CN116003569A - 一种用于治疗多形性胶质母细胞瘤的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及癌症疫苗研发领域，具体涉及用于治疗多形性胶质母细胞瘤的疫苗。本发明涉及一种精准治疗多形性胶质母细胞瘤的核酸疫苗。这种疫苗利用趋化因子CX3CL1经序列优化后的功能活性变体作为辅助，利用一种多形性胶质母细胞瘤(GBM)的特有体内突变靶点EGFRvIII作为靶向抗原。结果表明：这种新型疫苗可以在体内诱导高效的特异性体液免疫和细胞免疫反应，并使得免疫***最终对目标肿瘤细胞进行大量杀伤，可以有效术后预防或治疗多形性胶质母细胞瘤。

Description

一种用于治疗多形性胶质母细胞瘤的疫苗

技术领域

本发明涉及涉及肿瘤的免疫治疗和预防技术领域，具体涉及一种用于治疗多形性胶质母细胞瘤的疫苗。

背景技术

多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是一种成人常见的中枢神经***恶性神经上皮性肿瘤。其主要的治疗方式有：手术、放疗和化疗等，且多种临床治疗手段的综合平均生存期为12～15个月(Cloughesy,Cavenee et al.2014)。这种恶性神经上皮肿瘤具有治疗手段单一，手术困难，生存期短等特点，是一种非常难以治愈的癌症疾病。能够引起胶质母细胞瘤的分子机制非常复杂，其中人体重要酪氨基酸激酶受体EGFR的突变是引起这种疾病的最主要因素之一。EGFR蛋白的过量表达在原发性胶质母细胞瘤的发病中占比高达57.4％(Brennan,Verhaak et al.2013,Jawhari,Ratinaud et al.2016)。

EGFR又被称为HER1或者ERBB1，是一种ERBB膜蛋白家族中的酪氨酸激酶受体(Arteaga and Engelman 2014)，也是多种人体表皮生长因子如TGF-α，EGF，amphiregulin，betacellulin等的细胞表面受体。这种跨膜蛋白可以有效接收多种配体分子的信号，并通过细胞内多类细胞信号途径，将配体分子信号进行细胞内传递，从而实现胞内蛋白表达或翻译的精细调控。

然而，EGFR作为最重要的人体表皮生长因子的受体蛋白，其突变体可能造成很多人体表皮细胞生长的异常。在这之中，EGFR基因被发现存在五种特异性的缺失突变，分别为vI(N末端缺失)，vII(外显子14-15号缺失)，vIII(外显子2～7号缺失)，vIV(外显子25～27号缺失)和vV(外显子25～28号缺失)。其中vII型和vIII型均可以导致肿瘤发生(Furnari,Cloughesy et al.2015)。而vIII由于缺失外显子过多，是导致胶质母细胞瘤的最重要缺失突变。因此，EGFRvIII型的分子机制也受到胶质母细胞瘤治疗领域的广泛关注。

EGFRvIII型缺失突变在胶质母细胞瘤的肿瘤细胞表面往往和野生型的EGFR基因共同表达，然而EGFRvIII型突变基因可以导致上皮细胞在收受外来配体分子信号的时候发生信号通路紊乱，导致该上皮细胞过量表达EGFR基因，且细胞出现癌变，开始过度增殖。因此，在多形性胶质母细胞瘤的肿瘤细胞表面，野生型EGFR和EGFRvIII的蛋白都会发生过量表达，这使得该肿瘤细胞与正常细胞产生区别。提示EGFRvIII可以作为一种特异性的肿瘤细胞靶点被免疫***识别。

由于EGFRvIII基因的缺失和错位突变，导致其表达产物在EGFR野生型蛋白中缺失了6-273号氨基酸，并且在缺失之后的断点处引入了一个新的甘氨酸作为第6号氨基酸连接前后的多肽序列。因此，EGFRvIII虽然仅为EGFR野生型的缺失突变体，但其1～13号氨基酸的多肽表位是该缺失突变体所特有的，在野生型EGFR中并不存在。所以该序列及其结构上的后续少量多肽结构将具备独一无二的蛋白序列和结构形式，这种本质上的区别可以作为靶向该肿瘤细胞的重要标识使用。

CX3CL1是一种最早于1997年在人体基因组中发现的免疫细胞趋化因子(Bazan,Bacon et al.1997)。该趋化因子的家族分类非常独特，和其他常规CC家族及CXC家族趋化因子的蛋白质结构具有一定的序列差异。CX3CL1最早发现是一种全长序列中含有跨膜区的类似细胞膜糖蛋白的跨膜蛋白，这种蛋白后来被证明在人体组织分布中存在两种不同的结构模式。一种是全长的分布于细胞膜表面的糖蛋白形式，含有其N端头部的趋化结构，中间的糖茎结构以及C端的细胞膜锚定结构。另一种形式为被酶切仅含有趋化结构与糖茎结构的分泌蛋白形式。现已证明，后者的分泌蛋白形式是CX3CL1作为趋化因子在组织中分布中的主要形式，这种形式可以和其他CC家族或CXC家族的普通趋化因子一样，行使免疫细胞的趋化能力。

