CN116024196B

CN116024196B - 一种脂肪酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN116024196B
Application number: CN202211493064.0A
Authority: CN
Inventors: 杨登峰; 李红亮; 潘丽霞; 李娟�; 张秀; 阳丽艳; 黄艳冰
Original assignee: Guangxi Academy of Sciences
Current assignee: Guangxi Academy of Sciences
Priority date: 2022-11-25
Filing date: 2022-11-25
Publication date: 2024-06-14
Anticipated expiration: 2042-11-25
Also published as: CN116024196A

Abstract

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种脂肪酶突变体及其应用。所述脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述脂肪酶突变体在制备三氯蔗糖中的应用具体为：以八乙酰基蔗糖为原料，在碱性蛋白酶E及脂肪酶突变体作用下，选择性脱除4,1’,6’‑乙酰基保护基，得到4,1’,6’‑三羟基‑五乙酰基蔗糖中间体，后经常规的化学氯代法以及水解法脱除其余乙酰保护基制备三氯蔗糖。本发明提供的脂肪酶突变体LIP‑GX蛋白表达量显著增高，特异性显著增强，反应所得选择性脱乙酰产物收率明显提高。对于三氯蔗糖生产领域来说，本发明提供的脂肪酶突变体LIP‑GX具有广泛的应用前景和经济效益。

Description

一种脂肪酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种脂肪酶突变体及其应用。

背景技术

近年来，三氯蔗糖作为一种应用广泛、附加值高的食品添加剂受到广泛的关注。其化学名为4,1',6'-三氯-4,1',6'-三脱氧半乳型蔗糖，是一种白色粉末状产品，极易溶于水、乙醇和甲醇。其甜度为蔗糖的600倍左右，且甜味纯正，同时具有安全性高、稳定性好等特点。三氯蔗糖是由英国Tate&Lyie公司于1976年开发的一种蔗糖氯化衍生物，目前其合成方法主要分为下几种：

(1)全基团保护法：以蔗糖为原料，首先，通过一步反应利用两种保护基保护蔗糖上的全部羟基，三苯甲基保护蔗糖6,1',6'-位三个伯位羟基，乙酰基保护剩余的仲位羟基；第二步，选择性脱除三苯甲基保护基得到五乙酰基蔗糖；再经4,6-位乙酰基迁移，制得重要中间体4,1',6'-三羟基五乙酰基蔗糖；之后，经过氯化、脱乙酰基保护得到三氯蔗糖，总收率约30％。本方法工艺流程复杂，所涉及的反应步骤较多，在工业生产过程中，无疑会增加生产成本及废液的排放量。全基团保护法制备三氯蔗糖的合成路线如下：

(2)单酯法：以蔗糖为原料，利用化学方法选择性的对蔗糖6-位伯羟基进行单酯化，即得蔗糖-6-酯，再用适当的氯化剂进行选择性氯化制备三氯蔗糖-6-酯，最后脱除6-位酯基制得三氯蔗糖，总收率约30％-40％。本方法虽然缩短了三氯蔗糖的合成步骤，但同样存在一些缺点。例如，在氯化反应过程中，由于氯化反应缺少选择性会造成多种氯代副产物杂质的生成，给后续纯化步骤造成巨大困难。保护法制备三氯蔗糖的合成路线如下：

(3)棉子糖法：以棉子糖为原料，棉子糖在三苯基氧膦或亚硫酰氯的作用下，经氯代生成4,1',6',6”-四氯-4,1',6',6”-四脱氧半乳型棉子糖，最后在酶作用下，水解生成三氯蔗糖，总收率约27％。本方法原料棉子糖来源较为困难，一般需从半乳糖和蔗糖水溶液中合成，生产成本较高。棉籽糖法制备三氯蔗糖的合成路线如下：

在以上这些工作基础上，本发明开发一种酶法-化学法联合制备三氯蔗糖的高效方法，以全乙酰蔗糖为原料，碱性蛋白酶E及脂肪酶突变体LIP-GX作用下，以较高的收率得到4,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖中间体，后经常规的化学氯代法以及水解法脱除其余乙酰保护基制备三氯蔗糖。

