CN116083299B

CN116083299B - 一种促进鹰嘴豆结瘤的木垒根瘤菌及其用途

Info

Publication number: CN116083299B
Application number: CN202211567775.8A
Authority: CN
Inventors: 万传星; 沈红玲; 梁红丽; 谷荣
Original assignee: Tarim University
Current assignee: Tarim University
Priority date: 2022-12-07
Filing date: 2022-12-07
Publication date: 2024-06-11
Anticipated expiration: 2042-12-07
Also published as: CN116083299A

Abstract

本发明公开了一种能够促进鹰嘴豆结瘤固氮的根瘤菌新物种木垒根瘤菌，于2022年8月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.62640。所述根瘤菌菌株具有结瘤率高和固氮能力强的特性；接种所述根瘤菌对鹰嘴豆的地上部分生物量有显著影响，鹰嘴豆植株鲜重增加了22.09％，显著促进了植物的生长。因此，该菌株为生产鹰嘴豆微生物肥料提供了重要的根瘤菌资源。

Description

一种促进鹰嘴豆结瘤的木垒根瘤菌及其用途

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种能够促进鹰嘴豆结瘤的木垒根瘤菌及其应用。

背景技术

鹰嘴豆，学名：Cicer arietinum，又名桃尔豆、鸡豆、鸡头豆，属野豌豆族，是豆科植物中的稀有品种。鹰嘴豆为豆科草本植物，起源于亚洲西部和近东地区。是世界上栽培面积较大的豆类植物，约一亿五千万亩，其中印度和巴基斯坦两国的种植面积占全世界的80％以上，中国只有零星分布，主要分布在新疆、青海和甘肃等西北省份，其中新疆木垒县是我国鹰嘴豆的主产区。鹰嘴豆具有耐干旱、耐瘠薄、固氮、好管理等特性，适合在木垒县山旱地种植。加快鹰嘴豆产业的发展，对促进区域经济发展，带动山区农民增收致富具有重要意义。鹰嘴豆的淀粉具有板栗香味。鹰嘴豆粉加上奶粉制成豆乳粉，易于吸收消化，是婴儿和老年人的营养食品。鹰嘴豆还可以做成各种点心和油炸豆。

根瘤菌（Rhizobium）是一种能与豆科植物建立共生关系的土壤细菌，包括固氮根瘤菌属（Azorhizobium）、茎瘤菌属（Allorhizobium）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）、根瘤菌属（Rhizobium）和中华根瘤菌属（Sinorhizobium）。豆科植物与根瘤菌之间的共生固氮体系一直是研究热点。目前仅在我国新疆昌吉州、甘肃会宁市以及宁夏固原市发现了鹰嘴豆结瘤现象，并且分离得到了鹰嘴豆根瘤菌资源，其余新引种的区域如云南丘北、吉林白城、山东青岛、黑龙江大庆、河南汝州等区域均未发现有结瘤现象，这说明鹰嘴豆具有较高的结瘤特异性，并且目前为止在中国只发现了两个鹰嘴豆根瘤菌共生种群，即木垒中慢生根瘤菌和文新中慢生根瘤菌，国外发现的鹰嘴豆根瘤菌种群在我国并没有分布，说明中国鹰嘴豆根瘤菌具有特殊的生物地理学分布特征和区域特色。

目前，为了满足鹰嘴豆大规模引种过程中鹰嘴豆接种根瘤菌的需求，扩充固氮根瘤菌的微生物菌种资源库，有必要筛选出更多新的具有高效结瘤固氮能力的根瘤菌菌株，充实微生物菌种资源库。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种适合盐碱地土壤使用的全新的木垒根瘤菌，以促进鹰嘴豆结瘤固氮。

本发明从鹰嘴豆根瘤中分离并筛选出2株TRM95796 和TRM96647结瘤根瘤菌菌株。本发明对菌株的16S rDNA基因序列进行测序分析，表明本发明提供的根瘤菌菌株的16SrDNA基因序列与根瘤菌属（Rhizobium sp.）的菌株Rhizobium alvei TNR-22T的序列相似性为96.3％。TRM96647 与根瘤菌（Rhizobium azooxidifex Po 20/26^T）的16S r RNA基因序列相似性为97.5％。

