CN116041506B - 糖缺失性转铁蛋白的单克隆抗体对及检测试剂盒 - Google Patents
糖缺失性转铁蛋白的单克隆抗体对及检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116041506B CN116041506B CN202310012006.XA CN202310012006A CN116041506B CN 116041506 B CN116041506 B CN 116041506B CN 202310012006 A CN202310012006 A CN 202310012006A CN 116041506 B CN116041506 B CN 116041506B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cdt
- monoclonal antibody
- transferrin
- trf
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 title claims abstract description 89
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 title claims abstract description 89
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 230000002950 deficient Effects 0.000 title claims description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 49
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 49
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 53
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 27
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 27
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 21
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 claims description 17
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 claims description 17
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 9
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 6
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 4
- 101100257637 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) trf-2 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 claims description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 101000766307 Gallus gallus Ovotransferrin Proteins 0.000 abstract description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 7
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008133 Iron-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010035210 Iron-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 description 1
- 206010008609 Cholangitis sclerosing Diseases 0.000 description 1
- 206010008635 Cholestasis Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000014567 Congenital Disorders of Glycosylation Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 208000036623 Severe mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 206010001584 alcohol abuse Diseases 0.000 description 1
- 201000007930 alcohol dependence Diseases 0.000 description 1
- 208000025746 alcohol use disease Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108700022763 carbohydrate-deficient transferrin Proteins 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000001883 cholelithiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 208000001130 gallstones Diseases 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical group 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 201000000742 primary sclerosing cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000010850 salt effect Methods 0.000 description 1
- 208000010157 sclerosing cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开一种糖缺失性转铁蛋白的单克隆抗体对及检测试剂盒。包括抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2,所述抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2分别与CDT抗原的不同表位结合,所述抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2不与TRF结合。利用该抗体制备的检测试剂盒可直接测试血液或体液样本中天然的CDT,无需将CDT与其他血清蛋白和非CDT的转铁蛋白异构体分离,无需对样本进行预处理。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体涉及糖缺失性转铁蛋白的单克隆抗体对及检测试剂盒。
背景技术
人转铁蛋白(Human Transferrin,TRF)是一种分子量约为80kDa的与铁结合的血浆单链糖蛋白,可将铁通过血液循环输送到制造红细胞的骨髓以及肝脏和脾脏中。在结构上,它是一条由679个氨基酸组成的多肽链,有两个铁结合位点和两个连接到Asn432和Asn630的N连接寡糖链,两个糖链位点分别可结合2支、3支或4支的糖链,每支糖链末端为一个带有负电荷的唾液酸分子。糖缺失转铁蛋白(Carbohydrate-deficient TransferrinCDT)是转铁蛋白的异构体,临床上将无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白和双唾液酸转铁蛋白亚型并称为CDT。
酒精滥用是CDT水平升高的最常见原因,CDT是唯一获得美国食品和药物管理局批准用于识别重度酒精使用的标志物。慢性酒精滥用者中,乙醇及其副产物乙醛抑制负责添加碳水化合物侧链的酶并诱导唾液酸酶的产生,该酶将末端唾液酸残基从侧链上切割下来。因此,在长期大量饮酒的患者中,每个转铁蛋白分子中碳水化合物成分的数量减少,从而提高了CDT的水平。
CDT升高还有许多其他原因,比如a)胆管因疾病阻塞或损坏的患者,例如胆汁淤积性肝病、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、胆结石或肝癌/胰腺癌患者,血液中CDT水平升高;b)转铁蛋白变体,该变体可由氨基酸取代而产生,目前已报道至少38种由于氨基酸取代而导致的遗传转铁蛋白变体,有三种表型:TRFC、TRFB和TRFD,其中TRFC为血液中转铁蛋白的正常形式,TRFB和TRFD为两种变体,TRFD在白种人中非常罕见,患病率不到万分之一,但已被证明会导致CDT水平升高,TRFD在非洲人中更为常见;c)先天性糖基化障碍综合症(Congenital disorders of glycosylation,CDG),它是一组非常罕见的综合症,是一种将侧链添加到蛋白质的酶的遗传缺陷,在受影响的儿童中,存在严重的智力迟钝以及其他身体异常,并且CDT水平在50-100%的范围内,在杂合子或疾病携带者中,CDT水平通常在10-25%的范围内;d)在某些生理或病理条件下,例如怀孕、类风湿性关节炎、恶性肿瘤和酗酒等,聚糖结构会发生特征性变化,血液中CDT水平升高。
目前CDT的检测方法中,由于缺乏与CDT特异性结合的CDT抗体,因此需要将CDT与其他血清蛋白和非CDT的转铁蛋白异构体分离。利用CDT和非CDT的转铁蛋白异构体的不同电荷和等电点,可以通过阴离子交换等色谱法、等电聚焦(IEF)电泳法或毛细管电泳和毛细管区带电泳将CDT和非CDT异构体分离出来。自1993年以来开发的许多商业CDT测试产品也都需要在免疫测定法定量检测CDT之前在阴离子交换微柱上分离CDT和非CDT异构体,这些产品包括CDTect-RIA、CDT-EIA(瑞典乌普萨拉的Pharmacia&Upjohn)、%CDT-TIA(挪威奥斯陆的Axis-Shield)、%CDTri-TIA(Bio-Rad Laboratories,CA,USA)和Tinaquant-%CDT/转铁蛋白(Roche Diagnostic GmbH,Germany),而近年来开发的基于免疫亲和液相色谱法和电喷雾质谱法的快速测定CDT的方法,材料和仪器昂贵,不能常规应用。
发明内容
本发明提供高特异性、高亲和力的糖缺失性转铁蛋白的单克隆抗体对及检测试剂盒,解决现有的CDT检测方法中缺乏与CDT特异性结合的CDT抗体、检测之前需要将CDT与其他血清蛋白和非CDT的转铁蛋白异构体分离的问题。
