CN116024086A

CN116024086A - 插件式组织培养芯片

Info

Publication number: CN116024086A
Application number: CN202211617760.8A
Authority: CN
Inventors: 秦建华; 郭雅琼; 张旭
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2022-12-15
Filing date: 2022-12-15
Publication date: 2023-04-28

Abstract

本发明涉及生物组织工程领域，具体涉及一种插件式组织培养芯片。芯片包括芯片本体，芯片本体由上至下设置有通孔层、通道层；通孔层为一个基板，基板上设有多个通孔，所述通孔数量≥3，每一排通孔为一个培养单元；通道层在对应的通孔层下方；通道层上设有多个通道槽，每个通道槽对应于一个培养单元；通道层和通孔层闭合后，每个培养单元底部四周与通道槽四周闭合，使每一培养单元均为独立结构；通孔内放置插件，插件上部为支撑结构用以将插件卡在通孔上边缘，支撑结构下方连接有中空的腔室，腔室底部为多孔薄膜。本发明芯片配合使用可拆卸的插件，提高芯片上培养和共培养的成功率，芯片使用中不引入外部装置，同时实现单器官或多器官模型构建。

Description

插件式组织培养芯片

技术领域

本发明涉及生物组织工程领域，将微流控芯片技术应用到组织培养技术领域，具体涉及一种插件式组织培养芯片的构建及应用方法。

背景技术

器官芯片是一类新的人体器官和组织微生理体外模型，它将微流控技术与微加工、细胞生物学相结合，在对外界环境参数的控制中具有其他技术难以比拟的能力，可以通过产生流体剪切力、机械应力、生化浓度梯度等理化刺激使细胞展现更加真实的生理学功能，因而在体外生理学模型建立中具有特殊的优势，在模仿人体组织和器官方面显示出巨大的潜力。

现有的芯片模型普遍采用注射泵或蠕动泵进行流体驱动(A multi-organ chipwith matured tissue niches linked by vascular flow，https://doi.org/10.1038/s41551-022-00882-6)，或者采用在线的PDMS泵阀进行流体驱动(Repeated dose multi-drug testing using a microfluidic chi，https://doi.org/10.1038/s41598-020-65817-0)，这样的芯片不仅增加了装置的复杂性，而且增加了操作难度。多数器官芯片模型将细胞或组织直接添加到芯片中，这样假如培养失败，芯片与细胞全部作废，提高了成本(Multi-organ system for the evaluation of efficacy and off-target toxicity ofanticancer therapeutics,DOI:10.1126/scitranslmed.aav1386)。另外，人体是一个复杂的***，存在多种器官之间的相互作用，而由于不同组织器官在体外的培养条件不同，往往难以在体外实现不同器官之间的自由组合与相互作用研究。综上，仍需对器官芯片进行改进，以满足研究需要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种插件式组织培养芯片，应用灵活可定制、可拆卸的插件作为细胞或组织培养载体，先培养后***芯片中，结合流体通道提供流体剪切力、促进物质交换或连通不同类型组织器官，提高细胞和组织的成功率的同时以一种简便的方式建立动态培养模型，研究不同器官间的交流与作用。另外，在本芯片中，不同插件内可以使用组织特异性培养基，而在流体通道内使用共同培养基，既保证了组织特性性微环境，又可保证不同组织之间的物质交换。

本发明提供的一种基于微流控技术的无泵式高通量多器官联合培养芯片，可应用于构建各种生物屏障、类器官培养、多器官相互作用等体系。

为解决现有技术的不足，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种组织培养芯片，所述芯片包括芯片本体，芯片本体由上至下设置有通孔层、通道层；

通孔层为一个基板，基板上设有多个通孔，所述通孔数量≥3，每一排通孔为一个培养单元；

所述通道层在对应的通孔层下方；所述通道层上设有多个通道槽，每个通道槽对应于一个培养单元；

所述通道层和通孔层闭合后，每个培养单元底部四周与通道槽四周闭合，使每一培养单元均为独立结构；

所述通孔内放置插件，所述插件上部为支撑结构用以将插件卡在通孔上边缘，支撑结构下方连接有中空的腔室，腔室底部为多孔薄膜。

上述技术方案中，进一步地，所述支撑结构包括圆环形状横梁，横梁外径大于通孔内径，横梁通过连接臂与腔室连接；所述腔室为柱状；腔室内下部任选设置有多个微坑阵列结构；腔室内部任选设置有两分隔或三分隔式插件，每一分割区域下部任选设置有微坑阵列结构；所述多孔薄膜的材料为聚碳酸酯或聚酯，多孔薄膜的孔径为0.1-12.0μm。

上述技术方案中，进一步地，所述每一个培养单元中间位置的通孔为插件池用以放置插件，插件池两边的通孔为流动培养基储液池，用以放置培养基。

上述技术方案中，进一步地，所述通道槽为圆角矩形凹槽；所述通孔的形状为圆形、椭圆形、方形或多边形。

上述技术方案中，进一步地，所述芯片包括上盖，覆盖于芯片本体上方。

上述技术方案中，进一步地，芯片材质可为聚碳酸酯PC、聚苯乙烯PS、环烯烃共聚物Cyclic olefin copolymer COC或cyclo olefin polymer COP等塑料。

上述技术方案中，进一步地，所述通孔相互独立，垂直于通道层设置；所述插件置于通孔后，插件底部的多孔薄膜悬于通道槽的液面上。

上述技术方案中，进一步地，所述通孔内径等于或大于插件的腔室外径；通孔内径大于腔室外径时，可在通孔内侧设一凹陷空隙，用于电极测量或其他传感器的接入。

上述技术方案中，进一步地，所述通孔层和通道层一体成型，或通过粘合组装、热压封接成一体结构。

本发明提供了前述芯片在细胞培养、器官培养中的应用；优选地，所述应用为细胞单层培养、细胞上下层共培养、细胞在水凝胶中包埋培养、细胞在气液界面培养，所述器官培养为单器官培养、多组织器官培养。

上述技术方案中，进一步地，所述芯片在应用时，放在摇床上，随摇床上下摇摆为细胞或组织提供流体环境。

本发明还提供了一种插件，所述插件上部为支撑结构，支撑结构下方连接有中空的腔室，腔室底部为多孔薄膜，腔室内部设置有垂直插板，将腔室分为多个区域，每一分割区域下部任选设置有微坑阵列结构；优选地，所述支撑结构包括圆环形状横梁，横梁外径大于通孔内径，横梁通过连接臂与腔室连接；优选地，所述多孔薄膜的材料为聚碳酸酯或聚酯，多孔薄膜的孔径为0.1-12.0μm；优选地，腔室内部设置有两分隔或三分隔式插板。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明设计了一种新型的芯片结构，配合使用可拆卸的插件，通过在芯片外进行细胞的接种和初步培养之后，再装配到芯片上培养，提高芯片上培养和共培养的成功率，插件即插即用，不固定于通孔中，使用灵活；

(2)本发明的芯片放置于摇床上培养，实现重力作用下的流体驱动，通过摇床提供流体动力，实现在无泵阀及外部管道的情况下培养基的动态流动，提供了一种简单易用的体外组织培养平台；并且不引入其他外部装置，可以避免管道吸附，减少液体死体积。另外，同一个摇床上可以同时进行多个芯片的培养，进一步提高通量。

(3)本发明芯片可以根据不同组织器官的培养方式选择适合的插件，进行培养之后方便的进行组合，在插件内部保留适合组织器官的微环境，在流体通道中采用共同培养基进行物质交换，以进行器官互作研究，不仅可以实现单器官模型的构建，也可以实现多器官模型的构建，满足多种培养方式。

(4)本发明芯片可以配合使用不同结构的插件，满足不同组织器官类型的培养需要。

附图说明

图1本发明芯片分层结构示意图；

图2本发明芯片整体结构示意图；

图3本发明芯片单个插件池截面示意图；

图4本发明芯片两个插件池结构示意图；

图5本发明芯片两个插件池截面示意图；

图6本发明插件不同腔室结构的示意图：a.腔室底部仅为多孔薄膜，b.腔室底部在多孔薄膜上设置微坑阵列结构；c.三分隔式插件；d.两分割式插件结合微坑阵列结构；e.两分隔式插件结合一侧有微坑阵列结构；

图7本发明芯片应用电极测量示意图；

图8本发明一种插件结构剖面示意图。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

一种组织培养芯片，包括芯片本体，芯片本体由上至下设置有通孔层1、通道层2；通孔层1为一个基板，基板上设有多个通孔1-1，通孔相互独立，垂直于通道层设置，通孔数量≥3，每一排通孔为一个培养单元；通道层2在对应的通孔层1下方；通道层2上设有多个通道槽2-1，每个通道槽2-1对应于一个培养单元；通道层和通孔层闭合后，每个培养单元底部四周与通道槽四周闭合，使每一培养单元均为独立结构；每一个培养单元中间位置的通孔为插件池1-1-1用以放置插件3，插件池两边的通孔为流动培养基储液池1-1-2，用以放置培养基；通孔层3和通道层4一体成型，或通过粘合组装、热压封接成一体结构。插件3上部为支撑结构3-1，支撑结构下方连接有中空的腔室3-2，腔室底部为多孔薄膜3-3，插件置于通孔后，插件底部的多孔薄膜悬于通道槽液面上；支撑结构3-1包括圆环形状横梁3-1-1，横梁外径大于通孔内径以便于将插件卡在通孔上边缘，横梁通过连接臂3-1-2与腔室3-2连接；腔室为柱状；腔室内下部任选设置有多个微坑阵列结构；腔室内部任选设置有两分隔或三分隔式插件，每一分割区域下部任选设置有微坑阵列结构；如图6所示不同插件结构，图6a为插件腔室底部仅为多孔薄膜，图6b为插件腔室底部在多孔薄膜上设置微坑阵列结构，图6c为插件腔室内设置三分隔式插件，图6d为插件腔室内设置两分割式插件结合多孔薄膜上微坑阵列结构，图6e为插件腔室内设置两分隔式插件结合多孔薄膜一侧上有微坑阵列结构；多孔薄膜的材料为聚碳酸酯或聚酯(PET)，多孔薄膜的孔径为0.1-12.0μm；通道槽2-1为圆角矩形凹槽；通孔的形状为圆形、椭圆形、方形或多边形；芯片还包括上盖4，覆盖于芯片本体上方；通孔内径可以等于或大于插件的腔室外径；通孔内径大于腔室外径时，通孔内壁与腔室外壁的空隙用于电极测量或其他传感器的接入；通孔设有接口，用于电极测量或其他传感器的接入。

实施例2

采用实施例1的芯片结构，设计包含3个独立培养单元的通用型插件式组织培养芯片，每一个培养单元含有一个插件池，进行肠屏障的构建，方法过程如下：

(1)芯片预处理

芯片部分紫外照射除菌或环氧乙烷灭菌；

(2)细胞接种

肠上皮细胞(CaCO-2细胞)悬液调整至1～5×10⁶cells/ml细胞密度，先接种于插件3中，插件选用图6a所示插件结构，在孔板静置培养24h；

(3)芯片培养

将插件3***芯片的插件池，储液池内及通道槽内都采用HDMEM培养基，盖上上盖，将芯片置于摇床进行动态培养；构建肠屏障模型。芯片中插件中的肠细胞均能感受到相同的流体剪切力，保证了流体施加的均一性，并且采用摇床代替微流控器官芯片常用的注射泵或者蠕动泵，其通量可大大增加。本实施例中所用摇床为Thermo Scientific^TM数字试管摇摆式振荡器。

(4)跨膜电阻测量

动态培养5天后，可以采用商业化跨膜电阻测量仪对形成的肠屏障进行跨膜电阻测量(如图7)，评估肠屏障模型的完整性。

以本发明插件式组织培养芯片构建的肠屏障模型，后续可采用生物学常用的细胞检测手段对分别排列于多孔膜两侧的细胞进行检测，包括细胞死活标记染色、细胞免疫荧光染色、基因表达检测、蛋白质检测等。

实施例3

利用实施例1中的通用型插件式组织培养芯片进行类器官培养，方法过程如下：

(1)芯片预处理

芯片部分紫外照射除菌或环氧乙烷灭菌；

(2)类器官接种

将肝类器官传代后重悬于水凝胶(如matrigel)，将悬液加入插件3中插件选用图6a所示插件结构，放入37℃培养箱0.5-1小时使水凝胶固化，加入肝培养基，如HepatiCult^TM类器官生长培养基继续培养24h。

(3)芯片培养

培养后，将插件***芯片的插件池，在流动培养基储液池及通道槽中加入1ml肝培养基，盖上上盖，将芯片置于摇床进行动态培养；构建成功肝类器官模型，后续可采用生物学上常用的检测手段对肝类器官进行表征，包括细胞死活标记染色、冷冻切片、细胞免疫荧光染色、基因表达检测、蛋白质检测等。

实施例4

采用实施例1的芯片结构，设计包含3个独立培养单元的通用型插件式组织培养芯片，每一个培养单元含有两个插件池，进行肠-肝模型构建，方法过程如下：

(1)芯片预处理

设计制作芯片，紫外照射除菌，20～200μg/ml I型胶原修饰插件多孔膜1-2h，促进细胞贴附，PBS冲洗1-3次；

(2)细胞接种

将肠上皮细胞(CaCO-2细胞)悬液调整至1～5×10⁶cells/ml细胞密度，接种于一个插件中，插件选用图6a所示插件结构，采用HDMEM培养基，放入37℃培养箱，静置培养24h-48h。

将原代肝细胞悬液调整至1～5×10⁶cells/ml细胞密度，接种于另一插件中，插件选用图6b所示插件结构，采用肝培养基，放入37℃培养箱，静置培养24h-48h。

(3)芯片培养

培养后，分别将两个插件***芯片的一个培养单元的两个插件池中，在流动培养基储液池中加入1ml advanced DMEM/F12培养基，这样既保证了组织特性微环境，又可保证不同组织之间的物质交换。盖上上盖，将芯片置于摇床进行动态培养，构建肠-肝模型，后续可采用生物学上常用的细胞检测手段对插件中的细胞进行检测，包括细胞死活标记染色、细胞免疫荧光染色、基因表达检测、蛋白质检测。

实施例5

采用实施例1的芯片结构，设计包含3个独立培养单元的通用型插件式组织培养芯片，每一个培养单元含有1个插件池，进行血脑屏障模型构建，方法过程如下：

(1)芯片预处理

(2)细胞接种

将脑微血管内皮细胞悬液调整至1～5×10⁶cells/ml细胞密度接种到插件的多孔薄膜反侧，插件选用图6a所示插件结构，待细胞贴附后，将原代脑胶质细胞与周细胞悬液调整至1～5×10⁶cells/ml细胞密度，接种插件内部多孔薄膜正侧，放入37℃培养箱，静置培养24h-48h。

(3)芯片培养

培养后，将插件***芯片的插件池，在流动培养基储液池中加入1ml内皮培养基，盖上上盖，将芯片置于摇床进行动态培养；后续可采用生物学上常用的检测手段对肝类器官进行表征，包括细胞死活标记染色、冷冻切片、细胞免疫荧光染色、基因表达检测、蛋白质检测等。

实施例6

采用实施例1的芯片结构，设计包含3个独立培养单元的通用型插件式组织培养芯片，每一个培养单元含有1个插件池，进行肺气血屏障模型构建，方法过程如下：

(1)芯片预处理

(2)细胞接种

将肺上皮细胞悬液调整至1～5×10⁵cells/ml细胞密度，接种于一个插件中，插件选用图6a所示插件结构，采用RMPI培养基，放入37℃培养箱，静置培养24h-48h。

(3)芯片培养

培养后，将插件***芯片的插件池，将插件内培养基吸干，使细胞暴露于空气中；储液池中加入1mlRMPI培养基，盖上上盖，将芯片置于摇床进行动态培养。后续可采用生物学上常用的细胞检测手段对插件中的细胞进行检测，包括细胞死活标记染色、细胞免疫荧光染色、基因表达检测、蛋白质检测。

对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims

1.一种组织培养芯片，其特征在于，所述芯片包括芯片本体，芯片本体由上至下设置有通孔层(1)、通道层(2)；

通孔层(1)为一个基板，基板上设有多个通孔(1-1)，所述通孔数量≥3，每一排通孔为一个培养单元；

所述通道层(2)在对应的通孔层(1)下方；所述通道层(2)上设有多个通道槽(2-1)，每个通道槽(2-1)对应于一个培养单元；

所述通孔(1-1)内放置插件(3)，所述插件上部为支撑结构(3-1)用以将插件卡在通孔上边缘，支撑结构下方连接有中空的腔室(3-2)，腔室底部为多孔薄膜(3-3)。

2.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述支撑结构(3-1)包括圆环形状横梁(3-1-1)，横梁外径大于通孔内径，横梁通过连接臂(3-1-2)与腔室(3-2)连接；所述腔室为柱状；腔室内下部任选设置有多个微坑阵列结构；腔室内部任选设置有两分隔或三分隔式插件，每一分割区域下部任选设置有微坑阵列结构；所述多孔薄膜的材料为聚碳酸酯或聚酯，多孔薄膜的孔径为0.1-12.0μm。

3.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述每一个培养单元中间位置的通孔为插件池(1-1-1)用以放置插件(3)，插件池两边的通孔为流动培养基储液池(1-1-2)，用以放置培养基。

4.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述通道槽(2-1)为圆角矩形凹槽；所述通孔的形状为圆形、椭圆形、方形或多边形。

5.根据权利要求1所述的一种芯片，其特征在于，所述芯片包括上盖(4)，覆盖于芯片本体上方。

6.根据权利要求1所述的一种插件式组织培养芯片，其特征在于，所述通孔相互独立，垂直于通道层设置；所述插件置于通孔后，插件底部的多孔薄膜浸润于通道的槽液面下。

7.根据权利要求1所述的一种插件式组织培养芯片，其特征在于，所述通孔内径等于或大于插件的腔室外径；优选地，在通孔内侧设一凹陷空隙，用于电极测量或其他传感器的接入。

8.根据权利要求1所述的一种插件式组织培养芯片，其特征在于，所述通孔层(1)和通道层(4)一体成型，或通过粘合组装、热压封接成一体结构。

9.根据权利要求1-8任一项所述的芯片在细胞培养、器官培养中的应用；优选地，所述应用为细胞单层培养、细胞上下层共培养、细胞在水凝胶中包埋培养、细胞在气液界面培养，所述器官培养为单器官培养、多组织器官培养；优选地，所述芯片在应用时，放在摇床上，随摇床上下摇摆为细胞或组织提供流体环境并促进不同细胞间物质交换。

10.一种插件，所述插件上部为支撑结构(3-1)，支撑结构下方连接有中空的腔室(3-2)，腔室底部为多孔薄膜(3-3)，其特征在于，腔室内部设置有垂直插板，将腔室分为多个区域，每一分割区域下部任选设置有微坑阵列结构；优选地，所述支撑结构(3-1)包括圆环形状横梁(3-1-1)，横梁外径大于通孔内径，横梁通过连接臂(3-1-2)与腔室(3-2)连接；优选地，所述多孔薄膜的材料为聚碳酸酯或聚酯，多孔薄膜的孔径为0.1-12.0μm；优选地，腔室内部设置有两分隔或三分隔式插板。