CN116042461B

CN116042461B - 一株娄彻链霉菌及在枸杞病害防控中的应用

Info

Publication number: CN116042461B
Application number: CN202211517575.1A
Authority: CN
Inventors: 何嘉; 黄大野; 孙海霞; 曹春霞
Original assignee: Hubei Biopesticide Engineering Research Center; Institute of Plant Protection of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sicience
Current assignee: Hubei Biopesticide Engineering Research Center; Institute of Plant Protection of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sicience
Priority date: 2022-11-29
Filing date: 2022-11-29
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2042-11-29
Also published as: CN116042461A

Abstract

本发明属于农业微生物领域，公开了一株娄彻链霉菌及在枸杞病害防控中的应用，所述的娄彻链霉菌为娄彻链霉菌（Streptomyces rochei）novonest14，保藏编号为：CCTCC NO:M 20221492，该菌株首次被报道用于叶面喷雾防治枸杞白粉病和炭疽病，灌根防控枸杞根腐病，在农业生产中具有广阔的应用前景。

Description

一株娄彻链霉菌及在枸杞病害防控中的应用

技术领域

本发明属于农作物防治技术领域，具体涉及一株娄彻链霉菌及在枸杞病害防控中的应用。

背景技术

枸杞(Lycium barbarum)为茄科枸杞属多年生落叶灌木，在中国等亚洲的一些国家种植和使用历史长达2 000多年。枸杞的果、叶、根、花均具有较高的药用价值和保健效果。枸杞根腐病是常发病害，随着枸杞种植年限的延长发病率逐年加重，造成植株死亡，给生产造成极大损失，严重制约产业发展。另外，枸杞炭疽病和白粉病是枸杞的主要叶部病害，同样会对枸杞产量造成一定损失。目前对枸杞病害的防治主要使用化学药剂，化学药剂的使用不但造成生产成本增加，且易产生抗药性，破坏生态平衡，潜在威胁人畜健康。因此筛选和利用微生物制剂来防治枸杞病害是解决问题的有效手段，是农业可持续发展的有效保障。

一株优秀的生防菌株能否发挥其能力的第一步就是在寄主植物根围及其他生境稳定定殖，生防菌的在根系和土壤中的定殖能力与防控效果密切相关。枸杞种植主要集中在我国青海和宁夏地区，土壤类型偏盐碱，气候干旱，外源生防菌剂由于盐碱和干旱的极端条件，使用到土壤后不能有效定殖和繁殖，生防效果大打折扣。另外，外源生防菌在枸杞根内定殖能力与土著生防菌具有较大差别，也是影响防效的一个重要因素。

本发明中生防菌从枸杞生长环境和植株内部分离的土著微生物更容易在枸杞和当地土壤中定殖，有助于提高病害防控效果，与市场上娄彻链霉菌菌剂产品具有明显区别。娄彻链霉菌novonest14是从枸杞根内分离的一株内生生防菌，目前防控枸杞病害的报道较少，本发明公布了其在枸杞白粉病、炭疽病和根腐病防控中的应用，生防菌在作物根系和叶际的定殖能力与生防效果密切相关，本申请还进行了novonest14在枸杞根系定殖能力的测定，旨在为后期novonest14的应用奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种分离的链霉菌，所述链霉菌为娄彻链霉菌novonest14，其保藏号为CCTCC NO:M 20221429。所述链霉菌可用于枸杞炭疽病、白粉病和根腐病的防治。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案来实现

一种分离的链霉菌，从枸杞根内分离，经鉴定为娄彻链霉菌(Streptomycesrochei)，已于2022年9月26日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：Streptomyces rochei novonest 14；保藏编号为CCTCC NO:M 20221492；地点：中国，武汉，武汉大学。

novonest 14菌株在高氏一号培养基上生长良好，气生菌丝颜色白色到灰白色，基内菌丝颜色起初为淡紫色后期变为黄色，后期菌落有黑色同心圆轮纹，边缘不规则，光学显微镜镜检观察到孢子链直或柔曲，孢子为棒状或椭球型。(图1)。

娄彻链霉菌(Streptomyces rochei)在制备植物病原菌抑制剂中的应用，特别是用于制备防治枸杞炭疽病、白粉病和/或根腐病的药物；

所述的应用过程是将含有娄彻链霉菌novonest 14的菌剂对枸杞进行灌根或喷施于枸杞叶面上。

本发明的保护内容还包括：娄彻链霉菌novonest 14用于制备防治枸杞病害的微生物菌剂。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明提供了一种娄彻链霉菌，该菌株首次被报道可用于同时防治枸杞炭疽病、白粉病和根腐病的防治，与现有杀菌剂和杀虫剂无交互抗药性。