本发明提供糖缺失性转铁蛋白的单克隆抗体对,包括抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2,所述抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2分别与CDT抗原的不同表位结合,且所述抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2均不与TRF结合,其中所述抗CDT单克隆抗体M1是由保藏编号为CCTCC NO:C2022391的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRFM1产生的,所述抗CDT单克隆抗体M2是由保藏编号为CCTCC NO:C2022392的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M2产生的,所述抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M1和抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M2均于2022年12月21日保藏,保藏单位:中国典型培养物保藏中心;请求保***为深圳上泰生物工程有限公司,保藏地址为中国武汉。
进一步地,所述CDT抗原为天然CDT抗原或使用蛋白质重组技术制备的重组CDT抗原。
进一步地,所述抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2的制备方法包括以下步骤:
S1、将如上述的重组CDT抗原作为抗原进行动物免疫;
S2、提取S1中动物的细胞并与骨髓瘤融合产生杂交瘤细胞;
S3、用如上述的重组CDT抗原通过夹心ELISA选择所述产生所述抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2的杂交瘤细胞;
S4、用天然CDT抗原通过与所述S3步骤中的夹心ELISA相同的方法确认所述杂交瘤细胞;
S5、用TRF通过与所述S3步骤中的夹心ELISA相同的方法反向筛选所述杂交瘤细胞,得到产生所述抗CDT单克隆抗体M1的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M1和产生所述抗CDT单克隆抗体M2的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M2。
本发明还提供一种高特异性、高亲和力的糖缺失性转铁蛋白的检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2、校准品和质控品,所述试剂R1包括如上述的抗CDT单克隆抗体M1的胶乳微球偶联物和如上述的抗CDT单克隆抗体M2的胶乳微球偶联物。
进一步地,所述校准品和质控品含有如上述的CDT抗原。
进一步地,所述抗CDT单克隆抗体M1的胶乳微球偶联物和抗CDT单克隆抗体M2的胶乳微球偶联物的制备方法包括以下步骤:
S1、致敏:将乳胶溶液置于离心管中,加入敏化缓冲液,再加入所述抗CDT单克隆抗体M1或抗CDT单克隆抗体M2,混合均匀,置于37℃反应1小时;
S2、封闭:加入封闭缓冲液,超声2分钟后,37℃封闭1小时,封闭完成后,离心以去除上清液中未反应的部分;
S3、加入1mL致敏缓冲液并超声处理乳胶,用致敏缓冲液调节抗CDT单克隆抗体M1的胶乳微球偶联物700nm处的吸光度为0.8Abs。
进一步地,所述敏化缓冲液为pH6.1的20mM MES,所述致敏缓冲液为pH 7.5的10mMPBS,所述封闭缓冲液包括pH 7.5的10mM PBS、10%的牛血清白蛋白和0.095%w/w的叠氮钠。
进一步地,所述S1步骤中加入抗CDT单克隆抗体M1或抗CDT单克隆抗体M2后溶液的浓度为0.03~0.09mg/mL。
本发明还提供一种杂交瘤细胞对,所述杂交瘤细胞对分别用于产生如上述的单克隆抗体对,所述杂交瘤细胞对为产生所述抗CDT单克隆抗体M1的保藏编号为CCTCC NO:C2022391的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M1和产生所述抗CDT单克隆抗体M2的保藏编号为CCTCC NO:C2022392的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M2,所述抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M1和抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M2均于2022年12月21日保藏,请求保***为深圳上泰生物工程有限公司。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明的抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2是能识别天然CDT结构的抗体,是能分别识别不同的CDT表位的两个单克隆抗体对,利用该抗体制备的检测试剂盒可直接测试血液或体液样本中天然的CDT,无需将CDT与其他血清蛋白和非CDT的转铁蛋白异构体分离,无需对样本进行预处理。
(2)CDT与TRF蛋白的区别仅在于缺失糖基化位点,由于抗原识别表位空间较小,用常规方法无法同时制备两种识别不同表位的CDT单克隆抗体,因此,用于CDT特异性检测的试剂盒只能选择竞争法,本发明克服了上述不足,成功制备了能够结合CDT蛋白的两种不同表位的单克隆抗体,用本发明抗体制备的胶乳免疫比浊法试剂盒,用双抗夹心法检测即可,夹心法在抗体识别抗原反应中,抗体结合抗原的不同表位比识别单一表位更牢固,且随着抗原浓度增加,抗原抗体复合物能形成更大的网状颗粒,表现在光信号变化更大,比竞争法的检测灵敏度更高。
(3)利用蛋白质重组技术制备CDT抗原,并使用该CDT抗原作为抗原进行动物免疫,之后细胞融合获得产生抗体的杂交瘤细胞,通过夹心ELISA筛选产生CDT抗体的杂交瘤细胞,并用天然CDT确认和用TRF进行反向筛选,得到产生抗CDT单克隆抗体M1的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M1和产生抗CDT单克隆抗体M2的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M2。而现有技术中,通常将等电点为5.4的TRF与神经氨酸酶共同温育而人工制备等电点为5.7的CDT,这种将蛋白质变性处理,蛋白质构象的确认往往不完整,本发明的CDT抗原的制备则克服了上述的问题,且通过天然CDT确认和用TRF进行反向筛选,保证了本发明制备的抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2对天然CDT的特异性。
