CN113388034A - 脂蛋白(a)的抗原肽、其抗体及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及脂蛋白(a)抗体或其抗原结合片段,其特异性结合选自如SEQ ID NO:1~3所示的一种或更多种KIV抗原肽。使用这样的抗体可以准确地检测样本中脂蛋白(a)含量,而无需使用标准品来建立曲线。此外,本发明还涉及相应的抗原肽、核酸分子、融合蛋白和方法。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测领域,尤其涉及一种脂蛋白(a)的抗原肽及与其特异性结合的抗体。
背景技术
脂蛋白(a)(lipoprotein(a))主要合成于肝脏,对脂蛋白(a)检测的同时结合患者症状以及其他相关诊断结果(例如,甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、同形半胱氨酸等),可以对心血管疾病进行诊断。也就是说,准确检测脂蛋白(a)将利于心血管疾病的辅助判断。与其他脂蛋白一样,脂蛋白(a)包括一个内含胆固醇、甘油三酯、磷脂等的脂肪核。在该脂肪核外包裹有2条蛋白链,由apoB以及代表脂蛋白(a)特征的apo(a)组成,并由二硫键链接。因此,对脂蛋白(a)的检测只能针对其中的apo(a)来进行。
apo(a)是由许多小“圈”(亦称环饼结构)链接而形成的一个蛋白,根据氨基酸序列差异,其饼环结构可分为KIV-1~KIV-10型。除KIV-2型外,其他型均只有一个环饼结构,而KIV-2型在各个apo(a)中所重复的环饼数各异,其拷贝数范围可为3到40,从而导致了不同个体的apo(a)分子量从187000到662000不等。因此,KIV-2相对分子质量的不均一性使得了脂蛋白(a)免疫分析方法的准确性下降。具体而言,若抗体所识别的是多拷贝的KIV-2饼环区域,那么如果检测对象的apo(a)颗粒大小小于校准品的apo(a)颗粒大小,得到的脂蛋白(a)的检测结果就会偏低;反之,结果就会偏高。
为了克服难以准确反映脂蛋白(a)水平的问题,罗氏和电化生研均采用5个梯度不同颗粒大小的校准品。一方面,这样的方法的准确性强烈地依赖校准品所建立曲线,另一方面,制备以上校准品的过程非常繁琐,成本较高。
为了避免多个梯度的校准品的引入,理论上可以使用能识别每个apo(a)上具有单一拷贝数环饼区域(即,非KIV-2区域)的抗体来检测脂蛋白(a)的颗粒浓度。
对此,一些研究者尝试以重组KIV-1饼环为抗原进行免疫获得多克隆抗体,但由于所采用的抗原与KIV-2环饼的相似程度很高,所获得的多克隆抗体仍存在对KIV-2饼环有亲和力的情况,故无法获得真正意义上的非KIV-2特异性的抗体,不能准确反映脂蛋白(a)的水平。
此外,还有一些研究者尝试采用天然脂蛋白(a)为免疫抗原,筛选非KIV-2特异性的抗体,但由于KIV-2的多拷贝数和其与其他型KIV环饼的高相似度,使用天然脂蛋白(a)作为免疫抗原筛选非KIV-2特异性抗体的效率低下,从而无法高效地获得能准确反映脂蛋白(a)水平的抗体。
据此,在脂蛋白(a)检测领域中,存在对快速、便捷地获得非KIV-2特异性抗体的强烈需求。
发明内容
为了方便地筛选非KIV-2特异性抗体,本发明人对脂蛋白(a)中apo(a)结构进行了研究。在第一方面,本发明提供了一种抗原肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的一项或更多项所示。
使用本发明的抗原肽并按照常规的抗体制备方法,仅需免疫若干只动物,就能获得特异性结合KIV-6/7、KIV-8或KIV-9区域,而不结合KIV-2区域的抗体。此外,这样的抗体能够用于脂蛋白(a)的检测,且与市售的商品产品相比,具有较高的可比性。进一步地,使用本发明抗原肽所获得的抗体满足试剂关于偏差程度的性能要求。
在一个具体的实施方式中,本发明的抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一个具体的实施方式中,本发明的抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一个优选的实施方式中,本发明的抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一个具体的实施方式中,本发明的抗原肽还可为具有上述氨基酸序列的抗原肽的任意两种或更多种的组合,作为免疫原。例如:采用具有氨基酸SEQ ID NO:1的抗原肽和具有氨基酸SEQ ID NO:3的抗原肽一起作为免疫原。
需要说明的是,通过选择如SEQ ID NO:3所示的抗原肽,本发明进一步提高了筛选非KIV-2特异性的抗脂蛋白(a)抗体时效率,如下文实施例部分所证实的,使用SEQ ID NO:3所示的抗原肽制备抗原来免疫6只动物,所得到的6份免疫血清均对KIV-9呈阳性,而对KIV-2呈阴性。进一步地,在利用SEQ ID NO:3所示的抗原肽所筛选的抗体来检测脂蛋白(a)的情况下,其与市售的商品产品相比,具有非常高的可比性。
