CN116064431A - 一种提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶(AFO)及其应用。本发明通过蛋白质工程技术对野生型黄曲霉毒素氧化酶分子内的关键氨基酸残基进行了改造，筛选得到了一种提高胃蛋白酶抗性的突变体黄曲霉毒素氧化酶。本发明所述的作用于黄曲霉毒素(AFB1)的突变体黄曲霉毒素氧化酶(AFO^P477N)对胃蛋白酶的抗性半衰期比野生型AFO延长了22％。突变体AFO^P477N相比于野生型，在20～60℃时仍保有60％以上的活性；最适反应pH为6.0；在pH 7.0～8.0时保有40％以上的活性。

Description

一种提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素氧化酶，特别涉及到提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶。

背景技术

本课题组1999年在国际上首先报道，从食用性真菌假密环菌(Armillariellatabescens)中纯化出具有黄曲霉毒素去毒作用的活性物，命名为黄曲霉毒素解毒酶(AflatoxinDetoxinfizyme，ADTZ)。进一步研究发现，该酶是一种氧化还原酶，可以与黄曲霉毒素(AFB1)等结构类似物发生氧化反应，因此更名为黄曲霉毒素氧化酶(Aflatoxion-Oxidase，AFO)。研究结果显示，AFO能够将AFB1转化成无毒产物。该方法高效、低毒、并且特异性强、不污染环境。

由于黄曲霉毒素毒性强、热稳定性好，用通常的物理和化学方法不能彻底地去除黄曲霉毒素，并且还会破坏原料营养价值。所以目前最有效的去除黄曲霉毒素的方法是生物酶解法。

迄今，有关黄曲霉毒素解毒酶的研究主要集中于黄曲霉毒素解毒基因的克隆和异源表达；通过基因重组方法获得产不同特征的黄曲霉毒素解毒酶的菌株；降解机理研究以及黄曲霉毒素解毒酶制剂的制备与应用等。检索中国专利文库，发现有关黄曲霉毒素解毒酶的专利有十余个，关于发现或筛选来自不同微生物来源的具有不同特征的黄曲霉毒素解毒酶及其编码基因的专利有：、CN1712526A等；关于使用基因重组等方法获得不同特性突变体的专利有两个，且均由本课题组申请，其中专利CN104130984A通过对野生型黄曲霉毒素氧化酶底物结合部位的关键氨基酸残基进行改造，发明了作用于杂色曲菌素的黄曲霉毒素氧化酶；专利CN104611305A通过对野生型黄曲霉毒素解毒酶三维结构外层部位的关键氨基酸残基进行改造，发明了一种对胰蛋白酶抗性提高的突变体；关于黄曲霉毒素解毒酶应用的专利有CN107727722A、CN102175736A、CN101216450A、CN104152419A、CN103947847A、CN1719243A等。检索中国学位论文库有关玉黄曲霉毒素解毒酶的主要研究包括揭示酶学性质、催化反应机理、酶基因的克隆和异源表达、酶的定向改造、解毒酶制剂在饲料工业的应用等。而有关具有胃蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶的研究和专利，迄今尚未见报道。在饲料添加应用中黄曲霉毒素降解酶对胃蛋白酶抗性的延长，可以提高该酶的使用效率，具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶。

本发明所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶，它是由氨基酸序列为SEQID NO.1的来源于食用性真菌假密环菌(Armillariellatabescens)的黄曲霉毒素氧化酶随机突变筛选到的突变体黄曲霉毒素氧化酶，其具有一个氨基酸取代，所述的氨基酸取代是第477位的取代。

本发明是对黄曲霉毒素氧化酶的基因(称为AFO基因)进行易错PCR。由食用性真菌假密环菌(Armillariellatabescens)中获得的黄曲霉毒素氧化酶的基因序列的GENBANK登录号为AY941095.1。该酶的成熟蛋白的氨基酸序列为AAX53114.1(SEQ ID NO.1)。

本发明通过对黄曲霉毒素氧化酶进行突变筛选到了一株突变体黄曲霉毒素氧化酶，经实验表明，所获得的突变体AFO对AFB1的降解功能不受影响，对胃蛋白酶的抗性半衰期比野生型AFO延长了22％，命名为AFO^P477N。

