CN105838606B - 一种高通量细胞联合培养芯片 - Google Patents

一种高通量细胞联合培养芯片 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高通量细胞联合培养芯片，包括N组培养平台，N≥1，多组培养平台呈圆形发散状分布，N组培养平台之间或相对独立，或每组之间通过微桥依次连通，或选择性的相邻两组至相邻（N‑1）组之间通过微桥连通；每组培养平台包括三层结构，由内向外依次连接的内层营养液灌注单元、中间层生物胶灌注单元和外层细胞培养单元，三者之间通过微桥连通；每组培养平台中包括1‑10个细胞培养单元，相邻细胞培养单元之间通过微桥连通；本发明的细胞联合培养芯片，多种细胞不接触，使得细胞的生长环境更接近于体内的生长环境，且操作方便，便于临床应用。

Description

一种高通量细胞联合培养芯片
技术领域
本发明属于细胞生物医学领域，具体涉及一种能够实现高通量的细胞联合培养芯片。
背景技术
微流控芯片具有成本低、设备小、高度集成、样本消耗少等优点，被广泛应用到细胞生物领域。细胞生物学研究正从对单种细胞的观察和研究，发展到对多种细胞相互作用的观察和研究。对于复杂的生物学体系，需要多种细胞同时存在的平台才能更好的模拟真实存在的细胞微环境。从而更全面深入的探索细胞之间的复杂网络以及介导它们之间相互作用的信号通路等。细胞联合培养是研究细胞与细胞之间相互作用比较常用的方法。
常规的细胞混合培养，虽可解决离体状态下多细胞间相互作用问题，同时起到了一定的模拟体内环境的作用，但当前，基于细胞培养的微流控芯片多限于两种或四种细胞联合培养，或一种目标细胞与其他多种细胞混合培养，一种芯片上可同时培养的细胞种类较少，通量小、效率低，此状态下，离体细胞表型与离体前差异较大，限制了对微环境中各细胞组分进行观察，若对此状态下的细胞进行化疗药物的敏感性检测，则会限制对结果判定的准确性，无法更真实的模拟体内真实环境。另外，当前用于药筛的微流控芯片的培养室灌流通道与营养液灌注通道及药物灌注通道之间无微桥一类的连接结构，多为两条相对独立平行的通道，限制了营养液灌注通道及药物灌注通道与细胞培养室的接触面积。
发明内容
本发明为了克服一种芯片上可同时培养的细胞种类较少、通量小的技术缺陷，涉及一种高通量细胞联合培养芯片，包括N组培养平台，N≥1，多组培养平台呈圆形发散状分布，N组培养平台之间或相对独立，或每组之间通过微桥依次连通，或选择性的相邻两组至相邻（N-1）组之间通过微桥连通；每组培养平台包括三层结构，由内向外依次连接的内层营养液灌注单元、中间层生物胶灌注单元和外层细胞培养单元，三者之间通过微桥连通；每组培养平台中包括1-10个细胞培养单元，相邻细胞培养单元之间通过微桥连通。
所述内层营养液灌流单元包括依次连接的进液口、液体流道、液体池、液体流道、出液口；为了增大液体池的面积，增大营养液的储存容量，为细胞持续提供营养，所述液体池采用三角形漏斗形状，多个培养平台中的液体池的顶点指向同一圆心。
进一步的，所述细胞培养单元包括细胞进口，一端封闭，另一端通过细胞流道连接细胞培养室；所述培养室的另一端通过细胞流道连接细胞出口；所述培养室为方形。
进一步的，所述中间层生物胶灌注单元设有进胶口、胶体流道和出胶口；所述胶体流道上与所述细胞培养室接触的地方设有微桥。
为了增加细胞培养室与生物胶灌注单元及营养液灌注单元的接触面积，所述胶体流道包括一条主道和（N-1）条分支，主道形成整个生物胶灌注单元的框架，跨过整个细胞培养单元，首端和末端分别连接进胶口和出胶口；分支位于每两个细胞培养单元之间，用于将相邻的细胞培养单元通过微桥连通，首端与主道连通，末端连接出胶口。
为了保证胶体流道中的基质胶可以刚好充满微桥，由于表面张力的作用，基质胶不会溢出微桥，所述微桥长为400-1000μm，宽为50-100μm，两个微桥的间距为400-600μm。
优选的，细胞培养单元与生物胶灌注单元之间及生物胶灌注单元与营养液灌注单元之间的微桥长为400-500μm，宽为50-60μm，两个微桥的间距为 400-500μm。
优选的，相邻两组培养平台之间的微桥长为900-1000μm，宽为50-80μm，间距为500-600μm。
为了保证营养液中的营养成分足够满足细胞培养数量，所述细胞联合培养芯片包括4-8组培养平台，每组培养平台中包括3-10个细胞培养单元，相邻细胞培养单元之间通过微桥连通。优选的，包括四组培养平台，呈十字分布，四组培养平台之间或相对独立，或依次全部连通，或两两连通；每组培养平台中包括三个细胞培养单元，相邻细胞培养单元之间通过微桥连通
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明可以根据培养平台和细胞培养单元的数量，形成多种细胞共培养，高通量，可实时连续观察多种细胞间的相互影响，更真实的模拟体内环境。根据培养平台之间是否连通，可自由组合成几组共培养平台，根据不同实验需求进行相应操作，实现多种实验操作的功能。不同组合的共培养平台上可以进行对照实验，方便观察实验结果，可避免外界环境因素对对照实验结果的影响。
附图说明
图1为实施例1中12种细胞共培养芯片的微结构示意图；
图2为实施例1中2组6种细胞共培养芯片的微结构示意图；
图3为实施例1中4组3种细胞共培养芯片的微结构示意图；
图4 为实施例1单个细胞培养平台的微结构示意图；
图5为图4中单组营养液灌注单元示意图；
图6 为图4中多组营养液灌注单元示意图；
图7为图4中生物胶灌注单元示意图；
图8为图4中细胞培养单元示意图；
图9为实施例1中细胞共培养芯片三维示意图；
图中标注：1.营养液灌注单元，1.1 进液口，1.2 液体流道，1.3 液体池，1.4 出液口；2.生物胶灌注单元，2.1 进胶口，2.2胶体流道，2.3 出胶口；3. 细胞培养单元，3.1 细胞进口，3.2 细胞流道，3.3细胞培养室，3.4 细胞出口；4.微桥；5.进液柱；6.负压吸引装置；10. 培养平台。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下将结合附图和实施例，对本发明作进一步详细说明。
本实施例提出了一种高通量细胞联合培养芯片，多种细胞不接触，使得细胞的生长环境更接近于体内的生长环境，且操作方便，便于临床应用。
所述细胞联合培养芯片，包括壳体、载体和微结构；所述壳体与载体封接而成，壳体材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS），该材料具有可塑性好、理化性质稳定、无毒无味、透明、通气性良好的优良性能，适宜作为本发明的壳体材料。所述壳体的厚度为3-5mm。所述载体的材料为玻璃。
所述微结构位于壳体内表面，所述微结构为腔道，所述腔道的高度为50-100 μm。所述微结构包括N组培养平台10，N≥1，多组培养平台10呈圆形发散状分布，N组培养平台之间或相对独立，或每组之间通过微桥4依次连通，或选择性的相邻两组至相邻（N-1）组之间通过微桥4连通，例如可以是相邻的两组连通、或相邻的三组连通、或相邻的（N-1）组连通。
如图4所示，每组培养平台10包括三层结构，由内向外依次连接的内层营养液灌注单元1、中间层生物胶灌注单元2和外层细胞培养单元3，三者之间通过微桥4连通；每组培养平台中包括1-10个细胞培养单元3，相邻细胞培养单元之间通过微桥连通。
如图5所示，所述内层营养液灌流单元1包括进液口1.1、液体流道1.2、液体池1.3和出液口1.4；为了方便进液和出液，所述进液口和出液口均穿过壳体将腔道与外界连通；所述液体流道和液体池位于壳体和载体之间。所述营养液灌流单元1的形状是围绕其内部的细胞培养单元和生物胶灌注单元所形成的形状而定，其形状设定要求既可以为细胞培养室持续提供营养又能够方便不同组织间的连接，本实施例的液体池采用三角形漏斗形状，多个培养平台呈圆形发散状分布，即培养平台中的液体池的顶点指向同一圆心，如图6所示，有利于增大液体池的面积，增大营养液的储存容量，为细胞持续提供营养。
所述进液口1.1与进液柱5连接，通过进液柱5将营养液注入营养液灌流单元1中。所述出液口1.4连接负压吸引装置6，开始灌液时所述负压吸引装置6提供负压，使得进液柱5内的液体开始流动，当液体从进液口经液体流道进入出液口时，取下负压吸引装置6，此时进液柱内的液体会由自身液面高度差的重力作用持续流动，达到持续灌流的目的。所述负压吸引装置可以是负压吸引微量注射器。
所述进液柱5为上口宽下口窄的瓶体，容量为200-300μL，所述瓶体的下口直径为0.8-1mm，上口直径为4-6mm，瓶体高度为40-45mm，灌液时进液柱的液面高度为25-35mm。
本实施例的营养液灌流单元，操作简便易行，仅采用负压吸引装置及重力作用便可维持灌流液在该***持续稳定灌流，不需微量泵维持，减少了细胞培养过程中污染的几率，适合临床上细胞联合培养的大规模应用。
如图6所示，所述中间层生物胶灌注单元2位于内层营养液灌流单元1与外层细胞培养单元3之间，有进胶口2.1，胶体流道2.2和出胶口2.3；所述胶体流道上与所述细胞培养室接触的地方设有微桥。所述胶体流道2.2包括一条主道和（N-1）条分支，主道形成整个生物胶灌注单元的框架，跨过整个细胞培养单元，首端和末端分别连接进胶口2.1和出胶口2.3；分支位于每两个细胞培养单元之间，用于将相邻的细胞培养单元通过微桥连通，首端与主道连通，末端连接出胶口2.3。
所述胶体流道内灌注基质胶；所述基质胶为温度敏感性生物胶，在0 - 4 ℃时为液体状态，此时灌注于生物胶灌注单元中，使其充满胶体流道及各个微桥，在37 ℃维持8-12h，开始呈凝胶状，具有一定的强度。所述基质胶的浓度以及微桥的长度、宽度以及胶体流道的长度、宽度设计，均为了保证基质胶可以刚好充满微桥，由于表面张力的作用，基质胶不会溢出微桥。因此，设置微桥长为400-1000μm，宽为50-100μm，两个微桥的问距为400-600μm，胶体流道的宽度为150-250μm，能够满足要求，优选的，细胞培养单元与生物胶灌注单元之间及生物胶灌注单元与营养液灌注单元之间的微桥长为400-500μm 、宽为50-60μm、间距为 400-500μm，胶体流道的宽度为200-220μm；相邻两组培养平台之间的微桥长为900-1000μm，宽为50-80μm，间距为500-600μm。凝胶状的基质胶可以允许营养液灌流通道中的小分子营养物质及化疗药物通过，而不允许细胞通过，从而可以充分保障营养物质和化疗药物弥散至细胞培养室中；也可以允许细胞因子通过，如细胞代谢产生的生物蛋白、小分子有机物及无机物，使得不同细胞培养室内的不同细胞相互影响。
所述外层细胞培养单元3位于中间层生物胶灌注单元2外侧，如图8所示，包括细胞进口3.1，一端封闭，另一端通过细胞流道3.2连接细胞培养室3.3；所述培养室3.3的另一端通过细胞流道3.2连接细胞出口3.4；优选的培养室3.3为方形。每组培养平台10中的多个细胞培养单元3平行排列，相邻细胞培养室3.3之间通过胶体流道上的微桥4连通。所述生物胶灌注单元2包围每个细胞培养单元3，以增大培养室3.3与营养液灌注单元1的接触面积。
在所述细胞培养室3.3内灌注稀释胶和细胞的混合物，所述稀释胶是使用完全培养液将基质胶稀释4-8倍后得到的，所述完全培养液是一种在基本培养液内加入一些富含氨基酸、维生素和碱基之类的天然物质，即加入生长因子，可用来满足微生物的各种营养缺陷型菌株的生长需要。所述稀释胶使得细胞处于三维培养状态，细胞在稀释胶内的浓度为106-107/ml。所述多个细胞培养室中可以培养多种细胞，实现细胞的联合培养，不同类型细胞彼此间不接触，但其产生的细胞因子可以通过微桥中的基质胶，弥散到整个体系中，实现更接近实体状态下的微环境模拟，使得在芯片上培养细胞更接近于体内环境。
实施例1
如图1-3所示的细胞联合培养芯片包括四组培养平台，呈十字形分布，每组培养平台包括三个细胞培养单元。每组培养平台中的胶体流道2.2包括一条主道和两条分支，两条分支分别在三个细胞培养单元之间，将三个细胞培养单元通过微桥连通。本实施例中细胞培养单元与生物胶灌注单元之间及生物胶灌注单元与营养液灌注单元之间的微桥长为400μm 、宽 为50μm、间距为 400μm，胶体流道的宽度为200μm；相邻两组培养平台之间的微桥长为900μm，宽为50μm，间距为500μm。
四组培养平台的液体池1.3之间也可以通过微桥依次连通，如图1所示，可实现12种细胞共培养，高通量，同时观察12种细胞间的相互影响，更真实的模拟体内环境。四组培养平台中可以通过微桥两两连通，如图2所示，可实现2组6类细胞共培养。四组培养平台之间可以相互独立，如图3所示四组培养平台之间没有连通，可实现4组3类细胞共培养。后两种情况不仅可以模拟人体内环境，同时还可以在一张芯片上做对照试验，使观察结果一目了然。
以上实施例仅是本发明若干种优选实施方式中的几种，应当指出，本发明不限于上述实施例；对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.一种高通量细胞联合培养芯片，其特征在于，包括N组培养平台，N≥1，当N=1时，N组培养平台之间相对独立，当N>1时，多组培养平台呈圆形发散状分布，N组培养平台之间或相对独立，或每组之间通过微桥依次连通，或选择性的相邻两组至相邻N-1组之间通过微桥连通；每组培养平台包括三层结构，由内向外依次连接的内层营养液灌注单元、中间层生物胶灌注单元和外层细胞培养单元，三者之间通过微桥连通；每组培养平台中包括1-10个细胞培养单元，相邻细胞培养单元之间通过微桥连通；
所述内层营养液灌流单元包括依次连接的进液口、液体流道、液体池、液体流道、出液口，所述内层营养液灌流单元呈“几”型设置，所述液体池采用三角形漏斗形状，多个培养平台中的液体池的顶点指向同一圆心；
所述细胞培养单元包括细胞进口，一端封闭，另一端通过细胞流道连接细胞培养室，所述细胞培养单元呈直线型设置；所述培养室的另一端通过细胞流道连接细胞出口，所述培养室为方形；
所述中间层生物胶灌注单元设有进胶口、胶体流道和出胶口，所述胶体流道上与所述细胞培养室接触的地方设有微桥，所述胶体流道包括一条主道和N-1条分支，主道形成整个生物胶灌注单元的框架，跨过整个细胞培养单元，首端和末端分别连接进胶口和出胶口；分支位于每两个细胞培养单元之间，用于将相邻的细胞培养单元通过微桥连通，首端与主道连通，末端连接出胶口；
细胞培养单元与生物胶灌注单元之间及生物胶灌注单元与营养液灌注单元之间的微桥长为400-500μm，宽为50-60μm，两个微桥的间距为 400-500μm；相邻两组培养平台之间的微桥长为900-1000μm，宽为50-80μm，间距为500-600μm。
2.根据权利要求1所述的高通量细胞联合培养芯片，其特征在于，包括4-8组培养平台，每组培养平台中包括3-10个细胞培养单元，相邻细胞培养单元之间通过微桥连通。
3.根据权利要求2所述的高通量细胞联合培养芯片，其特征在于，包括四组培养平台，呈十字分布，四组培养平台之间或相对独立，或依次全部连通，或两两连通；每组培养平台中包括三个细胞培养单元，相邻细胞培养单元之间通过微桥连通。
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