该方法与已报道的方法(全基团保护法或单酯法)相比，反应类型比较简单易操作，氯代反应位点更加专一，副反应及多氯代杂质较少，容易操作纯化。另外，酶法联合化学法可大大减少废液排放，比较符合当前环保要求，适用于工业生产。

发明内容

在本文中，术语“突变体”可理解为包含至少一个野生型或天然氨基酸被不同于野生型或天然多肽的氨基酸取代的突变型多肽。突变体可以只包含一个野生型或天然氨基酸取代，称为“点突变”或“单点突变”多肽。另外，突变体可包含两个或更多个野生型或天然氨基酸被不同于野生型或天然多肽的两个或多个氨基酸取代。

取代突变可利用本领域熟知的任何诱变技术制备，包括但不限于定点诱变。其中，定点诱变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的形状及表征。

本发明中，术语“表达载体”是指包含适当的调控序列，例如启动子、终止子、增强子等的本领域的常规表达载体。

本发明中，术语“氨基酸”：包含天然氨基酸、合成氨基酸、以及以类似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名法委员会(BiochemicalNomenclature Commission)所推荐的单字母符号来提及。

本发明中的脂肪酶突变体的构建，是通过定向进化的技术手段得到的。具体为，利用易错PCR、DNA重排、半理性设计及三维结构模拟等定向进行技术来获得突变体。更为具体的是，本发明通过三维结构模拟技术来进行酶的定向进化。采用同源建模的方法，利用能量最低原理和分子对接技术预测出可能的与催化相关的一个或多个位点，然后对这些位点进行定点饱和定点突变，从中筛选出活性有显著提高的突变体。

本发明中，术语“氨基酸序列”是氨基酸相互连接形成肽链(或多肽)的顺序。

本发明中，术语“重组质粒”指的是目的基因和载体结合后的产物。

本发明中，术语“宿主细胞”为本领域常规的各种宿主细胞，只要能使载体稳定地自行复制，且所携带的核酸分子可被有效表达即可。其中所述宿主细胞是真核表达细胞。

本发明中，术语表达盒：是指能够在宿主细胞(如微生物细胞、植物细胞)中表达所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动所述蛋白质基因转录的启动子，还可包括终止所述蛋白质基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

本发明中，术语一致性：指核酸序列间的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本发明的目的是提供一种脂肪酶突变体及其应用。

一方面，本发明提供了一种脂肪酶突变体LIP-GX，所述脂肪酶突变体LIP-GX的序列为：

(1)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

优选地，用于表达所述脂肪酶突变体LIP-GX的表达载体包括但不限于pPIC9K，pPIC3.5K，pPICZα、pPICZ、pET22b、pMA5。

优选地，用于所述表达载体转化的宿主细胞为真菌或细菌。

进一步优选地，用于所述表达载体转化的宿主细胞为毕赤酵母。

另一方面，本发明提供了一种脂肪酶突变体基因，其为用于编码上述的脂肪酶突变体LIP-GX的基因。

优选地，所述脂肪酶突变体LIP-GX基因的序列为：

(1)由SEQ ID NO.2所示的基因序列；或

(2)与序列SEQ ID NO.2限定的基因序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的基因序列；或

(3)SEQ ID NO.2所示的基因序列经增加、缺失或替换一个或多个密码子具有同等活性的由(1)衍生的基因。

又一方面，本发明提供了上述脂肪酶突变体LIP-GX或上述基因在制备三氯蔗糖中的应用。

当作为生物催化剂用于生产时，本发明的脂肪酶突变体LIP-GX可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括但不限于游离酶、固定化酶、纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶、细胞破碎物；所述菌体的形式包括但不限于存活菌体细胞、死亡菌体细胞。