对两个根瘤菌菌株进行了保藏：奇台根瘤菌Rhizobium qitaiense TRM95796 和Rhizobium muleienseTRM96647于2022年7月27日和2022年8月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏号分别为GDMCC NO. 62650和GDMCC NO. 62640，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

本发明提供一种固氮微生物制剂，含所述根瘤菌Rhizobium muleiense TRM96647菌株和/或其菌悬液。菌悬液的OD值为0.8-1.2，菌悬液的发酵条件为25℃，pH 7.0，YMA培养基。将两菌株菌悬液分别接种到鹰嘴豆植株上，鹰嘴豆的株高、根重量、地上部分重量、根瘤重量等都获得了明显的提升，因此该菌株适用于鹰嘴豆的栽培生产，特别适用于盐碱地区鹰嘴豆的栽培生产，有利于促进植株结瘤固氮，增加植株的氮素营养，促进鹰嘴豆优质高产。

本发明具有以下有益效果：

本发明是从鹰嘴豆根瘤中分离并筛选出的结瘤根瘤菌菌株，所述根瘤菌菌株具有结瘤率高和固氮能力强的特性；接种根瘤菌TRM96647对鹰嘴豆的生物量有显著影响，对鹰嘴豆植株鲜重增加了22.09％，显著促进了植物的生长。该菌株为生产鹰嘴豆微生物肥料提供了重要的根瘤菌资源。

附图说明

图1奇台根瘤菌TRM95796^T和木垒根瘤菌TRM96647^T的电镜照片；

图2 A 菌株TRM95796^T和TRM96647^T基于16S rRNA基因邻接法***进化树。

图2B 菌株TRM95796^T和TRM96647^T基于16S rRNA基因最大简约法***进化树。

图2C 菌株TRM95796^T和TRM96647^T基于16S rRNA基因最大似然法***进化树。

图3菌株TRM95796^T和TRM96647^T 全基因组（TYGS）***进化树

图4菌株TRM95796^T和TRM96647^T 管家（recA-atpD）基因邻接法***进化树

图5菌株TRM95796^T和TRM96647^T 极性脂类型（PE：磷脂酰乙醇胺；PIM：磷脂酰肌醇甘露糖苷；DPG：双磷脂酰甘油；PI：磷脂酰肌醇；L1，L2：未知化合物）

图6接种菌株TRM95796^T和TRM96647^T鹰嘴豆盆栽试验结果。

图7接种菌株TRM95796^T和TRM96647^T大田试验鹰嘴豆长势图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例一、奇台根瘤菌TRM95796和木垒根瘤菌TRM96647的来源与分离培养

从新疆奇台县和木垒县的鹰嘴豆种植地采集新鲜饱满的根瘤，根瘤样品采集后用流水清洗表面，用75%乙醇和2%次氯酸钠溶液分别进行表面消毒，再用无菌水反复冲洗，再用消过毒的刀子将单个根瘤切开后，再用镊子夹住根瘤在固体YMA（含刚果红终浓度25ppm）培养基上划线，在28℃恒温培养箱中倒置培养5～7d直至有清晰的菌落长出，并且根据菌体的形态、大小、透明度、黏稠度、颜色、光泽等特征，对分离得到的根瘤菌单克隆进行3～4次的划线纯化，直到长出清晰的单克隆，挑取单菌落转接冻干管，4℃低温保存，并将获得的菌株命名为奇台根瘤菌TRM95796和木垒根瘤菌TRM96647。

实施例二、奇台根瘤菌TRM95796和木垒根瘤菌TRM96647的鉴定

为进一步确定根瘤菌TRM95796和TRM96647的分类学地位，本发明采用多相分类方法对该菌株进行了分类鉴定。

形态观察用培养基

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，酵母提取物5g/L，调节pH为7.0-7.2，30℃培养3天。