(4)该检测试剂盒基于透射或散射的胶乳增强免疫比浊法,可提高测定的准确性,扩大测定范围;配套使用通用的自动化分析设备,如全自动生化分析仪或特定蛋白分析仪等,能够降低经济成本。
(5)利用本发明的CDT检测试剂盒可直接检测样本中CDT的浓度,并同时计算CDT:TRF比率,提高了CDT在TRF增加的患者中的诊断特异性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为重组人血清转铁蛋白(TRF)完整质谱(Intact Mass);
图2为重组糖基缺失转铁蛋白(CDT)完整质谱(Intact Mass);
图3为重组TRF和重组CDT的凝胶电泳;
图4为不同浓度的单克隆抗体的吸光度检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例及附图,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
本发明实施例提供糖缺失性转铁蛋白的单克隆抗体对,包括可配对使用的抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2,所述抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2分别与CDT抗原的不同表位结合,且所述抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2均不与TRF结合,其中所述抗CDT单克隆抗体M1是由保藏编号为CCTCC NO:C2022391的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M1产生的,所述抗CDT单克隆抗体M2是由保藏编号为CCTCC NO:C2022392的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M2产生的,所述抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M1和抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M2均于2022年12月21日保藏,请求保***为深圳上泰生物工程有限公司。
具体地,所述CDT抗原为天然CDT抗原或使用蛋白质重组技术制备的重组CDT抗原。
具体地,所述抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2的制备方法包括以下步骤:
S1、将如上述的重组CDT抗原作为抗原进行动物免疫;
S2、提取S1中动物的细胞并与骨髓瘤融合产生杂交瘤细胞;
S3、用如上述的重组CDT抗原通过夹心ELISA选择所述产生所述抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2的杂交瘤细胞;
S4、用天然CDT抗原通过与所述S3步骤中的夹心ELISA相同的方法确认所述杂交瘤细胞;
S5、用TRF通过与所述S3步骤中的夹心ELISA相同的方法反向筛选所述杂交瘤细胞,得到产生所述抗CDT单克隆抗体M1的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M1和产生所述抗CDT单克隆抗体M2的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M2。
本发明实施例还提供一种高特异性、高亲和力的糖缺失性转铁蛋白的检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2、校准品和质控品,所述试剂R1包括如上述的抗CDT单克隆抗体M1的胶乳微球偶联物和如上述的抗CDT单克隆抗体M2的胶乳微球偶联物。
具体地,所述校准品和质控品含有如上述的CDT抗原。
具体地,所述抗CDT单克隆抗体M1的胶乳微球偶联物和抗CDT单克隆抗体M2的胶乳微球偶联物的制备方法包括以下步骤:
S1、致敏:将乳胶溶液置于离心管中,加入敏化缓冲液,再加入所述抗CDT单克隆抗体M1或抗CDT单克隆抗体M2,混合均匀,置于37℃反应1小时;
S2、封闭:加入封闭缓冲液,超声2分钟后,37℃封闭1小时,封闭完成后,离心以去除上清液中未反应的部分;
S3、加入1mL致敏缓冲液并超声处理乳胶,用致敏缓冲液调节抗CDT单克隆抗体M1的胶乳微球偶联物700nm处的吸光度为0.8Abs。
具体地,所述敏化缓冲液为pH6.1的20mM MES,所述致敏缓冲液为pH 7.5的10mMPBS,所述封闭缓冲液包括pH 7.5的10mM PBS、10%的牛血清白蛋白和0.095%w/w的叠氮钠。
具体地,所述S1步骤中加入抗CDT单克隆抗体M1或抗CDT单克隆抗体M2后溶液的浓度为0.03~0.09mg/mL。
本发明实施例还提供一种杂交瘤细胞对,所述杂交瘤细胞对分别用于产生如上述的单克隆抗体对,所述杂交瘤细胞对为产生所述抗CDT单克隆抗体M1的保藏编号为CCTCCNO:C2022391的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M1和产生所述抗CDT单克隆抗体M2的保藏编号为CCTCC NO:C2022392的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M2,所述抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M1和抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M2均于2022年12月21日保藏,请求保***为深圳上泰生物工程有限公司。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到,未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的细胞株、试剂及载体等均有商品供应或以别的途径能为公众所得,它们仅作为举例,对本发明不是唯一的,可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。