优选地，用脂肪酶突变体LIP-GX和碱性蛋白酶E共同作用制备三氯蔗糖，反应式为：

所述碱性蛋白酶E的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步具体的，以八乙酰基蔗糖作为底物，向其中加入碱性蛋白酶E(SubtilisinE)反应2小时，后再将脂肪酶LIP-GX加入到反应体系中进一步反应8小时，选择性脱除4,1’,6’-乙酰基保护基，以较高的收率得到4,1’,6’-三羟基-五乙酰基蔗糖中间体，后经常规的化学氯代法以及水解法脱除其余乙酰保护基制备三氯蔗糖。

优选地，所述反应体系选自N,N-二甲基甲酰胺、正丁醇、水、丙酮、二氧六环、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈中的至少一种。

进一步优选地，所述反应体系选自N,N-二甲基甲酰胺、正丁醇中的至少一种。

再进一步优选地，所述反应体系为N,N-二甲基甲酰胺和正丁醇。

再进一步优选地，所述反应液中N,N-二甲基甲酰胺与正丁醇体积比为8:1-3:1。

优选地，所述八乙酰基蔗糖的浓度为30-70g/L。

优选地，所述脂肪酶突变体LIP-GX和碱性蛋白酶E的浓度为30-70mg/L。

优选地，用脂肪酶突变体LIP-GX和碱性蛋白酶E共同作用制备三氯蔗糖的主要作为机理为碱性蛋白酶E协同脂肪酶突变体LIP-GX选择性脱除乙酰蔗糖4,1’,6’-位乙酰基保护基。

又一方面，本发明提供了包含上述脂肪酶突变体LIP-GX的细胞器或细胞。

又一方面，本发明提供了包含上述基因的表达盒、质粒或细胞。

再一方面，本发明提供一种基因工程载体，所述基因工程载体包含上述的基因，所述基因工程载体为pPIC9K载体。

再一方面，本发明提供了一种重组菌，所述重组菌包含上述的基因。

优选地、所述的重组菌选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、罗氏真养杆菌、巨大产碱杆菌、假单胞菌属、气生单胞菌属、嗜盐单胞菌属、酿酒酵母、谷氨酸棒状杆菌中的一种。

进一步优选地，所述重组菌选自大肠杆菌BL21、枯草芽孢杆菌WB600、毕赤酵母GS115中的一种。

进一步优选地，所述宿主菌选自毕赤酵母GS115。

再一方面，本发明提供了上述重组菌在生产脂肪酶中的应用。

优选地，重组菌生产脂肪酶的工艺如下：

将大量发酵的重组菌发酵液，进行离心分离，8000rpm，10min，获得上清，再浓缩上清，即可以获得上清的浓缩液，也就是酶的浓缩液，即完成重组菌生产脂肪酶的工艺。

本发明的有益效果为：

(1)本发明与LIP(野生型蛋白)相比，本发明提供的脂肪酶突变体LIP-GX蛋白表达量显著增高，特异性显著增强，反应所得选择性脱乙酰产物收率明显提高。对于三氯蔗糖生产领域来说，本发明提供的脂肪酶突变体LIP-GX蛋白具有广泛的应用前景和经济效益。

(2)在生产中以八乙酰基蔗糖为底物，碱性蛋白酶E和脂肪酶LIP-GX催化反应，有效地获得了三氯蔗糖的前体4,1’,6’-三羟基-五乙酰基蔗糖的产生，从而为增加了最终生产三氯蔗糖提供保障。

(3)利用本方法生产的脂肪酶LIP-GX，最终产脂肪酶的蛋白表达量比以常规方法生产脂肪酶增加60％，可显著降低脂肪酶的生产成本。

附图说明

图1为LIP蛋白和LIP-GX蛋白的SDS-PAGE结果，图1中，M为蛋白标志物，1为LIP蛋白，2为LIP-GX蛋白。

图2为LIP和LIP-GX的HPLC检测结果。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，所使用的的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

以下实施例使用的实验材料如下：

pPICZA载体：购自Invitrogen公司，货号为V19520。

PTMl溶液：购自上海瑞楚生物科技有限公司，货号为T1925。

4,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖、6,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖标准品为自主合成并验证。

