CN116083591A - 一种平鲷snp分子标记的多态性引物及其应用 - Google Patents

一种平鲷snp分子标记的多态性引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种平鲷SNP分子标记的多态性引物，所述多态性引物为18对，18对引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～36所示，18对引物用于扩增的平鲷SNP分子标记为36个，编号依次为RSSNP1～RSSNP36，所述RSSNP1～RSSNP36位于如SEQ ID NO：37～54所示的序列中，还公开了上述引物在平鲷遗传多样性分析中的应用。本发明首次在平鲷上批量建立了具有丰富多态性的SNP分子标记，并筛选出了18对多态性引物，为平鲷的家系鉴定、种群遗传结构、遗传育种，增殖放流等研究提供了高效的分析技术工具；本发明所使用的开发SNP标记的方法，简便、快捷、高效，节约了人力和成本。

Description

一种平鲷SNP分子标记的多态性引物及其应用
技术领域
本发明属于鱼类遗传育种领域，具体涉及一种平鲷SNP分子标记的多态性引物及其应用。
背景技术
平鲷(Rhabdosargus sarba
Figure BDA0003838657390000011
1775)，隶属于鱼纲Pisces、鲈形目Perciformes、鲷科Sparidae、平鲷属Sparus，广泛分布于印度洋至西太平洋，西起东非、红海，北至日本南部，南至澳大利亚。在中国分布于黄海、东海、南海及台湾南部、西部及澎湖海域。平鲷为热带、亚热带浅海底层鱼类，平时分散栖息于水深50米以内的浅海处，移动不远。幼鱼时栖息于内湾，对恶劣环境抵抗力较强。为杂食性鱼类，以双壳类、虾、蟹、虾蛄、藤壶及海藻等为食，是一种重要的经济鱼类。近年来，由于环境污染、过度捕捞等导致平鲷自然种群严重衰退，种质严重退化等；同时平鲷养殖群体的近亲繁殖、小规格亲本人工育苗等原因，导致平鲷养殖种质严重退化，抗病力减弱，养殖性能下降等。以上问题严重制约了平鲷养殖业的持续健康发展。
目前在平鲷的研究工作主要集中在遗传多样性评估、染色体核型、组织学、繁殖生物学等，而在分子辅助育种方面开展的工作较少。曹艳等人基于线粒体控制区序列对中国沿海的平鲷种群开展了遗传多样性分析。目前随着测序技术的飞速发展，大量的SNP应用到水产动物的遗传育种工作，如鲷科鱼类的黄鳍鲷等。这些SNPs具有高多态性，分布广泛等众多优点，在鲷科鱼类遗传育种中具有广泛的应用前景。目前，尚未见筛选平鲷SNP位点的报道。
发明内容
本发明第一个目的在于提供一种平鲷SNP分子标记的多态性引物，该引物能用于扩增平鲷SNP分子标记。
本发明目的还在于提供上述的多态性引物在平鲷遗传多样性分析中的应用。
为实现上述第一目的，本发明采用以下技术方案：
一种平鲷SNP分子标记的多态性引物，所述多态性引物为18对，每对引物包括上游引物和下游引物，18对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～36所示，用于扩增的平鲷SNP分子标记为36个，编号分别为RSSNP1～RSSNP36，所述RSSNP1～RSSNP36的核苷酸序列如SEQID NO：37～54所示，其中36个SNP分子标记与18对引物的对应关系如下所示：
所述多态性引物为18对，每对引物包括上游引物和下游引物，18对引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～36所示，18对引物用于扩增的平鲷SNP分子标记为36个，36个平鲷SNP分子标记编号依次为RSSNP1～RSSNP36，所述RSSNP1～RSSNP36位于如SEQ ID NO：37～54所示的序列中，其中36个平鲷SNP分子标记与18对引物的对应关系如下所示：
36个SNP分子标记与18对引物的对应关系如下所示：
Figure BDA0003838657390000021
优选的，36个平鲷SNP分子标记如下：
Figure BDA0003838657390000032
为实现上述第二目的，本发明采用以下技术方案：
上述的多态性引物在平鲷遗传多样性分析中的应用。
遗传多样性分析时：选取最具多态性的18对引物对广东阳江的平鲷野生群体进行遗传多样性分析。根据直接测序法得到相应位置的碱基，来确定基因型，之后使用Arlequinversion 3.5软件统计各标记在野生群体的等位基因数(NA)，观测杂合度(HO)，期望杂合度(HE)，最小等位基因频率(Minor allele frequency，MAF)，并进行哈迪·温伯格平衡(HWE)检验；使用Fstat2.93计算各标记在各样本的遗传分化程度(FIS)；使用PIC_CALC 0.6计算各样本的多态信息含量(Polymorphic informationcontent,PIC)，以此来描述平鲷SNP分子标记多态性的特征。
本发明还提供了上述平鲷SNP分子标记及其多态性引物的筛选方法，包括以下步骤：
(1)提取平鲷样品的基因组DNA，建立测序文库；
(2)采用Illumina HiSeq测序平台进行简化基因组测序，获得平鲷原始序列；
(3)将步骤(2)中获得的原始序列去除接头并进行质量过滤后获得高质量序列，使用Trinity软件对高质量序列进行从头组装，得到670,784,230bp平鲷Clean Base；
(4)有效测序数据通过BWA软件比对到参考基因组，比对结果经SAMTOOLS去除重复；
(5)采用SAMTOOLS软件对若干样本(比如20个样本)进行群体SNP的检测，SAMTOOLS软件检测公共的SNP位点，经过滤后，获得高质量的SNP位点用于后续分析，对于所有的SNP位点，利用Primer 5.0软件设计出29300对引物；
(6)使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取平鲷鳍条的DNA；
(7)选取步骤(5)中设计出的引物(比如随机选取100对引物)对步骤(6)中的DNA进行PCR扩增；
(8)检测步骤(7)中PCR产物的多态性，筛选出所述18对具有多态性位点的扩增引物，获得所述平鲷SNP分子标记。
在上述平鲷SNP分子标记及其多态性引物的筛选方法中：
优选的，步骤(7)中PCR扩增时的反应体系为10μL，包括100ng/μL基因组DNA 0.5μL、Buffer 1μL、dNTP 0.15μL、Taq酶0.15μL、ddH2O 7.6μL、正反引物均为0.3μL。