目前针对EGFRvIII作为肿瘤细胞靶点的特异性疫苗包括主动和被动免疫的特异性疫苗，其中多肽疫苗在***过程中发挥免疫作用。ridopepimut(CDX-110)，是一个与EGFRvⅢ一级结构相似的人工合成的14肽与孔蓝蛋白结合，可以诱导EGFRvⅢ特异性的体液和细胞免疫应答。由于ridopepimut的有效性和安全性，其能够成为一个极具前景的GBM治疗策略，但其EGFRvⅢ氨基酸序列作为靶标特异性需要进一步提高，且当前的疫苗虽然表现出存活期显著延长，但是不能治愈。因此，存在提供改善的EGFRvIII疫苗以增强存活的需要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于一种用于治疗多形性胶质母细胞瘤的疫苗。

本发明提供了CX3CL1变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明提供了所述的CX3CL1变体在提高抗原分子交叉呈递效果中的应用。

本发明中，CX3CL1是趋化因子，行使免疫细胞的趋化能力。本发明对CX3CL1蛋白结构及序列分析后，进行了CX3CL1趋化因子重构。结果表明，在重构的CX3CL1趋化因子变体中CX3CL1-b具有较高的趋化活性，可显著提高细胞抗原分子交叉呈递效果，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

进一步的，所述的细胞抗原分子是抗原的一种，其位于细胞表面，每一种细胞都存在本身特有的表面抗原。所述的细胞包括：干细胞、血细胞、红细胞、白细胞、血小板、巨噬细胞、白细胞；所述的白细胞包括淋巴T细胞、淋巴B细胞、神经细胞、肌细胞、DC细胞。在本发明的一些具体实施例中，是以巨噬细胞、DC细胞和T细胞为受试对象，进行不同CX3CL1趋化因子变体抗原分子交叉呈递效果的筛选。

本发明提供了融合蛋白，其包括CX3CL1变体和抗原；

本发明所述抗原来自病毒、病原菌和/或肿瘤。在本发明中，所述抗原可为来自病毒、病原菌和/或肿瘤的蛋白。一些实施例中，所述抗原来自病毒的衣壳蛋白或非结构蛋白、病原菌的膜蛋白、鞭毛蛋白或肿瘤的表面抗原。其可为的完整片段，也可为其抗原决定簇。其可仅含有一个抗原决定簇，也可以由多个抗原决定簇串联而成，也可以为一个抗原决定簇重复串联两次或以上。

本发明中，所述病毒包括但不限于HPV病毒、EBV、HCV、HIV、HBV、VZV或冠状病毒中至少一种；

本发明中，所述肿瘤包括但不限于胶质母细胞癌、肝癌、***、卵巢癌、肺癌、头颈癌、***癌、乳腺癌、血癌、结直肠癌胃癌、膀胱癌、神经纤维肉瘤、***肉瘤或移行上皮癌中至少一种。

一些实施例中，所述抗原为HPV病毒的E2、E5、E6和/或E7蛋白或其突变表位。所述HPV病毒包括各种亚型的HPV病毒，例如，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56和/或HPV58型。

一些实施例中，所述抗原为EB病毒的LMP1、LMP2、EBNA1、或其突变表位。

一些实施例中，所述抗原为冠状病毒的S蛋白、N蛋白、E蛋白、M蛋白或其表位。所述冠状病毒为SARS病毒、MERS病毒和/或COVID_19。

一些实施例中，所述抗原为胶质母细胞癌的CD133和/或EGFRvIII；所述的EGFRvIII包括EGFRvIII胞外区、EGFRvIII胞外特异表位肽、EGFRvIII胞外区与EGFRvIII胞外特异表位肽组合、EGFR胞外区或EGFR全长序列中的至少一种。

一些实施例中，所述抗原为肝癌的GPC3蛋白和/或AFP蛋白。

一些实施例中，所述抗原为***癌的PSA，PSMA，PSCA，PAP和/或STEAP1。

一些实施例中，所述抗原为乳腺癌的Her2/neu和/或BCAR3的优势表位。

一些实施例中，所述抗原为黑色素瘤的MAGE-A3，ISR2，NY-ESO-1，Melan A，gp100，Tyrosinase，TRP1和/或TRP2。

一些实施例中，所述抗原为血癌的Immunoglobulin idiotype，Immunoglobulinκ-chain和/或Immunoglobulinλ-chain。

一些实施例中，所述抗原为结直肠癌的AIM2，HT001，TAF1B，Micoryx和/或TGFβRII。

一些实施例中，所述抗原为卵巢癌的folate receptor-α。

一些实施例中，所述抗原为多种原癌基因、抑癌基因和/或肿瘤特异性抗原的P53，IDH1/2，BAGE，GAGE1，GAGE2，CAG3，RAGE，CEA，CDK4，CASP-8，ras，bcr/abl和/或MUC-1。

本发明利用CX3CL1与DC细胞等免疫细胞表面受体的趋化结合能力将上述的抗原蛋白转运交叉呈递到DC细胞表面，从而提高了各种抗原蛋白被DC细胞吞噬、加工、呈递的效率，改善了其防治相关疾病的效果。本发明实施例中，以EGFRvIII的EGFRvIII胞外区与EGFRvIII胞外特异表位肽组合抗原递呈效率已经验证能够被CX3CL1提高，且其他蛋白与CX3CL1融合后也会起到良好的效果。