实施例1免疫原的制备、鉴定以及应用
免疫原的制备
人血清转铁蛋白的编码序列由来自人肝cDNA库的全长cDNA克隆的限制性片段组装而成。选择了最新的人类转铁蛋白基因表达的TRF,其序列为SEQ ID NO.1,如下所示:
使用基因合成的分子生物学方法,合成高水平的重组人血清转铁蛋白(TRF),通过电泳分析判断TRF分子大小和纯度(图1,与天然血清中分离的TRF的一致),具有完整糖基化位点和完整功能。
再利用蛋白质重组技术,将参与阴离子结合、盐效应、受体相互作用和金属结合调节的单个氨基酸残基替换成同位素取代的氨基酸,其中432和630位的天冬酰胺残基突变为天冬氨酸(图2),获得没有糖基化位点的去糖基-TRF(deglyco-TRF),即CDT抗原。
免疫原的鉴定
通过等电聚焦凝胶电泳验证CDT抗原的结构和等电点与天然CDT的一致性(图3)。
通过ELISA夹心法检测CDT抗原的特异性和准确性,具体用本发明的抗CDT单克隆抗体M1(anti-deglyco-TRF M1)包被,用本发明的CDT抗原或天然CDT夹心,用本发明的抗CDT单克隆抗体M2(anti-deglyco-TRF M2)检测。
免疫原的应用
CDT抗原还作为CDT检测试剂盒中的配套校准品和质控品的主要原料使用。用含有本发明的CDT抗原或天然CDT蛋白配制校准品,与分别用具有不同表位的两种单克隆抗体M1和M2致敏的两种胶乳微球混合以引起凝集,通过仪器的透射或散射光信号测量凝集的浊度变化。
实施例2抗体的制备
将实施例1获得的CDT抗原作为抗原,并对5周龄的BALB/c小鼠进行皮下免疫。提取的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合产生杂交瘤细胞。通过夹心ELISA选择产生CDT抗体的杂交瘤细胞,并用天然CDT确认。并用TRF进行反向筛选,确认抗CDT单克隆抗体对天然CDT的特异性。
动物免疫
浓度为0.5mg/mL的CDT抗原溶液与相同体积的佐剂混合并乳化,皮下免疫5周龄BALB/c小鼠。每隔两星期加强一次免疫,共免疫3次。每次免疫前取血样检测血液中的抗体活性。最后一次免疫的14天后,注射100μL的抗原乳液到小鼠的腹腔,3天后取出脾脏进行融合。
细胞融合
将小鼠脾细胞、骨髓瘤细胞(P3×63Ag8.653)和聚乙二醇4000混合于HAT选择性培养基中融合2分钟,分装于96孔培养板中,二氧化碳培养箱中37℃培养,制备杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞的筛选和确认
通过夹心ELISA法检测筛选上述制备的杂交瘤细胞中能够产生抗体的杂交瘤细胞,具体步骤包括:
a.将10μg/mL的抗小鼠抗体的PBS溶液加入96孔微孔板中,每孔200μL,并在4℃下反应过夜;
b.用PBS溶液洗涤一次微孔板,再用含0.5% BSA的PBS溶液封闭;
c.将杂交瘤细胞的培养上清液100μl加入微孔板中,室温下反应1小时;
d.再用含0.05%Tween的PBS洗涤溶液洗涤;
e.加CDT抗原或TRF在室温下反应1小时并如上述步骤洗涤;
f.加入100μL碱性磷酸酶(HRP酶)标记的抗转铁蛋白多克隆抗体(通过购买获得),使其在室温下反应1小时;
h.再次洗涤后,加入底物开始显色;
i.用酶标仪测量490nm处的吸光度。
选择具有针对CDT抗原但不针对TRF的抗体活性的杂交瘤细胞。
用人血清天然CDT通过相同的夹心ELISA确认产生的CDT单克隆抗体的杂交瘤细胞,获得杂交瘤细胞,杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体能够与人血清中天然CDT特异性结合,因此目标抗体可被筛选出来。
实施例3配对抗体的筛选
筛选出单克隆抗体后,从中取出两种单克隆抗体,一种作为捕获抗体,另一种作为标记抗体(HRP酶标记),将捕获抗体包被在抗原板上,先加入抗原(CDT抗原或天然CDT),孵育后洗去未结合的抗原,再加入标记抗体,孵育后洗去未结合的标记抗体,最后加入显色液显色。如果可以显色,说明标记抗体与抗原特异性结合,该捕获抗体与标记抗体为一对配对抗体。如果不能显色,说明标记抗体不能与抗原结合,从而被洗脱,该捕获抗体与标记抗体不是配对抗体。获得的抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2为天然CDT的匹配抗体,其中抗CDT单克隆抗体M1是由保藏编号为CCTCC NO:C2022391的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M1产生的,抗CDT单克隆抗体M2是由保藏编号为CCTCC NO:C2022392的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M2产生的,与对照测试的天然CDT浓度有良好的相关性。
实施例4CDT免疫比浊法检测试剂盒的制备和使用
CDT免疫比浊法检测试剂盒的制备
CDT胶乳免疫比浊法检测试剂盒包括:R1试剂、R2试剂、校准品和质控品。R1试剂为含促凝剂的缓冲液,R2试剂主要含抗CDT单克隆抗体M1胶乳微球偶联物和抗CDT单克隆抗体M2胶乳微球偶联物的混合悬液,校准品和质控品是将不同浓度的实施例1制备的CDT抗原溶解在特定的缓冲液中而制得。