根据本发明所述的黄曲霉毒素氧化酶的进一步特征，所述在第477位的氨基酸取代是用天冬酰胺取代脯氨酸；所述的突变体黄曲霉毒素氧化酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.2。

本发明所述的突变体黄曲霉毒素氧化酶(AFO^P477N)，经模拟人工胃液(pH为1.2，浓度为0.012mg/mL的胃蛋白酶在37℃条件下)，使用W_AFO:W_胃蛋白酶＝50：1的条件进行反应，经计算后突变体AFO^P477N的半衰期约39min，而野生型AFO^wt的半衰期约32min。突变体AFO^P477N对胃蛋白酶的抗性半衰期比野生型AFO延长了22％，显示突变体AFO^P477N对胃蛋白酶的抗性比野生型AFO^wt提高了。突变体AFO^P477N的其他酶学性质相比于野生型黄曲霉毒素氧化酶也发生了一些改变。相比于野生型，突变体在20～60℃时仍保有60％以上的活性；最适反应pH为6.0；在pH 7.0～8.0时保有40％以上的活性。

进一步地，本发明提供了一种DNA分子，其编码本发明所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶。

本发明所述的突变体DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

本发明的另一个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的DNA分子。

本发明的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的DNA分子，或者含有本发明所述的载体。

上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。

本发明还提供了本发明所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶的生产方法，包括：在适于黄曲霉毒素氧化酶表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的黄曲霉毒素氧化酶。

当本发明所述的DNA分子以合适的取向和正确的阅读框***到所述的载体，或者转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可以在任何真核或者原核表达***中表达。许多宿主-载体***都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主-载体***包括但不限于：用噬菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞***；用病毒感染的昆虫细胞***；用细菌感染的植物细胞***。本发明优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或者寡核苷酸。

本发明优选的宿主为真核***如毕赤酵母；本发明优选的蛋白质表达方法为毕赤酵母分泌表达。

本发明的另一个方面是提供了所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶的用途，具体是所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶在制备食品添加剂或饲料添加剂中的应用。

附图说明

图1是SDS-PAGE蛋白电泳图，黑色箭头所指处为Marker 75Kd条带，黑色方框中为目的蛋白，大小为75Kd左右。其中，泳道1为野生型黄曲霉毒素氧化酶蛋白培养上清；泳道2为野生型黄曲霉毒素氧化酶蛋白培养上清的硫酸铵沉淀蛋白。

图2是本发明所述的野生型AFO^wt与突变体AFO^P477N蛋白在人工胃液处理前和经人工胃液处理后的残留蛋白结果图；1-8泳道分别为经胃蛋白酶消化0、10、20、30、40、60、80、100min后剩余的AFO蛋白量。

图3是本发明所述的野生型AFO^wt与突变体AFO^P477N蛋白的灰度扫描数据结果。人工胃液中含胃蛋白酶。

图4是本发明所述的野生型AFO^wt和突变体AFO^P477N的最适反应温度。

图5是本发明所述的野生型AFO^wt和突变体AFO^P477N的温度稳定性。

图6是本发明所述的野生型AFO^wt和突变体AFO^P477N的最适反应pH。

图7是本发明所述的野生型AFO^wt和突变体AFO^P477N的pH稳定性。

具体实施方式

本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。

“AFO^wt”表示野生型黄曲霉毒素氧化酶，其基因以斜体“AFO^wt”表示。

“AFO^Mut”表示易错PCR得到的基因片段。

“pPIC3.5K-AFO^Mut”表示易错PCR得到的基因片段与载体pPIC3.5K相连。

“AFO^P477N”表示突变体黄曲霉毒素氧化酶，其基因以斜体“AFO^P477N”表示。

实施例1：黄曲霉毒素氧化酶基因的合成

本发明采用Armillariellatabescens来源的野生型黄曲霉毒素氧化酶的基因(GenBank注册号为AY941095.1)，由上海捷瑞基因公司合成(其它具有全基因合成的商业公司同样可以完成)。

实施例2：验证黄曲霉毒素氧化酶基因(AFO)是否正确获得

1.将全基因合成的含AFO目的基因的pPIC3.5K质粒进行抽提并进行单酶切和双酶切验证。酶切条件如下表1。

表1：

2.酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳进行验证。

结果显示，重组质粒经Not I和Sac I酶切后得到两条带，分别是9000bp的pPIC3.5K载体和大小为2000bp的目的基因片段。重组质粒经SalⅠ单酶切后，得到11000bp的条带。双酶切和单酶切产物片段大小均符合预期，说明克隆载体含有目的基因，可进行下一步实验。