(2)与目前使用化学合成农药防治相比，由于其来自于自然环境，具有高效、低毒、不污染环境和不易产生抗药性等优点。

(3)本发明筛选到的娄彻链霉菌具有枸杞根际际的定殖特性，与其他已报道的娄彻链霉菌相比，虽然在实验室阶段的平板抑菌实验效果上不相上下。离体抑菌试验表明，novonest14对枸杞根腐病病原菌具有良好的抑菌活性，抑菌率达到80.26％。但本发明的菌株特别适用于枸杞根腐病的防治，对枸杞灌根后，novonest14菌剂能明显降低枸杞根腐病死亡率，防效达到81.64％，而对照菌剂T203防效仅为10.19％。

附图说明

图1novonest 14菌株菌落形态。

图2菌株novonest14基于16S rRNA基因序列比对***发育树。

图3novonest 14抑菌活性示意图。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

娄彻链霉菌的获得及鉴定：

一株分离的娄彻链霉菌，从枸杞根系内分离得到，经16s rDNA结合生理生化鉴定后属于娄彻链霉菌(Streptomyces rochei)(图1，图2，表1)，已于2022年9月26日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：Streptomyces rochei novonest 14；保藏编号为CCTCC NO:M 20221492；地点：中国，武汉，武汉大学。

在本发明中，娄彻链霉菌novonest 14或被简称为novonest 14。

形态特征：菌落圆形，乳白色。

菌株生理生化特性：气生菌丝颜色白色到灰白色，基内菌丝颜色起初为淡紫色后期变为黄色，后期菌落有黑色同心圆轮纹，边缘不规则，光学显微镜镜检观察到孢子链直或柔曲，孢子为棒状或椭球型。

表1菌株novonest14生理生化特性-碳源利用

+：阳性反应；-：阴性反应；W:弱阳性反应实施例2：

娄彻链霉菌Streptomyces rochei novonest 14的发酵：

娄彻链霉菌Streptomyces rochei novonest 14种子液的制备：包括将斜面保存菌种在高氏1号平板活化，挑取菌块接种至200毫升种子培养基中，在30℃，180转/分的摇床上培养3天；即得种子液。

种子培养基配方为：1L培养基中包括25g蔗糖，8g大豆蛋白胨，0.50g磷酸二氢钾，0.6g碳酸钙，其余为水。

液体发酵液制备：将娄彻链霉菌Streptomyces rochei novonest 14种子液按5％量接种于发酵培养基，温度为30℃，发酵罐的搅拌速度500rpm/min，发酵培养基的装量为罐体容积的60％，发酵4天。

所述的发酵培养基的配方包括：甘露糖6％、大豆蛋白胨6％、酵母粉0.6％、碳酸钙0.8％、氯化钠0.5％；pH值7，其余为水。

将珍珠岩高温灭菌，将发酵液和珍珠岩均匀混合，混合比例为4mL：1g混合，混合后平铺于塑料盒中，珍珠岩高度为5cm，发酵温度为30℃，发酵时间为14d；100℃烘干后打碎备用；所述的珍珠岩的粒径为：3mm-5mm。

经珍珠岩基质发酵后，娄彻链霉菌Streptomyces rochei novonest 14的孢子数为3.0×10¹⁰个孢子/g，经分离划线培养，无杂菌，发酵均匀，完全，将该菌剂的浓度调整为3亿/g，用于以下实施例。

实施例3：娄彻链霉菌novonest 14对枸杞根腐病病原菌的抑菌活性及防控枸杞根腐病效果

供试枸杞根腐病病原菌茄病镰刀菌(Fusarium solani)分离自枸杞病植株，4℃保存于PDA斜面，其他病原真菌4℃保存于PDA斜面。将斜面菌株转入PDA平板进行活化，30℃培养6d备用。用4mm打孔器接入上述病原菌菌碟置于PDA平板中央，随后在距病原菌25mm处两侧接入novonest14平板菌碟，以不接novonest14菌碟空白对照，对照菌剂为(娄彻链霉菌T203)。