在第二方面,本发明提供了一种融合蛋白,其包括本发明的抗原肽。
在一些实施方式中,本发明的融合蛋白进一步包括选自亲和标签多肽。
在一些实施方式中,本发明的融合蛋白进一步包括蛋白载体。
在一些实施方式中,本发明的融合蛋白进一步包括将所述融合蛋白靶向预定的位置的多肽。
在第三方面,本发明提供了一种核酸分子,其编码本发明的抗原肽或者本发明的融合蛋白。
在第四方面,本发明提供了一种表达载体,其包含本发明第三方面中的核酸分子。
在第五方面,本发明提供了一种宿主细胞,其包含本发明第三方面中的核酸分子或本发明第四方面的表达载体。
在第六方面,本发明提供了一种获得非KIV-2特异性的抗脂蛋白(a)抗体的方法,所述方法利用本发明的抗原肽作为抗原。
在获得非KIV-2特异性的抗脂蛋白(a)抗体的方法一个变型中,所述方法利用本发明中抗原肽与蛋白载体的融合蛋白作为抗原。
在第七方面,本发明提供了一种制备抗体的方法,所述方法使用本发明的抗原肽作为免疫原来生产抗体。
在制备抗体的方法的一个变型中,所述方法利用本发明中抗原肽与蛋白载体的融合蛋白作为免疫原来生产抗体。
在第八方面,本发明提供一种抗体或其抗原结合片段,其特异性结合选自如SEQID NO:1~3所示的一种或更多种KIV抗原肽。
可替代地,本发明的抗体或其抗原结合片段是利用本发明第一方面的抗原肽而产生的。
可以理解,SEQ ID NO:1所示的抗原肽位于KIV-6区域和KIV-7区域上,当利用SEQID NO:1所示的抗原肽进行筛选时,可以获得能与KIV-6和KIV-7上相应抗原表位特异性地结合的抗体。SEQ ID NO:2所示的抗原肽位于KIV-8区域上,当利用SEQ ID NO:2所示的抗原肽进行筛选时,可以获得与KIV-8上相应抗原表位特异性地结合的抗体。SEQ ID NO:3所示的抗原肽位于KIV-9区域上,当利用SEQ ID NO:3所示的抗原肽进行筛选时,可以获得与KIV-9上相应抗原表位特异性地结合的抗体。
在一些实施方式中,本发明的抗体或抗原结合片段不与如SEQ ID NO:4所示的KIV-2抗原肽特异性结合。
在一个优选的实施方式中,本发明的抗体或其结合片段特异性结合如SEQ ID NO:3所示的KIV抗原肽。
在一些实施方式中,本发明的抗体可选自单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体。
在具体的实施方式中,本发明的抗体为单克隆抗体。
在具体的实施方式中,本发明的抗体为多克隆抗体。
在具体的实施方式中,所述抗体可为鼠源、兔源或羊源的。
在第九方面,本发明提供了一种核酸分子,其编码本发明的抗体或其抗原结合片段。
在第十方面,本发明提供了一种试剂盒,用于检测脂蛋白(a),其包括本发明的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中,试剂盒包括本发明的抗体或其抗原结合片段,并且其中所述抗体或其抗原结合片段包被在固相支持物上。
在另一些实施方式中,试剂盒包括本发明的抗体或其抗原结合片段,并且其中所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记物。
在又一些实施方式中,试剂盒包括本发明的第一抗体或其抗原结合片段,以及本发明的第二抗体或其抗原结合片段,并且其中,所述第一抗体或其抗原结合片段所结合的KIV抗原肽与所述第二抗体或其抗原结合片段的KIV抗原肽不同。
在再一些实施方式中,试剂盒包括本发明的抗体或其抗原结合片段,并且其中所述抗体未包被在固相支持物上且未带有可检测的标记物。
在本发明中,表述“第一”和“第二”等仅用于描述目的,用以区分所限定的物质,而不以任何方式限定次序或主次。
在第十一方面,本发明提供了一种检测脂蛋白(a)的方法,包括以下步骤:
a)将源自受试者的样本与本发明的抗体或其抗原结合片段接触;以及
b)确定所述样本中是否存在脂蛋白(a)或确定样本中所存在的脂蛋白(a)的水平。
在一些实施方式中,抗体或其抗原结合片段包被在固相载体上。
在另一些实施方式中,抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记物。
在又一些实施方式中,抗体或其抗原结合片段未包被在固相载体上且未带有可检测的标记物。
在示例性的实施方式中,抗体或其抗原结合片段被用于双抗体夹心测定中。
在第十二方面,本发明提供了抗体或其抗原结合片段在制备用于检测脂蛋白(a)的试剂盒中的应用。
在第十三方面,本发明提供了一种组合物,其包括选自如SEQ ID NO:1~3所示的一种或更多种KIV抗原肽,以及如SEQ ID NO:4所示的KIV-2抗原肽。
在第十四方面,提供了本发明第八方面的抗体或其抗原结合片段在制备用于评估心血管疾病的方法中使用的试剂盒中的用途,所述方法包括以下步骤:
a)将源自受试者的样本与权利要求1~6任一项中所述抗体或其抗原结合片段接触;以及
b)确定所述样本中是否存在脂蛋白(a)或确定样本中所存在的脂蛋白(a)的水平。
通过对脂蛋白(a)中对apo(a)链进行研究,本发明首次发现并确认了位于apo(a)链中的SEQ ID NO:1至3所示的抗原肽序列,通过使用这些抗原肽序列,能够更方便、快速地生产特异性结合仅具有单个拷贝的KIV-6/7、KIV-8或KIV-9区域的抗体,这些抗体不与KIV-2区域特异性结合。当这样的抗体被用来检测脂蛋白(a)时,可以使检测结果的准确地提高,同时本发明大大提高了筛选这样的抗体效率。另外,本发明的方案避免了脂蛋白(a)检测过程中,多浓度标准品的引入,降低了检测试剂的成本。
附图说明
图1示出了抗体#A1所制备的脂蛋白(a)检测试剂盒与商业化试剂比对结果;
图2示出了使用抗体#A1所包被的微球的情况下,粒径与绝对偏差之间的关系;
图3示出了使用抗体#A1制备脂蛋白(a)检测试剂盒的情况下,0~300nmol/L的参考物质所对应的绝对偏差,其中浓度≤100nmol/L的评价依据为绝对偏差;
图4示出了使用抗体#A1制备脂蛋白(a)检测试剂盒的情况下,0~300nmol/L的参考物质所对应的相对偏差,浓度大于100nmol/L的参考物质的评价依据为相对偏差;
图5示出了抗体#B4所制备的脂蛋白(a)检测试剂盒与商业化试剂比对结果;
图6示出了使用抗体#B4所包被的微球的情况下,粒径与绝对偏差之间的关系;
图7示出了使用抗体#B4制备脂蛋白(a)检测试剂盒的情况下,0~300nmol/L的参考物质所对应的绝对偏差,其中浓度≤100nmol/L的评价依据为绝对偏差;
图8示出了使用抗体#B4制备脂蛋白(a)检测试剂盒的情况下,0~300nmol/L的参考物质所对应的相对偏差,浓度大于100nmol/L的参考物质的评价依据为相对偏差;
图9示出了抗体#C3所制备的脂蛋白(a)检测试剂盒与商业化试剂比对结果;
图10示出了使用抗体#C3所包被的微球的情况下,粒径与绝对偏差之间的关系;
图11示出了使用抗体#C3制备脂蛋白(a)检测试剂盒的情况下,0~300nmol/L的参考物质所对应的绝对偏差,其中浓度≤100nmol/L的评价依据为绝对偏差;
图12示出了使用抗体#C3制备脂蛋白(a)检测试剂盒的情况下,0~300nmol/L的参考物质所对应的相对偏差,浓度大于100nmol/L的参考物质的评价依据为相对偏差。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明,本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明,而非限制本发明。
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。
如本文所使用的,术语“抗体”是指免疫球蛋白分子,包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体;此外,还涉及重组地或合成地产生/合成的抗体。抗体,如果以大于或等于约104M-1、优选地大于或等于约105M-1、更优选地大于或等于约106M-1和更优选地大于或等于约107M-1的Ka与抗原肽结合,则被定义为是“免疫特异性的”或特异性地结合。
如本文中所使用的,术语“单克隆抗体”是指是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,即,除可能的可以少量存在的自然发生的突变之外,构成群体的单个抗体是相同的。针对单抗原位点,单克隆抗体是高度特异的。单克隆抗体是有利的,因为它们可以通过杂交瘤细胞株培养获得,并且基本上不受其他免疫球蛋白的污染。
如本文所使用的,术语“多克隆抗体”是指无需制备杂交瘤细胞,而直接将抗原注入到动物体内进行免疫,经测定效价后所收集到的血液上清。可选地,在得到上清后,进一步纯化以得到多克隆抗体。
如本文所使用的,术语“抗原结合片段”通常包括亲代抗体的抗原结合区,轻链和/或重链可变区的至少一部分(例如,六个CDR),其保留亲代抗体的至少一定的结合特异性。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。
优选的,抗原结合片段是指抗体的抗原结合区、轻链和重链可变区或六个CDR。
本发明的抗体还包括抗体的衍生物,在本文中,“抗体的衍生物”指可以包括保守氨基酸替代的抗体(又称为“保守变异体”),它的生物学活性与亲代抗体相比基本不发生改变。
多克隆抗体可以通过本领域普通技术人员已知的多种技术中的任一种来制备。在一种这样的技术中,首先将含有本发明的抗原肽的免疫原(例如,偶联有蛋白载体的抗原肽)注射进适当的动物中,优选根据预定的计划进行一次或多次增强免疫接种,然后定期从动物取血。然后可以通过纯化技术,如Protein A亲和纯化,从这些血清中纯化出对本发明的抗原肽特异性的多克隆抗体。