实施例3：易错PCR

1.易错PCR是在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因发生随机突变。

本发明根据pPIC3.5K-AFO^wt基因序列，使用Primier 6.0软件和DNA MAN设计易错PCR引物。

上游引物(5’-3’):CGAGCTCGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAG

下游引物(5’-3’):TTGCGGCCGCAATTAATGATGATGATGATGATGC

引物设计后交由上海捷瑞生物工程有限公司进行合成。合成完成后设计易错PCR反应体系以及反应程序。

表2：

表3：

2.PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳进行验证。

结果显示：经过易错PCR后，可扩增得到2000bp左右的目的基因片段。扩增结果符合预期，可进行下一步实验。

3.PCR产物回收

PCR产物电泳后，在紫外投射仪上观察目的条带，并进行切胶回收。使用NEB的DNA胶回试剂盒，回收得到的DNA片段即为AFO^Mut，置于4℃保存。

实施例4：构建毕赤酵母分泌表达载体pPIC3.5K-AFO^Mut

1.双酶切AFO^Mut和表达载体pPIC3.5K

表4：

按照以上体系双酶切AFO^Mut与pPIC3.5K-AFO。酶切完成后，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳进行验证，分别得到符合预期的9000bp左右的载体片段以及2000bp左右的目的基因片段，将该片段切胶回收，进行下一步实验。

2.双酶切后AFO^Mut和表达载体pPIC3.5K连接

连接体系如下表5。

表5：

连接过夜后可直接将连接产物进行下一步实验。

3.转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并验证

过夜连接的产物转化进大肠杆菌感受态细胞DH5α，步骤如下：

从-80℃冰箱取出1管100μL的感受态细胞置于冰上让其慢慢解冻，将其分装成2×50μL；将连接产物加入到感受态细胞中，用移液器轻轻吹打混匀，冰上放置30min；随后42℃金属浴热击90s，然后迅速将其放置在冰上，冷却2-3min；将热击后的产物加入到温浴的LB液体培养基中，轻轻震荡混匀，置于37℃摇床震荡培养1h；将上述离心，弃部分上清，剩余部分进行重悬，菌悬液进行涂板(平板含氨苄抗性)；平板正面朝上放置半小时后，待菌液被吸收，37℃倒置培养过夜。

转化后的大肠杆菌培养过夜后，平板上长出单菌落，用LB液体培养基将平板上的所有单克隆洗下来，转入LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜。对过夜培养的菌液进行质粒抽提，步骤同上。此时得到含突变基因的pPIC3.5K-AFO^Mut质粒。

将得到的pPIC3.5K-AFO^Mut质粒按照“实例2步骤1”的双酶切体系进行酶切验证。酶切完成后，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳进行验证，分别得到符合预期的9000bp左右的载体片段以及2000bp左右的目的基因片段。表明分泌表达载体pPIC3.5K-AFO^Mut构建成功，可进行下一步实验。

4.电转毕赤酵母GS115

为了提高单拷贝表达盒在毕赤酵母染色体上的整合效率，利用限制性内切酶SalI对pPIC3.5K-AFO^Mut进行单酶切线性化，随后通过同源重组的方式，得到稳定的携带目的基因的重组子。本实验的受体菌为毕赤酵母GS115，电转化后使用MD平板进行初步筛选，然后挑取MD平板上的单克隆于2mL的YPG液体培养基中培养14～16h后抽取毕赤酵母基因组进行PCR验证和进一步筛选阳性克隆重组子。

经过MD平板筛选和PCR验证，得到电转成功的阳性克隆重组子。通过易错PCR构建的突变体AFO文库库容约为2.0X 10⁴。

5.阳性克隆重组子的初筛验证

将电转成功的阳性克隆重组子接种于装有1ml YPD培养基的96深孔板中，于30℃，200rpm，培养4d；培养完成后于12000g、4℃离心，收集AFO酵母工程菌上清液并设计实验使用HPLC检测AFB1的降解情况以进行初筛。

实验组：200μL上清液+300μL PBS Buffer+AFB1(AFB1终浓度为20ng/ml)