引物

采用细菌通用引物由北京擎科生物科技有限公司上海分公司合成。其序列分别为：27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’）和1492R（5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）。

试验方法

根瘤菌TRM95796和TRM96647形态学观察方法

扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察：挑取根瘤菌TRM95796和TRM96647单菌落于LB液体培养基，30℃培养，离心收集菌体，加入2.5%戊二醛进行固定。用扫描和透射电子显微镜观察记录菌株形态，菌体形状和大小，有无鞭毛等。

根瘤菌TRM95796和TRM96647基因组DNA的提取方法

收集培养平板上的TRM95796和TRM96647菌体放入1.5mL的无菌离心管中，加入480μL的1×TE缓冲液。加入20μL溶菌酶（50mg·m L^-1），放入37℃摇床中，200rpm振荡过夜。每管加入50μL 20％的SDS，加入5μL 20mg·m L^-1的蛋白酶K，放入60℃摇床中，200r/min振荡1h。加入550μL的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），12000rpm离心10min，取上清移入另一离心管中，反复抽提2-3次。取上清，加入等体积的无水乙醇，加入0.1倍体积的乙酸钠（3mol·L^-1），放入4℃冰箱中沉淀DNA约0.5h。12000rpm离心10min，弃上清。用200μL的70％乙醇清洗离心产物2次，12000rpm离心5min，弃上清，将乙醇挥发完全。用50μL无菌超纯水充分溶解底部的DNA，1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，将提取的DNA放入-20℃冰箱中保存备用。

根瘤菌菌TRM95796和TRM96647 16S r RNA基因的扩增方法

用细菌16S r RNA基因通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’）和1492R（5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）扩增细菌基因组DNA中的16S r RNA基因片段。

25μL的PCR反应体系为：dd H₂O 20.4μL，10×Buffer（缓冲液含Mg²⁺）2.5μL，dNTPs0.5μL，引物27F（10μmol·L^-1）0.5μL，引物1492R（10μmol·L^-1）

0.5μL，Taq DNA聚合酶0.1μL，模板DNA 0.5μL。

PCR反应条件为：预变性94℃ 4min；变性94℃ 1min，退火56℃ 1min，延伸72℃2min，30次循环；总延伸72℃ 8min。反应完成后用1％琼脂糖凝胶电泳检测。符合条件的PCR产物进行序列测定。

测序结果的比对分析。测序结果用SeqMan软件拼接，序列通过EzBioCloud数据库中的已有效发表的菌株序列进行比对，下载相似度较高的已有效发表菌株的16S r RNA基因序列，用MEGAX软件对序列进行***发育树的构建，确定放线菌的分类学地位。

全基因组拼接结果用NCBI中GenBank数据库进行比对，进一步确定菌株的分类学地位。

试验结果

根瘤菌TRM95796和TRM96647的形态学观察结果

根瘤菌TRM95796和TRM96647革兰氏染色为阴性，最适生长温度25℃，最适生长p H为7，最适NaCl（W/V）为0％，在LB培养金上25℃平板培养3d，菌落圆形，浅黄色，菌落边缘整齐，凸起。通过扫描电镜观察发现：根瘤菌TRM95796呈长杆状，菌体宽度为0.3-0.4μm，长度为1.5-1.7μm；TRM96647呈杆状，菌体宽度为0.4-0.5μm，长度为1.1-1.5μm；通过透射电镜观察发现：菌体有鞭毛，见图1。根据根瘤菌TRM95796和TRM96647菌落、菌体形态和生理特征测定，确定TRM95796和TRM96647属于根瘤菌属（Rhizobium）。

根瘤菌TRM95796和TRM96647的分子生物学鉴定结果

根瘤菌TRM95796和TRM96647的16S rRNA基因序列测定结果

测序结果用SeqMan软件拼接，确定TRM95796和TRM96647分别由1501和1383个碱基组成，得到根瘤菌TRM95796和TRM96647的16S rRNA基因序列分别为：