毕赤酵母GS115购自美国Thermofisher公司，货号为C18100。

酵母浸粉购自英国OXIOD公司，货号为LP0021。

咪唑购自生物工程(上海)股份有限公司，货号为A600277。

胰蛋白胨购自英国OXIOD公司，货号为LP0042。

生物素购自生物工程(上海)股份有限公司，货号为B540156。

YNB购自生物工程(上海)股份有限公司，货号为B540132。

实施例1突变蛋白的发现

在SEQ ID NO.3所示的脂肪酶氨基酸序列的基础上，进行同源建模、分子对接和同源蛋白氨基酸序列比对分析潜在的关键氨基酸位点，构建突变蛋白库(包括单突变、多突变等形式，由几十万个具体序列的蛋白质组成)。对突变蛋白库中的每个蛋白作为脂肪酶对酶活进行检测，发掘酶活显著增高的突变蛋白，其中一个突变蛋白如序列表的SEQ ID NO.1所示。

将SEQ ID NO.3所示的蛋白质命名为LIP蛋白，其编码基因如SEQ ID NO.4所示。将SEQ ID NO.1所示的蛋白质命名为LIP-GX蛋白，其编码基因如SEQ IDNO.2所示。与LIP蛋白相比，LIP-GX蛋白具有两个点突变，点突变依次为V230和V233。

实施例2重组酵母的获得

一、重组酵母GS115-LIP的获得

1、将SEQ ID NO.4自5’末端第1至891位核苷酸所示的双链DNA分子正向***pPICZA载体的Xho I和Not I酶切位点之间，得到重组质粒pPicZa-LIP。

2、用限制性内切酶SacI将重组质粒pPicZa-LIP进行单酶切，得到线性化质粒。

3、将步骤2得到的线性化质粒导入毕赤酵母GS115，得到重组酵母毕赤酵母GS115-LIP。

二、重组酵母GS115-LIP-GX的获得

1、将SEQ ID NO.2自5’末端第1至891位核苷酸所示的双链DNA分子正向***pPICZαA载体的XhoI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pPICZαA-LIP-GX。重组质粒中，形成SEQID NO.6所示的融合基因，表达SEQ ID NO.5所示的融合蛋白。

2、用限制性内切酶SacI将重组质粒pPicZa-LIP-GX进行单酶切，得到线性化质粒。

3、将步骤2得到的线性化质粒导入毕赤酵母GS115，得到重组酵母GS115-LIP-GX。

实施例3、LIP蛋白和LIP-GX蛋白的制备以及LIP蛋白和LIP-GX蛋白作为脂肪酶的酶学性质

一、蛋白的制备

BMGY液体培养基：

溶剂为pH＝6.0的PBS缓冲液；

溶质及其浓度如下：

酵母提取物10g/L、胰蛋白胨20g/L、甘油l0g/L、YNB13.4g/L、生物素4×10^-4g/L。

BMMY液体培养基：

溶剂为pH＝6.0的PBS缓冲液；

溶质及其浓度如下：

酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，甲醇0.5％(体积百分含量)，YNB13.4g/L，生物素4×10^-4g/L。

溶液I：

溶剂为pH＝8.0，20mM的Tris-HCl缓冲液；

溶质及其浓度如下：

20mM咪唑，300mM NaCl。

溶液Ⅱ：溶剂为pH＝8.0，20mM的Tris-HCl缓冲液；

溶质及其浓度如下：

250mM咪唑，300mM NaCl。

重组酵母为：重组酵母GS115-LIP或重组酵母GS115-LIP-GX。

蛋白的制备包括以下步骤：

1、将重组酵母接种至3mL BMGY液体培养基中，30℃，250rpm振荡培养18小时，得到OD_600nm＝3的种子液。

2、取lmL种子液，接种至10mL BMMY液体培养基中，30℃，250rpm振荡培养96小时。培养过程中，分别于培养24、48、72小时后各向培养体系补加100μL甲醇。