以待空白对照长满平板后统计各处理和对照菌落直径，并计算抑菌率。

抑菌率＝[(空白对照菌落直径-处理菌落直径)/(空白对照菌落直径-菌饼直径)]×100％

通过离体抑菌试验表明，novonest14对枸杞根腐病病原菌具有良好的抑菌活性，抑菌率达到80.26％(图3)，对照菌株T203抑菌率为82.77％。

枸杞根腐病试验地位于宁夏红宝寺枸杞基地，枸杞品种宁杞7号，树龄8年。2022年4月开展菌剂处理试验，将novonest14和T203菌剂稀释300倍灌根，每株菌液用量2.5L灌根，对照灌清水。间隔10天灌根一次，共灌根3次。每个处理4次重复，每个重复40棵枸杞，采摘前统计对照和处理死亡枸杞数量，并计算防效。

试验结果表明，novonest14菌剂能明显降低枸杞根腐病死亡率，防效达到81.20％，而对照菌剂T203防效仅为9.47％。

死亡率＝(植株总数-健康植株数量)/植株总数×100％

防治效果＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100％。

表2novonest14菌剂处理对枸杞根腐病的防治效果

处理	死亡率(％)	防效％(％)
			novonest14	5.62	81.64
T203	27.50	10.19
			对照	30.62	-

实施例4：娄彻链霉菌novonest 14对枸杞白粉病和炭疽病防控效果

枸杞白粉病和炭疽病试验设在红寺堡大河乡百瑞源枸杞种植基地，于5月上旬枸杞白粉病和炭疽病发病前期进行叶面喷药，novonest14菌剂稀释200倍，对照为清水，喷至叶面饱和，间隔7d施用第二次。约一个月左右，待对照充分发病每个处理4次重复，每个重复40棵枸杞，后调查枸杞白粉病和炭疽病的病情指数，并计算其防效。

枸杞白粉病分级标准：

0级：无病；

1级：病斑占整个叶面积的5％以下；

3级：病斑占整个叶面积的6％～10％；

5级：病斑占整个叶面积的11％～25％；

7级：病斑占整个叶面积的26％～50％；

9级：病斑占整个叶面积的51％以上。

病情指数＝Σ(各级病叶数×相对级数值)×100/(调查总叶数×9)。

枸杞炭疽病分级标准：：

0级：无病斑，叶色正常；

1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；

3级：病斑面积占整个叶面积的6％～10％；

5级：病斑面积占整个叶面积的11％～25％；

7级：病斑面积占整个叶面积的26％～50％；

9级：病斑面积占整个叶面积的51％以上。

防治效果(％)＝[1-(空白对照区施药前病情指数×处理区施药后病情指数)/(空白对照区施药后病情指数×处理区施药前病情指数)]×100

表3：novonest 14防控枸杞白粉病效果

处理	病情指数	防效(％)
			novonest 14	52.74	74.10
对照	13.66	-

表4：novonest 14防控枸杞炭疽病效果

处理	病情指数	防效(％)
			novonest 14	44.27	67.52
对照	14.38	-

实施例5：

novonest 14在枸杞根际定殖能力

将novonest 14和T203在含不同浓度利福平培养基进行抗性筛选，获得抗利福平突变菌株(菌株经检测除具有利福平抗性外，其余生理生化特性与原始菌株无显著性差异)，2个菌株可在含300μg·mL^-1的利福平的LB中正常生长。

将抗利福平突变2个菌株按照实施例2发酵，调整菌剂浓度为3亿/g，稀释300倍灌根枸杞苗和棉花苗根部，10d后取出植株，用无菌水将根部清洗干净，称1g、研磨、稀释后，涂布于含300μg·mL^-1的利福平的LB平板，37℃培养24h后计数，测定菌株在枸杞和棉花的定殖能力。

试验表明，在枸杞根际分离的novonest 14对枸杞根部具有专一的定殖效果，定殖量为3.6×10⁵cfu·g^-1，而在棉花根部无定殖作用，而T203在两种作物均无定殖作用，novonest 14的这种专一定殖效果能持续性防控根腐病的侵染,。

表5novonest 14和T203在枸杞和棉花根际定殖能力

Claims

1. 一株分离的娄彻链霉菌（Streptomyces rochei） novonest 14，所述的娄彻链霉菌novonest 14的保藏编号为：CCTCC NO:20221492。

2.权利要求1所述的娄彻链霉菌在防治枸杞病害中的应用，所述的病害为枸杞白粉病、枸杞炭疽病或枸杞根腐病。

3.权利要求1所述的娄彻链霉菌在制备防治枸杞病害微生物菌剂中的应用，所述的病害为枸杞白粉病、枸杞炭疽病或枸杞根腐病。

4.根据权利要求2所述的应用，所述的应用过程是将含有权利要求1所述的娄彻链霉菌的菌剂对枸杞进行灌根或喷施于枸杞叶面上。