SEQ ID NO:1

>TRM95796

CCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCGCTGACCCTACCGTGGTCGCCTGCTTCCCTTGCGGGTTGGCGCAGCGCCTTCGGGTAAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCGTTCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCACCCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGACGGCTTTTGGAGATTAGCTCACCCTCGCGGGTTCGCTGCCCATTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCTCGGCTTATCACCGGCAGTCCCTCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAGAGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCCGGTCTAGCCGAACTGAAGGACAATGTCTCCACTGTCCGGAACCGGGATGTCAAGGGCTTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGGTTTAATGGCGTTAGCTGCGCCACCGACATGCATGCATGCCGACGGCTAACATTCATCGTTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGGTCAGTAATGGGACCAGTAAGCCGCTTCCGGCCACTGGTGTTCCTCCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGGAATTCCACTTACCTCTTCCATACTCGAGACACCCAGTATCAAAGGCAGTTCCAGAGTTGAGCTCTGGGATTTCACCCCTGACTTAAATGTCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAACAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGGGCTTCTTCTCCGGATACCGTCATTATCTTCTCCGGTGAAAGAGCTTTACAACCCTAGGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTATGGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCAACGCGGGCTCATCCATCCCCGATAAATCTTTCCCCCCCATAAAATGCCAAGGGCATTCTATGATTCTTGGTATTTTAAAGGGGGGCGTATACGGTATTAGCACACGTTTCCATGCGTTATTCCGTAGGGTTGGGTAGATTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCGCTGACATATTGCTATGCCCGCTCGACTTGCATGTGTTAAGCCTGCCGCCAGCGTTCGTTCTGAGCCATGATCAAACTCT

SEQ ID NO:2

>TRM96647

CGGCGTTGATCTGAACTCAGGATCACTCGTGTTACACTGCAATCGCGTGTCGCCCTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCCTTTGCTACGGAATAACTCCGGGAAACTGGAACTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGATGAAGATAATGACGGTAGTCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGGTATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGAGCTCAACTCCGGAACTGCCTTTGATACTGGGTACCTAGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTCCGAGTGGAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTTTACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGATCGCGGTTCGTGGAGACACGTTCCTTCAGTTCGGCTGGATCGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGGACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACCGCGAGGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCCACCATGGGGAGTTGGTTTTACCGAAAGGTAGTGTGCTAACCGCAAGGAGGCAGCTAACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAAGCCGTAAAGGGCGACACGCGATTGCAGTCTTGAGTCCACCTGAAGGATGTCAAACTTGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTTCCATAAAAACAACATACGAGCCGGAACAAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGAC

根瘤菌TRM95796和TRM96647同源进化树构建结果

通过在EzBioCloud数据库中进行比对，与待测根瘤菌16S r RNA基因序列相似度较近的序列，用MEGA软件对放线菌16S r RNA基因序列进行多重序列比对，构建***发育树。根瘤菌TRM95796和TRM96647进化树见图2A、图2B和图2C，根瘤菌TRM95796与根瘤菌（Rhizobium alvei TNR-22T）的16S r RNA基因序列（一致性为96.31％）聚在同一个***进化分支上，TRM96647 与根瘤菌（Rhizobium azooxidifex Po 20/26^T）的16S r RNA基因序列（一致性为97.5％），但相似度较低，故将该根瘤菌新物种根据采样地命名为奇台根瘤菌Rhizobium qitaiense TRM95796和木垒根瘤菌 Rhizobium muleiense TRM96647。

根瘤菌TRM95796和TRM96647全基因组及其看家（recA-atpD）基因进化树构建结果

将菌株TRM95796、TRM96647、TRM96650 与近缘根瘤菌菌株基因组上传至 TYGS（http://tygs.dsmz.de）构建全基因组***发育进化树（如图3），TRM 95796 与菌株（Rhizobium alvei TNR-22T）聚类在一个分支上，TRM96647T与（Rhizobium azooxidifexPo 20/26^T）聚在一个簇上，全基因组聚类结果与16S rRNA结果一致。

