼠骨小梁相对体积（Tb.BV/TV）。
2.7 数据分析
采用SPSS 22.0统计软件对实验数据进行统计学分析，实验结果通过方差齐性检验，使用单因素方差分析各组间的统计学差异，用平均数±标准差(mean±SD)表示。P>0.05表示无统计学意义，P<0.05为有统计学意义。
3. 实验结果
3.1 骨骼中钙（Ca）含量检测结果
为评价受试物单独或混合处理对大鼠骨骼钙含量的影响，测定了大鼠骨骼钙含量，如表2-1所示。
表2-1：
注：#表示和空白对照组对比，＜0.05，##表示和空白对照组对比，＜0.01，###表示和空白对照组对比，＜0.001；*表示与模型对照组比，P＜0.05，**表示与模型对照组比，P＜0.01，***表示与模型对照组比，P＜0.001；下同。
3.2 血清中磷（P）含量检测结果
为评价受试物单独或混合处理对大鼠血清中磷含量的影响，测定了大鼠血清中的磷含量，如表2-2所示。
表2-2：
钙和磷是构成骨骼的主要元素，在骨骼的建立中相互协调。样品处理结果显示，与模型对照组相比，实验例和对比例的骨骼中Ca和血清中P的含量均得到了不同程度的改善（对比例差异不显著），并且当N-乙酰神经氨酸与透明质酸钠以一定的比例复配使用时，可以在骨骼建立中可以相互协调，能够协同地增加Ca和P的吸收，从而促进骨骼发育和健康。
通过实验例与对比例的比较发现，N-乙酰神经氨酸与透明质酸钠在组合使用时存在协同效应，例如，就使用的组分以及用量而言，表2-1中，实验例3相当于对比例2和6的组合，相对于模型对照组而言，实验例3、对比例2和对比例6分别使得骨骼中Ca的含量增加了21.25mg/g、4.85mg/g、12.75mg/g，实验例3大鼠骨骼中Ca的增量(21.25mg/g)大于对比例2和6各自的增量之和(17.6mg/g)。同理，实验例5（相当于对比例3与对比例6的组合）也可以得出协同增效的结论。
表2-2中，实验例3相当于对比例2和6的组合，相对于模型对照组而言，实验例3、对比例2和对比例6分别使得血清中P的含量增加了0.17mM、0.06 mM、0.03mM，实验例3大鼠血清中P的增量（0.17mM）大于对比例2和6各自的增量之和（0.09mM）。同理，实验例4、5、6也得出协同增效的结论。
3.3 骨密度测定结果
为评价受试物单独或混合处理对大鼠骨密度的影响，测定了大鼠骨密度的情况，如表2-3所示。
表2-3：
样品处理结果显示，当N-乙酰神经氨酸与透明质酸钠以一定比例组合使用时，能够协同的促进骨骼发育和健康，显著增加骨密度。
例如，实验例5相当于对比例3和6的组合，相对于模型对照组而言，实验例5、对比例3、对比例6分别使得骨密度增加了0.062g/cm3、0.03g/cm3、0.028g/cm3，实验例5的骨密度的增加量（0.062g/cm3）大于对比例3和对比例6各自的增量之和（0.058 g/cm3）。
与骨代谢相关指标的测定结果
3.4 血清中碱性磷酸酶（ALP）含量的测定结果
为评价受试物单独或混合处理对大鼠血清中碱性磷酸酶（ALP）含量的影响，测定了大鼠血清中ALP的情况，如表2-4所示。
表2-4：
ALP主要由成骨细胞和肝脏合成分泌，是反映骨代谢的重要指标。在血清中50%的ALP是由成骨分泌产生，因此，在一定程度上，血清ALP水平反映骨代谢的变化情况。相关研究结果显示，在机体内出现骨质快速流失或是存在骨折风险时，机体内血清ALP水平明显升高，分析其原因可能是骨吸收的加剧，导致代偿性骨形成以及骨转换增强。
样品处理结果显示，N-乙酰神经氨酸与透明质酸在以一定的比例组合使用时存在协同效应，能够协同地促进骨骼发育和健康，协同地显著减少血清中碱性磷酸酶的含量，明显改善骨代谢。
例如，就使用的组分以及用量而言，实验例3相当于对比例2和6的组合，相对于模型对照组而言，实验例3、对比例2、对比例6分别使得碱性磷酸酶减少了36.89U/L、14.09U/L、22.15U/L，实验例3中大鼠血清中的碱性磷酸酶的减少量(36.89U/L)大于对比例2和对比例6各自的减量之和（36.24U/L）。同理实验例6也得出此结论。
3.5 血清中骨钙素（BGP）含量的测定结果
为评价受试物单独或混合处理对大鼠血清中骨钙素（BGP）含量的影响，测定了大鼠血清中BGP的情况，如表2-5所示。
表2-5：