本发明中，所述的EGFRvIII胞外区与EGFRvIII胞外特异表位肽组合，简称为vIII抗原或vIII，其是以蛋白质结构学与免疫学相关理论为指导，并兼顾特异性的激发高效体液免疫和细胞免疫反应，选择特异性EGFRvIII的T细胞表位作为细胞免疫抗原识别序列，以及未暴露在蛋白结构表面的内层蛋白质结构序列作为体液免疫新抗体识别位点进行设计的，其安全性好，抗原特异性强，可以有效的激活细胞免疫反应。

进一步的，所述的融合蛋白还包括T2蛋白，所述T2序列是由T4噬菌体纤维蛋白C末端的一段短肽(T4 phageheadfibritin)改造而来，种属来源属于外源序列，该序列在人体内完全没有，不会出现增强免疫后对人体其他蛋白造成杀伤的问题。有报道认为该序列可以在某些情况下促进某些蛋白的三聚体化。实验结果表明，T2蛋白在抗原蛋白C端可以有效加强抗原分子在细胞免疫过程中的免疫强度，显著增加了特异性T细胞产生的数量，起到了免疫增强因子的决定性作用。

更进一步的，本发明所述的融合蛋白，还包括N端的IgE信号肽，和/或C端的Flag标签。所述的IgE信号肽的氨基酸序列为MDWTWILFLVAAATRVHS，如SEQ ID NO:15所示，其在重组蛋白N端的添加促使融合蛋白分泌到胞外；所述的Flag标签的氨基酸序列为DYKDDDDK，如SEQ ID NO:16所示，该序列只为鉴定蛋白表达的标签不影响序列的免疫效果。

本发明中，所述的融合蛋白的序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:3和/或SEQ IDNO:12所示中任意一个或多个。

在一些具体的实施例中，本发明所述的融合蛋白的组合形式可以包括如下所述的任意一种：

CX3CL1变体和vIII抗原；

CX3CL1变体、vIII抗原、信号肽和Flag标签；

CX3CL1变体、vIII抗原和T2蛋白；

CX3CL1变体、vIII抗原、T2蛋白、信号肽和Flag标签。

本发明提供了编码所述融合蛋白的核酸，其包括：

编码CX3CL1变体的核酸，如SEQ ID NO:4所示；

编码EGFRvIII胞外区与EGFRvIII胞外特异表位肽组合的核酸，如SEQ ID NO:1所示；

编码T2蛋白的核酸，如SEQ ID NO:5所示。

进一步的，所述的编码CX3CL1变体的核酸与编码EGFRvIII胞外区与EGFRvIII胞外特异表位肽组合的核酸通过linker(G₅S)n，其中n为1～10；本发明实施例中，所述linker序列为GGGGGSGGGGG，序列如SEQ ID NO:14所示。

更进一步的，在一些实施例中，所述核酸的组合可以为CX3CL1-Linker-vIII。

在另一些实施例中，本发明所述核酸的组合可以为CX3CL1-Linker-vIII-T2。

在另一些实施例中，本发明所述核酸的组合可以为IgE-CX3CL1-Linker-vIII-Flag。

在另一些实施例中，本发明所述核酸的组合可以为IgE-CX3CL1-Linker-vIII-T2-Flag。

本发明所述的编码融合蛋白的核酸可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。在本发明实施例中，所述核酸为DNA或RNA形式。所述DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。所述DNA可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。核酸可以是例如载体(如表达或克隆载体)的一部分，或一个片段。所述核酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。所述RNA形式为由基因转录获得的mRNA等。

在本发明中，对表达融合蛋白的DNA序列进行了优化，这些优化包括但不限于：密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。

本发明中还提供了融合蛋白的转录单元，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的DNA序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly(A)信号等。

本发明提供了重组载体，其包括载体骨架和本发明所述的核酸。

本发明所述重组载体，是指重组的核酸载体，是一种重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对模式动物或哺乳动物细胞中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知真核细胞利用启动子，增强子以及终止子。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组***物。具体实施例中，编码本发明提供的融合蛋白的核酸可构建于各种真核表达载体中。例如，其骨架载体可以是pVR系列载体(参见中国专利ZL202110624820.8)。

进一步的，在一些具体实施例中，本发明所述的重组载体可以包括如下所示的任意一种或两种以上的组合：

pVR-CX3CL1-vIII-T2；

pVR-CX3CL1-vIII；

pVR-vIII。

本发明提供了转化或转染本发明所述的重组载体的宿主。用使用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞，这样转化的宿主细胞有能力复制编码蛋白质的载体或表达期望蛋白质。

进一步的，所述的宿主包括模式动物或哺乳动物细胞。所述的模式动物包括小鼠、大鼠、兔子等生物医学领域常用的实验动物，本发明对此不做限定。所述的哺乳动物细胞包括CHO细胞、BHK细胞、Sp2/0、HEK293、HEK293T。

更进一步的，本发明以小鼠为实验对象，导入所述核酸或载体进行体内活性及特异性实验。本发明以HEK293T细胞为受试对象，转化或转染上述重组载体，观察蛋白表达情况。结果表明质粒pVR-CX3CL1-vIII-T2、pVR-CX3CL1-vIII和对照组质粒pVR-vIII都能够顺利正常在哺乳动物细胞中表达。

本发明提供了所述的融合蛋白的制备方法，其通过培养本发明所述重组宿主，获得含有所述融合蛋白的培养物。

本发明提供了如下I)～V)中的至少一种在制备防治肿瘤的药物中的应用：

I)、本发明所述的融合蛋白；

II)、本发明所述的核酸；

III)、本发明所述的重组载体；

IV)、本发明所述的宿主；

V)、本发明所述制备方法制得的融合蛋白。

进一步的，本发明所述的肿瘤为恶性肿瘤。

一些实施例中，所述恶性肿瘤为高表达EGFR的肿瘤。所述高表达EGFR的肿瘤为脑癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、***癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌。

一些具体实施例中，所述肿瘤为肺癌。所述肺癌包括非小细胞肺癌或小细胞肺癌。

更进一步的，本发明所述防治包括抑制肿瘤生长，降低肿瘤体积或延缓肿瘤的生长速度中的任意一种，本发明对此不做限定。

本发明中，所述的应用还包括在制备小鼠移植瘤药物中的应用。实验结果表明：pVR-CX3CL1-vIII-T2质粒、CX3CL1-vIII-T2-mRNA以及CX3CL1-vIII-T2蛋白在接瘤第20天前后小鼠移植瘤完全消失，达到了完全的肿瘤治疗效果。

本发明提供了防治肿瘤的药物，其包括如下i)～v)中的任意一个或多个：

i)、本发明所述的融合蛋白；

ii)、本发明所述的核酸；

iii)、本发明所述的重组载体；

iv)、本发明所述的宿主；

v)、本发明所述制备方法制得的融合蛋白。

进一步的，本发明提供的防治肿瘤的药物还包括与所述的核酸序列反向互补的核苷酸序列，所述的核酸的转录mRNA或翻译起始产物等，本发明对此不做限定。

进一步的，所述的药物还包括含有所述核酸、重组核酸或mRNA的脂质纳米颗粒。所述的脂质纳米颗粒的制备过程包括利用动物体内转染试剂对所述的核酸、重组核酸或mRNA进行包裹，形成含有所述核酸或mRNA脂质纳米颗粒形式的疫苗用于肿瘤的防治。

更进一步的，本发明所述的药物还包括药学上可接受的辅料或载体。

本发明提供了一种防治肿瘤的方法，其为给予本发明所述的药物。其给予方式可以包括注射、口服或基因枪。

本发明涉及一种精准治疗多形性胶质母细胞瘤的核酸疫苗。这种疫苗利用趋化因子CX3CL1经序列优化后的功能活性变体作为辅助，利用一种多形性胶质母细胞瘤(GBM)的特有体内突变靶点EGFRvIII作为靶向抗原。结果表明：这种新型疫苗可以在体内诱导高效的特异性体液免疫和细胞免疫反应，并使得免疫***最终对目标肿瘤细胞进行大量杀伤，可以有效术后预防或治疗多形性胶质母细胞瘤。

附图说明

图1示CX3CL1及其各种功能活性变体趋化各类专职抗原提呈细胞能力分析比较；

图2示EGFR和EGFRvIII蛋白(蓝色)N端胞外结构域蛋白质完整结构及EGFRvIII抗原识别蛋白(红色)；

图3示pVR-CX3CL1-vIII-T2，pVR-CX3CL1-vIII，pVR-vIII三种构建质粒图谱；

图4示检测pVR-CX3CL1-vIII-T2，pVR-CX3CL1-vIII，pVR-vIII三种质粒目的基因的表达情况，利用蛋白免疫印迹技术(Western blot)检测C端带有Flag标签的融合蛋白表达情况；

图5示不同融合基因对小鼠进行预防型免疫用于后期测试特异性T细胞反应的时间轴；

图6不同融合基因对小鼠进行免疫后特异性T细胞反应的Elispot检测结果；

图7不同融合基因、mRNA和蛋白疫苗分别对小鼠进行预防型免疫和接瘤时间轴；

图8上述预防型免疫和量瘤检测结果图；

图9不同融合基因、mRNA和蛋白疫苗分别对小鼠进行治疗型免疫和接瘤时间轴；

图10上述治疗型免疫和量瘤检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种用于治疗多形性胶质母细胞瘤的疫苗，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

vIII抗原基因序列为：

CX3CL1-vIII-T2融合基因序列为：

CX3CL1-vIII-T2融合蛋白的氨基酸序列为：

CX3CL1核苷酸序列为：

T2核苷酸序列为：

vIII抗原蛋白氨基酸序列为：

CX3CL1氨基酸序列为：

质粒pVR-CX3CL1-vIII-T2融合基因序列为：

质粒pVR-vIII融合基因序列为：

质粒pVR-CX3CL1-vIII融合基因序列为：

CX3CL1-vIII-T2-mRNA编码融合蛋白的mRNA序列为：

CX3CL1-vIII-T2融合蛋白的氨基酸序列为：

CX3CL1-Linker-vIII融合蛋白氨基酸序列为：

Linker氨基酸序列为：GGGGGSGGGGG(如SEQ ID NO:14所示)。

IgE氨基酸序列为：MDWTWILFLVAAATRVHS(如SEQ ID NO:15所示)。

Flag氨基酸序列为：DYKDDDDK(如SEQ ID NO:16所示)。

本发明实施例中，涉及的片段的氨基酸序列和编码的核酸片段如表1：

表1片段的氨基酸序列和编码的核酸序列

序列编号	氨基酸
		SEQ ID NO:1	vIII抗原基因序列
SEQ ID NO:2	CX3CL1-vIII-T2融合基因序列
		SEQ ID NO:3	CX3CL1-vIII-T2融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO:4	CX3CL1核苷酸序列
		SEQ ID NO:5	T2核苷酸序列
SEQ ID NO:6	EGFRvIII抗原蛋白氨基酸序列
		SEQ ID NO:7	CX3CL1氨基酸序列
SEQ ID NO:8	质粒pVR-CX3CL1-vIII-T2融合基因序列
		SEQ ID NO:9	质粒pVR-vIII融合基因序列
SEQ ID NO:10	质粒pVR-CX3CL1-vIII融合基因序列
		SEQ ID NO:11	CX3CL1-vIII-T2-mRNA编码融合蛋白的mRNA序列
SEQ ID NO:12	CX3CL1-vIII-T2融合蛋白的氨基酸序列
		SEQ ID NO:13	CX3CL1-Linker-EGFRvIII氨基酸序列
SEQ ID NO:14	linker
		SEQ ID NO:15	IgE
SEQ ID NO:16	Flag

本发明中，所述的EGFRvIII胞外区与EGFRvIII胞外特异表位肽组合，亦称为EGFRvIII抗原、vIII抗原、vIII或EGFRvIII。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 CX3CL1趋化因子变体构建

对CX3CL1趋化因子进行蛋白结构与序列分析。经分析发现，该分子存在三部分结构域，分别为：N端的趋化因子结构域，中间的糖茎结构域和C端的跨膜结构域。为了摸索出针对各种免疫细胞最为高效的趋化因子序列，对CX3CL1蛋白本身进行多种序列构建并同时测试蛋白分子的趋化能力。由于C端结构域为跨膜结构域，无法将抗原蛋白分子分泌出细胞外，故在不同变体测试中全部删除C端跨膜区，将CX3CL1蛋白的25～338号氨基酸序列定义为全长CX3CL1分子。以此为基础的，结合蛋白质结构学分析，设计如下分子变体构建(括号中示氨基酸序号)：CX3CL1-a(25～100)；CX3CL1-b(25～128)；CX3CL1-c(25～185)；CX3CL1-d(25～265)；CX3CL1-e(25～309)；CX3CL1-f(25～338，全长)和CX3CL1-g(37～388)。针对以上全部分子变体进行序列合成并构建到大肠杆菌pET28a载体中进行蛋白表达纯化，最终获得全部7种蛋白分子的粗纯样品进行后续实验。

从小鼠骨髓以及外周血分别分离单核细胞和T细胞亚群。其中骨髓单核细胞分别加入M-CSF和GM-CSF、IL4诱导分化为巨噬细胞和DC细胞后进行趋化实验。趋化小室(碳酸脂膜Transwell小室：5μm；Costar，Cat：3422)的上室中放入上述分离或诱导分化的细胞，根据实验室前期工作基础加入细胞数量为1×10⁶/100μl/孔。同时设置自发迁移对照组以及CX3CL1细胞因子全部功能变体组，所加入的细胞数目相同。根据实验室前期已有的工作基础，100ng/ml为最佳趋化效率剂量。4小时后收集趋化下室中的细胞，并进行流式分析CX3CL1功能变体对各类免疫细胞的趋化能力。结果显示：CX3CL1不同分子变体能有效的从上室中募集各类免疫细胞到下室中(P＜0.001)，且不同蛋白分子的趋化能力有差别，趋化能力最强的功能活性变体并非传统序列分析理解的趋化因子结构域蛋白，而是相较之下序列更长的分子变体CX3CL1-b(图1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

实施例2EGFRvIII抗原序列和CX3CL1趋化因子蛋白序列的结构预测和序列选择

EGFRvIII为人源EGFR基因的缺失错位突变基因，其外显子2～7号部分缺失并在缺失后引入新的一个甘氨酸作为连接。因此为保证抗原识别序列的唯一性和特异性，防止机体免疫抑制机制的发生，EGFRvIII的抗原序列不可以使用全长序列，否则抗原蛋白将可能激发机体识别自身野生型EGFR导致过敏反应或者可能激发免疫抑制机制导致免疫***无法识别抗原序列为外源物质进行攻击。为此，以蛋白质结构学与免疫学相关理论为指导，并兼顾特异性的激发高效体液免疫和细胞免疫反应，需要选择特异性EGFRvIII的T细胞表位作为细胞免疫抗原识别序列；以及未暴露在蛋白结构表面的内层蛋白质结构序列作为体液免疫新抗体识别位点。

经过理论结构分析与多种长度序列等组合的尝试，最终筛选获得的抗原结构序列如图2所示。抗原序列最终选择EGFR N端胞外结构区域的红色结构区域。该部分在结构上位于野生型EGFR胞外区的内部，在一般人体细胞中无法被抗体蛋白识别锚定。但是在缺失2～7号外显子的EGFRvIII突变体中，该区域暴露在整个蛋白的最外部，可以有效被抗体识别并结合。同时该片段还带有EGFRvIII缺失的N末端序列以及添加的甘氨酸连续识别表位，经过人源HLA表位预测，该片段具有多处有效的MHC结合表位肽段，可以有效的激活细胞免疫反应。

CX3CL1的趋化因子结构序列根据实施例1中进行的不同功能变体的趋化能力比较实验结果分析，采用优化后的CX3CL1-b，作为本发明中所使用的序列进行后续实施例实验(后续实验中一律使用CX3CL1代替CX3CL1-b作为趋化因子名称)。

实施例3融合基因或蛋白疫苗的抗原设计方案及哺乳动物表达质粒的构建与制备

构建pVR-CX3CL1-vIII-T2质粒：EGFRvIII特异性抗原序列采用SEQ ID NO:6所示氨基酸序列，人源CX3CL1蛋白采用SEQ ID NO:7所示氨基酸序列。添加T2多肽序列(序列如SEQ ID NO:5所示)后按照5’到3’的顺序，构建融合蛋白CX3CL1-linker-EGFRvIII-T2，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。在融合蛋白CX3CL1-vIII-T2的N末端连接一个氨基酸序列为MDWTWILFLVAAATRVHS的IgE信号肽；在融合蛋白CX3CL1-vIII-T2的C末端连接一个DYKDDDDK的8个氨基酸组成的Flag标签。

最终得到的融合蛋白，自N端→C端依次包括：IgE信号肽、人源CX3CL1蛋白序列、linker序列(GGGGGSGGGGG)、EGFRvIII蛋白序列、T2蛋白序列、Flag标签序列。

将融合蛋白的氨基酸序列进行哺乳动物细胞表达偏好的密码子优化，确定其融合基因序列为SEQ ID NO:8将该融合基因序列进行基因合成(其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示)，之后将其整体构建到pVR质粒载体(序列和图谱见专利：202110624820.8)的对应多克隆位点区域，使其能够以正确的密码子翻译顺序表达融合蛋白。最终构建形成的质粒命名为pVR-CX3CL1-vIII-T2质粒。如图3A所示。

构建pVR-vIII质粒：在EGFRvIII特异性抗原序列之前在连接一个氨基酸序列为MDWTWILFLVAAATRVHS的IgE信号肽，之后连接DYKDDDDK的8个氨基酸组成的Flag标签。使得最终得到的融合蛋白自N端→C端依次包括：IgE信号肽、EGFRvIII特异性蛋白序列、Flag标签序列。如图3C所示。

将融合蛋白的氨基酸序列进行哺乳动物细胞表达偏好的密码子优化，确定其融合基因序列为SEQ ID NO:9该融合基因序列进行基因合成，之后将其整体构建到pVR质粒载体的对应多克隆位点区域，使其能够以正确的密码子翻译顺序表达融合蛋白。最终构建形成的质粒命名为pVR-vIII质粒。

构建质粒pVR-CX3CL1-vIII：同样的令最终构建的融合基因自N端→C端依次包括：IgE信号肽、人源CX3CL1蛋白序列、linker序列(GGGGGSGGGGG)、EGFRvIII特异性蛋白序列、Flag标签序列。

将融合蛋白的氨基酸序列进行哺乳动物细胞表达偏好的密码子优化，确定其融合基因序列为SEQ ID NO:10将该融合基因序列进行基因合成，之后将其整体构建到pVR质粒载体的对应多克隆位点区域，使其能够以正确的密码子翻译顺序表达融合蛋白。最终构建形成的质粒命名为pVR-CX3CL1-vIII质粒。如图3B所示。

实施例4构建质粒的体外细胞转染实验

转染前24小时，在6孔细胞培养板内接种2.5×10⁵个HEK293T细胞，待细胞密度长到60％～70％时开始转染试验。转染时提前在37℃水浴锅中预热细胞培养基、无血清的Opti-MEM培养基。转染时将5微克空载体(Vector)，pVR-CX3CL1-vIII-T2表达载体，pVR-CX3CL1-vIII表达载体，pVR-vIII表达载体和20μL PEI转染试剂先后加入到200μL无血清的Opti-MEM中，混合均匀后，室温下静置20分钟。将需要转染的细胞更换新鲜培养基，轻柔加入上述转染体系，轻轻摇匀。将细胞放回细胞培养箱中培养6小时后换液。转48小时后收取细胞用Western Blot检测EGFRvIII融合基因质粒HEK293T细胞中的表达效果。

将收集细胞，加入60μL的含有PMSF或Cocktail蛋白酶抑制剂的0.5％ NP40裂解缓冲液。充分重悬细胞，4℃旋转裂解细胞30分钟。12000rpm，4℃离心裂解液10分钟，收集上清至新的1.5mL EP管中，弃掉沉淀。根据样品实际体积加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混合均匀后将样品放在100℃空气浴中加热10分钟，立即进行Western blot，利用Flag标签抗体(Sigma,F3165)进行检测，结果如图4显示空载体(Vector)的Negative control无蛋白表达，pVR-CX3CL1-vIII-T2和pVR-CX3CL1-vIII表达蛋白大小位置明显高于pVR-vIII，说明实验组质粒pVR-CX3CL1-vIII-T2、pVR-CX3CL1-vIII和对照组质粒pVR-vIII都能够顺利正常在哺乳动物细胞中表达。

实施例5稳转EGFRvIII全长蛋白的TC-1小鼠细胞系构建

将缺失外显子2-7号的EGFRvIII蛋白全长序列进行哺乳动物细胞密码子优化，合成基因并通过酶切连接方式构建到pEZ-lv201质粒载体的对应对克隆位点之内。使得稳转质粒载体可以同时表达目的基因和EGFP指示基因。参照实施例4的类似方法将构建EGFRvIII目的基因的pEZ-lv201质粒12μg、包装质粒pAX2 10μg和pMD2.G 3μg同时顺转进入HEK293T细胞中。经过3天的细胞培养在荧光显微镜下观察细胞可以发现有部分细胞成功转入目的质粒并显示出绿色荧光。将细胞培养上清吸出并加入到已经准备好的状态优质的TC-1细胞系培养皿中。经过2天病毒感染，将细胞上清进行换液，再经过2两天时间培养后，在被感染的细胞培养基上清中按照1000:1的比例加入嘌呤霉素进行筛选。3天后对培养皿进行换液去除死细胞，剩余活细胞进行培养。培养期间对细胞每隔一天进行观察，必要时进行换液和细胞传代培养工作。直到全部细胞感染稳转慢病毒并在荧光显微镜下呈现绿色荧光。将此时的扩增的细胞按照实施例4中的方法进行细胞处理并裂解，最终进行westernblot实验检测目的蛋白是否表达。结果确定表达的细胞株为稳转EGFRvIII全长蛋白的TC-1稳转细胞系。

实施例6探索融合基因疫苗诱导细胞特异性T细胞反应的情况

鉴于融合基因在哺乳动物细胞可以正常表达。我们提取单独pVR-CX3CL1-vIII-T2、pVR-CX3CL1-vIII、pVR-vIII质粒，利用TERESA活体基因导入仪对小鼠进行免疫质粒电转，质粒剂量25μg，加上阴性对照PBS组共4组，每组5只。按照图5的时间轴标注的免疫策略对小鼠进行免疫，之后在D14对各组小鼠进行解剖取脾脏并加入加了肝素的PBS溶液中。将脾脏研磨为细胞状态，并通过滤网过滤掉***等杂质。将细胞溶液整体进行1500rpm离心3min。弃上清，剩余沉淀采用震荡法打散后加入2mL裂红液于室温裂解1min，裂红后马上加入10mLPBS终止裂红过程。后将全部样品进行1500rpm离心3min。弃去上清，使用5mL的PBS溶液洗涤一次。第二次1500rpm离心3min。弃去上清后加入5mL灭活过的10％FBS的1640培养基，重悬沉淀后，进行细胞计数。

从Elispot试剂盒(货号：3321-4APW-2)中取出待检测用预包被板条，用无菌PBS洗涤4次，200μL/孔/次，最后1次弃液后在吸水纸上拍干。每孔中加入工作培养基200μL/孔，室温孵育30min，弃去板孔中培养基在吸水纸上拍干。按照试剂盒推荐方法在孔中加入2.5×10⁵个单个核细胞，同时在实验组孔中加入2μg/孔的多肽库(多肽库为抗原EGFRvIII序列的全长多肽库混合液)溶液混合；阳性对照组中加入阳性试剂Cell Activation Cocktail(货号：423301)；阴性对照组中不加入任何物质。在37℃细胞培养箱中培养18h；第二天按照试剂盒操作流程对样品进行抗体染色和洗涤，最终显色5min，统计Elispot的斑点数并进行数据比较。结果如图6所示。结果显示，pVR-CX3CL1-vIII-T2、pVR-CX3CL1-vIII、pVR-vIII三种质粒相比，pVR-CX3CL1-vIII-T2的特异性T反应最强，pVR-vIII质粒的特异性T反应最弱。这说明，CX3CL1趋化因子在抗原蛋白的N端可以有效诱导抗原分子与特异性免疫细胞的结合，从而大大加强了抗原分子交叉呈递的效果，使得CX3CL1最终能够诱导出抗原分子更强的特异性免疫反应。另外，T2多肽在抗原蛋白C端可以有效加强抗原分子在细胞免疫过程中的免疫强度，大大增加了特异性T细胞产生的数量，起到了免疫增强因子的决定性作用。因此，该项目设计的pVR-CX3CL1-vIII-T2为目前免疫效果最强的融合基因序列组合。

实施例7融合基因DNA和mRNA以及蛋白形式疫苗对小鼠稳转移植瘤细胞TC-1同种移植瘤发生的干预效果

鉴于融合基因在哺乳动物细胞可以正常表达。我们提取单独pVR-CX3CL1-vIII-T2和pVR-vIII质粒，利用TERESA活体基因导入仪对小鼠进行免疫质粒电转，并体外转录制备可转录pVR-CX3CL1-vIII-T2的mRNA疫苗与体内转染试剂in vivo-jetPEI包裹成脂质纳米颗粒作为mRNA形式疫苗(记做CX3CL1-vIII-T2-mRNA，序列如SEQ ID NO:11所示)。

另纯化融合蛋白作为蛋白疫苗，其中pVR-CX3CL1-vIII-T2质粒对应的融合蛋白记做CX3CL1-vIII-T2(SEQ ID NO:12)。

同种移植稳转EGFRvIII的TC-1细胞后观察融合基因免疫对TC-1移植瘤细胞生长的抑制情况。

确定TC-1细胞成瘤后，我们按照图7时间轴标注的免疫策略对小鼠进行质粒电转和mRNA肌肉注射以及蛋白皮下注射。将C57B6(购自为通利华)雌性小鼠和雄性小鼠分为A、B两组，每组分别注射PBS、pVR-vIII质粒、pVR-CX3CL1-vIII-T2质粒、CX3CL1-vIII-T2-mRNA以及CX3CL1-vIII-T2蛋白的五小组，每小组五只，利用脱毛膏进行小鼠右侧靠近腹股沟***处脱毛处理。之后直接注射mRNA，蛋白或利用电转仪在脱毛处注射质粒，每只25μg，每两周一次，共注射两次，在最后一次注射后一周接种之前摸索好成瘤条件的TC-1瘤细胞，观察肿瘤形成时间并每两天测量肿瘤的长径a和短径b，按照a×b×b/2进行肿瘤体积计算，绘制肿瘤生长曲线。结果如图8所示，免疫pVR-CX3CL1-vIII-T2质粒、pVR-vIII质粒、CX3CL1-vIII-T2-mRNA以及CX3CL1-vIII-T2蛋白的组别均能使得小鼠体内移植瘤无法成瘤，疫苗效果显著。而且在D30天对所有小鼠进行二次接瘤挑战，结果显示移植瘤仍然无法成瘤。这说明四组疫苗均有非常明显的预防肿瘤的效果。

实施例8融合基因疫苗对小鼠移植瘤细胞TC-1同种移植瘤的治疗效果

鉴于在预防免疫实验中CX3CL1-vIII-T2等疫苗的效果优良。我们又对融合基因免疫的TC-1同种移植瘤的治疗效果进行实验探索。采用如图9中的时间轴对小鼠进行接瘤和质粒治疗性免疫。每次免疫接种量为25μg。在接瘤后开始对小鼠进行免疫两次分别为D4和D11。之后按照相同方法进行量瘤，统计肿瘤体积。绘制肿瘤生长曲线如图10所示。结果显示，pVR-CX3CL1-vIII-T2质粒、CX3CL1-vIII-T2-mRNA以及CX3CL1-vIII-T2蛋白的三组相较pVR-vIII质粒组肿瘤生长抑制效果更加明显，且pVR-CX3CL1-vIII-T2质粒、CX3CL1-vIII-T2-mRNA以及CX3CL1-vIII-T2蛋白的三组在接瘤第20天前后移植瘤完全消失，达到了完全的肿瘤治疗效果。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (18)

1.CX3CL1变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

2.权利要求1所述的CX3CL1变体在提高抗原分子交叉呈递效果中的应用。

3.融合蛋白，其包括CX3CL1变体和抗原。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗原来自病毒、病原菌和/或肿瘤；所述肿瘤包括胶质母细胞癌、肝癌、***、卵巢癌、肺癌、头颈癌、***癌、乳腺癌、血癌、结直肠癌胃癌、膀胱癌、神经纤维肉瘤、***肉瘤或移行上皮癌中至少一种。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，

所述的抗原为胶质母细胞癌的CD133和/或EGFRvIII；所述的EGFRvIII包括EGFRvIII胞外区、EGFRvIII胞外特异表位肽、EGFRvIII胞外区与EGFRvIII胞外特异表位肽组合、EGFR胞外区或EGFR全长序列中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗原为EGFRvIII胞外区与EGFRvIII胞外特异表位肽组合，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

7.根据权利要求3～6任一项所述的融合蛋白，其特征在于，还包括T2蛋白。

8.根据权利要求3～7任一项所述的融合蛋白，其特征在于，还包括信号肽和Flag标签。

9.根据权利要求3～8任一项所述的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:12所示中的至少一种。

10.编码权利要求3～9任一项所述的融合蛋白的核酸。

11.根据权利要求10所述的核酸，其特征在于，其中：

编码CX3CL1变体的核酸，如SEQ ID NO:4所示；

编码EGFRvIII胞外区与EGFRvIII胞外特异表位肽组合的核酸，如SEQ ID NO:1所示；

编码T2蛋白的核酸，如SEQ ID NO:5所示。

12.重组载体，其包括：载体骨架和权利要求10或11所述的核酸。

13.根据权利要求12所述的重组载体，其特征在于，所述载体骨架包括pVR。

14.转化或转染权利要求12或13所述的重组载体的宿主。

15.根据权利要求14所述的宿主，其特征在于，包括模式动物和/或哺乳动物细胞。

16.权利要求3～9任一项所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，培养权利要求14或15所述的宿主，获得含有所述融合蛋白的培养物。

17.如下I)～V)所示中至少一种在制备防治肿瘤的药物中的应用:

I)、权利要求3～9任一项所述的融合蛋白；

II)、权利要求10或11所述的核酸；

III)、权利要求12或13所述的重组载体；

IV)、权利要求14或15所述的宿主；

V)、权利要求16所述的制备方法制得的融合蛋白。

18.防治肿瘤的药物，其原料包括如下i)～v中的任意一个或多个：

i)、权利要求3～9任一项所述的融合蛋白；

ii)、权利要求10或11所述的核酸；

iii)、权利要求12或13所述的重组载体；

iv)、权利要求14或15所述的宿主；

v)、权利要求16所述的制备方法制得的融合蛋白。

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