采用Neighbor-Joining（NJ）法将根瘤菌TRM95796和TRM96647的看家基因（recA、atpD）与近缘种根瘤菌的看家基因序列构建看家基因的***发育进化树，近缘近缘种根瘤菌的看家基因序列可从NCBI数据库进行下载。根瘤菌TRM95796与根瘤菌（Rhizobium alvei TNR-22T）的看家基因序列聚在同一个***进化分支上，TRM96647 与根瘤菌（Rhizobium azooxidifex Po 20/26^T）的看家基因序列聚在同一个***进化分支上（如图4），通过16S rRNA聚类分析、全基因组聚类分析和看家基因聚类分析，三种方式呈现一致结果，故表明TRM95796和TRM96647都为根瘤菌新物种。

菌株TRM95796T和TRM96647T 极性脂类型

采用双相薄层层析法分析菌株极性脂类型，通过使用茚三酮试剂、茴香醛显色剂及钼磷酸显色剂分析可知菌株TRM95796 细胞膜磷脂类脂类型为磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰甘油（PG）、未知类型的氨基糖脂（AGL）、双磷脂酰甘油（DPG）、未知类型的磷脂（PL1）、含葡萄糖胺的未知结构磷酸类脂（NPG），与相似菌株比较，相似菌株含有L1-L4，PL2；而TRM95796不含有，表明两者之间存在差异，显色结果见图5。TRM96647细胞膜磷脂类脂类型为磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰甘油（PG）、双磷脂酰甘油（DPG）、含葡萄糖胺的未知结构磷酸类脂（NPG），未知类型的氨基磷酸脂APL1、APL2和未知类型的氨基脂 (AL1)、未知类型的磷脂PL1，PL2；菌株与最相近的菌株比较，相似菌株缺少磷脂酰甘油（PG），双磷脂酰甘油（DPG）、含葡萄糖胺的未知结构磷酸类脂（NPG），表明两个新物种菌株与相近菌株存在差异，是潜在的新物种，显色结果见图5。

表1菌株TRM95796和TRM96647与相似菌株多相分类指标主要比较

注：菌株：1, Rhizobium qitaienseTRM95796^T ; 2, R.alveiTNR-22^T ( Sheu SYet al.); 3, R. tarimense PL-41^T (Turdahon M et al.); 4, R. muleiense TRM96647^T; 5, R. azooxidifex Po 20/26^T(BehrendtUet al.);6,R. subbaraonis JC85^T(Ramana CVet al.) +, 积极的; –, 消极的;

表2 菌株TRM95796^T和TRM96647^T与根瘤菌属近缘种菌株的dDDH和ANI值

实施例三、根瘤菌TRM95796和TRM96647回接鹰嘴豆试验

鹰嘴豆种子灭菌：选颗粒饱满大小的均匀的鹰嘴豆种子，用 75％乙醇处理 30s，再用次氯酸钠灭菌 2min，然后用无菌水洗涤 8-10 次，均匀铺于 1％水琼脂平板上，28℃正置催芽 2-3d 或者洗涤后直接用水浸泡，放于 28℃培养箱 1-2h。

菌体培养：配制1L YMA液体培养基，分装于5个三角瓶中，于121℃灭菌20min；将已纯化并达到对数生长期的根瘤菌菌液，吸取2mL菌液于装有YMA培养基的三角瓶中，在28℃的摇床以180r/min的转速振荡过夜至菌液OD 600值达到0.6±0.05后，分装于灭过菌的50mL离心管中，在离心机中以5000rpm离心10min后取出，倒掉上清液，用无氮营养液重悬得到菌悬液备用。

鹰嘴豆盆栽：催芽或浸泡后的种子播种于灭菌蛭石中，每盆 6 颗，等到植物长出第一片子叶后，盆里留三颗健壮的幼苗，根系处接种 5mL 上述步骤的根瘤菌菌悬液，在光照室培养30-45 天，生长期间用 Fahraeus 无氮营养液浇植物。光照室温度 20℃，光照16h，黑暗 8h。

