CN116035217B - 一种具有减肥减脂作用的组合物与应用 - Google Patents

一种具有减肥减脂作用的组合物与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有减肥减脂作用的组合物与应用，属于食品医药领域。本发明所述具有减肥减脂作用的组合物，包括以下重量份的组分：山药肽10～35份、N‑乳酰苯丙氨酸0.8～1.2份；所述山药肽的相对分子质量≤5kDa。该组合物通过山药肽与N‑乳酰苯丙氨酸相搭配，以N‑乳酰苯丙氨酸为辅助显著提升山药肽的减肥减脂功效，所得产品可有效抑制人体中胰脂肪酶的活性，展示出较好的减肥、减重功效，同时安全无毒副作用，可直接作为膳食补充剂补充人体所需其他营养。

Description

一种具有减肥减脂作用的组合物与应用
技术领域
本发明涉及食品医药领域，具体涉及一种具有减肥减脂作用的组合物与应用。
背景技术
超重和肥胖主要表现为人体体内脂肪组织积蓄过剩。引起超重和肥胖的原因有很多，包括遗传与环境因素、物质代谢与内分泌功能的改变、不良的生活及饮食习惯以及精神心理因素等。目前，除了控制饮食和加强锻炼外，超重和肥胖还缺乏对应的药效明确、副作用小的临床减肥方法。
另一方面，目前主流使用的化学类减肥药虽然种类较多，主流的化学类减肥药为了抑制人体热量的摄入，会采用一些控制人体食欲的神经激素类物质作为关键组分，这些物质虽然配合其他减肥药物或者减脂手术可以迅速帮助人们摆脱肥胖和超重，但这类化合物对复杂的中枢神经***中类似的受体都有一定作用，不可避免引起相应的副作用，且过量服用或对于一些特殊体质的人群而言容易上瘾，甚至可能造成厌食症等不良后果。
针对目前合成类化学减肥药的瓶颈问题，人们开始以中医药方向寻求药食同源且无毒副作用的减肥药方。主要在于中药对于人体的作用相对温和，同时采用“药食同疗”的方法可以进一步减少药物对于人体的副作用。现有中医药研究表明，肥胖人群的主要体质类型为痰湿质和气虚质，因此根据中医药角度，健脾补脾对于肥胖人群的减重和降脂具有十分重要的意义。
发明内容
基于现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供了一种具有减肥减脂作用的组合物，该组合物通过特定相对分子质量的山药肽与N-乳酰苯丙氨酸相搭配，以N-乳酰苯丙氨酸为辅助显著提升山药肽的减肥减脂功效，所得产品可有效抑制人体中胰脂肪酶的活性，展示出较好的减肥、减重功效，同时安全无毒副作用，可直接作为膳食补充剂补充人体所需其他营养。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种具有减肥减脂作用的组合物，包括以下重量份的组分：
山药肽10～35份、N-乳酰苯丙氨酸0.8～1.2份；
所述山药肽的相对分子质量≤5kDa。
山药甘平，补脾养肺，养阴生津，善补脾阴，因此也是“药食同源”的典范，而山药中的蛋白质含量丰富，当利用酶解技术将山药中蛋白质进行降解后，可产生具有生物活性的山药肽，该物质具有明显的抑制人体中胰脂肪酶并达到减肥减脂的功效。另一方面，单纯的山药肽对于人体的减肥减脂效果具有一定程度的限制，主要原因在于山药肽是一种混合物，其中的特定活性序列含量不高，需要摄入足量的山药肽方可实现好的生物效果；但过量摄入又会影响到人体的新陈代谢。为解决山药肽整体作用效率低的现实问题，发明人经过实验发现，在山药肽中加入一定含量的N-乳酰苯丙氨酸，可有效协同促进山药肽对于胰脂肪酶活性的抑制程度，这可能与其促进山药肽中特定活性序列与脂肪酶的结合有关。其中，N-乳酰苯丙氨酸又名lac-phe分子，该分子为内生氨基酸代谢物，可在血液中检测到，研究表明(如《An exercise-inducible metabolite that suppresses feeding and obesity》等)这种分子可以在一定程度上遏制小鼠食欲，但在人体中的效果尚未被确认。而发明人经过实验发现，当其作为辅助成分与山药肽共同作用时，对于食欲的抑制效果不明显，说明其在一定剂量范围内不会过分影响到神经中枢。同时，发明人经过实验发现，N-乳酰苯丙氨酸的添加量并非越多越好，过量的lac-phe分子摄入可能会导致整体产品对于胰脂肪酶抑制效率变低，所述组合物的两种关键组分需维持在特定的比例范围内才能实现最佳的减肥减脂功效。