对照组：200μL上清液+300μL PBS Buffer+500uL甲醇+AFB1(AFB1终浓度为20ng/ml)

将实验组与对照组在30℃下进行反应，分别于6h、12h、24h取样进行检测；实验组使用等体积的甲醇终止反应，充分震荡后，静置30min。随后13000rpm，离心10min，取上清液进行HPLC检测。温度值设为35℃，紫外吸光度365nm，FLD激发波长365nm，FLD发射波长425nm。

降解率计算公式：

将反应24h后降解率大于70％的阳性单克隆重组子送往上海生物工程有限公司进行测序。经对突变体AFO文库的筛选，其中一个阳性单克隆重组子经测序为单点突变，突变位点为第477位，将其命名为AFO^P477N。

实施例5：野生型AFO^wt及突变体AFO^P477N重组蛋白的SDS-PAGE电泳检测本实施例的SDS-PAGE电泳检测包括以下步骤：

(1)配置10mL 10％的分离胶，混匀后用微量移液器往玻璃板中灌胶，直到离短玻璃板上沿2～3厘米处停止，然后用蒸馏水封住胶面，可轻轻抬起制胶器一端然后放下使胶面平整，聚合40min后到弃蒸馏水，用滤纸吸去多余水分。

(2)配置4mL 5％的浓缩胶，均匀的灌在分离胶之上，***相应规格的梳子同时应避免产生气泡，聚合30min待胶凝固。

(3)装好电泳槽，将槽内灌电泳液，体积宜大于电泳槽体积的一半，把制好的胶移入电泳槽中，小心拔去梳子。

(4)依次点样，点样量不宜过多，15μL每孔为合适。

(5)电泳开始时先设置90V跑胶，指示剂至浓缩胶部分将电压改为120V继续电泳，目的条带跑到中间位置时可停止电泳(目的条带对应于Maker的相应条带，事先可获知)。

(6)小心剥下凝胶，考马斯亮蓝R-250染色30min后，脱色液脱色至背景较浅蛋白条带清晰即可。

(7)凝胶成像并观察结果。SDS-PAGE蛋白电泳结果如图1、图2所示。

图1是SDS-PAGE蛋白电泳图，黑色箭头所指处为Marker 75Kd条带，黑色方框中为目的蛋白，大小为75Kd左右。其中，泳道1为野生型黄曲霉毒素氧化酶蛋白培养上清；泳道2为野生型黄曲霉毒素氧化酶蛋白培养上清的硫酸铵沉淀蛋白。该结果表明目的基因在毕赤酵母GS115中成功表达，可扩大培养并分离纯化目的蛋白以进行下一步实验。

实施例6：电泳检测野生型AFO^wt及突变体AFO^P477N重组蛋白的胃蛋白酶抗性检测

将野生AFO^wt和突变体AFO^P477N用人工胃液(pH为1.2，浓度为0.012mg/mL的胃蛋白酶在37℃条件下)消化(野生型AFO^wt蛋白与突变体AFO^P477N蛋白的添加量相同，人工胃液和酶蛋白含量按照质量比为1：50的比例)分别在0、10、20、30、40、50、60、80、100min取出20μl并加入7μl蛋白电泳缓冲液终止消化并立即煮沸5min，然后进行SDS-PAGE电泳检测胃蛋白酶的消化效果，对SDS-PAGE电泳蛋白条带进行灰度扫描检测残留蛋白量，计算野生型AFO^wt与突变体AFO^P477N蛋白经胃蛋白酶处理前和处理后的酶半衰期。

结果如图2、图3所示：本发明所述的突变体黄曲霉毒素氧化酶(AFO^P477N)，经模拟人工胃液(pH为1.2，浓度为0.012mg/mL的胃蛋白酶在37℃条件下)消化处理100分钟，经计算突变体AFO^P477N的半衰期约39min，而野生型AFO^wt的半衰期约32min，AFO^P477N的半衰期比野生型延长了22％。由此显示突变体AFO^P477N对胃蛋白酶的抗性比野生型AFO^wt提高了。

实施例8：野生型AFO^wt及突变体AFO^P477N重组蛋白的酶学性质分析

酶活测定

在室温，pH＝7.4的反应条件下，AFO^wt和AFO^P477N以AFB1作为水解底物发生反应，通过HPLC检测AFB1的峰面积的变化来表示底物减少量，进而对AFO的酶活进行表征。反应体系见表6。