优选的，步骤(7)中PCR扩增时的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。
优选的，步骤(8)中PCR产物的多态性利用直接测序法，根据相应位置的碱基来判定基因型。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首次在平鲷上批量建立了具有丰富多态性的SNP分子标记，并筛选出了18对多态性引物，为平鲷的遗传多样性、家系鉴定、种群遗传结构、遗传育种，增殖放流等研究提供了高效的分析技术工具；
(2)本发明所使用的开发SNP标记的方法，简便、快捷、高效，节约了人力和成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1
本实施例通过以下方法筛选获得平鲷SNP分子标记及其多态性引物，包括以下步骤：
(1)提取平鲷样品的基因组DNA，建立测序文库；
(2)采用Illumina HiSeq测序平台进行简化基因组测序，获得平鲷原始序列；
(3)将步骤(2)中获得的原始序列去除接头并进行质量过滤后获得高质量序列，使用Trinity软件对高质量序列进行从头组装，得到670,784,230bp平鲷Clean Base；
(4)有效测序数据通过BWA软件(参数：mem-t 4-k 32-M)比对到参考基因组，比对结果经SAMTOOLS去除重复(参数：rmdup)；
(5)采用SAMTOOLS等软件对20个样本进行群体SNP的检测，SAMTOOLS软件检测公共的SNP位点，经过滤后，最后获得高质量的SNP位点用于后续分析，对于所有的SNP位点，利用Primer 5.0软件设计出29300对引物；
(6)使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取平鲷鳍条的DNA；
(7)随机选取100对步骤(5)中的特异性引物对步骤(6)中的DNA进行PCR扩增；
PCR扩增的反应体系为10μL，包括100ng/μL基因组DNA 0.5μL、Buffer 1μL、dNTP0.15μL、Taq酶0.15μL、ddH2O 7.6μL、正反引物均为0.3μL。
PCR扩增的反应程序为:94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。
(8)检测步骤(7)中PCR产物的多态性，筛选出18对具有多态性位点的扩增引物，获得平鲷微卫星标记。
获得的多态性引物为18对，每对引物包括上游引物和下游引物，18对引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～36所示，18对引物用于扩增的平鲷SNP分子标记为36个，36个平鲷SNP分子标记编号依次为RSSNP1～RSSNP36，所述RSSNP1～RSSNP36位于如SEQ ID NO：37～54所示的序列中，如表1-2所示。
PCR产物的多态性利用直接测序法，根据相应位置的碱基来判定基因型。
遗传多样性分析：选取最具多态性的18个引物对广东阳江的平鲷野生群体进行遗传多样性分析。根据直接测序法得到相应位置的碱基，来确定基因型，之后使用Arlequinversion 3.5软件统计各标记在野生群体的等位基因数(NA)，观测杂合度(HO)，期望杂合度(HE)，最小等位基因频率(Minor allele frequency，MAF)，并进行哈迪·温伯格平衡(HWE)检验；使用Fstat2.93计算各标记在各样本的遗传分化程度(FIS)；使用PIC_CALC 0.6计算各样本的多态信息含量(Polymorphic informationcontent,PIC)，以此来描述平鲷SNP分子标记多态性的特征。
如表1所示，在36个野生平鲷样本中对这36个SNP分子标记遗传多样性分析的结果表明：36个SNP分子标记的表观测杂合度HO在0.0333～0.5000，期望杂合度HE在0.0644～0.4994，多态信息含量PIC值在0.0624～0.3747，最小等位基因频率MAF在0.0333～0.4833，遗传分化程度FIS在-0.1600～0.9205。从而证明本发明筛选的微卫星位点的引物具有遗传多态性。
表1 36个SNP标记的多态性相关信息
Figure BDA0003838657390000061
Figure BDA0003838657390000071
Figure BDA0003838657390000081
Figure BDA0003838657390000091
注：NA为等位基因数目，HO为表观杂合度，HE为期望杂合度，PHWE为哈迪温伯格平衡检验，PIC为多态信息含量，MAF为最小等位基因频率，FIS为遗传分化程度。
获得的SNP编号为RSSNP1～RSSNP36的微卫星位点的核苷酸序列具体如下表2所示：
表2 36个微卫星位点的序列信息
Figure BDA0003838657390000092
Figure BDA0003838657390000101
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为。

Claims (3)

1.一种平鲷SNP分子标记的多态性引物，其特征是：所述多态性引物为18对，每对引物包括上游引物和下游引物，18对引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～36所示，18对引物用于扩增的平鲷SNP分子标记为36个，36个平鲷SNP分子标记编号依次为RSSNP1～RSSNP36，所述RSSNP1～RSSNP36位于如SEQ ID NO：37～54所示的序列中，其中36个平鲷SNP分子标记与18对引物的对应关系如下所示：
36个SNP分子标记与18对引物的对应关系如下所示：
Figure FDA0003838657380000011
Figure FDA0003838657380000021
2.根据权利要求1所述的平鲷SNP分子标记的多态性引物，其特征是：36个平鲷SNP分子标记如下：
Figure FDA0003838657380000022
Figure FDA0003838657380000031
3.权利要求1或2所述的多态性引物在平鲷遗传多样性分析中的应用。
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