另一方面，山药是营养丰富的天然植物部位，在进行酶解处理后，其含有各种大小不同的酶解肽物质，而较大的山药肽仍需要人体消化***消化，吸收难度较大，同时具有减肥减脂作用的有效成分不多，为了保障产品具有实时高效的减肥功效，本发明所述山药肽优选采用相对分子质量较小的种类。
优选地，所述组合物中N-乳酰苯丙氨酸的重量份为1份。
优选地，所述组合物中山药肽的重量份为20～30份。
正如上文所述，单独的山药肽并不能有效实现对于人体胰脂肪酶的抑制效果，随着N-乳酰苯丙氨酸的引入，整体组合物的对于胰脂肪酶的抑制效果进而整体表现出来的减肥减脂(减重)效果也逐渐提升，当两者的重量比为(20～30)：1时，产品的活性功效程度最高，当N-乳酰苯丙氨酸的添加量进一步提升时，产品的性能又会有所降低。
优选地，所述N-乳酰苯丙氨酸的制备方法，包括以下步骤：将L-苯丙氨酸、乳酸和氧化钙混合分散在溶剂中，随后在80～100℃下混合搅拌2.5～3.5h，经过滤、浓缩及干燥后，即得所述N-乳酰苯丙氨酸。
更优选地，所述L-苯丙氨酸、乳酸和氧化钙的质量比为L-苯丙氨酸：乳酸：氧化钙＝(0.9～1.05)：(4.3～4.5)：(0.09～0.13)。
更优选地，所述N-乳酰苯丙氨酸的制备方法还包括以下步骤：采用振动粉碎机将所得N-乳酰苯丙氨酸进行破碎处理，然后过20～25目筛，再将过筛所得粉末置入低温破壁粉碎机中，于-8～-12℃下振动粉碎10～20min。
优选地，所得产物可以通过HPLC-MS/MS***进行结构鉴定。
N-乳酰苯丙氨酸在人体中主要依靠cndp2蛋白的催化，以人体生成的乳酸及苯丙氨酸为原料结合并生成，而在本发明中，以L-苯丙氨酸、乳酸和氧化钙为原料，通过适当的加热混合条件同样可以制备出纯度较高的lac-phe分子并应用在本发明所述组合物当中。
本发明的另一目的在于提供一种本发明所述山药肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将山药粉碎后，加水混合均匀，再加入碱性蛋白酶进行酶解处理，得酶解液A；
(2)将酶解液A灭酶处理，随后离心，取上清液用超滤膜过滤后，经冷冻干燥，即得所述山药肽。
优选地，所述超滤膜为5kDa超滤膜。
现有技术中，山药肽的产率普遍较低，又由于山药酶解产物并非均能够起到减肥减脂的功效，因此当山药酶解产物应用在本发明所述组合物时，目标酶解低聚肽含量越多，其减肥减脂功效越好，同时生产经济效率也越高，而经过实验研究发现，不同的酶对于山药的酶解程度不同，酶解出来的产物也自然不同，当使用碱性蛋白酶对山药进行酶解时，相比于其他常见酶种类，不仅目标酶解低聚肽的产率较高，同时减肥减脂的活性较强。
优选地，所述步骤(1)中山药与碱性蛋白酶的质量比为100：(0.2～2.5)；
更优选地，所述步骤(1)中山药与碱性蛋白酶的质量比为100：(0.2～1)。
在酶解过程中，底物山药的添加量与酶接种量需维持在一个特定的比例上，并非越多越好，主要是由于山药在酶解后存留多种物质，包括未酶解的山药(酶解存在饱和现象)、酶的代谢物、酶以及酶解后除低聚肽之外的其他酶解结构产物，而由于本发明所述产品所需要的关键物质仅为山药肽，因此需要维持其最佳的浓度和产率。经筛选，以上述底物/酶添加比例制备的山药肽产率较高，纯度较高，功效更佳。
优选地，所述步骤(1)中酶解处理的温度为35～65℃；
更优选地，所述步骤(1)中酶解处理的温度为45～50℃。
在本发明中，酶解低聚肽需要维持在较低的相对分子质量范围，因此需要保障酶在酶解处理过程中具有较高的活性，而经过实验发现，酶解温度对于酶的活性有较大影响，无论是过低或过高都会使得酶的活性降低，同时过高的酶活性也会使得酶代谢物迅速增加，反而会抑制酶的酶解效率，因此，以35～65℃尤其是45～50℃的温度进行酶解处理的效果最佳。
优选地，所述步骤(1)中酶解处理的时间为6～24h；
更优选地，所述步骤(1)中酶解处理的时间为10～12h。
如上所述，随着酶解处理进程的推进，酶解产物以及酶的代谢物反而会造成酶活性的降低，因此酶解的时间并非越长越好，经试验筛选，以6～24h最为适宜。
优选地，所述步骤(2)中离心的温度为4～8℃，时间为10～25min，离心速率为8000～12000rpm。
本发明的再一目的在于提供所述组合物的制备方法，包括以下步骤：将各组分混合均匀，即得所述具有减肥减脂作用的组合物。
本发明所述具有减肥减脂作用的组合物的制备方法简单，无需依靠设备便可轻易实现工业化规模生产。
本发明的再一目的在于提供所述组合物在制备具有减肥功效的制品上的应用。
优选地，所述制品为药品、食品或保健品。
更优选地，所述药品的剂型为临床药学可接受的剂型。
更优选地，所述极性为片剂、丸剂、颗粒剂或液体剂。
本发明所述具有减肥减脂作用的组合物药效较好，可有效抑制人体中胰脂肪酶的活性，减少人体的脂肪含量，最终达到减脂减重的功能，该产品也具有丰富的膳食纤维，可同步补充人体所需营养。所述产品主要为人体含有物质以及天然生物酶解产物，安全无毒副作用，可长期使用。该产品具有良好的稳定性，可制备成各类制品或剂型，应用价值高。
同时需要说明的是，本发明所述组合物性质稳定，本领域技术人员根据实际需求，将该产品应用于制备商业制品时，可添加甜味剂、防腐剂、稳定剂等多种加工助剂或添加剂，只要不影响本发明所述组合物的功效均是允许的。
本发明的有益效果在于，本发明提供了一种组合物，该组合物通过特定相对分子质量的山药肽与N-乳酰苯丙氨酸相搭配，以N-乳酰苯丙氨酸为辅助显著提升山药肽的减肥减脂功效，所得产品可有效抑制人体中胰脂肪酶的活性，展示出较好的减肥、减重功效，同时安全无毒副作用，可直接作为膳食补充剂补充人体所需其他营养。本发明还提供了一种山药肽的制备方法，所述方法针对本发明所述组合物的特定活性低分子量低聚肽的需要，通过特定的酶种类实现山药酶解的高资源利用率和高产率。本发明还提供了所述组合物在制备具有减肥功效的制品上的应用。该产品安全无毒，作用效果强，适合应用在多个制品形式当中，商业价值高。
附图说明
图1为本发明所述N-乳酰苯丙氨酸的制备方法所制备产品以及N-乳酰苯丙氨酸标准对照品的HPLC-MS/MS结构标准图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及对比例对本发明作进一步说明，其目的在于详细地理解本发明的内容，而不是对本发明的限制。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。本发明实施、对比例所设计的实验试剂、原料及仪器，除非特别说明，均为常用的普通试剂、原料及仪器。
实施例1
本发明所述具有减肥减脂作用的组合物的一种实施例，本实施例所述组合物包括5份山药肽以及1份N-乳酰苯丙氨酸，两者直接混合得到产品。
所述山药肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将去皮清洁后的新鲜山药粉碎至100目后，按照质量比山药：水为1:25加水混合均匀后，调节混合液的pH至9.5，随后以质量比碱性蛋白酶：山药为0.2:100的接种量加入碱性蛋白酶，在45℃环境下搅拌6h进行酶解处理，得酶解液A；
(2)将酶解液A在90℃下灭酶处理30min，随后在4℃、10000rpm速率条件下离心15min至溶液分层，取上清液用超滤膜过滤5kDa以下的低聚肽后，经冷冻干燥，即得所述山药肽。
所述N-乳酰苯丙氨酸的制备方法，包括以下步骤：
将165g食用级L-苯丙氨酸、720g食用级乳酸和17g食用级氧化钙混合分散在2000mL水中，随后在100℃下混合搅拌3h，经过滤及旋蒸干燥后，采用振动粉碎机破碎成粗粉，随后过24目筛网，再转移至超低温超微破壁粉碎机中于-10℃下振动粉碎15min，即得所述N-乳酰苯丙氨酸。将所得产物以及市售N-乳酰苯丙氨酸标准对照品通过HPLC-MS/MS***进行结构鉴定所得产物为N-乳酰苯丙氨酸。
实施例2
本发明所述具有减肥减脂作用的组合物的一种实施例，本实施例所述组合物包括40份山药肽以及1份N-乳酰苯丙氨酸，两者直接混合得到产品。
所述山药肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将去皮清洁后的新鲜山药粉碎至100目后，按照质量比山药：水为1:25加水混合均匀后，调节混合液的pH至9.5，随后以质量比碱性蛋白酶：山药为1.5:100的接种量加入碱性蛋白酶，在55℃环境下搅拌12h进行酶解处理，得酶解液A；
(2)将酶解液A在90℃下灭酶处理30min，随后在4℃、10000rpm速率条件下离心15min至溶液分层，取上清液用超滤膜过滤5kDa以下的低聚肽后，经冷冻干燥，即得所述山药肽。
所述N-乳酰苯丙氨酸的制备方法同实施例1。
实施例3
本发明所述具有减肥减脂作用的组合物的一种实施例，本实施例所述组合物包括15份山药肽以及1份N-乳酰苯丙氨酸，两者直接混合得到产品。
所述山药肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将去皮清洁后的新鲜山药粉碎至100目后，按照质量比山药：水为1:25加水混合均匀后，调节混合液的pH至9.5，随后以质量比碱性蛋白酶：山药为2.5:100的接种量接种碱性蛋白酶，在65℃环境下搅拌18h进行酶解处理，得酶解液A；
(2)将酶解液A在90℃下灭酶处理30min，随后在4℃、10000rpm速率条件下离心15min至溶液分层，取上清液用超滤膜过滤5kDa以下的低聚肽后，经冷冻干燥，即得所述山药肽。
所述N-乳酰苯丙氨酸的制备方法同实施例1。
实施例4
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，以质量比碱性蛋白酶：山药为0.5:100的接种量接种碱性蛋白酶。
实施例5
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，以质量比碱性蛋白酶：山药为1:100的接种量接种碱性蛋白酶。
实施例6
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，以质量比碱性蛋白酶：山药为1.5:100的接种量接种碱性蛋白酶。
实施例7
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，以质量比碱性蛋白酶：山药为2:100的接种量接种碱性蛋白酶。
实施例8
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，以质量比碱性蛋白酶：山药为2.5:100的接种量接种碱性蛋白酶。
实施例9
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，酶解处理时的温度为35℃。
实施例10
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，酶解处理时的温度为40℃。
实施例11
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，酶解处理时的温度为50℃。
实施例12
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，酶解处理时的温度为55℃。
实施例13
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，酶解处理时的温度为60℃。
实施例14
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，酶解处理时的温度为65℃。
实施例15
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，酶解处理时的时间为8h。
实施例16
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，酶解处理时的时间为10h。
实施例17
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，酶解处理时的时间为12h。
实施例18
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，酶解处理时的时间为16h。
实施例19
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，酶解处理时的时间为20h。
实施例20
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述山药肽的制备方法步骤(1)中，酶解处理时的时间为24h。
效果例1
为了验证本发明所述具有减肥减脂作用的组合物的减肥减脂功效，将本发明实施例1所得产品采用橄榄油底物乳化法进行其对于胰脂肪酶活性抑制效果的测定，具体测试方法如下：
用蒸馏水配制2％的聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol，PVA)溶液，并用纱布过滤。向2％的PVA溶液中加入1/3体积的橄榄油，采用剪切乳化机10000rpm高速剪切9min，制备PVA乳液，即为底物溶液。向25mL的比色试管中加入2mL的橄榄油底物乳化液和2.5mL的PBS，涡旋震荡混均匀，并于40℃水浴5min，再加入1mL的加水稀释后的实施例1产品(2mg/mL)和0.5mL的胰脂肪酶溶液(3mg/mL)，充分混匀后继续水浴加热20min，加入6mL的95％乙醇和1mL的HCl(6mol/L)终止反应。加入3mL的异辛烷震荡90s，60℃水浴静置分层，取上层溶液1mL，再加入4mL的异辛烷及1mL的醋酸铜显色剂，漩涡震荡90s，静置分层后取上层溶液，710nm处测定吸光度。对照组(control)不添加本发明所述具有减肥减脂作用的组合物溶液。所有吸光度值均经过完全空白孔(blank，不添加样品溶液和酶)进行校准。按照如下公式计算：胰脂肪酶抑制率(％)＝(1-Asample/Acontrol)×100。
同时，采用实施例1相同方法配制类似的实验样品组，各实验样品组除了山药肽和N-乳酰苯丙氨酸的重量份不一样以外无其他区别，具有对照如表1所示，将各对照组进行相同的测试实验，结果如表1所示。
表1
分组 产品组分组成 胰脂肪酶抑制率(％)
实施例1 5份山药肽+1份N-乳酰苯丙氨酸 30.6±3.18
实验组1 5份山药肽+0份N-乳酰苯丙氨酸 25.5±2.61
实验组2 10份山药肽+1份N-乳酰苯丙氨酸 32.6±2.86
实验组3 15份山药肽+1份N-乳酰苯丙氨酸 37.6±1.91
实验组4 20份山药肽+1份N-乳酰苯丙氨酸 40.6±3.74
实验组5 25份山药肽+1份N-乳酰苯丙氨酸 45.6±2.68
实验组6 30份山药肽+1份N-乳酰苯丙氨酸 42.6±2.34
实验组7 35份山药肽+1份N-乳酰苯丙氨酸 35.6±3.76
实验组8 40份山药肽+1份N-乳酰苯丙氨酸 30.2±3.25
从表1可以看出，仅含有山药肽的实验组1表现出一定的胰脂肪酶抑制活性，但抑制程度并不高，而将N-乳酰苯丙氨酸与山药肽搭配后的实施例1产品其胰脂肪酶抑制率提升了5％左右，说明lac-phe分子的引入可有效协助山药肽实现更好的抑制效果。随着山药肽的比重增大，整体产品表现出来的胰脂肪酶活性抑制效果也逐渐增强，说明在一定程度上产品依然以山药肽为主要功效物质，lac-phe分子为辅助物质，并在两者的重量比为25:1时，所得组合物的胰脂肪酶抑制率最高，达到45.6％左右。但随着山药肽的添加比重继续增加至超过25:1时，产品的效果开始下降，至两者的重量比为40:1时，产品的抑制率降低至30.2％，说明两者需要维持在特殊的配比范围内才能实现较好的协同增效效果，其中两者重量比为(5～40)：1时，产品的胰脂肪酶抑制率可达到30％以上，而达到(20～30)：1时，抑制率可达到40％以上。
效果例2
进一步地，为了探究本发明所述组合物在活体生物应用上的真实减肥减重功效，以SPF级雄性C57小鼠，高脂饲料喂养10周构建肥胖小鼠模型。将肥胖小鼠随机分为5组，分别为模型对照组和4组给药组，4组给药组的测试对象分别为效果例1中实验组1产品、实验组2产品、实验组5产品和实验组8产品，每组12只小鼠。给药组每天灌胃0.5g/kg的对应产品，模型对照组给予等体积的蒸馏水，给药期间小鼠仍自由摄取高脂饲料。自给药开始每天记录小鼠的体重与摄食量，至第6周时将小鼠麻醉，取其腹部脂肪称重，计算不同时间阶段的体重平均值并记录实验结束后的统计体重增加率和进食量抑制率，测试结果如表2～4所示。
表2
表3
表4
分组 第六周小鼠腹部脂肪重量(mg，mean±SD)
模型对照组 364.7±40.8
实验组1 305.1±25.7
实验组2 289.5±32.1
实验组5 228.4±21.3
实验组8 271.5±27.9
从表2～4可以看出，由于高热量的摄食，模型组小鼠实验期间的体重增长率高达27.5％，实验模型构建成功，而相比于模型组，仅使用山药肽的实验组1产品可以有效抑制小鼠的体重增长率，使其降低至20.4％，另一方面，山药肽的使用也能少量地减少小鼠的正常摄食食欲，主要是由于山药肽具有一定的纤维饱腹感，因此在正常摄入下其可以存在一定的食欲抑制作用，这两种作用下使得小鼠体内的堆积脂肪量也有一定程度地下降。实验组2、5和8产品在应用时，相比于实验组1产品具有更加显著的功效，其中实验组5产品可以使得小鼠的体重增长率不足10％，实验后的脂肪质量只有约230mg，几乎只有模型组的一半，表明本发明所述组合物有益于降低食物中脂肪在消化***中的吸收和堆积，同时也能抑制外界脂类物质在体内转化为脂肪。相对而言，实验组5的产品效果优于实验组2和8的产品，这与效果例1的实验结果类似，说明本发明所述组合物在生物体应用时的减肥减重功能可能与生物体内的胰脂肪酶活性有关，而组合物中两种关键物质的配比也需要维持在一定范围内才能在生物体内实现理想的减肥减重功效。此外，从表3可以看出，各实验组对于小鼠的进食抑制率几乎相同，说明本发明所述组合物并不会如lac-phe分子在生物体内的作用机理这样通过直接抑制生物体的食欲来实现减肥减重功效，lac-phe分子只是作为辅助物质配合山药肽带来的饱腹感带来微弱(＜10％)的抑制进食作用，产品的主要功能机制还是在于抑制胰脂肪酶的活性。
效果例3
为了验证本发明所述山药肽的制备方法中所用酶种类的优选性，按照实施例1所述山药肽的制备方法进行酶解对照实验，除碱性蛋白酶外，分别采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶采用相同制备方法进行对照实验，统计实施例1组及各对照组产品的收率(即山药肽产品/原料去皮清洁后的新鲜山药×100％)，同时，统计实施例2和实施例3所得山药肽的收率。并采用效果例1中的方法检测以上山药肽的胰脂肪酶抑制活性，测试结果如表5所示。
表5
酶种类 山药肽产品收率(％) 山药肽产品胰脂肪酶抑制率(％)
碱性蛋白酶(实施例1) 1.37 25.5
胃蛋白酶 0.79 13.1
胰蛋白酶 0.81 15.6
木瓜蛋白酶 1.06 18.6
中性蛋白酶 0.96 17.3
碱性蛋白酶(实施例2) 1.51 26.3
碱性蛋白酶(实施例3) 1.62 22.8
从表5可以看出，并非任意的酶均可很好地对山药进行酶解并获得小分子的低聚肽，而碱性蛋白酶相比于其他种类的蛋白酶对于山药而言有更好的水解效果，各实施例所述制备方法所得山药肽的收率高达1.37～1.62％。相应地，酶的种类也决定了所得山药肽的胰脂肪酶抑制效率，相较于其他蛋白酶，碱性蛋白酶酶解制备的山药肽胰脂肪酶抑制活性较好。
进一步地，为了探究本发明所述山药肽在酶解过程中的酶/底物的最佳添加配比，除实施例1外，对实施例4～8所得山药肽同样进行收率统计与胰脂肪酶抑制活性评价，结果如表6所示。
表6
实施例 山药肽产品收率(％) 山药肽产品胰脂肪酶抑制率(％)
实施例1 1.37 25.5
实施例4 1.43 26.1
实施例5 1.58 26.6
实施例6 1.51 26.3
实施例7 1.55 26.5
实施例8 1.60 26.8
从表6可以看出，随着酶与底物的比例从0.2:100逐渐提升至实施例4～8所述的(0.5～2.5):100，所得山药肽的收率有所上升，但提升程度并不明显，提升了5倍浓度的实施例5相比于实施例1而言其收率增长率只有约15％，而随着酶添加量进一步增加，产物的收率没有进一步明显提升，甚至出现降低的情况，说明过多的酶添加量反而可能抑制酶的活性以及酶解的效率，无法水解得到低于5kDa分子量的产物。另一方面，当酶使用量达到(0.5～2.5):100时，山药肽的胰脂肪酶抑制活性在26.1～26.8％小范围内浮动变化，酶量的增加不会对制备处理的山药肽的胰脂肪酶活性产生大幅度提升。因此基于工艺成本及效果的考虑，酶与底物的添加质量比例以(0.2～1)：100最为合适。
进一步地，为了探究本发明所述山药肽在酶解过程中的最佳酶解温度，除实施例1外，对实施例9～14所得山药肽同样进行收率统计与胰脂肪酶抑制活性评价，结果如表7所示。
表7
实施例 山药肽产品收率(％) 山药肽产品胰脂肪酶抑制率(％)
实施例1 1.37 25.5
实施例9 1.28 22.5
实施例10 1.32 23.6
实施例11 1.45 26.5
实施例12 1.43 26.2
实施例13 1.38 24.6
实施例14 1.32 23.1
从表7可以看出，当酶解温度在35～45℃范围内时，山药肽的收率较低且随着温度提升，该收率也逐步提升，说明该温度范围对于碱性蛋白酶而言并非最佳。当酶解温度在45～60℃时，产物的收率较高，但当温度高于50℃后，产物的收率开始下降，说明碱性蛋白酶的最佳酶解温度约为45～50℃，而超过该范围反而会降低酶的酶解活性，同时也会增加工艺耗能。此外，不同酶解温度制备的山药肽的胰脂肪酶抑制活性与收率呈现相同的趋势，可以看出酶的最适活性决定着活性序列的有效释放。因此本发明所述山药肽在制备过程中的最佳酶解温度为45～50℃。
进一步地，为了探究本发明所述山药肽在酶解过程中的最佳酶解时间，除实施例1外，对实施例15～20所得山药肽同样进行收率统计与胰脂肪酶抑制活性评价，结果如表8所示。
表8
/>
从表8可以看出，随着酶解时间从实施例1的6h逐渐增加，山药肽的收率也有所增加，酶解至10h时产率达到1.5％以上，而酶解时间增加至一倍的12h后，收率达到了1.63％，增长率达到19％。随着酶解时间进一步推移，产物的收率并没有进一步提升，说明酶解出现饱和状态，甚至由于酶解物和酶代谢物的堆积，酶解反应被抑制。同样地，酶解时间为6～12h内制备的山药肽的胰脂肪酶抑制活性逐渐增加，但酶解时间在12h以后得到的山药肽其胰脂肪酶抑制活性开始出现下降的趋势，过度的水解可能造成其中活性序列的破坏。因此本发明所述山药肽的酶解时间最佳为10～12h。
效果例4
为了验证本发明所述山药肽的制备方法中过滤产物的优选性，除了按照实施例1所述山药肽的制备方法进行酶解对照实验，分别采用10kDa超滤膜(只能过滤相对分子质量10kDa以上的物质)和5kDa超滤膜(只能过滤相对分子质量5kDa以上的物质)，对酶解产物进行滤过，分别获得分子量＜5kDa、5-10kDa和＞10kDa的片段。通过效果例1中的方法检测胰脂肪酶抑制活性，测试结果如表9所示。
表9
组分片段 胰脂肪酶抑制率(％)
＜5kDa 25.5±2.61
5～10kDa 8.9±2.82
＞10kDa 4.36±1.47
结果如表9所示，山药肽的胰脂肪酶抑制率与分子量有关，分子量越小其抑制活性越高。相较于＞10kDa和5～10kDa的组分，分子量＜5kDa组分的胰脂肪酶抑制活性较好，说明酶解后制备的产物中并非所有组分均具有胰脂肪酶抑制活性，为了达到预期的效果，需要对产物进行特定筛选以获得活性山药肽。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种具有减肥减脂作用的组合物，其特征在于，由以下重量份的组分组成：
山药肽20~30份、N-乳酰苯丙氨酸1份；
所述山药肽的相对分子质量≤5 kDa；
所述山药肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）将山药粉碎后，加水混合均匀，再加入碱性蛋白酶进行酶解处理，得酶解液A；山药与碱性蛋白酶的质量比为100：（0.2~2.5）；酶解处理的温度为35~65℃，时间为6~24h；
（2）将酶解液A灭酶处理，随后离心，取上清液用超滤膜过滤后，经冷冻干燥，即得所述山药肽。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述N-乳酰苯丙氨酸的制备方法，包括以下步骤：将L-苯丙氨酸、乳酸和氧化钙混合分散在溶剂中，随后在80~100℃下混合搅拌2.5~3.5h，经过滤、浓缩及干燥后，即得所述N-乳酰苯丙氨酸。
3. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述超滤膜为5 kDa超滤膜。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述步骤（1）中山药与碱性蛋白酶的质量比为100：（0.2~1）。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述步骤（1）中酶解处理的温度为45~50℃；酶解处理的时间为10~12h。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述步骤（2）中离心的温度为4~8℃，时间为10~25min，离心速率为8000~12000rpm。
7.如权利要求1~6任一项所述具有减肥减脂作用的组合物在制备具有减肥功效的制品上的应用，所述制品为药品或保健品。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述制品对人体胰脂肪酶的活性具有抑制作用。
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