3、取整个培养体系，4℃，8000rpm离心15分钟，收集上清液。

4、将上清液过镍亲和离子柱，然后用10mL溶液Ⅰ洗涤柱子，然后用2mL溶液Ⅱ洗脱目的蛋白，收集用溶液Ⅱ洗脱时的过柱后溶液。所述镍柱为Qiagen公司生产的规格为1mL的柱子。

5、将上述过柱后溶液转移到透析袋中，在去离子水中4℃透析48小时(每6小时更换新的去离子水)，然后取透析袋内的液相，冷冻干燥，得到干粉。

所述利用重组酵母GS115-LIP进行上述步骤得到的干粉为LIP蛋白。每10mL完成步骤2的体系中，LIP蛋白的产量为2.0mg。

重组酵母GS115-LIP-GX进行上述步骤得到的干粉为LIP-GX蛋白。每10mL完成步骤2的体系中，LIP-GX蛋白的产量为4.5mg。

将LIP蛋白和LIP-GX蛋白分别用pH6.0，100mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图1。

结果表明，LIP-GX的蛋白表达量比原始的LIP增加60％，得到了显著提高。

二、LIP蛋白和LIP-GX蛋白作为脂肪酶的酶活性比较

脂肪酶酶活性的测定方法如下：

500μL反应体系中包括400μL的Tris-HCL缓冲液(20mmol/L、pH 8.0)、50μL的pNPB(10mmol/L)和50μL酶液，37℃下反应5min，500μL无水乙醇终止反应，410nm下测量吸光度值。

酶活力定义：在一定温度和pH下，1min内催化生成1μmoL对硝基苯酚所需要的酶量定义为一个活力单位(U)。酶活性的计算公式如下：

U＝[ΔA/(0.01×t)]×D；

式中：U为酶活力；ΔA是反应时间内吸光值的变化；t为反应时间(min)；D为稀释倍数。

实验结果：LIP-GX的发酵液上清酶活力为116U/ml；LIP的发酵液上清的酶活力为72U/ml；突变酶的活力比野生酶的活力提高了至少60％；但LIP-GX的比酶活性为124U/mg；LIP的比酶活性为128U/mg，野生酶和突变酶的比酶活性基本在一个水平上。因此，我们可以得出LIP-GX是在表达量得到了增加，而不是酶比活上的增加。

三、蛋白作为脂肪酶的特异性

利用脂肪酶突变体LIP-GX或上述基因制备三氯蔗糖的工艺如下：

将八乙酰蔗糖先与蛋白酶E反应，再和脂肪酶LIP-GX进行反应，得到4,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖和6,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖的混合物，再将6,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖转化为4,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖，然后进行4,1',6'位的氯化反应，得到4,1',6'-氯化-五乙酰基蔗糖，最后在甲醇钠和甲醇中完成水解反应，得到三氯蔗糖。

脂肪酶酶催化特异性的测定采用高效液相色谱法。脂肪酶在一定条件下，催化1',6'-二羟基-六乙酰基蔗糖生成大量4,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖和6,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖。通过三种化合物标准品制备标准曲线，再根据液相结果的峰面积计算转化率。LIP和LIP-GX的HPLC检测结果如图2所示。

转化率＝目标产物/总产物×100％；

LIP-GX的总转化率为85％；产物1的转化率为50％；产物2的转化率为35％；LIP的总转化率为80％，产物1的转化率为36％；产物2的转化率为44％。

高效液相色谱法检测脂肪酶反应后的产物，色谱条件如下：

流动相：

A液：超纯水

B液：乙腈

流动相比例：A液：B液＝25:75；

色谱柱：C18，流速1mL/min；

柱温：30℃；

检测波长：210nm；

进样量20ul，样品浓度为5mg/mL。

LIP蛋白进行上述步骤，4,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖在产物中所占的质量百分含量为36％，6,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖在产物中所占的质量百分含量为44％。LIP-GX蛋白进行上述步骤，4,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖在产物中所占的质量百分含量为50％，6,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖在产物中所占的质量百分含量为35％。

结果表明，与LIP蛋白相比，LIP-GX蛋白作为脂肪酶的特异性大幅提高，4,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖含量提高了38.89％，6,1',6'-三羟基-五乙酰基蔗糖含量下降20.45％，具有更好的应用于工业生产的潜力。