骨钙素（BGP）是一种含维生素依赖的氨基酸的非胶原蛋白，主要由成骨细胞产生和分泌，它能维持骨的正常矿化速率，抑制异常的羟基磷灰石结晶形成和软骨矿化速率，可以直接反映成骨细胞功能状态和骨形成的状况。
样品处理结果显示，当将这两种组分以一定比例组合使用时，能够协同地增加大鼠血清中骨钙素的含量，促进骨代谢。
就使用的组分以及用量而言，实验例3相当于对比例2和6的组合，相对于模型对照组而言，实验例3、对比例2、对比例6分别使得大鼠血清中BGP含量增加了0.41μg/L、0.02μg/L、0.19μg/L，实验例5中BGP的增量（0.41μg/L）大于对比例2和对比例5各自的增量之和（0.21μg/L）。
同理实验例2（相当于对比例3和对比例5的组合）、4（相当于对比例3和对比例5的组合）、5（相当于对比例3和对比例6的组合）、6（相当于对比例2和对比例5的组合）都能得出协同增效的结论。
由此可见，当将两者以一定比例组合使用时，能够显著的增加血清中骨钙素的含量，两种组分之间特定的比例存在协同效应，能够协同地改善骨代谢，促进骨骼健康。
3.6 骨小梁相对体积（Tb.BV/TV）的检测结果
为评价受试物单独或混合处理对大鼠Bv/Tv（骨小梁相对体积）含量的影响，测定了大鼠骨小梁相对体积的情况，如表2-6所示。
表2-6：
骨小梁相对体积(Bv/Tv)这一比值能够反应不同样本骨小梁骨量的多少，该值增高说明骨合成代谢大于分解代谢，骨量增加，反之亦然，从而能够间接反映骨代谢状况。
样品处理结果显示，当N-乙酰神经氨酸与透明质酸钠以一定比例组合使用时存在协同效应，能够协同地促进骨骼发育和健康，显著增加骨小梁相对体积。
就使用的组分以及用量而言，实验例3相当于对比例2和6的组合，相对于模型对照组而言，实验例3、对比例2、对比例6分别使得骨小梁相对体积增加了0.011%、0.001%、0.0074%，实验例3中大鼠骨小梁相对体积的增量（0.011%）大于对比例2和对比例6各自的增量之和（0.0084%）。
实验例4相当于对比例3和对比例5的组合，相对于模型对照组而言，实验例4、对比例3、对比例5分别使得骨小梁相对体积增加了0.0111%、0.0035%、0.0072%，实验例5骨小梁相对体积的增量（0.0111%）大于对比例2和4自的增量之和（0.0107%）。
同理，实验例6（相当于对比例2和对比例5的组合）也可以得出协同增效的结论。
协同效果总结
如上述实验结果显示，当N-乙酰神经氨酸与透明质酸钠以一定比例复配使用时（例如N-乙酰神经氨酸与透明质酸钠比例为大于1:4时），实验例2~6均在一种或多种考察指标中显示了具有协同效应，能够提升骨骼健康。
产业上的可利用性
本发明所提供的营养组合物在制备用于改善骨密度和骨代谢的可食用产品中的用途可以应用于工业制备中。
Claims (5)
1.一种营养组合物在制备用于改善骨密度和骨代谢的可食用产品中的用途，其特征在于，所述组合物包括：
i）N-乙酰神经氨酸类物质，
ii）透明质酸盐；
其中，所述组合物中N-乙酰神经氨酸类物质与透明质酸盐的用量比为大于1:4且5:1以下；并且，所述组合物任选地也包括其它营养成分；以组合物的总质量计，所述N-乙酰神经氨酸类物质的含量为0.04质量%以上；所述透明质酸盐的含量为0.01质量%以上；
所述N-乙酰神经氨酸类物质以N-乙酰神经氨酸无水物、N-乙酰神经氨酸水合物中的一种或多种形式存在，所述透明质酸盐为透明质酸钠。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸类物质选自来源于天然原料提取物、化学合成、酶催化或者微生物发酵液中的一种或多种；所述透明质酸盐选自来源于动物提取物、化学合成或者人工发酵液中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸类物质与所述透明质酸盐的用量比为1:2至2:1。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述其它营养成分包括蛋白质、维生素、单糖、多糖或植物提取物中的一种或多种；所述组合物为液体、半固体或固体。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述可食用产品包括乳制品，并且，所述乳制品包括儿童乳粉制品、孕产妇、中老年乳粉制品。
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