抗CDT单克隆抗体M1/M2胶乳微球偶联物的制备(单抗浓度优化):将100μL的10%粒径为0.13μm的乳胶溶液置于1.5mL离心管中,加入825μL pH6.1的20mM MES,再加入一定量的10mg/mL抗CDT M1单克隆抗体,使溶液中的抗体浓度为0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL和0.09mg/mL,混合均匀,置于37℃反应1小时。致敏后,加入100μL封闭缓冲液(pH 7.5的10mM PBS、10%的牛血清白蛋白和0.095%w/w的叠氮钠),超声2分钟后,37℃封闭1小时。封闭完成后,离心以去除上清液中未反应的部分。加入1mL pH 7.5的10mM PBS并超声处理乳胶。用pH 7.5的10mM PBS调节抗CDT单克隆抗体M1的胶乳微球偶联物700nm处的吸光度为0.8Abs。
通过相同的步骤用抗CDT单克隆抗体M2致敏制备抗CDT单克隆抗体M2胶乳微球偶联物。
CDT免疫比浊法检测试剂盒的使用
使用日立自动分析仪Model 7180进行测量。让150μL R1试剂分别与各浓度的校准品5μL反应0-5分钟后,再加入50μLR2试剂,记录加入R2试剂后30秒的吸光度A1,反应1-5分钟后,记录吸光度A2,吸光度A2与A1的差值为反应度,以校准品浓度为横坐标,反应度为纵坐标做校准曲线。再按上述步骤测试样本,测试样本的吸光度带入校准曲线方程中,可计算出样本的浓度。上述吸光度的测量波长均为570nm,测光点为19-34。
将含有上述步骤制备的由不同浓度的抗CDT M1单克隆抗体制备的R2试剂检测不同浓度的CDT抗原,结果如图4。如图4所示,反应液中的抗体浓度为0.02mg/mL时灵敏度不充分,但在0.03mg/mL~0.09mg/mL时确认到CDT依赖性吸光度增加,表明这一范围是抗体的使用范围。
检测原理可以是免疫透射比浊法或散射比浊法,检验仪器可适用但不限于生化分析和特定蛋白分析仪。
按上述方法分别测试CDT的浓度和TRF的浓度,可计算CDT:TRF的比率。
实施例5CDT免疫比浊法检测试剂盒的性能测试
a.空白限
用5ul生理盐水作为CDT浓度为0的检测样本,按上述步骤重复测定20次,测试空白限结果如表1。
测试次数 | 测试浓度(mg/dL) |
1 | 0 |
2 | 0.1 |
3 | -0.3 |
4 | -0.2 |
5 | 0.1 |
6 | 0 |
7 | 0.2 |
8 | -0.2 |
9 | 0.1 |
10 | -0.2 |
11 | 0.2 |
12 | -0.3 |
13 | -0.1 |
14 | 0 |
15 | 0 |
16 | -0.4 |
17 | -0.1 |
18 | -0.3 |
19 | 0.1 |
20 | 0 |
ave | -0.065 |
SD | 0.1785 |
ave+2SD | 0.292 |
CDT试剂的ave+2SD值为0.292,表明试剂具有良好的空白限。
b.重复性
4个不同CDT浓度的血清样本,每个样本重复测试10次,测试重复性结果如表2。
测试次数 | 样本1(mg/dL) | 样本2(mg/dL) | 样本3(mg/dL) | 样本4(mg/dL) |
1 | 1.2 | 4.9 | 17.3 | 25.6 |
2 | 1.3 | 4.9 | 17.2 | 25.7 |
3 | 1.3 | 4.6 | 17.1 | 25.4 |
4 | 1.3 | 4.9 | 17.4 | 25.3 |
5 | 1.3 | 4.8 | 17.6 | 25.5 |
6 | 1.3 | 4.8 | 17.8 | 25.8 |
7 | 1.2 | 4.7 | 17.7 | 24.9 |
8 | 1.3 | 4.7 | 17.2 | 24.8 |
9 | 1.4 | 4.9 | 17.8 | 25.6 |
10 | 1.3 | 4.7 | 17.9 | 25.4 |
ave | 1.29 | 4.79 | 17.5 | 25.4 |
SD | 0.0568 | 0.1101 | 0.2944 | 0.3266 |
CV | 4.40% | 2.30% | 1.68% | 1.29% |
测试不同浓度的血清样本,测试重复性的变异系数均小于5%,说明CDT检测试剂盒具有良好的重复性。
c.线性范围
用纯化的天然CDT溶解在阴性血清中,分别配制低浓度和高浓度的CDT,再用高低浓度CDT互相混合成4个不同浓度,一共有6个不同浓度的CDT样本,分别使用检测试剂盒检测,每个浓度测试3次,分别求出检测结果的均值。以稀释浓度为自变量,以检测结果均值为因变量求出线性回归方程。结果如表3。
CDT检测试剂盒线性在1.2-120mg/dL范围内,相关系数为0.9998,绝对偏差小于1.2mg/dL,相对偏差在±5%以内,表明线性良好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.高特异性、高亲和力的糖缺失性转铁蛋白的配对单克隆抗体,其特征在于,包括抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2,所述抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2分别与CDT抗原的不同表位结合,所述抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2均不与TRF结合,其中所述抗CDT单克隆抗体M1是由保藏编号为CCTCC NO:C2022391的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M1产生的,所述抗CDT单克隆抗体M2是由保藏编号为CCTCCNO:C2022392的抗人脱糖转铁蛋白的杂交瘤细胞株TRF M2产生的,所述CDT抗原为天然CDT抗原或使用蛋白质重组技术制备的重组CDT抗原,所述杂交瘤细胞株TRF M1和杂交瘤细胞株TRFM2均以使用蛋白质重组技术制备的重组CDT抗原为免疫原免疫获得。
2.一种高特异性、高亲和力的糖缺失性转铁蛋白的检测试剂盒,其特征在于,包括试剂R1、试剂R2、校准品和质控品,所述试剂R1包括如权利要求1所述的抗CDT单克隆抗体M1的胶乳微球偶联物和如权利要求1所述的抗CDT单克隆抗体M2的胶乳微球偶联物。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒,其特征在于,所述校准品和质控品含有如权利要求1所述的CDT抗原。