表6：

体系成分	体积(ul)
		底物AFB1(1ug/mL)	2.5
AFO(2mg/mL)	25
		低盐缓冲液(PBS和NaCl)	222.5
总体积	250

室温反应30min，加入250μL甲醇充分震荡混匀以终止反应。将终止反应后的体系放在离心机中13 000rpm离心10min后，取20μL上清进行HPLC检测。温度值设为35℃，紫外吸光度365nm，FLD激发波长365nm，FLD发射波长425nm。

AFB1酶活力单位定义：一个单位(U)定义为在室温，pH＝7.4的条件下，每分钟降解1pmol AFB1所需要的酶量。酶活(U/mg)的计算公式为：

XD-酶活力，单位为U/mg

C₀-试样对照组的AFB1浓度，单位ng/ml

C-试样反应组的AFB1浓度，单位ng/ml

A-反应体系的体积，单位ul

T-反应时间，单位min

m-样品蛋白含量，单位mg

M-AFB1的摩尔质量，M＝312.3g/mol

最适反应温度及温度稳定性分析

最适反应温度：纯化后得到的AFO^wt和AFO^P477N蛋白在不同的温度(10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)下按照“实例8酶活测定”的方法测定酶活，以最高的酶活为100％，计算其他五个温度下的相对酶活。

温度稳定性：纯化后得到的AFO^wt和AFO^P477N蛋白在不同的温度(10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)下温育30min后，根据“实例8酶活测定”的方法测定酶活，以最高的酶活为100％，计算其他五个温度下的相对酶活。如图4所示，突变体AFO^P477N和野生型AFO^wt的最适反应温度都是30℃；如图5所示，野生型AFO^wt在10～50℃时可保有20％以上的酶活，突变体AFO^P477N在突变体在20～60℃时仍保有60％以上的活性。

相比于野生型，突变体在20～60℃时仍保有60％以上的活性；最适反应pH为6.0；在pH 7.0～8.0时保有40％以上的活性。

最适反应pH及pH稳定性分析

最适反应pH：纯化后得到的AFO^wt和AFO^P477N蛋白在不同pH(5、6、6.5、7、7.5、8)的低盐缓冲液(PBS和NaCl)中按照“实例8酶活测定”的方法测定酶活，以最高的酶活为100％，计算其他四个pH下的相对酶活。

pH稳定性分析：纯化后得到的AFO^wt和AFO^P477N蛋白在不同pH(5、6、6.5、7、7.5、8)的低盐缓冲液(PBS和NaCl)中30℃温育30min后，根据“实例8酶活测定”的方法测定酶活，以最高的酶活为100％，计算其他四个pH下的相对酶活。

如图6所示，野生型AFO^wt的最适反应pH为7.0，突变体AFO^P477N的最适反应pH为6.0。如图7所示，野生型AFO^wt在pH 7.0～8.0的范围内显示出较好的稳定性；突变体AFO^P477N在pH7.0～8.0时保有40％以上的活性。

综合以上两个实验可看出，突变体AFO^P477N的其他酶学性质相比于野生型黄曲霉毒素氧化酶发生了一些改变。

Claims (8)

1.一种提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶，其特征在于：它是由氨基酸序列为SEQID NO.1的来源于食用性真菌假密环菌(Armillariellatabescens)的黄曲霉毒素氧化酶随机突变筛选到的突变体黄曲霉毒素氧化酶，其具有一个氨基酸取代，所述的氨基酸取代是第477位的取代。

2.根据权利要求1所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶，其特征在于：所述在第477位的氨基酸取代是用天冬酰胺取代脯氨酸；所述的突变体黄曲霉毒素氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.一种DNA分子，其特征在于：其编码权利要求2所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶。

4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

5.一种载体，其特征在于：其含有权利要求3或4所述的DNA分子。

6.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求3或4所述的DNA分子，或者含有权利要求5所述的载体。

7.一种根据权利要求1所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶的生产方法，其特征在于，所述方法包括：在适于黄曲霉毒素氧化酶表达的条件下培养权利要求6所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的黄曲霉毒素氧化酶。

8.如权利要求1所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶在制备食品添加剂或饲料添加剂中的应用。

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