以不接种为对照，每个处6个重复，接种60天后收获鹰嘴豆植株，以植株鲜重、结瘤数、固氮酶活值作为测定根瘤菌的结合性和固氮能力的判断指标。

在空白对照（-N）无结瘤现象，而接种根瘤菌TRM95796和TRM96647能够促使鹰嘴豆结瘤，即回接处理平均每株鹰嘴豆可结根瘤30个和89个，根瘤剖面显示为深红色（见图6），测定其根瘤固氮酶活性为26.21μmol/h/g和68.08μmol/h/g，初步判定供试TRM95796和TRM96647菌株为具有固氮效率的根瘤菌。

实施例四、施用根瘤菌TRM95796和TRM96647菌悬液鹰嘴豆大田试验

试验地面积一共是 27m2。每一个小区 3m2。小区 3垄区，6 米行长，每个小区间用塑料膜隔开，深度为50cm。一共9 小区排布形式如下：

区组1	区组2	区组3
			CK₁	接种TRM95796处理₁	接种TRM96647处理₃
接种TRM96647处理₁	CK₂	接种TRM95796处理₂
			接种TRM95796处理₃	接种TRM96647处理₂	CK₃

随机排列，3 种不同处理。每一种处理3个重复。

菌体培养：配制10L YMA液体培养基，分装于500mL三角瓶中每瓶装200mL，于121℃灭菌20min；将已纯化并达到对数生长期的根瘤菌菌液，吸取2mL菌液于装有YMA培养基的三角瓶中，在28℃的摇床以180r/min的转速振荡过夜至菌液OD 600值达到0.6±0.05后，分装于灭过菌的200mL离心管中，在离心机中以5000rpm离心10min后取出，倒掉上清液，用无氮营养液重悬得到菌悬液备用。

播种及接种：催芽或浸泡后的种子播种于大田中，等到植物长出第一片子叶后，根系处接种上述步骤的根瘤菌菌悬液，田间进行日常管理，试验过程中进行鹰嘴豆的生育期调查，并记录调查结果。鹰嘴豆的株高、地上部分生物量（鲜重和干重）、根瘤数、根瘤重量等性状。从鹰嘴豆出苗开始，分别在鹰嘴豆出苗期、花期、结荚期进行调查；在每个处理小区随机各取 3 个单株进行测定。

从整体上看，对照组（不接菌处理）的鹰嘴豆叶片植株矮小，茎细，而实验组，接种根瘤菌TRM95796和TRM96647的鹰嘴豆叶片偏绿，植株偏高且茎较粗，地上部分生物量（鲜重和干重）和根瘤数（如图7）、根瘤重量优于对照组。

Claims

1.一种能够促进鹰嘴豆结瘤固氮的根瘤菌，其特征在于，其为木垒根瘤菌（Rhizobium muleiense），保藏号为GDMCC No.62640。

2.如权利要求1所述的根瘤菌的培养方法，其特征在于，其培养所用的培养基为YMA培养基：甘露醇10g/L，酵母浸粉0.4g/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄ 0.2g/L，微量元素4mL；所述微量元素营养液包括0.22g ZnSO₄，1.81g MnSO₄，2 .86g H₃BO₃，0 .8g ，CuSO₄·5H₂O和0 .02gH₂MoO₄，琼脂18g/L，水1L，调节pH为7.0-7.2。

3.如权利要求2所述的根瘤菌的培养方法，其特征在于，发酵条件为25℃。

4.如权利要求1所述的根瘤菌在植物结瘤固氮中的应用，所述植物为鹰嘴豆。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述根瘤菌接种到植物植株上，促进植株结瘤固氮，增加植株的氮素营养。

6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述应用是用于鹰嘴豆的栽培生产。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是用于盐碱地区鹰嘴豆的栽培生产。

8.一种固氮微生物制剂，含有如权利要求1所述的根瘤菌的培养物，所述培养物是菌悬液。

9.如权利要求8所述的固氮微生物制剂，其特征在于，所述菌悬液的OD₆₀₀值为0.8-1.2。