4.如权利要求2所述的检测试剂盒,其特征在于,所述抗CDT单克隆抗体M1和抗CDT单克隆抗体M2的胶乳微球偶联物的制备方法包括以下步骤:
S1、致敏:将乳胶溶液置于离心管中,加入敏化缓冲液,再加入所述抗CDT单克隆抗体M1或抗CDT单克隆抗体M2,混合均匀,置于37℃反应1小时;
S2、封闭:加入封闭缓冲液,超声2分钟后,37℃封闭1小时,封闭完成后,离心以去除上清液中未反应的部分;
S3、加入1mL致敏缓冲液并超声处理乳胶,用致敏缓冲液调节抗CDT单克隆抗体M1的胶乳微球偶联物700nm处的吸光度为0.8Abs。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒,其特征在于,所述致敏缓冲液为pH 7.5的10mMPBS,所述封闭缓冲液包括pH 7.5的10mM PBS、10%的牛血清白蛋白和0.095%w/w的叠氮钠。
6.如权利要求4所述的检测试剂盒,其特征在于,所述S1步骤中加入抗CDT单克隆抗体M1或抗CDT单克隆抗体M2后溶液的浓度为0.03~0.09mg/mL。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310012006.XA CN116041506B (zh) | 2023-01-05 | 2023-01-05 | 糖缺失性转铁蛋白的单克隆抗体对及检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310012006.XA CN116041506B (zh) | 2023-01-05 | 2023-01-05 | 糖缺失性转铁蛋白的单克隆抗体对及检测试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116041506A CN116041506A (zh) | 2023-05-02 |
CN116041506B true CN116041506B (zh) | 2023-12-05 |
Family
ID=86123206
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310012006.XA Active CN116041506B (zh) | 2023-01-05 | 2023-01-05 | 糖缺失性转铁蛋白的单克隆抗体对及检测试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116041506B (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1378521A1 (de) * | 2002-07-05 | 2004-01-07 | Dade Behring Marburg GmbH | Carbohydrate Deficient Transferrin (CDT)-spezifische Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung |
CN1732261A (zh) * | 2002-12-24 | 2006-02-08 | 日东纺绩株式会社 | 用于诊断肝脏疾病的标志蛋白质以及使用该蛋白质诊断肝脏疾病的方法 |
JP2007254428A (ja) * | 2006-03-25 | 2007-10-04 | Nissui Pharm Co Ltd | 天然で未変性のcdtに対する抗体、抗体の製造方法、ハイブリドーマ、及び免疫測定方法 |
CN113866406A (zh) * | 2021-10-18 | 2021-12-31 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 一种特异性检测糖缺失性转铁蛋白的试剂盒 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090117668A1 (en) * | 2006-03-31 | 2009-05-07 | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. | Immune Agglutination Reagent Kit and Method of Measuring Antigen |
-
2023
- 2023-01-05 CN CN202310012006.XA patent/CN116041506B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1378521A1 (de) * | 2002-07-05 | 2004-01-07 | Dade Behring Marburg GmbH | Carbohydrate Deficient Transferrin (CDT)-spezifische Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung |
CN1732261A (zh) * | 2002-12-24 | 2006-02-08 | 日东纺绩株式会社 | 用于诊断肝脏疾病的标志蛋白质以及使用该蛋白质诊断肝脏疾病的方法 |
JP2007254428A (ja) * | 2006-03-25 | 2007-10-04 | Nissui Pharm Co Ltd | 天然で未変性のcdtに対する抗体、抗体の製造方法、ハイブリドーマ、及び免疫測定方法 |