实施例4、重组酵母GS115-LIP-GX的大规模发酵

一、制备培养基和相关溶液

种子培养基：溶剂为pH＝6.0的PBS缓冲液；

溶质及其浓度为：酵母浸粉lg/100mL、蛋白胨2g/100mL、甘油l g/100mL、YNB1.34g/100mL、生物素4×10^-4/l00mL。

基础培养基(pH5.0)：溶剂为水；溶剂及其浓度为：葡萄糖2g/100mL、85％磷酸4.5g/100mL、硫酸钙0.93g/100mL、硫酸钾1.82g/100mL、七水硫酸镁1.5g/100mL、氢氧化钾0.4g/100mL、PTMl溶液0.44mL/100mL。

葡萄糖溶液：溶剂为水；溶剂及其浓度为：葡萄糖50g/100mL、PTM l溶液l.2mL/100mL。

甲醇溶液：溶剂为甲醇；溶质为PTMl溶液1.2mL/100mL。

二、发酵

1、制备种子液

将重组酵母GS115-LIP-GX接种至300mL种子培养基中，30℃、250rpm振荡培养20小时，得到种子液(OD_600nm＝5)。

2、制备一级种子液

在150L一级种子罐中装入105L基础培养基，然后加入上述种子液，在“29-31℃、200rpm、通气量0.5-1vvm、压力0.03-0.05MPa、pH4.5-5.5、DO≥20％”的条件下培养20小时，得到一级种子液(OD_600nm＝10)。

3、制备二级种子液

在1500L二级种子罐中装入1050L基础培养基，然后加入上述的一级种子液，在“29-31℃、200rpm、通气量0.5-1vvm、压力0.03-0.05MPa、pH4.5-5.5、DO≥20％”的条件下培养16小时，得到二级种子液(OD_600nm＝10)。

4、生产发酵

在20吨发酵罐中装入10吨基础培养基，然后加入上述制得的所有二级种子液。

整个发酵过程的控制参数：温度25-30℃，pH4.5-5.5，转速90-150rpm，通气量0.5-1vvm，压力0.03-0.05MPa,DO≥20％。

持续培养，当第一次DO≥80％时，加入葡萄糖溶液，直至菌体湿重达到180g/L时停止加入葡萄糖溶液；

持续培养，当第二次DO≥80％时开始计时，l h后以13mL/h/L的流速加入甲醇溶液(初始流速为lmL/h/L，流速0.lmL/h/L的速度线性递增，直至流速到达3mL/h/L后保持交流速不变)；整个发酵培养时间为72h。上述的培养过程中均采用≥20％的除菌氨水控制pH。

发酵过程中，间隔时间取样，检测每升发酵体系中的菌体湿重以及每毫升发酵上清作为脂肪酶的酶活。

发酵完成后，发酵上清的脂肪酶酶活为58U/mL。

实际应用中，生产发酵参数可为如下：

持续培养，当第二次DO≥80％时开始计时，1-1.5h后以1-3mL/h/L的流速加入甲醇溶液，根据溶氧和菌体培养情况控制甲醇溶液的流速以0.1-0.2ml/h/L的速度递增，当甲醇溶液流速达到3mL/h/L时流速不再增加，直到发酵结束。

实施例5、重组酵母GS115-LIP-GX的大规模发酵(进一步优化工艺)

一、制备培养基和相关溶液

种子培养基：溶剂为pH6.0的PBS缓冲液；

溶质及其浓度为：酵母浸粉l g/100mL、蛋白胨2g/100mL，甘油l g/100mL，YNB1.34g/100mL、生物素4×10^-4/100mL。

基础培养基(pH5.0)：溶剂为水；溶质及其浓度为：甘油2g/100mL、85％磷酸5％g/100mL、硫酸钙0.l g/100mL、硫酸钾2g/100mL、七水硫酸镁l.5g/100mL、氢氧化钾0.4g/100mL、PTMl溶液0.44mL/100mL。

甘油溶液：溶剂为水；溶质及其浓度为：甘油50g/100mL、PTMI溶液1.2mL/100mL。

甲醇溶液：溶剂为甲醇；

溶质及其浓度为：PTMl溶液1.2mL/100mL。

山梨醇溶液：溶剂为水；

溶质及其浓度为：山梨醇l g/l00mL、PTMl溶液1.2mL/l00mL。

二、发酵

步骤1-3同上述实施例4。

4、生产发酵

在20吨发酵罐中装入10吨基础培养基，然后加入所有二级种子液。

整个发酵过程的控制参数：温度29-31℃，pH4.5-5.5，转速90-150rpm，通气量0.5-1vvm，压力0.03-0.05MPa,DO≥20％。

持续培养，当第一次DO≥80％时(甘油消耗完全)，以10mL/h/L的流速加入甘油溶液，直至菌体湿重达到180g/L时停止加入甘油溶液；

持续培养，当第二次DO≥80％时开始计时，l h后以13mL/h/L的流速加入甲醇溶液(初始流速为lmL/h/L，流速0.lmL/h/L的速度线性递增，直至流速到达3mL/h/L后保持交流速不变)，当甲醇溶液的流速达到3mL/h/LS才开始同时以0.8mL/h/L的流速加入山梨醇溶液；上述的所有培养过程中均采用≥20％的除菌氨水控制pH。

整个发酵培养时间为72h。

发酵完成后，发酵上清脂肪酶酶活为67U/mL。

实际应用中，生产发酵参数可为如下：

持续培养，当第一次DO≥80％时(甘油消耗完全)，以5-20mL/h/L的流速加入甘油溶液，直至菌体湿重达到180g/L时停止加入甘油溶液；

持续培养，当第二次DO≥80％时开始计时，1-1.5h后以1-3mL/h/L的流速加入甲醇溶液，根据溶氧和菌体培养情况控制甲醇溶液的流速以0.1-0.2ml/h/L的速度递增，当甲醇溶液流速达到3mL/h，直到发酵结束；当甲醇溶液的流速达到3mL/h/L时开始同时以0.5-lmL/h/L的流速加入山梨醇溶液。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种脂肪酶突变体LIP-GX，其特征在于，所述脂肪酶突变体LIP-GX的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的脂肪酶突变体LIP-GX的基因，其特征在于，所述脂肪酶突变体LIP-GX基因序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1中所述的脂肪酶突变体LIP-GX或权利要求2所述的基因在制备三氯蔗糖中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，脂肪酶突变体LIP-GX和碱性蛋白酶E共同作用制备三氯蔗糖，反应步骤如下：

以八乙酰基蔗糖作为底物，反应体系中加入碱性蛋白酶E和脂肪酶突变体LIP-GX催化反应，得到4,1’,6’-三羟基-五乙酰基蔗糖，后经化学氯代法以及水解法脱除乙酰基制备三氯蔗糖；

所述碱性蛋白酶E的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述反应体系包括N,N-二甲基甲酰胺和正丁醇。

6.根据权利要求4-5任意一项所述的应用，其特征在于，所述的碱性蛋白酶E和脂肪酶突变体LIP-GX选择性脱除八乙酰基蔗糖4-位,1’-位,6’-位乙酰基。

7.包含权利要求2所述的基因的表达盒或质粒。

8.一种基因工程载体，其特征在于，所述的基因工程载体包含权利要求2所述的基因，所述的基因工程载体为pPIC9K载体。

9.一种重组菌，其特征在于，所述的重组菌包含权利要求2所述的基因，所述的重组菌选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、罗氏真养杆菌、巨大产碱杆菌、假单胞菌属、气生单胞菌属、嗜盐单胞菌属、酿酒酵母、谷氨酸棒状杆菌中的一种。

10.根据权利要求9所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌选自大肠杆菌BL21、枯草芽孢杆菌WB600、毕赤酵母GS115中的一种。

11.权利要求9-10任一项所述重组菌在生产脂肪酶中的应用。