同样,单克隆抗体可以通过本领域普通技术人员已知的多种技术中的任一种来制备。例如,这些方法可以包括:制备能够产生具有所需特异性的抗体的永生细胞系。可以例如从得自免疫动物的脾细胞产生这种细胞系。然后例如通过融合骨髓瘤细胞融合配偶体(如与所免疫动物同源的配偶体),使脾细胞永生化。例如,可以利用膜融合促进剂(如聚乙二醇或非离子型去污剂)使脾细胞和骨髓瘤细胞结合几分钟,然后以低密度铺板在支持杂交细胞、但不支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上。经过足够时间,通常约1~2周,观察杂合体集落。选择单个集落,测试对抗原肽的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。可从生长杂交瘤集落的上清中分离单克隆抗体。另外,可以利用多种技术增加收率,如将杂交瘤细胞系注射进合适脊椎动物宿主的腹腔中。然后从腹水液或血液中收获单克隆抗体。通过常规技术,如色谱法、凝胶过滤、沉淀或萃取,可以从抗体中去除污染物。例如,使用标准技术,通过固定化的Protein G或Protein A的色谱法,可以纯化抗体。
本发明的检测试剂盒可采用多种形式,例如,试纸、含有各种测试所需试剂的测试盒、微流体芯片等,可以按照本领域技术人员已知的标准步骤来制造试剂盒。
本发明的试剂盒根据需要可包括容器、芯片、使用说明书、缓冲剂、免疫助剂和/或用于进行诊断/检测所需的其他材料、结构和/或试剂。
实施例中采用乳胶增加透射比浊为例对本发明的试剂盒进行说明,但不应理解为本发明的试剂盒仅限于此。
本发明的试剂盒包括非KIV-2特异性抗体,其产生自经本发明抗原肽免疫的动物,并可以以本领域常规的方式存在,例如,以溶解或干燥形式存在于容器中,包被在固相载体上(例如,膜、板、珠(如磁珠)、微球(诸如羧基微球、氨基微球、氯甲基微球、物理吸附微球等),以溶解或干燥形式存在于芯片的腔室中,但本发明不限于此。
本发明的抗体可以约10~100μg/ml的浓度来使用。
本发明的试剂盒中用于进行诊断/检测所需的其他反应物包括但不限于,除本发明的抗体外的其他抗脂蛋白(a)抗体、抗人抗体等。上述其他反应物可以以本领域常规的方式存在,例如,以溶解或干燥形式存在于容器中,包被在固相支持物上,以溶解或干燥形式存在于芯片的腔室中,但本发明不限于此。
本发明的试剂盒中用于进行检测所需的其他材料包括但不限于用于取样材料、用于进行对照材料和/或用于观察检测过程或结果的材料。
本发明的试剂盒中用于进行检测所需的其他试剂包括但不限于、洗涤剂、显色剂和/或终止剂。
在一个实施方式中,在本发明试剂盒中的抗体是可检测地标记的。可以使用本领域技术人员已知的任何标记物和标记方法。常用的标记物可包括酶(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等)、放射性同位素(如32P或125I)等、生物素、地高辛、胶态金属(如胶体金等)、荧光染料(如荧光素、罗丹明、德克萨斯红等)、化学发光化合物或生物发光化合物(如二氧杂环丁烷、鲁米诺或吖啶鎓等)。可以使用任何本领域众所周知的标记步骤,如酶或生物素基团的共价偶联、碘化、磷酸化、生物素化等。
在一些实施方式中,用于进行检测所需的其他反应物中的一种或更多种也可以为可检测地标记的。
本发明还包括一种检测受试者中脂蛋白(a)的存在的方法,所述方法包括:使得自受试者的生物样本与本发明的至少一种抗体或其抗原结合片段接触,以确定所述生物样本中存在以可溶形式天然存在于该样本中、并具有可与所述至少一种抗体或其抗原结合片段反应的抗原决定簇的分子,所述接触在足以检测所述抗体或其抗原结合片段与所述抗原决定簇的结合的条件和时间下进行。
在一个实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段被可检测地标记。在另一个实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段没有被可检测地标记,且其中所述抗体或其抗原结合片段与抗原决定簇的结合的检测是间接的。
本发明还包括一种检测受试者中脂蛋白(a)的存在的方法,所述方法包括:使得自受试者的生物样本与至少一种与微球偶联的本发明的抗体或其抗原结合片段接触,所述接触足以使所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合抗原肽并由此形成产生浊度的复合体的条件和时间下进行,并从而检测脂蛋白(a)的存在。
本发明还包括一种检测受试者中脂蛋白(a)的存在的方法,所述方法包括:使得自受试者的生物样本与至少一种固定化的对本发明的抗原肽特异性的第一抗体或其抗原结合片段接触,以确定分子在样本中的存在,所述接触在足以使所述第一抗体或其抗原结合片段特异性地结合抗原肽并由此形成免疫复合物的条件和时间下进行;除去所述样本的没有特异性地结合所述第一抗体的组分;和使所述免疫复合物与至少一种本发明抗原肽特异性的第二抗体或其抗原结合片段接触,其中所述第二抗体或其抗原结合片段的抗原结合位点不会竞争性地抑制所述固定化的第一抗体或其抗原结合片段的抗原结合位点,所述接触在足以检测所述第二抗体或其抗原结合片段与抗原肽的特异性结合的条件和时间下进行,并从而检测脂蛋白(a)的存在。在一个实施方案中,所述固定化的第一抗体或其抗原结合片段选自与SEQ ID NO:3所示的抗原肽特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中,所述第二抗体或其抗原结合片段选自与SEQ ID NO:1或2所示的抗原肽特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
本发明还公开了一种检测受试者中脂蛋白(a)的方法,所述方法包括:检测得自受试者的生物样本中的脂蛋白(a);在足以形成抗体/抗原复合物的条件和时间下,使所述生物样本与本发明的抗体或其抗原结合片段接触;以及显示所述复合物是否存在。
在本发明中,生物样本包括血清和血浆。
检测方法包括但不限于放射自显影、比浊法、荧光显微镜检术、直接和间接的酶促反应、放射性同位素法或非放射性同位素法等。这些方法尤其包括免疫比浊法、乳胶增强透射比浊法、Western印迹、重叠测定、RIA(放射免疫测定)和IRMA(免疫放射免疫测定)、GIA(胶体金免疫测定)、EIA(酶免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、FIA(荧光免疫测定),以及CLIA(化学发光免疫测定)。
基于对apo(a)的完整氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot:P08519.1)的研究,本发明人发现KIV-6中的CYHGDGQSYRGSFSTT片段能够作为抗原肽来筛选非KIV-2特异性脂蛋白(a)抗体,该肽同样存在于KIV-7中;此外,还发现KIV-8中的CYRGDGQSYRGTLSTT片段能够作为抗原肽来筛选非KIV-2特异性脂蛋白(a)抗体;KIV-9中的CYHGDGRSYRGISSTT片段能够作为抗原肽来筛选非KIV-2特异性脂蛋白(a)抗体。
当作为抗原使用时,本发明还提供了含本发明抗原肽的融合蛋白。本发明的抗原肽可与免疫学领域常见的蛋白载体(也称载体蛋白)进行偶联,构成融合蛋白,以更充分地引起免疫反应。示例性的蛋白载体可以是KLH、BSA或OVA。
本发明的抗原肽可以以多个拷贝的形式存在。
本发明还涉及编码抗原肽的核酸,以例如用于生产本发明的抗原肽或含抗原肽的融合蛋白。编码本发明抗原肽的核酸包括但不限于:抗原肽的编码序列本身;抗原肽的编码序列及额外的编码序列;抗原肽的编码序列(和任选的额外的编码序列)及非编码序列,例如可以另外包括但不必限于一种或多种调节性核酸序列,其可以是受调节的或可调节的启动子、增强子、其它转录调节序列、抑制子结合序列、翻译调节序列或任何其它调节性核酸序列。因而,编码抗原肽的核酸涵盖仅包括该多肽的编码序列的核酸以及包括额外的编码和/或非编码序列的核酸。
本发明也包括等效的表达载体。利用多种方法可将合适的核酸序列***多种公知的适于所选宿主细胞的表达载体中的任一种中。一般而言,利用本领域已知的方法,将核酸序列***适当的限制性内切核酸酶位点。用于克隆、分离、扩增及纯化的标准技术,所涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶学反应以及各种分离技术,术语本领域技术人员已知并常用的技术。
可以使用多种表达***,如原核表达***和真核表达***中的表达载体和宿主细胞来生产本发明的抗原肽。接下来以哺乳动物表达***为例进行说明,宿主细胞可包括猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系以及能够表达相容性载体的其它细胞系,如C127、3T3、CHO、Hela和BHK细胞系。哺乳动物表达载体应包含复制起点、合适的启动子和增强子以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受***点、转录终止序列以及5’侧翼非转录序列。源自例如SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供所需的非转录性遗传元件。通过本领域技术人员熟悉的多种方法,包括、但不限于例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔,可以将构建体引入宿主细胞中。
本发明的抗原肽可以是未修饰的多肽,或可以是经翻译后修饰的多肽,例通过糖基化、磷酸化、脂肪酰化(包括糖基磷脂酰肌醇锚定修饰等)、磷脂酶切割(如磷脂酰肌醇特异性的磷脂酶c介导的水解等)、蛋白酶切割、去磷酸化或任何其它类型的蛋白质翻译后的修饰,例如涉及共价化学键形成或断裂的修饰。
下面将结合实施例对本发明的实施方式进行详细描述,实施例中未注明具体条件的,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产产商的,为可以通过商购获得的常规产品。
实施例1抗原肽序列的预测
通过Genebank获取apo(a)的完整氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot:P08519.1),根据推测的KIV三维结构预测抗原肽,具体序列如下表1所示。
表1
实施例2抗原溶液的制备
首先,通过多肽合成方法分别合成KIV-6/7、KIV-8和KIV-9区的抗原肽。
随后,根据Bioconjugate technigues,Elsevier academic press,2008年第2版,P755-763,第19章中羧基和氨基偶联的具体操作方法,先用EDC活化蛋白载体KLH,再将KIV-6/7、KIV-8和KIV-9区抗原肽分别与蛋白载体进行偶联。制备好的溶液即可作为抗原。
实施例3特异性识别KIV-6/7的多克隆抗体的制备
免疫步骤:
1)取成年新西兰兔3只,分别记为#A1至#A3;
首次免疫:皮内多点注射包括背部两侧、足掌、***周围、耳后等,1只动物注射总数约8~10点,抗原注射总量为10~100μg;
第二次免疫:间隔10~20天,进行第二次免疫,选择皮下多点注射,抗原注射总量10~100ug;
第三次免疫:间隔10~15天,进行第三次免疫,选择皮下注射,抗原注射总量10~100ug;
第四次免疫:间隔7~10天,进行第四次加强免疫,选择皮下注射,抗原注射总量10~100ug。
使用上述方法免疫动物后获得的血清进行效价检测:
1.将已知的抗原固著于塑胶孔盘上,完成后洗去多余的抗原;
2.每个孔加入不同稀释梯度的待测检体,检体中若含有待测的一次抗体,则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结;
3.洗去多余待测检体,加入带有辣根过氧化物酶的二次抗体,与待测的一次抗体键结;
4.洗去多余未键结二次抗体,加入酶底物使酶呈色,在酶标仪(ELISA reader)测定塑胶盘中的吸光值(OD450值),以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。
选择KIV-6/7抗原肽、KIV-2抗原肽和天然脂蛋白(a)为抗原,筛选同时满足对KIV-6/7抗原肽和天然Lp(a)呈阳性,而对KIV-2抗原肽呈阴性的血清为目标抗体,结果如下表2所示。
表2
注:“效价”为满足信号值/空白值≥2.1的最高稀释度;“空白”为两次重复测量OD450的平均值;NC为阴性对照;“包被”栏中,甲为KIV-6/7抗原肽、乙为KIV-2抗原肽和丙为脂蛋白(a)。
如表2所示,多克隆抗体#A1对KIV-6/7抗原肽效价高、对脂蛋白(a)效价高,而对KIV-2抗原肽效价低。
根据蛋白质实验手册(Mark Page和Robin Thorpe,使用蛋白A或蛋白G纯化,Humana Press,2002年第二版,第42章:993-994)记载的纯化步骤,对上述多克隆抗体#A1进行Protein A亲和纯化。
实施例4使用多克隆抗体#A1制备脂蛋白(a)检测试剂盒
试剂1:0.2M磷酸缓冲溶液,pH值7.5,1%BSA;
试剂2:采用如下所述的羧基微球两步法偶联工艺将实施例3最终制备的经纯化的多克隆抗体#A1化学偶联到羧基微球上制备而成:
1、取1ml粒径大小在100~200nm商品化乳胶微球(浓度10%)至0.05M pH 4.5-7.5MES buffer中,充分混匀10min;
2、5s内添加3倍羧基摩尔倍数的活化剂EDC至上述溶液中,活化15~30min;
3、5000~1000g离心去除上清,沉淀物重悬至0.05~0.2M pH 6.5~8.0的磷酸钾缓冲溶液;
4、添加饱和吸附量的抗体至活化后微球中,中速搅拌2~4h;
5、第4步反应后的溶液加入封闭剂(0.05-0.2M pH 8.0的磷酸钾缓冲溶液、3g/LBSA、5g/L精氨酸和2g/L Tween 80);
对第5步获得的溶液进行超声(功率50%),超声10min,吸光度在10000以内,所获得的溶液作为试剂2。
实施例5多克隆抗体#A1与商业化试剂的方法学比对
为了评估实施例4所制备的基于多克隆抗体#1的脂蛋白(a)检测试剂盒的效果,将其与已溯源至nmol/L的罗氏试剂cobas701***的方法学比对。
罗氏试剂在cobas 701上的测定参数按照罗氏Lp(a)试剂盒的说明书的记载进行。
本发明试剂盒在迈瑞BS-2000生化分析仪上检测时的过程为:
1)将2ul样本与180ul R1混匀,37℃孵育;
2)加入45ul R2混匀,37℃孵育;
3)根据以下参数进行测定
主波长:605nm,次波长:800nm,空白时间:18-18,终点时间:32-33。结果如图1所示。
由图1可知,基于多克隆抗体#A1的脂蛋白(a)检测试剂盒与罗氏试剂cobas701***的R2在0.9887,两者具有较高的可比性。
实施例6多克隆抗体#A1的性能评估
为了进一步考察实施例4所制备的基于多克隆抗体#1的脂蛋白(a)检测试剂盒是否能够满足试剂性能要求,按照实施例5中本发明试剂盒的检测方法,以80个国际nmol/L溯源用的参考物质进行检测,重复测试2次,取平均值,同时计算其绝对偏差及相对偏差(跟参考物质的靶值比)。
图2中每一点对应一个参考物质,由点的分布可知,绝对偏差跟颗粒度大小无关。由图3可知,当样本浓度在0~50nmol/L时,其绝对偏差在5nmol/L以内;当样本浓度在50~100nmol/L,其绝对偏差在10nmol/L以内。由图4可知,当样本浓度大于100nmol/L时,其相对偏差在10%以内。因此,使用多克隆抗体#A1制备的检测试剂盒的绝对偏差和相对偏差可以满足试剂性能的要求。
实施例7特异性识别KIV-8的多克隆抗体的制备
首先,按照实施例3中的免疫步骤,使用实施例2制备的KIV-8抗原溶液,对4只新西兰兔进行免疫。然后按照实施例3中的效价检测方法,对由免疫动物获得的血清进行测试,结果如下表3所示。
表3
注:“效价”为满足信号值/空白值≥2.1的最高稀释度;“空白”为两次重复测量OD450的平均值;NC为阴性对照;“包被”栏中,甲为KIV-8抗原肽、乙为KIV-2抗原肽和丙为脂蛋白(a)。
如表3所示,多克隆抗体#B2和#B4对KIV-8抗原肽效价高、对脂蛋白(a)效价高,而对KIV-2抗原肽亲和力低。
同样,根据蛋白质实验手册的记载,对其中的多克隆抗体#B4进行Protein A亲和纯化。
实施例8使用多克隆抗体#B4制备脂蛋白(a)检测试剂盒
根据实施例4中的记载使用多克隆抗体#B4制备脂蛋白(a)检测的试剂1和试剂2。
实施例9多克隆抗体#B4与商业化试剂的方法学比对
为了评估实施例4所制备的基于多克隆抗体#1的脂蛋白(a)检测试剂盒的效果,根据实施例5中记载的方法将其与已溯源至nmol/L的罗氏试剂cobas701***的方法学比对,结果如图5所示。
由图5可知,基于多克隆抗体#B4的脂蛋白(a)检测试剂盒与罗氏试剂cobas701***的R2在0.9924,两者具有极高的可比性。
实施例10多克隆抗体#B4的性能评估
为了进一步考察实施例8所制备的基于多克隆抗体#B4的脂蛋白(a)检测试剂盒是否能够满足试剂性能要求,按照实施例6中的方法进行测试,结果如图6~图8所示。
图6中每一点对应一个参考物质,由点的分布可知,绝对偏差跟颗粒度大小非常分无关。由图7可知,当样本浓度在0~50nmol/L时,其绝对偏差在5nmol/L以内;当样本浓度在50~100nmol/L,其绝对偏差基本在10nmol/L以内。由图8可知,当样本浓度大于100nmol/L时,其相对偏差基本在10%以内。因此,使用多克隆抗体#B4制备的检测试剂盒的绝对偏差和相对偏差可以满足试剂性能溯源的要求。
实施例11特异性识别KIV-9的多克隆抗体的制备
首先,按照实施例3中的免疫步骤,使用实施例2制备的KIV-9抗原溶液,对6只新西兰兔进行免疫。然后按照实施例3中的效价检测方法,对由免疫动物获得的血清进行测试,结果如下表4所示。
表4
注:“效价”为满足信号值/空白值≥2.1的最高稀释度;“空白”为两次重复测量OD450的平均值;“包被”栏中,甲为KIV-9抗原肽、乙为KIV-2抗原肽和丙为脂蛋白(a)。
如表4所示,多克隆抗体#C3对KIV-9抗原肽效价高、对脂蛋白(a)呈效价高,而对KIV-2抗原肽效价低。
同样,根据蛋白质实验手册的记载,对上述多克隆抗体#C3进行Protein A亲和纯化。
实施例12使用多克隆抗体#C3制备脂蛋白(a)检测试剂盒
根据实施例4中的记载使用多克隆抗体#C3制备脂蛋白(a)检测的试剂1和试剂2。
实施例13多克隆抗体#C3与商业化试剂的方法学比对
为了评估实施例12所制备的基于多克隆抗体#C3的脂蛋白(a)检测试剂盒的效果,按照实施例5中的方法将其与已溯源至nmol/L的罗氏试剂cobas701***的进行比对,结果如图9所示。
由图9可知,基于多克隆抗体#C3的脂蛋白(a)检测试剂盒与罗氏试剂cobas701***的R2在0.991,两者具有极高的可比性。
实施例14多克隆抗体#C3的性能评估
为了进一步考察实施例12所制备的基于多克隆抗体#C3的脂蛋白(a)检测试剂盒是否能够满足试剂性能要求,按照实施例6中的方法进行检测,结果如图10~图12所示。
图10中每一点对应一个参考物质,由点的分布可知,绝对偏差跟颗粒度大小无关。由图11可知,当样本浓度在0~50nmol/L时,其绝对偏差在5nmol/L以内;当样本浓度在50~100nmol/L,其绝对偏差在10nmol/L以内。由图12可知,当样本浓度大于100nmol/L时,其相对偏差在10%以内。因此,使用多克隆抗体#C3制备的检测试剂盒的绝对偏差和相对偏差可以满足试剂性能的要求。
以上所述仅为本发明的优选实施方式,并非因此限制本发明的专利范围,凡是在本发明的发明构思下,利用本发明说明书内容所作的等效变换,或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司
<120> 脂蛋白(a)的抗原肽、其抗体及用途
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Ser Phe Ser Thr Thr
1 5 10 15
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Cys Tyr Arg Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Leu Ser Thr Thr
1 5 10 15
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Cys Tyr His Gly Asp Gly Arg Ser Tyr Arg Gly Ile Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr
1 5 10 15
Claims (19)
1.一种抗体或其抗原结合片段,其特异性结合选自如SEQ ID NO:1~3所示的一种或更多种KIV抗原肽。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中,特异性结合如SEQ ID NO:3所示的KIV抗原肽。
3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体。
4.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体为单克隆抗体。
5.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体为多克隆抗体。
6.权利要求1~5任一项中所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体为鼠源、兔源或羊源的。
7.一种核酸分子,其编码权利要求1~6任一项中所述的抗体或其抗原结合片段。
8.一种试剂盒,其包括权利要求1~6任一项中所述的抗体或其抗原结合片段。
9.权利要求8所述的试剂盒,其包括:
1)抗体或其抗原结合片段,其如权利要求1~6任一项所定义,并且所述抗体或其抗原结合片段包被在固相支持物上;
2)抗体或其抗原结合片段,如权利要求1~6任一项所定义,并且所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记物;
3)抗体或其抗原结合片段,如权利要求1~6任一项所定义,并且所述抗体未包被在固相支持物上且未带有可检测的标记物;或者
4)第一抗体或其抗原结合片段,如权利要求1~6任一项所定义;以及第二抗体或其抗原结合片段,如权利要求1~6任一项所定义,并且其中,所述第一抗体或其抗原结合片段所结合的KIV抗原肽与所述第二抗体或其抗原结合片段的KIV抗原肽不同。
10.权利要求1~6任一项中所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于评估心血管疾病的方法中使用的试剂盒中的用途,所述方法包括以下步骤:
a)将源自受试者的样本与权利要求1~6任一项中所述抗体或其抗原结合片段接触;以及
b)确定所述样本中是否存在脂蛋白(a)或确定样本中所存在的脂蛋白(a)的水平。
11.权利要求10所述的用途,其中,所述抗体或其抗原结合片段包被在固相载体上、所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记物、或所述抗体或其抗原结合片段未包被在固相载体上且未带有可检测的标记物。
12.一种抗原肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的一项或更多项所示。
13.权利要求12所述抗原肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
14.一种融合蛋白,其包括权利要求12或13所述的抗原肽。
15.权利要求14所述的融合蛋白,其中,所述融合蛋白进一步包括选自亲和标签多肽、蛋白载体或将融合蛋白靶向预定的位置的多肽。
16.一种核酸分子,其编码权利要求12或13所述的抗原肽或者权利要求14或15所述的融合蛋白。
17.一种表达载体,其包含权利要求16所述的核酸分子。
18.一种宿主细胞,其包含权利要求16所述的核酸分子或权利要求17所述的表达载体。
19.一种获得非KIV-2特异性的抗脂蛋白(a)抗体的方法,所述方法利用权利要求12或13所述的抗原肽或者利用权利要求14或15所述的抗原肽与蛋白载体的融合蛋白作为抗原。
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