CN113866406A (zh) * | 2021-10-18 | 2021-12-31 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 一种特异性检测糖缺失性转铁蛋白的试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116041506A (zh) | 2023-05-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO1994004563A1 (en) | PEPTIDES CONTAINING RESPECTIVE AMINO ACID SEQUENCES SELECTED FROM AMONG THOSE OF LIPOPROTEIN(a) AND APOLIPOPROTEIN(a), ANTIBODIES RESPECTIVELY RECOGNIZING THESE AMINO ACID SEQUENCES, AND METHOD OF ASSAYING WITH THESE ANTIBODIES | |
EP2105447A1 (en) | Avian-derived antibody capable of binding specifically to human hmgb1, immunological determination method for human hmgb1, and immunological determination reagent for human hmgb1 | |
EP2754672B1 (en) | Antibody capable of binding to specific region of periostin, and method of measuring periostin using the same | |
JPS61280571A (ja) | モノクロナ−ル抗体 | |
WO2016119639A1 (zh) | 检测重组蛋白提取物中残留杂蛋白的特异性抗体及检测试剂 | |
US20080261249A1 (en) | Detecting and Quantifying Host Cell Proteins in Recombinant Protein Products | |
EP3859332B1 (en) | Glycated hemoglobin (%) assay method | |
US20090117668A1 (en) | Immune Agglutination Reagent Kit and Method of Measuring Antigen | |
JP2008175814A (ja) | 尿中タンパク質分子の検出・定量による糖尿病性腎症の検査方法及びそれに使用するキット | |
EP2884277B1 (en) | Method and immunoassay reagent for measuring PIVKA-II | |
JP4310389B2 (ja) | 新規泡蛋白質及びその利用 | |
CN116041506B (zh) | 糖缺失性转铁蛋白的单克隆抗体对及检测试剂盒 | |
EP3988564A1 (en) | Leptin immunogen, hybridoma cell, monoclonal antibody, polyclonal antibody and use thereof | |
EP3239711A2 (en) | Method for measuring anti-drug antibody | |
EP0314338A1 (en) | Method for measuring human insulin | |
EP3184634A1 (en) | PROTEIN ASSAY METHOD SPECIFIC TO TRACP-5b (TARTRATE RESISTANT ACID PHOSPHATASE 5b) | |
US20060275849A1 (en) | Monoclonal antibody reagents | |
EP2187216B1 (en) | Novel liver cancer marker | |
EP3760641A1 (en) | Monoclonal antibody against apoa4, immunoassay method, and kit for measurement | |
JP7475584B2 (ja) | 免疫グロブリンaに結合しているペリオスチン並びに免疫グロブリンaに結合しているペリオスチンに結合する抗体、ペリオスチンの測定方法、ペリオスチンの測定試薬及びペリオスチン測定の正確性の改善方法 | |
US8349569B2 (en) | Anti-fibronectin fragment monoclonal antibody | |
JP2007254428A (ja) | 天然で未変性のcdtに対する抗体、抗体の製造方法、ハイブリドーマ、及び免疫測定方法 | |
JP4753366B2 (ja) | %cdtの定量方法 | |
CN115144597A (zh) | Cho-s细胞残留蛋白检测试剂盒及其制备方法 | |
CN113388034A (zh) | 脂蛋白(a)的抗原肽、其抗体及用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB03 | Change of inventor or designer information | ||
CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wu Xiangdong Inventor after: Zhang Ning Inventor after: Chen Xiaoru Inventor before: Wu Xiangdong Inventor before: Zhang Ning Inventor before: Zhou Liang Inventor before: Chen Xiaoru |
|
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |